Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Парвовирус B19 у доноров крови и больных гематологического стационара

На правах рукописи

Элижбаева Медина Абубакаровна

ПАРВОВИРУС В19 У ДОНОРОВ КРОВИ И БОЛЬНЫХ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО СТАЦИОНАРА

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

2 9 СЕН 2011

4854750

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

чл-корр. РАМН, д.м.н., проф. Савченко Валерий Григорьевич к.б.н. Судариков Андрей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпова Ольга Вячеславовна доктор медицинских наук, профессор Лукина Елена Алексеевна Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Федеральный Научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «_»_2011 г., в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.02 в ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрав-соцразвития РФ по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ГНЦ МЗСР России

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

ОБЩАЯ XAPAKf ЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Инфицирование парвовирусом В19 встречается достаточно часто. Известно, что к 70 годам 60-70 % людей имеют антитела к этому вирусу и, следовательно, перенесли инфекцию парвовируса В19 (PV В19). Вирус передается трансфузионным и воздушно-капельным путем. Основными клетками-мишенями для PV В19 являются эрит-робласты, дифференцировка в эритроциты которых после инфицирования вирусом нарушается, что приводит в конечном итоге к снижению количества эритроцитов в крови. Обычно этот период длится около двух недель - времени, необходимого для ан-тителообразования. Однако, у пациентов с иммунодефицитом или нарушением эрит-роидного ростка на фоне парвовирусной инфекции может возникнуть транзиторная анемия, тромбоцитопения, парциальная красноклеточная аплазия костного мозга и другие осложнения.

PV В19 термостабилен, поэтому инфицирование возможно также и при переливании препаратов, получаемых в результате переработки донорской крови. В острой фазе заболевания PV В19 может присутствовать в крови в очень высокой концентрации - до 1012 копий/мл. Таким образом, при пулировании плазмы от различных доноров в производстве компонентов для трансфузий может быть достаточно одного положительного образца для заражения всего объема.

Европейская фармакопея (ЕР) и Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (FDA), рекомендуют проверку донорской крови на наличие PV В19 наряду с другими особо опасными инфекциями, передающимися при трансфузиях компонентов крови, такими, как СПИД и гепатиты В и С. Банки крови США, Германии, Австрии, Великобритании осуществляют тестирование донорской крови на наличие PV В19.

Многочисленные работы указывают на необходимость количественного тестирования на PV В19 донорской крови, переливаемой больным, находящимся в состоянии иммуносупрессии. Выбраковка донорской крови, потенциально опасной для инфицирования при трансфузиях, повысит уровень вирусной безопасности гемотрансфузий.

Цель исследования

Оценить необходимость тестирования крови на парвовирус В19 в подразделениях службы крови и в гематологическом стационаре и определить группы больных, для которых такое тестирование необходимо в первую очередь.

Задачи исследования 1.Определить частоту встречаемости РУ В19 у доноров Отделения переливания крови (ОПК) ФГБУ Гематологический научный центр и Чеченской республиканской станции переливании крови (СПК).

2.Выявить частоту встречаемости РУ В19 у больных с различными диагнозами, проходящих лечение в ФГБУ Гематологический научный центр, в зависимости от пола, возраста, длительности пребывания в стационаре и наличия трансфузий.

3.Установить группы больных, которых необходимо тестировать на наличие РУ В19 во время прохождения лечения в клинике.

Научная новизна работы Впервые проведено исследование по определению встречаемости РУ В19 у двух популяций доноров ОПК ФГБУ Гематологический научный центр и Чеченской республиканской СПК. Впервые проведено масштабное исследование по определению встречаемости РУ В19 у больных с различными диагнозами, проходящих лечение в ФГБУ Гематологический научный центр, в зависимости от пола, возраста, длительности пребывания в стационаре и наличия трансфузий.

Значение для теории и практики Работа представляет большое значение для российской службы крови, т.к. в ней выявлена частота встречаемости РУ В19 у доноров крови в Москве и Московской области на примере доноров ОПК ФГБУ Гематологический научный центр и в Чеченской республике на примере доноров Грозненской станции переливания крови. Кроме того, в работе показана необходимость систематического мониторинга на РУ В19 гематологических больных и больных, находящихся в состоянии иммуносупрессии для своевременного выявления инфицирования парвовирусом и назначения лечения во избежание осложнений для больного и дальнейшего распространения вируса в отделении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Частота обнаружения ДНК PV В19 в крови доноров ОПК ГНЦ (1,0%) и в крови доноров Чеченской СПК (1,3%) соответствуют частоте в других Европейских и Азиатских странах.

2. Частота обнаружения PV В19 выше у больных острыми лейкозами. Тестирование препаратов крови, переливаемых этим больным, а также мониторинг PV В19 в процессе лечения необходимы для предотвращения осложнений в период лечения.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 8 июля 2011 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематоло-гия; гемобластозы и депрессии кроветворения» в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Материалы работы представлены на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2009г.) и на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010г.)

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 13 рисунков и 9 таблиц. Список цитированной литературы включает 319 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Мин-здравсоцразвития РФ (зав.лаб. - к.б.н. Судариков А.Б.). Исследования выполнялись в рамках бюджетной темы НИР.

Доноры. В работе использовали образцы сывороток 1011-ти доноров Гематологического научного центра Минздравсоцразвития РФ (г.Москва) (декабрь 2008г.), а

также сыворотки крови 510-ти доноров Чеченской республиканской станции переливания крови (г.Грозный) (ноябрь 2009г.). Среди доноров Чеченской республиканской станции переливания крови проводили анкетирование донора и у каждого из них брали информированное согласие на обезличенную обработку персональных данных.

Больные. В работе использовали сыворотки крови 1101 больного, находящихся на лечении в различных отделениях Гематологического научного центра Минздрав-соцразвития РФ (г.Москва) (2005 - 2010гг.).

Выделение вирусных нуклеиновых кислот из сыворотки крови. ДНК PV В19 выделяли с помощью гунидинтиоцианата. Сыворотку крови (ЮОмкл) смешивали с 450 мкл лизирующего буфера (5.5 M гуанидинтиоцианат, 0.3 M натрий ацетат, 50% фенола, насыщенного 0.1 M Трис, рН 6.5, транспортная РНК 25мкг/мл, внутренний контроль 2000 копий/мл). Добавляли 100 мкл хлороформа. Центрифугировали. К водной фазе добавляли равный объем изопропанола. После центрифугирования осадок отмывали 80% этанолом и растворяли в 25мкл деионизованной воды.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов донорской крови. У доноров Чеченской станции переливания крови кроме образцов сыворотки, брали 9 мл крови с 1мл 4%-ого цитрата Na и выделяли ядерные клетки. ДНК выделяли из лейкоцитов по модифицированному «солевому» протоколу.

Праймеры для ПЦР в реальном времени. Мы использовали праймеры для определения фрагмента гена неструктурного белка PV В19. Для определения ДНК HBV и РНК HCV в работе использовали ранее разработанные в лаборатории соответствующие системы праймеров и проб. В качестве внутреннего контроля использовали фрагмент гена Jok2 мыши. Последовательности олигонуклеотидних праймеров и проб приведены в таблице 1.

Внутренний контроль. В качестве внутреннего контроля выделения нуклеиновых кислот и прохождения полимеразной цепной реакции в каждой пробирке использовали фрагмент гена Jcik2 мыши.

Таблица №1. Последовательности праймеров и зондов, используемых в работе.

мишень 5'-3' ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДА

прямой обратный флюоресцентный зонд

PVB19 5'-actatgaaaactgggcaataaac-3' 5'-caccaccactgctgctgata-31 5'- caaggtcggtcgttgac-3' 5'-cy5-aattaatgcagatgccctc-cacccagac-bhq3-3'

HBV 5'-cttcgcttcacctctgc-3' 5'-fam-acataagaggactcttgg-actctcagcaat-bhq 1-3 5'-r&g-cactcgcaagcacccta-tcagg-bhql-3'

HCV 5'-ctcatggtgcacggtctac-3' * 5'- cgaaaggccttgtggtact-3' 5'-acctcgccagtgttgtcct-3'

ВК 5'-ggaccctacacagtttgaagag-3' 5'-FAM-agatgtgccgctatgac ccgctg-RTQl-3' 5'-Cy5-agatgtgccgctatga cccgctg-BHQ3-3'

Примечание. *Праймер использовали в реакции обратной транскрипции.

Создание внутреннего стандарта для количественного определения ДНК PVB19

1. Клонирование фрагмента ДНК PV BI9 в вектор pGEM-TEasy. Выделяли ДНК из сыворотки крови больного PV В19. Проводили классическую ПЦР. Полученный амплификат лигировали в вектор pGEM-TEasy (Promega) и клонировали в клетках E.coli (штамм ТВ1). Селекцию клонов проводили на среде LB+2% агар+х-GAL+IPTG+ампицилин. Выросшие белые колонии проверяли на наличие вставки 123 п.н. методом ПЦР.

2.Построение калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой использовали ряд последовательных разведений плазмиды pGEM-TEasy/PV В19 (2,5x10' копий/мл, 2,5х108 копий/мл, 2,5х107 копий/мл, 2,5х106 копий/мл, 2,5х105 копий/мл, 2,5х104 копий/мл, 2,5х103 копий/мл, 2,5х102 копий/мл).

ПЦР в реальном времени для определения PV В19. Реакционная смесь для ПЦР в реальном времени (25 мкл), содержала буфер для Taq ДНК полимеразы (ЮОтМ KCL, TrisHCL (pH 8,8)), MgCl2 2,5 мМ, смесь dNTP 25 мкМ, праймеры PV В19 и праймеры Jak2 (по 10 пмоль прямого и обратного праймеров), флюоресцентные зонды Hyb_PV В19 и Hyb_Jok2 (3 пмоль), SynTaq ДНК полимераза (1U), 5мкл раствора ДНК. ПЦР в реальном времени проводили в приборе АНК-32 («Синтол») при следующем температурном режиме: первоначальная денатурация 95°С, 5 мин и последующие 45 циклов соответственно, 60°С 50 сек. и 95°С 20 сек.

Верификация созданной тест-сисиемы для количественного выявления

ДНК PV В19. Для подтверждения чувствительности разработанного набора ДНК PV В19- положительные образцы были протестированы с помощью коммерческой тест-системы для выявления и количественного определения ДНК PV В19 AMimnCcHC®Parvovirus B19-FL. Экстракцию ДНК выполняли в этом случае с помощью набора Рибо-преп (ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Реакцию проводили на амплифи-каторе Rotor-Gene 6000 ("Corbett Research", Австралия) с детекцией флюоресцентного сигнала в режиме реального времени.

Мультиплексная ПЦР в реальном времени для выявления HBV и HCV.

Обратная транскрипция РНК HCV. Реакционная смесь для обратной транскрипции РНК HCV (10 мкл) содержала: буфер для M-MLV-ревертазы, смесь dNTP 25мкМ, обратный праймер HCV (10 пмоль), M-MLV-ревертаза (10U), ингибитор РН-Каз (1U), 5мкл раствора нуклеиновых кислот.

Обратную транскрипцию проводили при 50°С в течение 30 мин с последующим нагреванием при 95°С в течение 5 мин.

Параметры проведения мультиплексной ПЦР. Реакционная смесь для мультиплексной ПЦР в реальном времени (25 мкл) содержала: буфер для Taq ДНК полимера-зы (lOOmM KCL, TrisHCL (pH 8,8)), MgCb 2,5 мМ, смесь dNTP 25мкМ , праймеры HBV, HCV и Jak2 (по 10 пмоль прямого и обратного праймеров), флюоресцентные зонды Hyb_HBV, Hyb_HCV и Hyb_JaK2 (3 пмоль) и SynTaq ДНК полимераза (1U) «Синтол». 5мкл раствора кДНК добавляли после обратной транскрипции. ПЦР в реальном времени проводили приборе АНК-32 «Синтол» при следующем температурном режиме: первоначальная денатурация 95°С, 5 мин. и последующие 45 циклов 60°С 50 сек. и 95°С 20 сек, соответственно.

Выявление антител к вирусам. Для выявления: IgM (IgG)- антител к парвови-русу В19 использовали коммерческий иммуноферментной набор «Биотрин» (Ирландия); HbsAg - использовали коммерческий иммуноферментной набор реагентов «ГепаСтрип» (Россия); IgM (^О)-антител к вирусу гепатита С использовали коммерческий иммуноферментной набор реагентов «Бест анти-HCV» (комплект 3) (Россия).

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов использовали методы описательной статистики и однофакторный частотный

анализ; для расчета значимости применяли X2 критерий.

8

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка тест-системы для определения ДНК PV В19

Для качественного и количественного определения ДНК PV В19 методом поли-меразной цепной реакции в реальном времени были выбраны праймеры и флюоресцентно меченный зонд, специфически выявляющие фрагмент ДНК PV В19.

Мы использовали праймеры для определения фрагмента гена неструктурного белка PV В19, предложенные в работе [Compston L.I. et al., 2008]. Для получаемого амплификата мы разработали флюоресцентный зонд, который использовали с этими праймерами (рис.1) в ПЦР в режиме реального времени (primer 3 http://frodo.wi.mit.edi.i/primer3/).

5'CCTGACATGGGGTTACTAACAGAGGCTGATGTACAACAGTGGCTTACATGGTGTAATGCACAAA OCTGGGACC/I СТА TGAAAA CTGGGCAA ТЛАЛ CTACACTTTTGATTTCCCTGGAATTAATGCAG AT GCCCTCCACCCAGACCTCCAAACCACCCCAATTGTCACAGACACCAG7H2jClGÇ4GGl£ZïïCÏ GGZÏÏAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTTTTTAACCTCATCACCCCAGGCGCCTGGA ACACTGAAACCCC3'

Рисунок № 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена неструктурного белка PV В19. Жирным подчеркнутым курсивом выделены прямой и обратный праймеры, жирным шрифтом выделен флюоресцентный зонд. Размер амплификата 123 п.н.

Кроме того, был разработан внутренний контроль, вводимый на самой ранней стадии работы с образцом и выявляемый на последней стадии, для подтверждения успешного прохождениея всего процесса и исключения ложно-негативных результатов.

В качестве внутреннего контроля за прохождением всех этапов процесса мы использовали фрагмент кДНК гена Jok2 мыши, не имеющий гомологий с последовательностью ДНК PV В19 и ДНК человека (рис. 2).

5'TTGAAGACAG GGA СССТА СА С A GTTTGAA G A GAG ACACTTG AAGTTTCTACAGCAGCTTGGCA AAGGTAACTTCGGGAGTGTGGAGATGTGCCGCTATGACCCGCTGCAGGACAACACTGGCGAG GrGGTCGCTGTGAAGAAACTCCAGCACAGCACTGAAGAGCACCTCCGAGACTTTGAGAGGGAG ATCGAGATCCTGAAATCCTTGCAGCATGACAACATCGTCAAGTACAAGGGAGTGTGCTACAGTG CGGGTCGGCGCAACCTAAGATTAATTATGGAATATTTACCATATGG3'

Рисунок № 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента кДНК гена Jok2 мыши. Жирным подчеркнутым курсивом выделены прямой и обратный праймеры, жирным шрифтом выделен флюоресцентный зонд. Размер амплификата 117 п.н.

Амплификат (117 п.н., мол. вес 7,7х104 Да) выделяли из геля после электрофореза ПЦР-продуктов. Количество копий амплификата в миллилитре водного раствора определяли как указано выше (Материалы и методы). Выделенный амплифи-

кат добавляли в лизирующий буфер для выделения вирусной ДНК из образцов сыворотки крови в концентрации 103 копий/мл.

В систему был также введен внутренний стандарт для количественных измерений ДНК РУ В19. Для создания внутреннего стандарта амплификат, получаемый с используемыми для выявления ДНК РУ В19 праймерами, был клонирован в коммерческую плазмиду рОЕМ-ТЕаву. Концентрация выделенной ДНК вновь полученной плазмиды была измерена и построена калибровочная кривая. Для построения калибровочной кривой использовали ряд последовательных разведений плазмиды рОЕМ-ТЕаву/РУ В19 (2,5x109 копий/мл, 2,5х108 копий/мл, 2,5х107 копий/мл, 2,5х106 копий/мл, 2,5х105 копий/мл, 2,5х104 копий/мл, 2,5х103 копий/мл, 2,5х102 копий/мл).

Программное обеспечение, комплектуемое с прибором для проведения полиме-разной цепной реакции в реальном времени АНК-32 («Синтол»), позволяло строить калибровочную кривую и проводить с ее помощью количественные расчеты (рис.3).

В результате была получена тест-система для количественного определения ДНК РУ В19 (тест-система ГНЦ). Чувствительность тест-системы - 100 копий/мл сыворотки крови. Специфичность тест-системы обеспечивается специфичностью прайме-ров и зонда.

Рисунок № 3. Калибровочная кривая, построенная с помощью программного обеспечения АНК-32 («Синтол»),

По калибровочной кривой рассчитывали концентрации ДНК PV В19 в исследуемых образцах, учитывая объемы образца сыворотки и образца выделенной вирусной ДНК.

Результаты по изменению ДНК PV В19 нашей тест-системой мы сравнили со значениями, получаемыми с помощью коммерческого набора для выявления и количественного определения ДНК PV В19 AMmmCeHC®Parvovirus B19-FL.

Выявление ДНК PV В19 у доноров

Создание коллекции образцов сывороток и ДНК доноров. В процессе работы нами была собрана коллекция образцов сывороток крови и лейкоцитов доноров, из которых впоследствии выделялись нуклеиновые кислоты.

Создание базы данных доноров, а также стационарных и амбулаторных больных, исследованных на наличие ДНК PV В19. База данных состоит из электронной таблицы с идентификационными номерами доноров (г. Москва и г.Грозный) и больных, находившихся на лечении в стационаре или на амбулаторном наблюдении в ГНЦ и проходивших тестирование на наличие ДНК PV В19 и других вирусов. В базе данных содержатся сведения об образце взятого биологического материала (вид материала, ФИО больного, отделение, дата проведения анализов, результат). Созданная база данных связана с институтскими базами данных о больных и донорах, содержащими расширенную информацию.

Выявление ДНК PV В19 у доноров с помощью количественной тест-системы. Образцы сывороток от доноров 2-х вышеназванных популяций были протестированы на наличие ДНК PV В19 с помощью разработанной нами системы для количественного выявления ДНК PV В19 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Доноры ОПК ГНЦ. Из 1011 доноров ОПК ГНЦ образцов было выявлено 20 положительных на ДНК PV В19. Для анализа количественных результатов все области значения концентрации ДНК PV В19 мы разбили на три диапазона: диапазон А включал концентрацию вируса менее 104 копий/мл; диапазон Б - концентрации от 104 до 105 копий/мл; диапазон В - более 105 копий/мл. В диапазон А попали 12 из 20 вируспо-ложительных образцов (1,2 % от общего числа исследованных доноров), в диапазон Б - 5 образцов (0,5% от общего числа исследованных доноров) и в диапазон В - 3 образца (0,3%) (рис. 4).

Рисунок № 4. Частота встречаемости здоровых доноров и доноров, у которых обнаружена ДНК РУ В19 в различных концентрациях на ОПК ГНЦ. А - диапазон концентраций ДНК РУ В19 менее 104 копий/мл; Б - диапазон концентраций ДНК РУ В19 от 104 до 105 копий/мл; В -диапазон концентраций ДНК РУ В19 более 105 копий/мл.

Доноры Чеченской республиканской СПК. Из 510 доноров Чеченской республиканской СПК было выявлено 7 положительных на ДНК РУ В19. В диапазон А попали все 7 (1,3 % от общего числа исследованных доноров), в диапазоны Б и В не попало ни одного образца (рис 5).

Рисунок №5. Частота встречаемости ДНК РУ В19 у доноров Чеченской республиканской СПК. Во всех положительных образцах (1,3%) концентрация ДНК РУ В19 менее 104 копий/мл.

Доноры ОПК ГНЦ. У доноров ОПК ГНЦ, в 12-ти образцах сыворотки вируспо-ложительных на ДНК PV В19 , с концентрацией вирусной ДНК менее 104 копий/мл выявлялись только антитела класса IgG к PV В19. У доноров с концентрацией вирусной ДНК от 104до 105 копий/мл выявлялись одновременно антитела классов IgM и IgG (5 доноров из 20 вирусположительных доноров). Более 105 копий/мл ДНК РУ В19

Выявление антител классов IgM и IgG у доноров положительных на ДНК PV В19

было выявлено у трех доноров, причем у одного из этих доноров выявлены только ^М, у одного донора - одновременно ^М и и у одного донора - никаких антител к РУ В19 выявлено не было. Концентрация ДНК РУ В19 в последнем образце была самой высокой и составила 2x10'копий/мл.

Доноры Чеченской республиканской СПК. У чеченской популяции доноров, все 7 образцов сыворотки положительных на ДНК РУ В19 оказались с концентрацией вирусной ДНК менее 104 копий/мл и с антителами класса к РУ В19. С концентрацией вирусной ДНК от 104 до 105 копий/мл и более 103 копий/мл ДНК РУ В19 образцов выявлено не было.

Связь вирусной нагрузки с антителами, вырабатываемыми на РУ В19 Результаты нашей работы показывают, что у доноров как на ОПК ГНЦ, так и на Чеченской СПК встречается РУ В19, причем у доноров ОПК ГНЦ существенно чаще, соответственно, 2,0% (ОПК ГНЦ) против 1,3% (СПК Грозный). Распределение вирусной нагрузки и типа антител в этих группах также неодинаково. Процент доноров, имеющих концентрацию вируса более 104 копий/мл, среди московских доноров в нашей работе равен 0,8%, а среди чеченских доноров равен 0. Многочисленными работами показано, что компоненты донорской крови, имеющие концентрацию ДНК РУ В19 не более 104 копий/мл пригодны для переливания реципиентам и заготовки препаратов из крови, а антитела класса в большом количестве содержащиеся в этой крови обладают протективными свойствами относительно РУ В19. Таких доноров на ОПК ГНЦ было обнаружено 99,2%, а на Чеченской СПК - 100%.

Доноры, у которых выявляются только ^М-антитела к РУ В19 или одновременно антитела двух классов ^М и ^О, имеют более высокую вирусную нагрузку, и их кровь непригодна для переливания. Работы зарубежных исследователей показывают, что компоненты, содержащие ДНК РУ В19 в концентрации более 105 копий/мл ДНК РУ В19 и антитела класса 1§М указывают на острую инфекцию, и стоит отказаться от их использования. Отсутствие антител к парвовирусу В19 не говорит об отсутствии самого вируса в крови донора. Напротив, в период сероконверсии вирусная нагрузка может быть очень высокой (до 1012 и выше), а антител может не быть вообще. В нашем исследовании был выявлен 1 донор, у которого не было обнаружено ни ^М-ан-тител ни ^О-антитсл к РУ В19, однако, концентрация ДНК РУ В19 была 2 х 109 копий/мл. Этот факт показывает, что выявить доноров, инфицированных РУ В19, в пе-

13

риод сероконверсии можно только с помощью методов для выявления ДНК вируса, а серологические методы для выявления антител в этот период неинформативны, поскольку антитела еще не выработались. Результаты наших исследований полностью совпадают с литературными данными о том, что в крови доноров с высокой вирусной нагрузкой или может не содержаться никаких антител к РУ В19 или содержатся только ^М - антитела к РУ В19, а также 1|*М/1£0-антитела одновременно, а в крови доноров с вирусной нагрузкой не более не более 104 копий/мл содержатся только - антитела.

По результатам нашей работы 0,8% крови, полученной от 1011 доноров ОПК ГНЦ следовало бы выбраковать вследствие наличия в ней высокой концентрации ДНК РУВ19.

Тестирование доноров Чеченской республиканской СПК с помощью мультиплексной системы для комплексного тестирования гепатитов В и С и пар-вовируса В19. В процессе работы мы протестировали образцы сывороток всех доноров чеченской СПК с помощью разработанной ранее мультиплексной системы для комплексного выявления гепатитов В, С и парвовируса В19. Образцы совороток доноров, положительные на любой из названных вирусов, проходили тестирование на соответствующие антитела. Результаты приведены в табл.2

Таблица2. Тестирование доноров Чеченской СПК на гепатиты В , Си PV В19.

Всего 510 образцов ДНК HBV не обнаружена ДНК HBV обнаружена антитела к HBV обнаружены РНК HCV не обнаружена PHKHCV обнаружена антитела к HCV обнаружены

ДНКРУВ19 не обнаружена 501 2 2 493 10 10

ДНК РУ В19 обнаружена 7 0 0 7 0 0

антитела к РУВ19 обнаружены 7 0 0 7 0 0

Из таблицы следует, что положительной корелляции между инфицированностью PV В19 и гепатитами у доноров Чеченской СПК нет.

Результаты анкетирования доноров Доноры Чеченской республиканской СПК. Результаты обработки донорских анкет не позволили проанализировать связь заболеваемости PV В19 с социальным

14

статусом доноров (образование, профессия, семейное положение и т.д.) ввиду малой выборки (510 анкет чеченских доноров всего и 7 из них положительных на наличие PV В19). Все доноры были безвозмездными, причем часть из них были кадровыми. Среди кадровых доноров не было найдено гепатитов В и С. Не было выявлено различия в частоте встречаемости PV В19 среди кадровых доноров и остальных безвозмездных доноров. Мы не нашли разницы в инфицировании ДНК PV В19 доноров в зависимости от пола.

Доноры ОПК ГНЦ. Подробного анкетирования московских доноров не проводилось. Из информации, имеющейся в нашей базе данных по донорам, можно было сделать лишь следующие выводы:

1.Частота встречаемости PV В19 у доноров ГНЦ составляет 2%.

2.Различий по заболеваемости PV В19 между мужчинами и женщинами нет.

3.Инфицированность доноров, возраст которых более 40 лет в 2 раза меньше, чем инфицированность доноров, возраст которых менее 40 лет.

Частота по встречаемости PV В19 среди доноров СПК почти в 2 раза больше, чем максимально высокая зарегистрированная частота встречаемости PV В19 в мире. Что касается России, то, например, в Нижнем Новгороде встречаемость PV В19 была зарегистрирована на уровне 1,0% , а на выборке чеченских доноров мы получили 1,3%. Такой результат заставил нас провести более подробный анализ донорских анкет с помощью институтской базы. Мы выяснили, что из 1011-ти московских доноров 145 доноров было из г.Балашиха, причем все они были первичными и платными. Все эти доноры являлись военными и служили в одном гарнизоне, и кроводача у всех проходила примерно в одно и то же время - во второй половине декабря 2008 г. Из 145-ти доноров из г.Балашиха 12 оказались вируспозитивными, причем IgM-антитела, сопровождающие острую фазу инфекции, оказались у 6-ти, а один донор, имевший самую высокую концентрацию вируса, был серонегативен. Таким образом, частота встречаемости PV В19 среди доноров из г.Балашиха составила 8%. Ясно, что в г.Балашиха в декабре 2008 была вспышка заболеваемости PV В19, что и отразилось на полученной нами частоте встречаемости.

Известно, что симптомы в начале заболевания PV В19 сходны с симптомами развития ОРВИ. Именно в этот период в крови регистрируется высокая концентрация вируса и IgM-антитела. На самой первой стадии антител еще может не быть, а концен-

15

трация вируса при этом превышать 107- 109 копий/мл (среди московских доноров найден один). Таким образом, некоторые из единовременных платных доноров, находясь на первой стадии заболевания и чувствуя недомогание, сдавали кровь. Среди кадровых и бесплатных доноров мы таковых не нашли.

Таким образом, кровь, непригодная для переливания по отношению к PV В19, была зарегистрирована среди единовременных платных доноров, что говорит о различной мотивации при сдаче крови у кадровых доноров, доноров, сдающих кровь для родственников и единовременных платных доноров.

Если исключить 145 балашихинских доноров общего числа исследуемых нами доноров ГНЦ при подсчете распространенности PV В19, то вируспозитивных доноров останется 8, причем, только один донор имеет одновременно IgM- и IgG - антитела, а все остальные - только IgG- антитела. Ниже приведены скорректированные рисунки, иллюстрирующие частоту встречаемости PV В19 у московских доноров (рис.6). Мы полагаем, что именно эти результаты правильнее отражают частоту встречаемости Р V В19 среди доноров ГНЦ.

Рисунок № 6. Частота встречаемости здоровых доноров и вируспозитивных по ДНК РУ В19 без учета доноров из г. Балашиха в различных концентрациях на ОПК ГНЦ. А - диапазон концентраций ДНК РУ В19 менее 104 копий/мл; Б - диапазон концентраций ДНК РУ В19 от 104 до 105 копий/мл.

Результаты проведенных нами исследований позволяют придти к заключению о том, что частота встречаемости РУ В19 у российских доноров находится в том же диапазоне, что и частота, измеренная в различных регионах мира. Данные совпадают с данными, полученными на другой российской СПК - Нижнегородской станции переливания крови.

Выявление ДНК PV В19 у стационарных и амбулаторных больных гематологического центра

В настоящей работе мы проводили оценку обнаружения инфицирования парво-вирусом В19 больных Гематологического научного центра в зависимости от основных демографических характеристик, таких как: пол, возраст, а также диагноза, длительности пребывания в стационаре и количества полученных трансфузий.

Были две причины направления образцов в лабораторию: обязательное при поступлении в ГНЦ тестирование на гепатиты В и С, и целевое исследование на наличие ДНК PV В19. В таблице 3 приведены данные о числе положительных результатов в образцах крови в двух группах больных в зависимости от причины направления.

Таблица 3. Результаты тестирования на наличие ДНК РУ В19 в зависимости от причины направления.

Причина направления образца Число и процент положительных

крови на анализ тестов

Тест на вирусы НВУ, НСУ 23 из 702 (3.2%)

Тест на РУВ19 46 из 308 (14.9%)

р<0.0001

Естественно, в образцах второй группы частота обнаружения ДНК вируса суще-

ственно повышена (14.9%) и не может служить оценкой истинной распространенности инфицирования, так как образцы направлялись для подтверждения косвенных клинических признаков инфицирования. Причина же направлений в первой группе не связана непосредственно с подозрением на наличие паровирусной инфекции, поэтому оценка распространенности, полученная на пациентах этой группы (3.2%), более объективна. Поэтому дальнейший анализ проводился только по первой группе.

Частота обнаружения РУ В19 не зависит от пола и несколько снижается с возрастом с 4.4% в группе моложе 40 лет до 2.1% в группе старше 40 (табл. 4).

Таблица 4. Частота обнаружения ДНК РУ В19 в зависимости от демографических характеристик.____

Характеристика Значения Число и процент Значимость

положительных тестов (Рх2)

Пол мужской 12 из 378 (3.2%)

женский 11 из 324(3.4%) 0.87

Возраст < 40 лет 16 из 361 (4.4%)

>= 40 лет 7 из 328(2.1%) 0.094

Эти данные находятся в хорошем соответствии с результатами других исследователей.

Частота обнаружения РУ В19 у больных во всех отделениях ГНЦ, кроме отделения трансплантации костного мозга, составляет примерно 3%, что в 3 раза выше, чем частота встречаемости РУ В19 у доноров. В отделении трансплантации костного мозга она существенно выше - 8%, что естественно связано с профилем отделения и определяется диагнозом больных, госпитализируемых в отделение. Если сравнивать распространенность в группах по диагнозу, то самый высокий процент инфицированное™ РУ В19 - 7% -был в подгруппе больных с острым лейкозом (табл. 5). Нам не удалось встретить в литературе работ, посвященных исследованию частоты инфицирования парвовирусом В19 взрослых больных острым лейкозом, однако, опубликованы исследования инфицированности РУ В19 при острых лейкозах у детей, где оценки распространенности несильно отличаются от полученных нами.

Таблица №5. Частота обнаружения ДНК РУ В19 в зависимости от диагноза._

Диагностическая группа Число и процент положительных

_тестов_

Острый лейкоз 7 из 94 (7.5%)

Миелопролиферативные заболевания 1 из 33 (3.0%)

Лимфопролиферативные заболевания 2 из 69 (2.9%)

Анемия, аплазия 3 из 67 (4.5%)

Другое_4 из 92 (4.5%)_

р=0.10

Таблица №6. Частота обнаружения ДНК РУ В19 в зависимости от клинических факторов._

Фактор

Без фактора Число больных с положительными маркерами/из (%)

При наличии фактора Число больных с положительными

Относительный Риск

ОД (95%С1) р

Несколько

госпитализаций 12/210 (5.7%) 11/492 (2.2%) 2.7(1.2- 6.1) 0.018

Длительность

госпитализации более 2 месяцев 11/194(5.7%) 12/508 (2.4%) 2.5 (1.1- 5.7) 0.028

Наличие

трансфузий 6/102(5.9%) 17/583(2.8%) 2.1 (0.8 - 5.6) 0.11

В таблице 6 приведены данные по зависимости частоты обнаружения РУ В19 в зависимости от клинических факторов, характеризующих длительность пребывания в стационаре и наличия трансфузионной терапии. Хотя есть разница во встречаемости

ДНК PV В19 у больных, получавших и не получавших трансфузии в период пребывания в стационаре, формально она статистически не значима. Что касается длительности пребывания больных в стационаре, то ДНК PV В19 была обнаружена у чуть более 2 % у пациентов, находящихся в клинике менее 60 дней, и около 6 % у пациентов, госпитализация которых длилась более, 60 дней. Такое же примерно соотношение выявлено между больными, однократно госпитализированными и прошедшими госпитализацию в ГНЦ многократно. Таким образом, можно считать установленным, что распространенность PV В19 у тяжелых больных в 2-3 раза выше.

Из полученных в работе данных видно, то что частота обнаружения парвовируса В19 очевидно коррелирует с клиническими факторами, характеризующими тяжесть заболевания - это диагноз, длительность и кратность госпитализаций. Хотя данных для уверенных выводов недостаточно, можно предположить что, трансфузионный путь передачи менее вероятен, чем воздушно-капельный путь. Но тот факт, что распространенность PV В19 в донорской популяций при отсутствии тестирования компонентов составляет около 1%, с очевидностью свидетельствует, что этот путь инфицирования существует, и для реципиентов множественных трансфузий он существенен. Очевидно, что больной, получивший в гематологическом стационаре трансфузии компонентов крови, инфицированные PV В19, становится потенциальным источником инфекции для остальных пациентов. Можно предположить, что пациенты с PV В19 имеют тяжелые осложнения, и их пребывание в больнице продолжается существенно дольше, чем у других пациентов. Но однозначно установить причинно-следственную связь между длительность пребывания в стационаре и инфицированностью В19 имеющиеся данные не позволяют, так как нельзя исключить внутрибольничное инфицирование пациентов, долгое время находящихся в клинике.

То, что распространенность PV В19 среди гематологических больных выше, чем среди доноров очевидно и неудивительно. Симптомы, вызванные парвовирусной инфекцией, могут являться причиной поступления больного в гематологическое отделение. Контакт между собой пациентов, находящихся в отделении, множественные трансфузии также являются причиной увеличения распространенности PV В19 в гематологическом стационаре.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Парвовирус В19 передается в основном воздушно-капельным путем. Однако, существует вероятность передачи вируса с помощью трансфузий. По нашим данным в декабре 2008 г. 0,8 % из 1011 доноров обследованных на наличие РУ В19, имели в крови вирус с концентрацией, потенциально опасной для инфицирования при трансфузии. Учитывая повышенную распространенность РУ В19 среди гематологических больных и серьезные осложнения, вызываемые у них этим вирусом, мы полагаем, что компоненты крови, предназначенные для трансфузий этим больным, должны проходить тестирование на РУ В19. Кроме того, необходимо систематически проводить мониторинг на РУ В19 у больных, находящихся в состоянии иммуносупрессии, чтобы своевременно выявлять инфицирование парвовирусом и назначать лечение во избежание осложнений для больного и дальнейшего распространения вируса в отделении. Отметим, что во многих странах все компоненты, запасаемые банками крови, тестируются на РУВ19.

выводы

1. Разработана и верифицирована тест-система для количественного выявления PV В19 методом ПЦР в режиме реального времени. Протестировано 2500 образцов сывороток на наличие вируса у доноров и больных.

2. Показано, что у доноров, положительных на ДНК PV В19 и имеющих концентрацию вируса менее 104 копий/мл, обнаруживаются только IgG- антитела к PV В19; при концентрации вируса более 104 копий/мл — либо одновременно IgG и IgM, либо IgM. При высокой концентрации вируса антитела могут отсутствовать (серонегативное окно).

3. Установлено, что частота обнаружения ДНК PV В19 в крови доноров ОПК ГНЦ (1,0%) и в крови доноров Чеченской СПК (1,3%) соответствуют частоте в других Европейских и Азиатских странах.

4. Впервые обнаружено локальное повышение уровня инфицированности PV В19 (8%, декабрь 2008г., г.Балашиха, Россия), что необходимо учитывать при анализе популяционных данных, а также при планировании выездной деятельности службы крови.

5. Доказано, что чаще всего PV В19 обнаруживается у больных острыми лейкозами. Тестирование препаратов крови, переливаемых этим больным, а также мониторинг PV В19 в процессе лечения необходимы для предотвращения тяжелых осложнений, вызываемых этим вирусом.

6. Инфицированность PV В19 возрастает у больных, длительное время находящихся в стационаре, и не зависит от интенсивности трансфузий. Инфицированность PV В19 у доноров и больных не коррелирует с инфицированостью гепатитами В и С.

Список публикаций по теме диссертации

1. М.А. Элижбаева. И.С. Февралева, O.A. Глинщикова, О.Ю. Сильвейстрова, О.Ю. Шипулина, Э.А. Домонова, А.П. Сафонова, E.H. Овчинникова, З.М. Татаева, А.Б. Судариков.// Выявление парвовируса В19 в крови российских доноров.// Гематология и трансфузиология. 2011, т.56, №2, стр.10-13.

2. М.А. Элижбаева. И.С. Февралева, O.E. Ягужинская, O.A. Глинщикова, Е.Н.Овчинникова, М.И.Лазаренко, А.Б.Судариков.// Распространенность парвовируса В19 среди доноров московского региона.// Российская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Санкт-Петербург. Трансфузиология. Июль 18-19, 2009, т.Ю, №1-2, стр.73.

3. И.С. Февралева, O.A. Глинщикова, М.А. Элижбаева. Б.В. Зингерман, Ю.Ю. Гудилина, Т.Ц. Гармаева, С.М. Куликов, А.Б.Судариков, В.Г Савченко.// Распространенность PV В19 среди больных гематологического стационара.// Гематология и трансфузиология. 2011, т.56, №6.

4. О.Ю. Сильвейстрова, М.А. Элижбаева. О.Ю. Шипулина, И.С. Февралева, А.П. Сафонова, O.A. Глинщикова, Г.А. Шипулин, А.Б Судариков.// Исследование плазмы донорской крови на наличие ДНК Parvovirus В19.// VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». Москва. Сборник трудов. Ноябрь 24-26, 2010, т. 1, стр.347350.

5. E.G. Khamaganova, М.А. Elizhbaeva. M.V. Suchkova, A.B. Sudarikov.// Non-HLA Polymorphisms.// Tissue antigens.Abstracts for the 25,h European immunogenetics and Histocompatibility Conference Prague, Czech Republic. May 4-7, Tissue antigens. 2011, 77, №5, p.425-426.

6. Е.Г. Хамаганова, M.B. Сучкова, М.А. Элижбаева. А.Б. Судариков.// Гены KIR -иммуноглобулинподобных рецепторов естественных киллерных клеток в двух популяциях Российской Федерации.// Иммунология. 2011, т.32, №5, стр.245-248.

Используемые в автореферате сокращения Анти-НСУ - антитела к вирусу гепатита С ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ОЛ - острый лейкоз ОПК - отделение переливания крови п.н. - пара нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота СПК - станция переливания крови ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота (МТР - дезоксинуклеозидтрифосфат НЬзА§ - поверхностный антиген вируса гепатита В НВУ -вирус гепатита В НСУ - вирус гепатита С

- иммуноглобулины класса в ^М - иммуноглобулины класса М Р V В19 - парвовирус В19

Подписано в печать 01.09.2011 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru