Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИММУНОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИММУННЫЙ СТАТУС И ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МЫШЕЙ

003473100

На правах рукописи

Артамонов Сергей Александрович

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИММУНОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИММУННЫЙ СТАТУС И ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МЫШЕЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о ш:-] 2353

003473100

На правах рукописи

Артамонов Сергей Александрович

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИММУНОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИММУННЫЙ СТАТУС И ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МЫШЕЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в НИИ иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Колесников Олег Леонидович доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович доктор медицинских наук, профессор Ларионов Леонид Петрович

Ведущая организация:

Институт физиологии и иммунологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится «_»_2009 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Автореферат разослан «_»_2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время в клинической практике широко применяются различные иммуномодулирующие препараты, и их количество быстро растет. Ежегодно только в России успешно проходят государственные испытания 2030 новых иммунобиологических препаратов (Хаитов P.M., 2002). Влияние же на другие системы органов рассматривается, в первую очередь, только с точки зрения побочных эффектов.

Также известно то, что на рубеже двух столетий зародилась новая интегральная медико-биологическая дисциплина — нейроиммунология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной (Гриневич В.В., 2004).

Несмотря на то, что в онтогенезе клетки иммунной и нервной системы происходят из разных зародышевых листков (из эктодермы и мезодермы соответственно), функционально обе системы удивительно схожи.

При анализе сходства в организации нервной и иммунной систем привлекает внимание тот факт, что обе системы состоят из большого числа фено-типически различающихся клеток, организованных в сложные сети. В пределах такой сети клетки взаимосвязаны и функционируют по принципу обратной связи, когда пусковым сигналом служит адекватный раздражитель, а конечный ответ направлен на обеспечение полезного результата. Различие заключается в том, что в нервной системе клетки жестко фиксированы в пространстве, тогда как в иммунной они непрерывно перемещаются, и лишь кратковременно взаимодействуют друг с другом (Полетаев А.Б. и др., 2002; Корнева Е.А., 2003).

Феноменологически эти системы призваны обеспечивать безопасность контактов самого широкого плана между организмом и средой. Обе системы имеют диффузное строение, вследствие чего их элементы присутствуют практически во всех органах и тканях. И та и другая системы эволюционно адаптированы на способность оперативного восприятия поступающей из среды информации, ее переработку (интеграцию), хранение и воспроизведение (Danao Е.С., 1989). Обе системы обучаются и накапливают индивидуальный, не передающийся по наследству <окизненный опыт» с целью обеспечить более быструю и более адекватную адагггивно-гомеостатическую реакцию организма на повторение ранее встречавшейся ситуации (Ковалев И.Е., 1989, 1991). При этом между двумя системами прослеживается выраженная дифференцирован-ность по модальности воспринимаемых стимулов: нервная система специализируется на восприятии и обработке информации, поступающей в основном в виде стимулов физической природы, а иммунная система на восприятии и обработке информации, поступающей в виде химических стимулов (Ferenchk М„ 1997).

Учитывая тесную близость указанных систем, можно предположить, что иммунотропные препараты могут оказывать воздействие и на нервную систему.

Подобные эффекты могут быть важны при клиническом использовании веществ. Так Романенко Р.Н. и др. (2008), проводя анализ динамики психического состояния больных шизофренией с различными вариантами дефици-тарной симптоматики при назначении комбинаций иммунотропного средства с типичным и атипичным антипсихотиками, указывает, что циклоферон снижает астенизирующее действие антипсихотиков, что в конкретной клинической ситуации может играть как положительную, так и отрицательную роль, в зависимости от имеющегося варианта дефицитарных расстройств. André В. Reiriz (2006) выявил ухудшение памяти и когнитивных способностей у мышей при использовании циклофосфана.

Многие моменты остаются мало изучены. Это послужило одной из причин данного исследования.

Для оценки влияния иммунотропных препаратов на поведение и иммунную систему были использованы три препарата, различающиеся по механизмам действия: иммуномодулятор - бестим, иммуностимулятор - пиро-генал и иммунодепрессант - циклофосфан.

Цель работы

Изучить влияние иммунотропных препаратов бестима, пирогенала и циклофосфана на состояние органов иммунопоэза, периферическую кровь, а также поведенческую активность лабораторных животных.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на органы иммунопоэза и факторы неспецифической защиты мышей.

2. Изучить влияние иммунотропных препаратов на органы иммунопоэза и факторы неспецифической защиты и оценить клеточный иммунитет у мышей на фоне развития иммунного ответа на эритроциты барана.

3. Оценить влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на поведение, тревожность и уровень депрессии мышей

4. Оценить влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на поведение, тревожность и уровень депрессии мышей на фоне развития иммунного ответа на эритроциты барана.

Научная новизна

Впервые проведено исследование влияния бестима на поведение мышей. Выяснено, что бестим обладает способностью сохранять базовый уровень ориентировочно-исследовательской активности у мышей. Препарат снижает тревожность у животных, а на фоне введения в организм антигена он обладает кроме этого еще и антидепрессивным действием.

Проведено комплексное исследование влияния циклофосфана на иммунную и нервную систему здоровых мышей. Циклофосфан оказывает депрессивное действие на ориентировочно-исследовательское поведение мышей, не оказывая при этом влияния на уровень депрессии и тревожности.

Проведено комплексное исследование влияния пирогенала на иммунную систему и поведение мышей. Препарат не оказывает влияния на ориентировочно-исследовательское поведение животных, снижая их тревожность. На фоне иммунизации увеличивает исследовательскую активность животных без влияния на уровень тревожности. Пирогенал не оказывает антидепрессивного действия.

Практическая значимость исследования:

Хотя работа по своему существу носит фундаментальную направленность, проведенные исследования и полученные данные о влиянии препаратов на нервную систему, уточняют их эффекты и могут быть использованы при разработке практических рекомендаций по использованию препаратов в клинической практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Бесгим оказывает стимулирующее действие не только на иммунную, но и на нервную систему. Препарат способствует сохранению базовой ориентировочно-исследовательской активности мышей при повторных исследованиях.

2. Бестим на фоне развития иммунного ответа оказывает антидепрессивное действие у мышей.

3. Циклофосфан оказывает угнетающее действие на нервную систему. Препарат снижает ориентировочно-исследовательскую активность мышей, как при однократном введении, так и на фоне антигенной стимуляции.

4. Циклофосфан не оказывает влияния на уровень депрессии и тревожности у мышей.

5. Пирогенал снижает горизонтальную активность у здоровых мышей, а также снижает уровень тревожности.

6. На фоне иммунизации, пирогенал увеличивает исследовательскую активность у животных, не оказывая влияния на тревожность и уровень депрессии.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследований внедрены в работу НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА, учебный процесс кафедры фармакологии ГОУ ВПО ЧелГМА.

Апробация работы

Основные положения работы доложены: на 4-м съезде иммунологов Урала (Уфа, 2005), на 5-м съезде иммунологов Урала (Оренбург, 2006), на 3-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2005), на 10-м всероссийском научном форуме «Дни иммунологи в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на 4-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2006), на 5-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2007), на 8-м конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007г.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы. Текст изложен на 143 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 23 таблицами, 15 рисунками. Указатель литературы содержит 213 источников, из них 85 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для экспериментов было использовано 412 беспородных мышей, выращенных в виварии ЧелГМА. Животные содержались в теплом, сухом помещении в клетках по 10-15 штук, температура воздуха была комфортной, смена освещенности — естественная, питание сбалансированное, питье обильное согласно приказу МЗ РФ от 13.11.1977 №742. Умерщвление животных и болезненные процедуры проводились под эфирным наркозом. (Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, 1985).

В работе использовались следующие методики: Иммунологические методы

Оценка гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Для оценки гиперчувствительности замедленного типа проводили иммунизацию мышей эритроцитами барана, в дозе 108/20 г веса животного. В день иммунизации эритроцитарная взвесь трижды центрифугировалась на центрифуге ОПН-3 с 1500 оборотов в минуту, с целью удаления гемолизированных эритроцитов. Далее эритроцитарная взвесь разводилась в физиологическом растворе и вводилась животным внутрибрюшинно. Разрешающая доза эритроцитов барана вводилась под апоневроз задней лапы через 72 часа после иммунизации. В контрольную лапу вводился физиологический раствор в равном объеме. Стопы отделялись по голеностопному суставу и взвешивались на торсионных весах. Реакция оценивалась через 24 часа по коэффициенту интенсивности, рассчитанному по формуле:

,, Вес опытной лапы - Вес контрольной лапы

К=--- 100%.

Бесконтрольной

(Волчегорский И.А. и др., 2000, Хабриев Р.У., 2005) Определение веса селезенки и тимуса и количества ядросодержащих клеток в этих органах.

Выделенные тимус и селезенка взвешивались на торсионных весах. Тимус и селезенка размельчались в стеклянном гомогенизаторе, и далее полученную взвесь клеток разводили следующим образом: селезенка в 5 мл физиологического раствора, а тимус в 3 мл. Для подсчета общего количества ядросодержащих клеток (ЯСК) в этих органах в сухую пробирку наливали 0,4 мл 3-5% раствора уксусной кислоты, вносили 0,02 мл взвеси из пробирки,

содержащей размельченный орган, тщательно перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчитывали ядросодержащие клетки в 100 больших квадратах, затем, учитывая разведение, проводили пересчет количества клеток (Волчегорский И.А. и др., 2000).

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови.

Изучение способности нейтрофилов к захвату частиц проводили на модели поглощения частиц латекса. Для оценки фагоцитарной функции 50 мкл периферической крови смешивали с 50 мкл взвеси частиц полистирольного латекса в концентрации частиц 108/мл. После 30 минут инкубации при температуре 37°С готовили мазок, который высушивали, фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза. С помощью иммерсионной микроскопии оценивали активность фагоцитоза - процент нейтрофилов, захвативших хотя бы одну частицу латекса и интенсивность фагоцитоза - число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах. Определяли также фагоцитарное число-количество частиц латекса поглощенных одним фагоцитом (Методы изучения фагоцитирующих клеток..., 1986).

Также определяли активность и интенсивность фагоцитоза в расчете на литр крови (Волчегорский И.А. и др., 2000).

Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови с помощью НСТ-теста.

Постановку метода осуществляли следующим образом: в пробирки с 0,05 мл взвеси клеток добавляли 0,05 мл 0,2% раствора НСТ и 0,05 мл физиологического раствора. После 30-минутной инкубации при температуре 37°С делали мазки. После сушки препараты фиксировали и окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. Учет реакции производили с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении 90x10x1,5 (Маянский А.Н., 1979). Параллельно с помощью НСТ - теста определяли способность нейтрофилов крови отвечать повышением метаболической активности на стимуляцию частицами латекса. Для этого в пробирку с исследуемым материалом (50 мкл) и НСТ (50 мкл) добавляли 50 мкл монодисперсного полистирольного латекса с диаметром частиц 1,7 мкм в концентрации 1х108 частиц/мл. Для индуцированного теста также определяли активность и интенсивность по вышеуказанным формулам.

Кроме того, рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов (ФРН), который определялся как соотношение между коэффициентами активности и интенсивности реакции НСТ - индуцированного и НСТ - спонтанного тестов.

Подсчет количества лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарной формулы.

Для подсчета общего количества лейкоцитов крови в сухую пробирку наливали 0,4 мл 3-5% раствора уксусной кислоты, вносили 0,02 мл крови, тщательно перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчитывали лейкоциты в 100 больших квадратах, затем, учитывая разведение, проводили пересчет количества клеток на литр (Медицинские и лабораторные ..., 1998).

Для подсчета процентного соотношения различных видов лейкоцитов микроскопировали сухие фиксированные и окрашенные по Романовскому-Гимза мазки с выделением следующих форм лейкоцитов: нейтрофилы, лимфоциты и прочие клетки. Просчитывали 100 лейкоцитов, затем определяли процентное соотношение дифференцированных клеток (Медицинские и лабораторные ..., 1998). Этологические методы Тест «Открытое поле»

Для исследования ориентировочно-исследовательского поведения применялся актограф, конструкция которого описана в работе Weischer M.L. (1976). Опыты проводились в отдельной комнате с хорошей звукоизоляцией, при постоянном уровне освещения "открытого поля" и комфортной температуре воздуха (порядка 20° С). Время работы с 10-00 до 15-00. Мыши помещались в "открытое поле" и извлекались из него только руками.

Животное помещалось в актограф, после этого начинали регистрировать число выглядываний через отверстия, горизонтальную и вертикальную активность. Горизонтальная активность фиксировалась путем подсчета количества пересечения границ секторов. Вертикальная активность включала в себя подсчет количества стоек животных с упором, когда мышь опиралась на стенку, и количества стоек без упора, когда мышь не опиралась на стенку. Подсчитывали также количество актов груминга (т.е. самовылизывания и почёсывания), направленных на поддержание поверхности тела в чистом и не повреждённом состоянии. Наблюдение за животными в "открытом поле" велось в течение 5 минут, после этого подсчитывалось количество фекальных болюсов. По завершении исследования каждой мыши, стенки и дно акгогра-фа протирались влажной ветошью.

Горизонтальная и вертикальная активность свидетельствуют об ориентировочной активности, груминг о тревожности животного (Celis Е.М., 1993), а выглядывания в отверстия об исследовательской активности (Калуев A.B., 1998,ШовенР., 1982). Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»

Для изучения тревожности животного использовался тест «Приподнятый крестообразный лабиринт». Данный тест является одним из наиболее общепринятых тестов для оценки тревожного состояния особей (Pellow S., File S. Е., 1986; Lister R.G., 1987). За 5 мин до тестирования клетку с мышью приносили в затемненную комнату и тестировали поведение особи в течение 5 минут в лабиринте. Для этого животное помещали в центр лабиринта носом в закрытый рукав и регистрировали параметры: время нахождения в открытых рукавах, в центре и закрытых рукавах лабиринта (данные представлены в процентном соотношении времени нахождения в каждой части лабиринта к общему времени тестирования). Число выходов в открытые рукава, в центр и закрытые рукава выражалось, как и время, в процентном соотношении. Также учитывали число заглядываний под лабиринт. После тестирования каждой особи лабиринт тщательно промывали и высушивали.

Интерпретация методики следующая: время нахождения в закрытых частях лабиринта отражает уровень тревожности; увеличение количества выходов в открытые рукава лабиринта и центр, а также время нахождения в открытых частях лабиринта, свидетельствует о снижении тревожности животного. Заглядывание под лабиринт отражает степень исследовательской реакции животного (Калуев А.В., 1998; Van Erp А.М.М., 1994). Тест «подвешивания за хвост»

Тест «подвешивание за хвост» (tail suspension test) является популярной экспериментальной моделью депрессии. Он основан на наблюдении, что мыши, при их подвешивании за хвост, будут демонстрировать определенный период иммобильности, по латентности которого можно судить об уровне их депрессивности. Различные препараты приводят к изменениям длительности иммобильности животных (Stem L., 1985). Мышь подвешивалась за хвост. Тестирование проходило в течение 6 минут. В течение этого времени фиксировалось общее время неподвижности животного. Чем это время выше, тем выше считалась депрессия животного (Калуев А.В., 2002). Используемые препараты, дозы и схемы введения.

Во всех сериях экспериментов контрольные группы животных получали физиологический раствор в эквиобъемном количестве.

Пирогенал. Для опытов использовался пирогенал производства НИИ-ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи/Медгамал, Россия. Препарат вводился в дозе 13,5 мкг/кг веса внутримышечно с интервалом 24 часа, трехкратно. Доза препарата рассчитана согласно методике перерасчета равноэффективных доз с дозировки препарата, используемой для крыс (Волчегорский И.А. и др., 2000). Перед введением препарат разводился в стерильном физиологическом растворе.

Циклофосфан (Cyclophosphamide). Для опытов использовался цикло-фосфан производства «Биохимик» (г. Саранск, Россия). Использовалась следующая доза и схема введения препарата: 250 мг/кг веса животного, внутри-брюшинно, однократно (Мясная Н.В. и др., 2003). Перед введением препарат разводился в стерильном физиологическом растворе.

Бестим. Для опытов использовался бестим, полученный из ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург. Препарат вводился в дозе 1 мкг/кг веса животного внутрибрюшинно, через 24 часа, пятикратно (Петров А.В., 2004). Перед введением препарат разводился в стерильном физиологическом растворе.

1 2 3 4

1 I И

N

0 1 2 3 4 5 6 7 S Время, дни

Рисунок 1. Общая схема экспериментов

1 - первое изучение поведения в «открытом поле» или тревожности в «приподнятом крестообразном лабиринте» и начало введения препарата;

2 - второе изучение поведения или тревожности и иммунизация животных через 72 часа после окончания введения препарата (96 часов для циклофос-фана). Вывод из эксперимента части мышей и оценка у них функционального состояния нейтрофилов и органов иммунопоэза.

3 - введение разрешающей дозы эритроцитов барана

4 - третье изучение поведения или тревожности, проведение теста «подвешивания за хвост», оценка ГЗТ, функционального состояния нейтрофилов и органов иммунопоэза.

Статистические методы. Результаты исследований обрабатывались с использованием пакета прикладных статистических программ '^аЙБЙса 6.0" (Боровиков В., 2001). Статистическая обработка результатов исследований проводилась с определением средней арифметической вариационного ряда (М), среднеквадратичного отклонения (о). Достоверность отличия показателей между контрольной и опытной группами оценивалась по критерию Ман-на-Уитни (Ми) и критерию серий Вальда-Вольфовица (\У\У). Для связанных переменных применяли парный критерий Вилкоксона (УК). Оценка связи между изучаемыми показателями проводилась с использованием непараметрической методики оценки корреляции Кандела (Кк) и Спирмена (К5). Для разделения животных на группы по уровням ориентировочно-исследовательского поведения использовался кластерный анализ. Различия считали значимыми при р<0,05. Представленные цифровые данные в подавляющем большинстве были округлены до второго десятичного знака (Гланц С., 1998).

Результаты исследования

Пятикратная инъекция бестима не изменяла вес селезенки у животных. При этом наблюдалось увеличение количества ЯСК селезенки в расчете на массу тела животного на 14% по сравнению с контрольной группой животных. Вес тимуса, а также количество клеток в нем и не изменялись. В периферической крови было отмечено ярко выраженное увеличение количества моноцитов (в 2,2 раза), а также палочкоядерных нейтрофилов на 15% (таблица 1).

Влияние бестима на функциональное состояние нейтрофилов периферической крови здоровых мышей было не ярко выражено. Отмечалась тенденция к росту активности и интенсивности спонтанного НСТ теста у опытных мышей. Известно, что нейтрофилы животных, получавших бестим, активируются (Зурочка В.А., 2006). Вероятно в связи с частичной активацией нейтрофилов у мышей, получавших препарат, несколько снижен функциональный резерв.

Бестим - иммуномодулятор и наибольший эффект проявляет при измененном состоянии иммунной системы. Таким образом, небольшое количество изменений в параметрах иммунной системы, скорее всего, связано с тем, что препарат применялся на здоровых животных.

Таблица 1

Влияние бестима на органы иммунопоэза, периферическую кровь и функциональное состояние нейтрофилов здоровых мышей. (М±ст) _

Контроль (N=28) Бестим (N=29) Р(2-3)

1 2 3 4

Вес селезенки (мг) 113,24±38,66 107,83±36,22 Н.д.

ЯСК селезенки/массу тела (млн./г) 6,34±2,54 7,20±2,30 Р=0,021 (MU)

Вес тимуса (мг) 17,31± 14,03 15,45±8,55 Н.д.

ЯСК тимуса/массу тела (млн./г) 0,93±0,53 1,00±0,59 Н.д.

Лейкоциты крови (10у/л) 5,96±1,85 6,01±2,52 Н.д.

Палочкоядерные нейтрофилы (%) 5,46±2,56 5,71±2,97 Н.д.

Палочкоядерные нейтрофилы (10у/л) 0,33±0,21 0,38±0,31 P=0,015(WW)

Моноциты (%) 1,39±1,47 2,96±2,82 P=0,028(MU)

Моноциты (10у/л) 0,075±0,078 0,19*0,26 P=0,049(MU)

Активность HCT спонтанного (%) 32,81±7,17 35,39±7,06 Н.д.

Интенсивность HCT спонтанного (у.е.) 0,37±0,09 0,43±0,11 Н.д.

Функциональный резерв нейтрофилов (акг),(%) 138,73±50,22 132,18±32,21 Р=0,041 (WW)

Н.д. - недостоверно (Р > 0,05) для таблиц 1-5

На фоне иммунизации под действием бестима масса тимуса и селезенки, а также абсолютное количество клеток в этих органах не претерпели существенных изменений. В тоже время возросло на 20% количество ЯСК клеток в тимусе в расчете на мг веса органа, что позволяет говорить об увеличении плотности клеток в тимусе. Известно, что предшественники Т-лимфоцитов имеют размеры больше чем зрелые клетки (Абрамов М.Г., 1979). Следовательно, повышение плотности клеток косвенно свидетельствует об увеличении доли зрелых Т-лимфоцитов среди ЯСК тимуса. В периферической крови только увеличивалось процентное содержание палочкоядер-ных нейтрофилов на 30%. Интенсивность реакции ГЗТ у мышей получавших бестим не изменялся.

Активность и интенсивность фагоцитоза, а также фагоцитарное число при использовании бестима на фоне иммунизации не изменилась. Активность и интенсивность спонтанного НСТ теста и в опытной и в контрольной группе была одинаковой, с небольшой тенденцией к увеличению активности НСТ теста у животных, получавших препарат (таблица 2).

В целом можно сказать, что препарат не оказывает значительного влияние на параметры иммунной системы здоровых животных. Это подтвер-вдает иммуномодулирующий характер действия бестима.

Таблица 2

Влияние бестима на состояние органов иммунопоэза и функциональное состояние нейтрофилов на фоне иммунного ответа на эритроциты барана у здоровых мышей.

Контроль (N=29) Бестим (N=28) Р(2-3)

1 3 4

Вес тимуса (мг) 17,71±8,39 17,97±8,48 Н.д.

ЯСК тимуса (млн.) 20,65±9,09 23,17±8,59 Н.д.

ЯСК тимуса/массу тимуса (млн./мг) 1,2б±0,44 1,52±0,69 P=0,023(WW)

Активность HCT спонтанного (%) 34,21±5,60 34,86±4,37 Н.д.

Интенсивность HCT спонтанного (у.е.) 0,37±0,08 0,39±0,06 Н.д.

Активность HCT индуцирозанного (%) 40,24±4,01 40,07±4,42 P=0,045(WW)

Интенсивность HCT индуцированного (У-е.) 0,48±0,08 0,46±0,05 Н.д.

При приеме бестима и в опытной и в контрольной группе при повторном исследовании обнаружилось снижение горизонтальной активности на 26 и на 40 % соответственно. При этом в опытной группе уровень горизонтальной активности был достоверно выше чем в контрольной группе на 40%. Это говорит о то, что беетим способствует сохранению ориентировочной активности мышей при повторном исследовании. Вертикальная активность в опытной группе также была выше: у животных, принимавших бестим, в 1,5 раза выше количество стоек с упором. Кроме того, в контрольной группе наблюдалось снижение количества выглядываний в два раза. В группе, получавших бестим, количество выглядываний сохранялось на прежнем уровне и было достоверно выше, чем в контрольной группе в 3 раза (рисунок 2). Препарат, таким образом, способствует сохранению исследовательской активности у мышей.

В опытной группе наблюдалось снижение количества актов груминга на 32%, а так как увеличение актов груминга трактуется как повышение тревожности (Калуев A.B., 1998, Буреш Я, 1983), то препарат снижает тревожность.

Таким образом, препарат способствует сохранению ориентировочно-исследовательской активности, а также снижает уровень тревожности мышей.

Гор. Актив.

Стойки

В,пкщьвания

□ Котрогь(1) В Бестим (1)

■ Контрап>(2)

а Бестим (2)

О-Достоверная разница между 1 и 2 исследованием, -к - достоверная разница между контролем и опытом.

Рисунок 2. Влияние бестима на поведение мышей в тесте «Открытое поле». (Контроль (1) и Бестим (1) -первоначальное исследование поведения, Контроль (2) и бестим (2) -повторное, через 72 часа после окончания введения препарата).

Исследование влияние бестима на «поведения отчаяния» в тесте «подвешивания за хвост» не выявило достоверных отличий между опытной и контрольной группами. Это свидетельствует о том, что препарат не оказывает антидепрессивного действия.

В «приподнятом крестообразном лабиринте» в контрольной группе наблюдалось уменьшение количества входов в закрытые рукава и центр лабиринта в 2 раза. Бестим же, оказывая сохраняющее действие на ориентировочную активность, сохранял эти показатели на прежнем уровне. Принято считать, что увеличение времени нахождения в открытых рукавах лабиринта и центре лабиринта, а также увеличение количества выходов в центр и открытые рукава указывают на снижение тревожности (Van Erp А.М.М., 1994). Количество выходов в центр в опытной группе по сравнению с контрольной больше в 1,58 раза, в открытый рукав в 2 раза, время нахождения в центре в 1,5 раза, в открытом рукаве в 2 раза. Это указывает на снижение уровня тревожности. Кроме того, в группе животных, получавших бестим, количество заглядываний под лабиринт на 12% больше, чем в контрольной группе, что свидетельствует об увеличении исследовательской активности (Lister R.G., 1987). Таким образом, бестим снижает тревожность у животных.

Иммунизация наложила отпечаток на эффекты бестима в отношении поведения животных. В параметрах поведения в тесте «Открытое поле» исчезли различия. В опытной группе на фоне иммунного ответа в тесте «подвешивания за хвост» обнаружено снижение на 53 секунды время неподвижности животных. Таким образом, бестим обладает антддепрессивным действием. В «приподнятом крестообразном лабиринте» на фоне развития иммунного ответа животные контрольной группы не выходили в открытый рукав лабиринта, в отличие от животных, принимавших бестим. Процент выходов в центр был в контрольной группе в два раза меньше, чем в опытной группе. Таким образом, хотя на фоне иммунного ответа влияние бестима на тревожность не такое сильное, но эффект препарата сохраняется.

Стимулирующее действие бестима на поведение может быть связано как с его способностью стимулировать синтез ИЛ-2 (Пигарева Н.В., 2000) и выработку ИЛ-10 (Зурочка В.А., 2006), которые оказывают активирующее воздействие на нервную систему. По данным Зурочки В.А., (2006) бестим стимулирует фагоцитарные клетки, в том числе и нейтрофилы. Мы полагаем что, эффект действия препарата может быть также опосредован через продукты секреции нейтрофилов. Так А5 фракция, выделенная из секреторных продуктов активированных нейтрофилов, оказывает пролонгированное (до

10 суток) стимулирующее действие на психомоторную активность мышей (Зурочка А.В. и др., 1991).

Циклофосфан оказывал выраженное депрессивное действие на селезенку, тимус и периферическую кровь. Препарат снижал вес тимуса в 2,2 раза, вес селезенки в 2,5 раза. Количество ЯСК в тимусе уменьшилось в 5 раз, в селезенке же количество ЯСК уменьшилось также в 5 раз по сравнению с контрольной группой (таблица 3).

В периферической крови произошло достоверное снижение абсолютного содержания всех типов лейкоцитов. При этом относительное содержание нейтрофилов и лимфоцитов не претерпело значительных изменений. Количество моноцитов же снизилось в 2 раза.

Таблица 3

Влияние циклофосфана на органы иммунопоэза и периферическую кровь здоровых мышей (М±ст).___i__

Контроль (N=30) Циклофосфан (N=29) Р(2-3)

1 2 3 4

Вес селезенки (мг) 87,43±25,38 28,03±7,79 P=0,001(MU)

ЯСК селезенки (млн.) 202,13±56,80 41,38±1б,62 P=0,001(MU)

ЯСК селезенки/массу тела (млн./г) 8Д4±2,42 1,82±0,68 P=0,001(MU)

Вес тимуса (мг) 27,40±10,42 12,05±3,86 P=0,001(MU)

ЯСК тимуса (млн.) 48,05±24,62 9,84±3,13 P=0,001(MU)

ЯСК тимуса/массу тела (млн./г) 1,96±1,0б 0,44±0,16 P=0,001(MU)

Лейкоциты крови (10ч/л) 4,33±1,90 1,47±0,82 P=0,001(MU)

Палочкоядерные нейтрофилы (%) 3,П±1,64 3,25±1,58 Н.д.

Палочкоядерные нейтрофилы (Ю^/л) 0,13±0,01 0,05±0,047 P=0,001(MU)

Сегментоядершле нейтрофилы (%) 17,04±4,99 19,96±6,66 Н.Д.

Сегментоядерные нейтрофилы (Ю^/л) 0,74±0,44 0,29±0,17 P=0,001(MU)

Лимфоциты (%) 77,61±5,45 76,11±б,28 Н.Д.

Лимфоциты (10у/л) 3,34±1,57 1,15±0,б4 P=0,001(MU)

Моноциты (%) 2,25±1,65 1,04±1,55 P=0,011(MU)

Моноциты (10у/л) 0,10±0,09 0,01±0,02 P=0,001(MU)

Таким образом, однократное введение циклофосфана оказало на организм мышей иммунодепрессирующий эффект.

Циклофосфан на фоне развития иммунного ответа на эритроциты барана влиял на органы иммунопоэза и периферическую кровь иначе, чем без антигенной стимуляции. Так, при иммунизации не было отличий от контрольной группы в весе селезенки и количестве ЯСК в ней. Вес тимуса был ниже в опытной группе в среднем на 7 мг, а количество ЯСК было в 3 раза меньше, чем в контроле. Вероятно, при антигенной стимуляции в организме активизировались компенсаторные механизмы и поэтому вес этих органов, а также количество клеток в них стали восполняться (таблица 4).

При изучении клеточного состава лейкоцитов произошло перераспределение фракций лейкоцитов в сторону увеличения нейтрофилов и снижения лимфоцитов. Это, скорее всего, связано с тем, что циклофосфан обладает

лимфотоксическим эффектом (Машковский М.Д., 1998, Мясная Н.В. и др., 2003). На интенсивность реакции ГЗТ циклофосфан не оказал влияния.

Таблица 4

Влияние циклофосфана на органы иммунопоэза, периферическую кровь и функциональное состояние нейтрофилов здоровых мышей на фоне развития иммунного ответа (М±о).____

Контроль (N=30) Циклофосфан (N=26) Р(2-3)

1 2 3 4

Вес селезенки (мг) 134,73± 166,93 157,96±129,35 Н.д.

ЯСК селезенки (млн.) 216,25±65,63 273,65±195,66 Н.д.

Вес тимуса (мг) 24,30±10,64 17,37±2,62 P=0,001(MU)

ЯСК тимуса (млн.) 36,85± 15,62 12,93±3,63 P=0,001(MU)

Лейкоциты крови (10у/л) 4.49±1.65 4,86±2,46 Н.д.

Палочкоядерные нейгрофилы (%) 3,60±1,61 6,73±4,50 P=0,001(MU)

Палочкоядерные нейгрофилы (10*/л) 0,15±0,075 0,33±0,28 P=0,002(MU)

Сегментоядерные нейтрофилы (%) 20,60±7,42 33,50±13,87 P=0,001(MU)

Сегментоядерные нейгрофилы (107п) 0,94±0,58 1,65±1,07 P=0,002(MU)

Лимфоциты (%) 74,63±8,36 58,65±16,17 P=0,001(MU)

Лимфоциты (10у/л) 3,35±1,15 2,81±1,59 P=0,030(MU)

Моноциты (%) 1,30±1,64 1,88±1,97 Н.д.

Моноциты (10*/л) 0,065±0,098 0,091±011 Н.д.

Активность фагоцитоза (%) 26,10±6,83 31,27±9,87 P=0,011(MU)

Интенсивность фагоцитоза (ла-текс/ЮОкл) 0,33±0,11 0,42±0,16 P=0,015(MU)

Активность HCT спонтанного (%) 31,17±5,26 32,96±5,24 Н.Д.

Интенсивность HCT спонтанного (у.е.) 0,33±0,06 0,38±0,08 P=0,022(MU)

Активность HCT индуцированного (%) 36,15±4,27 42,88±5,17 P=0,001(MU)

Интенсивность HCT индуцированного (У.е.) 0,41±0,06 0,51±0,11 P=0,001(MU)

Функциональный резерв нейтрофилов (акт) (%) 119,77±23,70 133,14±26,02 P=0,040(MU)

Циклофосфан при антигенной стимуляции не только увеличивал количество нейтрофилов, но при этом стимулировал их функции. Так в опытной группе активность фагоцитоза возросла на 20%, интенсивность фагоцитоза на 25%. Интенсивность спонтанного НСТ - теста в опытной группе увеличилась на 15%, активность индуцированного НСТ - теста возросла на 16%, а интенсивность на 24% по сравнению с контролем. Соответственно возрос и функциональный резерв нейтрофилов (таблица 4). Некоторые авторы указывают, что при введении циклофосфана происходит элиминация субпопуляций лимфоцитов, которые отвечают за подавление иммунного ответа. Соответственно препарат может оказывать иммуномодулирующее действие. (Мясная Н.В., 2002). Этим можно объяснить такую реакцию иммунной системы животных.

Таким образом, циклофосфан при однократном приеме оказывает ярко выраженное иммунодепрессивное действие, а при антигенной стимуляции

оказывает иммуномодулирующее действие на фоне работы в организме компенсаторных механизмов по восстановлению погибших клеток иммунной системы.

После введения циклофосфана снижены по сравнению с первоначальным исследованием показатели ориентировочно-исследовательского поведения. Так горизонтальная активность уменьшилась в 2 раза, количество стоек снизилось на треть, количество выглядываний в отверстия уменьшилось в 2 раза. В контрольной группе подобные эффекты не отмечались. При этом данные показатели ориентировочно-исследовательского поведения были достоверно ниже, чем у контрольной группы животных. Количество пересечений квадратов в опытной группе ниже в 1,86 раза, количество стоек в 1,64 раза, выглядываний в отверстия в 3,9 раза (рисунок 3). То есть применение препарата вызывало снижение двигательной и исследовательской активности мышей.

-

——-— 1 кто 1 —|ж

Гор.актиаиостъ Стойка с упором Вьгподьеанкя

Рисунок 3. Поведение мышей при применении циклофосфана. Тест «Открытое поле»

Поведение мышей в тесте «подвешивания за хвост» не выявило отличий между контрольной и опытной группами. Препарат, таким образом, не оказывал антидепрессивного действия. Циклофосфан не влиял на уровень тревожности животных по данным, полученным в «приподнятом крестообразном лабиринте»

На фоне иммунизации препарат еще в 2 раза снизил горизонтальную активность мышей. Уровень горизонтальной активности в опытной группе был в 2, 5 раза меньше, чем у контрольной группы животных. Вертикальная активность была снижена в 2,5 раза за счет стоек с упором. Количество выглядываний в отверстия, говорящие об исследовательской активности животных в опытной группе было в 3,2 раза меньше, чем в контрольной группе (рисунок 4). Таким образом, циклофосфан на фоне иммунного ответа продолжал оказывать угнетающее действие на ориентировочно-исследовательское поведение мышей.

На фоне антигенной стимуляции на 8 день после введения циклофосфана достоверных отличий в поведении мышей в тесте «подвешивания за хвост» и «приподнятом крестообразном лабиринте» не было. Соответственно при использовании на фоне иммунного ответа, препарат не оказывает ни ан-

тидепрессивного, ни депрессивного действия, а также не влияет на тревожность.

★ □ Контроль □ Ииктфтп^чн

-к* 1

1 1-1*

Горлктивность

Стойка с угором

Выгледьвания

Рисунок 4. Влияние циклофосфана на поведение мышей в тесте «Открытое поле, на фоне иммунизации эритроцитами барана

Однократное введение циклофосфана вызывает сильные изменения в параметрах иммунной системы, в организме происходит включение компенсаторных механизмов. Циклофосфан, являясь алкилирующем веществом, синтезирован с таким расчетом, чтобы препарат обладал избирательной противоопухолевой активностью. Но в тоже время он оказывает воздействие и на иные клетки, в том числе и на нервные. Согласно Вгасс1 Ь., (2007) циклофосфан при терапии опухолей вызывает пролиферацию Т и В-лимфоцитов, мигрирующих в опухоль, а также вызывают «цитокиновый шторм», т. е. выброс ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-15, ИЛ-21 и ИФН-у. Эти же ци-токины обладают нейротропными эффектами. Подобные эффекты могут лежать в основе действия циклофосфана на поведение.

При трехкратном приеме пирогенала вес селезенки и тимуса, а также количество ЯСК в них достоверно не отличалось от контроля. Количество лейкоцитов периферической крови было одинаковым в контрольной и опытной группе. В формуле периферической крови также не наблюдалось сдвигов (таблица 5).

Способность к поглощению чужеродных частиц была практически одинаковой в опытной и контрольной группах. Выработка активных форм кислорода неактивными нейтрофилами также не изменялась (по данным спонтанного НСТ - теста). Обращает на себя внимание тот факт, что введение пирогенала изменяло реакцию нейтрофилов на частицы латекса: активность индуцированного НСТ - теста увеличилась на 8 процентов, а интенсивность на 7,5%. Эти сдвиги были статистически достоверны, но незначительны. Поэтому функциональный резерв нейтрофилов не претерпел изменений. Таким образом, можно говорить о кондиционировании нейтрофилов при действии пирогенала и увеличении выраженности реакции на чужеродные частицы.

В условиях иммунизации пирогенал вызывал снижение веса тимуса на 28% по сравнению с контрольной группой. Но при этом количество ЯСК в органе не изменилось. По данным некоторых авторов (Буркова Н.П., 1976) пирогенал вызывает дегенерацию и гибель тимоцитов, характерную для вве-

дения гидрокортизона. Вероятно, и в нашем случае были схожие процессы. Вес селезенки и количество ЯСК в ней достоверно не изменились в опытной группе по сравнению с контрольной. В периферической крови количество лейкоцитов не изменилось. Но при этом в опытной группе наблюдалось снижение как палочкоядерных нейтрофилов на 0,09*109/л, так и сегментоядер-ных нейтрофилов на 0,24*10% (таблица 5).

При оценке влияния пирогенала на фоне иммунизации на функциональные способности нейтрофилов обнаружено что активность и интенсивность фагоцитоза не изменилась. Также не претерпела изменений активность и интенсивность НСТтеста спонтанного и индуцированного

Таблица 5

Влияние пирогенала на состояние органов иммунопоэза и функциональное состояние нейтрофилов на фоне иммунного ответа на эритроциты барана у мышей (М±ст).____

Контроль (N=31) Пирогенал (N=29) Р(2-3)

1 2 3 4

Вес селезенки, мг 109,32±25,83 109,46±42,60 Н.д.

ЯСК селезенки, млн. 201,П±65,79 212,01±73,95 Н.д.

Вес тимуса, мг 21,13±10,78 15,26±7,42 Р=0,033(Ми)

ЯСК тимуса 33,27±20,60 27,78±12,70 Н.д.

Лейкоциты крови (10у/л) 5,36*1,90 4,94±1,81 Н.д.

Палочкоядерные нейтрофилы, (107л) 0,23±0,16 0,14±0,09 Р=0,016(Ми)

Сегментоядерные нейтрофилы, (10у/л) 1,07±0,50 0,83±0,39 Р=0,029(Ми)

Лимфоцигы, (10 /л) 4,16±1,30 4,07±1,32 Н.д.

Моноциты, (10у/л) 0,08±0,09 0,09±0,08 Н.д.

В группе животных, получающих пирогенал, наблюдается достоверное снижение уровня горизонтальной активности на 30 единиц пересечений квадратов по сравнению с первоначальным исследованием. На время неподвижности животных пирогенал не оказывал воздействия. Таким образом, пирогенал не оказывает антидепрессивного действия.

Пирогенал увеличивал на 23% число выходов в открытый рукав лабиринта по сравнению с контрольной группой, что говорит о том, что пирогенал снижает уровень тревожности животного. И в контрольной и опытной группе при этом увеличилось время нахождения в открытом рукаве. Так как согласно методике исследования увеличение количества выходов в открытые рукава и центра и время нахождения в там свидетельствует о снижение тревожности животных то, применение пирогенала снижает уровень тревожности чуть больше, чем в контрольной группе (за счет увеличения количества выходов в открытый рукав).

На фоне иммунного ответа на эритроциты барана пирогенал не оказывал влияния на ориентировочную активность. Были обнаружены различия в количества выглядываний в отверстия. В опытной группе их количество было достоверно выше на 5%. То есть пирогенал при иммунном ответе повы-

шает исследовательскую активность мышей, без изменения двигательной активности животных. Не наблюдается достоверных отличий в поведении мышей в тест «подвешивания за хвост», что указывает на отсутствие антидепрессивного действия.

В «приподнятом крестоборазном лабиринте» пирогенал не оказывает влияния на уровень тревожности животных.

Изменения в поведении при применении пирогенала, вероятно, можно объяснить тем, что пирогенал при своем введении повышает температуру тела и стимулирует продукцию ряда цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2), которые могут вызвать «sickness behavior», означающий поведение при болезни, включающий в себя нарушения сна, депрессию, отсутствие аппетита, нарушение полового поведения, снижение двигательной активности (DantzerR., 2001).

Суммируя все вышесказанное можно отметить, что бестим обладает сохраняющим действием на параметры ориентировочно-исследовательского поведения, а также снижает тревожность и обладает антидепрессивным эффектом. Пирогенал снижает тревожность, а на фоне иммунного ответа в дополнение к этому увеличивает исследовательскую активность. Циклофосфан оказывает депрессивное действие на ориентировочно-исследовательское поведение без влияния на тревожность мышей.

Учитывая тесную близость иммунной и нервной систем, мы оценили связи между теми параметрами иммунитета, которые достоверно отличаются в опытной и контрольной группах, и параметрами поведения животных.

Так в группе животных, получавших бестим, имелась прямая корреляционная связь между временем неподвижности в тесте «подвешивания за хвост» и функциональным резервом нейтрофилов (Ks=0.57, n=14, р=0.02), а количество заглядываний под лабиринт коррелировало с число моноцитов в крови (Ks=-0.55, п=14, р=0.03). В контрольной группе наблюдалась отрицательная корреляция между функциональным резервом нейтрофилов и количеством пересечений квадратов (Ks=-0.65, п=14, р=0.01), а также количеством стоек с упором (Ks=-0.55, п=14, р=0.04) и числом выглядываний в отверстия (К,—0.57, п=14, р=0.03).

На фоне иммунного ответа на 11 день после введения препарата обнаружено, что в опытной группе количество ЯСК тимуса на массу органа прямо коррелировало с количеством пересечений квадратов (Ks=0.74, п=15, р=0.01), атакже с количеством стоек супором (Ks=0.75, п=15, р=0.01). В контрольной группе таких взаимосвязей не было. Наши факты соответствуют литературным данным. Известно, что у пациентов с депрессией обнаруживается снижение общего количества Т-лимфоцитов и клеток, несущих антигены гистосовместимости класса II, у пациентов, страдающих паническими атаками, обнаружено снижение некоторых субпопуляции Т-клеток как по сравнению со здоровыми людьми, так и с депрессивными пациентами (Marazitti et al., 1992). У пациентов с синдромом хронической депрессии снижается продукция тиреоид-стимулирующего гормона моноцитами. Такие факторы как пассивный стоицизм, апатия и отсутствие социальной поддерж-

ки примерно на 50% определяют снижение ЕКК у больных с неопластическими заболеваниями (Page G.G., Ben-Eliyahu S., 1997).

В опытной группе, получавшей циклофосфан, обнаружена прямая корреляционная связь между весом селезенки и числом стоек без упора (Ks= 0.58, п=14, р=0.03), в контрольной же группе эта связь была отрицательной направленности (Ks=-0.61, п=15, р=0.01).

На фоне иммунизации функциональный резерв нейтрофилов коррелировал со временем неподвижности как в опытной группе (Ks=0.67, п=15, р=0.01), так и в контрольной группе (Ks=-0.62, п=14, р=0.01).

Таким образом, характер взаимосвязей между иммунной системой и поведением изменился при введении препарата. Изменения, вероятно, связаны с тем, что циклофосфан оказывает сильное депрессивное воздействие и в организме начинают работать различные компенсаторные механизмы, с целью нормализации гомеостаза.

В серии экспериментов с применением пирогенала при оценке связи параметров иммунной и нервной систем выявлено, в контрольной группе мышей есть обратная связь между уровнем горизонтальной активности и активностью индуцированного HCT - теста (Ks=-0.57, п=15, р=0.03). В опытной группе такой связи нет.

На 7 день после окончания введения препарата на фоне развития иммунного ответа в группе животных принимавших пирогенал найдены корреляционные связи между количеством актов груминга и числом палочкоядер-ных нейтрофилов (Ks=0.57, п=14, р=0.02), и между количеством актов груминга и активность HCT индуцированного на литр крови (Ks=0.64, п=14, р=0.01). В контрольной группе имелась связь между временем неподвижности и процентом палочкоядерных нейтрофилов (Ks=0.54, п=15, р=0.04).

Некоторые авторы (Труфакин В.А., 2001) указывают, что при хронических стрессах и повышение тревожности у мышей повышается количество нейтрофилов. Это хорошо сочетается с нашими данными.

Согласно литературным данным, мыши отличаются по уровню ориентировочно-исследовательской активности на три группы: с низкой активностью, со средней и высокой (Маркова Е.В., 2004). В связи с этим контрольные животные были разбиты нами на 3 группы с разным уровнем активности с помощью кластерного анализа. Иммунизация по-разному действовала на мышей, отличающихся разными исходными характеристиками, но относящихся к одной группе. При сравнении параметров иммунной системы, было обнаружено следующее: количество ЯСК селезенки на массу тела различалось между группами со средней и низкой степенью активности. В группе с низкой степенью активности этот показатель был на 9,4% ниже (Р=0,014 (MU)). Также в этих группах обнаружена разница в процентном содержании моноцитов, в группе с низким уровнем активности данный показатель был ниже на 8,3% (Р=0,014 (MU)).

Было выявлено, что иммунизация животных привела к нивелированию различий в поведении между этими группами при повторных исследованиях поведения.

Учитывая, что иммунизация привела к различному эффекту у групп с разной активностью, то есть нивелировала отличие в поведении животных, а также и в иммунной системе, можно предположить, что и препараты по-разному будут действовать на мышей с разным базовым уровнем поведения, но в наших экспериментах их было мало и разбить их на группы не представляется возможным.

Действием иммунотропных препаратов на параметры поведения на наш взгляд связаны с понятием единой регуляторной метасистемы, в которую невычленимыми компонентами входят нервная, иммунная и эндокринная системы. Конкретные механизмы влияния препаратов на параметры поведения, скорее всего непрямые. Это может быть влияние через цитокины, такие как ИЛ-1 (Fleshner M., 1995, Сибиряк C.B., 2003), ИЛ-2 (Sumizura А., 1989), ИЛ-6 (Hesse D.G., 1988) и другие. Возможен и иной путь влияния препаратов. Активация нейтрофилов, приводящая к увеличению секреции продуктов, и уже они влияют на поведение (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001, Зурочка A.B., 1991, Чукичев A.B., 1996). Третий путь воздействия возможен через изменение метаболизма нейромедиаторов. Так гуморальный ответ к ЭБ у крыс ингибирует выработку ацетилхолина в ЦНС (Назаров П.Г., 2006). Четвертый путь возможен при прямом действии препаратов. Например, циклофосфан, обладая алкилирующим действием, может влиять не только на опухолевые клетки, но и на другие клетки организма.

Изученные нами препараты обладали влиянием на параметры поведения животных. Это еще раз демонстрирует наличие нейро - иммунных связей. Полученные результаты указывают на целесообразность изучения характера влияния на функциональное состояние нервной системы и других им-муномодуляторов.

Выводы

1. Бестим у мышей увеличивает абсолютное и относительное количество моноцитов периферической крови и палочкоядерных нейтрофилов. На фоне развития иммунного ответа бестим увеличивает уровень палочкоядерных нейтрофилов периферической крови, а также относительное количество ядросодержащих клеток тимуса. Препарат незначительно снижает активность индуцированного HCT - теста.

2. Бестим сохраняет ориентировочно-исследовательскую активность и снижает уровень тревожности животных. При введении иммуномодулятора перед иммунизацией животных эритроцитами препарат снижает тревожность мышей, а также оказывает выраженное антидепрессивное действие.

3. При однократном применении циклофосфана снижается вес селезенки, тимуса, уменьшается количество ядросодержащих клеток в этих органах, и уровень лейкоцитов периферической крови у мышей.

4. При антигенной стимуляции эритроцитами барана циклофосфан восстанавливает вес селезенки и количество ядросодержащих клеток в ней у лабораторных животных. В периферической крови происходит восстановле-

ние количества лейкоцитов, снижается количество лимфоцитов и увеличивается уровень нейтрофилов. У нейтрофилов увеличивается активность и интенсивность фагоцитоза, активность и интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ - теста.

5. Однократный прием циклофосфана приводит к снижению ориентировочной и исследовательской активности животных. На фоне иммунизации эритроцитами барана циклофосфан еще больше снижает двигательную и исследовательскую активность мышей. На уровень тревожности на фоне иммунизации и без нее препарат не оказывает влияния.

6. Пирогенал оказывает воздействие на функциональное состояние нейтрофилов у мышей - увеличивает активность и интенсивность индуцированного НСТ - теста. На фоне иммунного ответа препарат снижает вес тимуса при сохранении количества ядросодержащих клеток в нем. Кроме того, снижается содержание нейтрофилов, как относительное, так и абсолютное.

7. Пирогенал снижает ориентировочную активность мышей, а также препарат вызывает снижение тревожности. На фоне антигенной стимуляции, пирогенал увеличивает исследовательскую активность и не оказывает влияние на уровень тревожности и уровень депрессии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Артамонов, С.А. Поведение животных при экспериментальной стафилококковой инфекции / С.А. Артамонов, В.А. Зурочка, Ю.О. Колесникова // Сборник работ юбилейной научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН «Университетская наука: взгляд в будущее» посвященный 70-летию КГМУ. - Курск: издательство КГМУ. -

2005. -т 1.-е. 11-12.

2. Артамонов, С.А. Влияние пирогенала на уровень тревожности у мышей / С.А. Артамонов // Материалы 3-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск: издательство «ЧелГМА». 2005. -с. 8-10.

3. Артамонов, С.А. Влияние пирогенала на уровень тревожности мышей и поведение в тесте «Открытое поле» / С.А. Артамонов // Иммунология Урала. - 2005. - №1(4). - с. 115.

4. Артамонов, С.А. Оценка функций иммунной и нервной систем при ведении циклофосфана / С.А. Артамонов, О.Л. Колесников // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека. Материалы конференции, посвященной 25-тилетию ЦНИЛ ЧелГМА. Челябинск: Изд-во «ЧелГМА», - 2006. - с. 184-187.

5. Артамонов, С.А. Влияние пирогенала на состояние нервной и иммунной систем с разным исходным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения / С.А. Артамонов, О.Л. Колесников // Медицинская иммунология-

2006. - том №8, №2-3. - с. 117-118.

6. Артамонов, С.А. Влияние циклофосфана на тревожность мышей с различным исходным состоянием нервной системы / С.А. Артамонов, О.Л. Колес-

ников // 1-ый Российско-Чешский медицинский форум. - Челябинск. - 2006. -с. 182-183.

7. Артамонов, С.А. Комплексная оценка влияния препарата бестим на иммунную и нервную системы / С.А. Артамонов, O.JI. Колесников, A.C. Сим-бирцев // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1 (14).-с. 95-97.

8. Артамонов, С.А. Оценка влияния препарата бестим на иммунную и нервную системы / С.А. Артамонов, O.J1. Колесников // Иммунология Урала . -

2006.-№1(5).- с. 102-103.

9. Артамонов, С.А. Влияние пирогенала на тревожность мышей с различным исходным уровнем тревожности/ С.А. Артамонов, Ю.О. Колесникова // 4 итоговая научно-практическая конференция молодых ученых, г. Челябинск: издательство «ЧелГМА». - 2006. - С. 7-8.

10. Артамонов, С.А. Изучение влияние бестима на уровень тревожности мышей / С.А. Артамонов, Ю.О. Колесникова // 5 итоговая научно-практическая конференция молодых ученых, г. Челябинск: издательство «ЧелГМА». -

2007. - с. 5-6-

П.Артамонов, С.А. Влияние иммунизацией эритроцитами барана (ЭБ) на нервную и иммунную системы мышей с различным исходным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения / С.А. Артамонов, O.JI. Колесников, JI.C. Борисова // Медицинская иммунология. - 2007. - том № 8, № 2-3. -с. 114-115.

12.Артамонов, С.А. Оценка характера воздействия бестима на нервную и иммунную системы здоровых мышей / С.А. Артамонов, O.JI. Колесников // Российский аллергологический журнал. - 2007. - № 3. - приложение 1.-е. 404.

На правах рукописи

Артамонов Сергей Александрович

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИММУНОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ИММУННЫЙ СТАТУС И ПОВЕДЕНЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МЫШЕЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 20.05.2009 Формат 60x84/16. Бумага Гознак 80г/м2. Печать офсетная. Усл.печл. 1,16 Тираж 120 экз. Заказ № 56

Отпечатано с готовых оригинал-макетов в ООО ПКФ «Тираж-Сервис» 454080, г. Челябинск, ул. Энтузиастов, 19

Актуальность проблемы.

В настоящее время в клинической практике широко применяются различные иммуномодулирующие препараты, и их количество быстро растет. Ежегодно только в России успешно проходят государственные испытания 20-30 новых иммунобиологических препаратов (Хаитов P.M., 2002). Влияние же на другие системы органов рассматривается, в первую очередь, только с точки зрения побочных эффектов.

Также известно то, что на рубеже двух столетий зародилась новая интегральная медико-биологическая дисциплина — нейроиммунология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной (Гриневич В.В., 2004).

Несмотря на то, что в онтогенезе клетки иммунной и нервной системы происходят из разных зародышевых листков (из эктодермы и мезодермы соответственно), функционально обе системы удивительно схожи.

При анализе сходства в организации нервной и иммунной систем привлекает внимание тот факт, что обе системы состоят из большого числа фенотипи-чески различающихся клеток, организованных в сложные сети. В пределах такой сети клетки взаимосвязаны и функционируют по принципу обратной связи, когда пусковым сигналом служит адекватный раздражитель, а конечный ответ направлен на обеспечение полезного результата. Различие заключается в том, что в нервной системе клетки жестко фиксированы в пространстве, тогда как в иммунной они непрерывно перемещаются, и лишь кратковременно взаимодействуют друг с другом (Полетаев А.Б. и др., 2002; Корнева Е.А., 2003).

Феноменологически эти системы призваны обеспечивать безопасность контактов самого широкого плана между организмом и средой. Обе системы имеют диффузное строение, вследствие чего их элементы присутствуют практически во всех органах и тканях. И та и другая системы эволюционно адаптированы на способность оперативного восприятия поступающей из среды информации, ее переработку (интеграцию), хранение и воспроизведение (Danao Е.С., 1989). Обе системы обучаются и накапливают индивидуальный, не передающийся по наследству «жизненный опыт» с целью обеспечить более быструю и более адекватную адаптивно-гомеостатическую реакцию организма на повторение ранее встречавшейся ситуации (Ковалев И.Е., 1989, 1991). При этом между двумя системами прослеживается выраженная дифференцированность по модальности воспринимаемых стимулов: нервная система специализируется на восприятии и обработке информации, поступающей в основном в виде стимулов физической природы, а иммунная система на восприятии и обработке информации, поступающей в виде химических стимулов (Ferenchk М., 1997).

Учитывая тесную близость указанных систем, можно предположить, что иммунотропные препараты могут оказывать воздействие и на нервную систему. Подобные эффекты могут быть важны при клиническом использовании веществ. Так, Романенко Р.Н. и соавт., (2008), проводя анализ динамики психического состояния больных шизофренией с различными вариантами дефицитарной симптоматики при назначении комбинаций иммунотропного средства с типичным и атипичным антипсихотиками указывает, что циклоферон снижает астени-зирующее действие антипсихотиков, что в конкретной клинической ситуации может играть как положительную, так и отрицательную роль, в зависимости от имеющегося варианта дефицитарных расстройств. Andre В. Reiriz (2006) выявил ухудшение памяти и когнитивных способностей у мышей при использовании циклофосфана.

Многие моменты взаимодействия систем остаются мало изучены. Это послужило одной из причин данного исследования.

Для оценки влияния иммунотропных препаратов на поведение и иммунную систему были использованы три препарата, различающиеся по механизмам действия: иммуномодулятор - бестим, иммуностимулятор - пирогенал и иммунодепрессант - циклофосфан.

Цель исследования:

Изучить влияние иммунотропных препаратов бестима, пирогенала и цик-лофосфана на состояние органов иммунопоэза, периферическую кровь, а также поведенческую активность лабораторных животных.

Для решения поставленной цели исследования были сформированы следующие

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на органы иммунопоэза и факторы неспецифической защиты мышей.

2. Изучить влияние иммунотропных препаратов на органы иммунопоэза и факторы неспецифической защиты и оценить клеточный иммунитет у мышей на фоне развития иммунного ответа на эритроциты барана.

3. Оценить влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на поведение, тревожность и уровень депрессии мышей

4. Оценить влияние бестима, пирогенала, циклофосфана на поведение, тревожность и уровень депрессии мышей на фоне развития иммунного ответа на эритроциты барана.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые проведено исследование влияния бестима на поведение мышей. Выяснено, что бестим обладает способностью сохранять базовый уровень ориентировочно-исследовательской активности у мышей. Препарат снижает тревожность у животных, а на фоне введения в организм антигена он обладает кроме этого еще и антидепрессивным действием.

Проведено комплексное исследование влияния циклофосфана на иммунную и нервную систему здоровых мышей. Циклофосфан оказывает депрессивное действие на ориентировочно-исследовательское поведение мышей, не оказывая при этом влияния на уровень депрессии и тревожности.

Проведено комплексное исследование влияния пирогенала на иммунную систему и поведение мышей. Препарат не оказывает влияния на ориентировочно-исследовательское поведение животных, снижая их тревожность. На фоне иммунизации увеличивает исследовательскую активность животных без влияния на уровень тревожности. Пирогенал не оказывает антидепрессивного действия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бестим оказывает стимулирующее действие не только на иммунную, но и на нервную систему. Препарат способствует сохранению базовой ориентировочно-исследовательской активности мышей при повторных исследованиях.

2. Бестим на фоне развития иммунного ответа оказывает антидепрессивное действие у мышей.

3. Циклофосфан оказывает угнетающее действие на нервную систему. Препарат снижает ориентировочно-исследовательскую активность мышей, как при однократном введении, так и на фоне антигенной стимуляции.

4. Циклофосфан не оказывает влияния на уровень депрессии и тревожности у мышей.

5. Пирогенал снижает горизонтальную активность у здоровых мышей, а также снижает уровень тревожности.

6. На фоне иммунизации, пирогенал увеличивает исследовательскую активность у животных, не оказывая влияния на тревожность и уровень депрессии.

Практическая значимость исследования: Хотя работа по своему существу носит фундаментальную направленность, проведенные исследования и полученные данные о влиянии препаратов на нервную систему уточняют их эффекты и могут быть использованы при разработке практических рекомендаций по использованию препаратов в клинической практике.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены: на 4-м съезде иммунологов Урала (Уфа, 2005), на 5-м съезде иммунологов Урала (Оренбург, 2006), на 3-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2005), на 10-м всероссийском научном форуме «Дни иммунологи в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на 4-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2006), на 5-й итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2007), на 8-м конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и им-мунофармакологии» (Москва, 2007г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 работ. Из них одна статья в журнале, рекомендованном ВАК и двое тезисов в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы. Текст изложен на 143 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 23 таблицами, 15 рисунками. Указатель литературы содержит 213 источников, из них 85 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Бестим у мышей увеличивает абсолютное и относительное количество моноцитов периферической крови и палочкоядерных нейтрофилов. На фоне развития иммунного ответа бестим увеличивает уровень палочкоядерных нейтрофилов периферической крови, а также относительное количество ядросо-держащих клеток тимуса. Препарат незначительно снижает активность индуцированного НСТ-теста.

2. Бестим сохраняет ориентировочно-исследовательскую активность и снижает уровень тревожности животных. При введении иммуномодулятора перед иммунизацией животных эритроцитами препарат снижает тревожность мышей, а также оказывает выраженное антидепрессивное действие.

3. При однократном применении циклофосфана снижается вес селезенки, тимуса, уменьшается количество ядросодержащих клеток в этих органах, и уровень лейкоцитов периферической крови у мышей.

4. При антигенной стимуляции эритроцитами барана циклофосфан восстанавливает вес селезенки и количество ядросодержащих клеток в ней у лабораторных животных. В периферической крови происходит восстановление количества лейкоцитов, снижается количество лимфоцитов и увеличивается уровень нейтрофилов. У нейтрофилов увеличивается активность и интенсивность фагоцитоза, активность и интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ теста.

5. Однократный прием циклофосфана приводит к снижению ориентировочной и исследовательской активности животных. На фоне иммунизации эритроцитами барана циклофосфан еще больше снижает двигательную и исследовательскую активность мышей. На уровень тревожности на фоне иммунизации и без нее препарат не оказывает влияния.

6. Пирогенал оказывает воздействие на функциональное состояние нейтрофилов у мышей - увеличивает активность и интенсивность индуцированного НСТ - теста. На фоне иммунного ответа препарат снижает вес тимуса при сохранении количества ядросодержащих клеток в нем. Кроме того снижается содержание нейтрофилов, как относительное, так и абсолютное.

7. Пирогенал снижает ориентировочную активность мышей, а также препарат вызывает снижение тревожности. На фоне антигенной стимуляции, пирогенал увеличивает исследовательскую активность и не оказывает влияние на уровень тревожности и уровень депрессии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование воздействия иммунотропных препаратов на иммунную и нервную системы имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Это связано с тем, что полученные данные расширяют представление как о свойствах препаратов, так и о взаимодействии иммунной и нервной систем в целом.

Существующий перечень практических рекомендаций по исследованию иммунотропных средств не включает в себя изучение воздействия препарата на нервную систему (Хаитов P.M., 2002). В связи с развитием медицины и появлением новой области знания - нейроиммунологии, появившейся в ходе интеграции накопленных знаний о нервной и иммунной системах, рассматривать эти системы в отдельности друг от друга нельзя. Системы представляют собой единую регуляторную метасистему, в которую не вычленяемыми компонентами входят как иммунная, так и нервная системы. Потому исследование воздействия препарата на какую-то отдельно одну систему в какой-то мере ущербно. Для того чтоб выяснить как действуют иммунотропные препараты на эти две системы было решено взять три препарата, по одному на каждый тип воздействия (иммуномодулирующее, иммуностимулирующее и иммунодепрессирую-щее), а также различающие по химической природе и происхождению. Бестим - иммуномодулятор, имеющий пептидную природу, пирогенал — иммуностимулятор липополисахарид бактериального происхождения и циклофосфан — иммунодепрессант эфир диамида фосфорной кислоты.

Препараты использовались в дозировках, при которых их эффект согласно литературным данным наиболее выражен.

Воздействие на иммунную систем оценивалась по влиянию на лейкоцитарную формулу периферической крови; по влиянию на органы иммунопоэза, оценивался вес селезенки тимуса и количество ЯСК в этих органах; оценивалось влияние на функциональную способность нейтрофилов периферической крови. (НСТ - тест и фагоцитоз). В другой серии экспериментов эти параметры оценивались на фоне антигенной стимуляции организма эритроцитами барана, при этом также у животных определялся уровень реакции ГЗТ на введенный антиген.

Из параметров нервной системы оценивалось ориентировочно-исследовательское поведение животных в «открытом поле», а также оценивалось поведение животных в «приподнятом крестообразном лабиринте» (тест оценки тревожности) и в тесте «подвешивания за хвост» (оценка уровня депрессии).

Первый препарат - бестим. Пятикратный введение бестима не изменял вес селезенки у животных. При этом наблюдалось увеличение количества ЯСК селезенки на массу тела животного на 14% по сравнению с контрольной группой животных (таблица 3.1). Вес тимуса, а также количество клеток в нем и их плотность не изменилась по сравнению с контрольной группой (таблица 3.1). В периферической крови было ярко выраженное увеличение количества моноцитов (в 2,2 раза), а также палочкоядерных нейтрофилов на 15%. (таблица 3.1)

Влияние бестима на функциональное состояние нейтрофилов периферической крови здоровых мышей было не ярко выражено. Наблюдалось снижение на 4% функционального резерва нейтрофилов (таблица 3.2). Известно, что нейтрофилы животных, получавших бестим, активируются (Зурочка В.А., 2006). Вероятно в связи с частичной активацией нейтрофилов у мышей, получавших препарат, несколько снижен функциональный резерв.

Таким образом, небольшое количество изменений в параметрах иммунной системы связано с тем, что препарат применялся на здоровых животных.

На фоне иммунизации под действием бестима масса тимуса и селезенки, а также абсолютное количество клеток в этих органах не претерпели существенных изменений. В тоже время возросло на 20% количество ЯСК клеток в тимусе в расчете на мг веса органа (таблица 3.3), что позволяет говорить об увеличении плотности клеток в тимусе. Известно, что предшественники Тлимфоцитов имеют размеры больше чем зрелые клетки (Абрамов М.Г., 1979). Следовательно, повышение плотности клеток косвенно свидетельствует об увеличении доли зрелых Т-лимфоцитов среди ЯСК тимуса. В периферической крови только увеличивалось процентное содержание палочкоядерных нейтрофилов на 30%. Согласно коэффициенту интенсивности уровень реакции ГЗТ у мышей получавших бестим не изменялся (рисунок 3.3).

Активность и интенсивность фагоцитоза, а также фагоцитарное число при использовании бестима на фоне иммунизации не изменилась (таблица 3.4). Активность и интенсивность спонтанного НСТ теста и в опытной и в контрольной группе была одинаковой, с небольшой тенденции к увеличению активности НСТ теста у животных, получавших препарат. Обнаружено небольшое снижение активности индуцированного НСТ - теста (таблица 3.4.). Данный факт можно объяснить тем, что при использовании бестима нейтрофилы активируются, что видно в тенденции к повышению активности спонтанного НСТ теста. Соответственно при активации они будут меньше активироваться.

В целом можно сказать, что препарат не оказывает значительного влияние на параметры иммунной системы здоровых животных. Это подтверждает иммуномодулирующий характер действия бестима.

На поведение мышей препарат оказывал следующее воздействие. При приеме бестима и в опытной и в контрольной группе при повторном исследовании обнаружилось снижение горизонтальной активности на 26 и на 40 % соответственно (таблица 3.5.). При этом в опытной группе уровень горизонтальной активности был достоверно выше чем в контрольной группе на 40%. Это говорит о то, что бестим способствует сохранению ориентировочной активности мышей при повторном исследовании. Вертикальная активность в опытной группе также была выше: у животных, принимавших бестим, в 1,5 раза выше количество стоек с упором. Кроме того, в контрольной группе наблюдалось снижение количества выглядываний в два раза (таблица 3.5). В группе, получавших бестим, количество выглядываний сохранялось на прежнем уровне и было достоверно выше, чем в контрольной группе в 3 раза. Препарат, таким образом, способствует сохранению исследовательской активности мышей. В опытной группе наблюдалось снижение количества актов груминга на 32%, а так как увеличение актов груминга трактуется как повышение тревожности (Калуев А.В., 1998, Буреш Я, 1983), то препарат снижает тревожность. Таким образом, препарат способствует сохранению ориентировочно-исследовательской активности, а также снижает уровень тревожности мышей. Исследование влияние бестима на «поведения отчаяния» в тесте «подвешивания за хвост» не выявило достоверных отличий между опытной и контрольной группами. Это свидетельствует о том, что препарат не оказывает антидепрессивного действия.

В «приподнятом крестообразном лабиринте» в контрольной группе наблюдается уменьшение количества входов в закрытые рукава и центр лабиринта в 2 раза. Бестим же, оказывая сохраняющее действие на ориентировочную активность сохраняет эти показатели на прежнем уровне (таблица 3.6.). Принято считать, что увеличение времени нахождения в открытых рукавах лабиринта и центре лабиринта, а также увеличение количества выходов в центр и открытые рукава указывают на снижение тревожности (Van Erp А.М.М, 1994). Как видно из таблицы 3.6, количество выходов в центр в опытной группе по сравнению с контрольной больше в 1,58 раза, в открытый рукав в 2 раза, время нахождения в центре в 1,5 раза, в открытом рукаве в 2 раза. Это указывает на снижение уровня тревожности. Кроме того в группе животных, принимавших бестим, количество заглядываний под лабиринт на 12% больше, чем в. контрольной группе, что свидетельствует об увеличении исследовательской активности (Lister R.G., 1987). Таким образом, бестим снижает тревожность у животных.

Иммунизация наложила отпечаток на эффекты бестима на поведение животных. В параметры поведения в тесте «Открытое поле» исчезли различия