Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка цитокинового статуса и оптимизация терапии атопического дерматита у детей

На правах рукописи

Каблави Набиль

Оценка цитокинового статуса и оптимизация терапии атопического дерматита у детей.

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2005 г.

Работа выполнена в ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

старший медицинский сотрудник, Зотова B.B.

доктор медицинских наук, ассистент кафедры кожных и венерических заболеваний РостГМУ Темников В.Е.

профессор, зав. кафедрой кожных

и венерических болезней

педиатрического факультета РГМУ

Короткий Н.Г.

кандидат медицинских наук,

ассистент кафедры клинической иммунологии

и аллергологии РостГМУ

Перелыгина Г.М.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

Ведущая организация:

Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится 30 июня 2005 года в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 в ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет (344022, г.Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

Автореферат разослан «30» мая

2005 года

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Т.Н. Кузина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Атопический дерматит (АД) - широко распространенное заболевание. По данным Н.Г. Короткого и соавт. (2003), АД занимает первое место по частоте поражения кожи у детей. Среди патогенетически значимых факторов при этом дерматозе ведущее место уделяется иммунопатологическим механизмам. В настоящее время при АД установлены нарушения тонких механизмов иммунологической регуляции. Неадекватное реагирование иммунной системы на различные аллергены, в большей степени грибкового и микробного происхождения, приводит к формированию при этом дерматозе аллергического воспаления ( Кунгуров Н.В., 1999. Короткий Н.Г. и соавт. 2003).

В литературе имеются сообщения об исследовании иммунного статуса и регуляторных механизмов иммунного ответа при АД. Grewe M. и соавт. (1998) установили нарушения соотношения ТН 2 и ТН 1 у больных с АД и полагают о важном патогенетическом значении выявленных изменений. Nacagawa S. и соавт. (1998), Dubois G.R. и соавт. (1998), выявили нарушения экспрессии ИЛ-4, ИЛ- 5, а также интерферона-у (ИФ-у), полагают, что Th2 ответ ведет к усилению синтеза Ig E и ведут к обострению патологического процесса.Vries I.J. и соавт.(1998) на основании изменения продукции фактора некроза опухоли альфа, ИЛ-4 и молекулы адгезии (VCAM-1) заключили, что выявленные изменения цитокиновой регуляции способствуют облегчению проникновению Т-лимфоцитов в кожу и формированию воспалительной Т- клеточной инфильтрации у пациентов АД. Аналогичные исследования проведены и другими авторами ( Leung D.Y. (1998); Kimuza M. et al (1998); Nacgava S. et al (1998); Leberge S. etal.(1998)).

В то же время, в доступной литературе мы не встретили комплексных исследований при АД цитокиновой регуляции, т.е. одновременной оценки содержания внутриклеточных цитокинов в клетках крови, их изменений in vitro после митогенной стимуляции. Изучение подобных фактов, с нашей точки зрения, позволит дать более точную трактовку механизмов нарушений иммунного статуса при АД.

Лечение АД представляют собой сложную задачу. Несмотря на появившиеся в последние годы новые методы терапии этого заболевания, проблема еще далеко не решена. Нередко после успешно проведенного лечения наступают рецидивы заболевания. В настоящее время уделяется большое внимание поиску лекарственных средств, направленных на модуляцию цитокинового статуса и уже получены обнадеживающие результаты (Takamatsu U., Hasegawa M., Sato S., 1998, Nonbicato G. et al, 1998; Pellegrino M. et al, 1998). В частности, достаточно эффективным оказалось использование 1 % крема элидел, который является селективным ингибитором проваспалительных цитокинов в пораженной при АД коже. Нам представляется актуальным дальнейшее совершенствование лечения дерматоза в этом направлении. Целесообразным, по-видимому, является

поиск лекарственных средств, влияющих системно на цитокиновый статус больных АД.

Цель исследования. Цель - изучить особенности формирования иммунного и цитокинового статуса у больных АД в зависимости от тяжести течения, а также разработать терапию этого заболевания с учетом выявленных нарушений.

Задачи исследования:

1. Изучить клиническую характеристику больных АД в зависимости от тяжести состояния.

2. 2.Иследование экспрессии молекул адгезии ( CD 54+, CD106+), а также про- (ФНО-а, ИЛ-1) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИФ-у) цитокинов у больных АД.

3. Изучение показателей клеточного иммунитета (CD4+, ТЫ, ^2), a также уровння IgE.

4. Обоснование иммуннокорригирующей медикаментозной терапии у больных АД.

5. Оценить динамику иммунологических показателей в процессе стандартной терапии и лечения с использованием галавита.

Научная новизна.

Впервые у больных АД детей:

У установлены особенности формирования цитокинового статуса, заключающиеся в усилении синтеза внутриклеточного провоспалительного цитокина ИЛ-1, МА 1САМ-1 СБЗ+ лимфоцитами, снижении продукции УСАМ-1 и повышении числа ИЛ-4 синтезирующих клеток; > выявлен дисбаланс соотношения ТЫ и ТЬ2 лимфоцитов в сторону увеличения числа ТЬ2 лимфоцитов, коррелирующий с гиперпродукцией 1дЕ; ^ определены наиболее информативные критерии прогноза течения заболевания, основанные на изменении показателей цитокинового и иммунного статуса;

дано научное обоснование включение иммуномодулятора галавита в комплексную программу лечения больных АД детей.

Практическая значимость.

На основании проведенных исследований в комплексную терапию заболевания был включен иммуномодулятор гачавит, что позволило значительно сократить сроки лечения больных со средне-тяжелым течением заболевания и повысить его эффективность. Предложенная методика лечения характеризуется отсутствием серьезных осложнений и побочных эффектов, проста в воспроизведении, характеризуется высокими фармакоэкономическими показателями, что позволяет надеяться на ее широкое внедрение в клинической практике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У больных детей со среднетяжелой формой АД наблюдаются выраженные нарушения цитокинового статуса, которые проявляются повышением активности провоспалительных цитокинов, снижением VCAM-1, снижением числа ТЫ-лимфоцитов, повышением ^2, коррелирующих с высоким уровнем IgE.

2. Комплексная терапия среднетяжелой формы АД у детей с использованием галавита характеризуется нормализацией показателей цитокинового статуса и снижением уровня IgE.

3. Использование разработанной комплексной терапии с включением галавита, обладающего иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью демонстрирует высокую клиническую эффективность, заключающуюся в уменьшении выраженности клинических проявлений заболевания.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты исследования используется в повседневной практике Ростовского областного, Ставропольского краевого кожно-венерологических диспансеров, а также в Ростовской городской детской больнице № 4.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Содержит введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 2 главы собственных исследований, заключение и выводы. Проиллюстрирована 12 таблицами и рисунками. Список литературы содержит 129 авторов (101 отечественных и 28 зарубежных).

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на конференции молодых ученых и специалистов РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2002), 1 Российском конгрессе дерматовенерологов (С.Петербург, 2003).

Материалы и методы исследования.

Под наблюдением находились 123 больных АД детей со среднетяжелым течением заболевания в возрасти от 4 до 7 лет, которые получали стационарное лечение в дерматологическом отделении ГБ № 4. После выписки дальнейшее наблюдение осуществляли в клинике кожных болезней Рост ГМУ. Тяжесть течения заболевания и динамику клинических изменений в процессе терапиии оценивали по индексу SCORAD, который рассчитывали по общепринятой методике .

Программа иммунологического обследования включала определение про- и противовоспалительных цитокинов в динамике заболевания, количество CD4+, ТЫ, ^2 лимфоцитов, а также урозень IgE.

С целью оценки гуморальной составляющей межклеточных взаимодействий в иммунной системе проводили изучение спонтанных и

индуцированных внутриклеточных цитокинов. У больных атопическим дерматитом исследовались молекулы адгезии ICAM-1 (CD54+) VCAM-1 (CD106+), а также про- (TNF-a, ИЛ-1) и противовоспалительные (ИЛ-4) цитокины. Проводилось изучение интерферонового статуса (ИФН-у). Цитокины определяли методом Fast Immune Cytokine System. Для активации цельной крови использовались поликлональный лейкоцитарный активатор -phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) и Ionomycin в присутствии Brefeldin A (BFA). Использовалась 4-х часовая инкубация в инкубаторе Thermo Forma (model 3110, Series Water Jacketed) с 5% содержанием СО2. На следующем этапе к суспензии клеток добавляли антитела к Fc рецептору, чтобы блокировать неспецифическое окрашивание. На третьем этапе проводили специфическое окрашивание поверхностных антигенов (CD3+, CD 14+). На четвертом этапе проводилась фиксация и пермиабилизация (усиление проницаемости мембраны) клеток. На пятом этапе проводилось внутриклеточное окрашивание антигенов (молекулы адгезии, про- и противовоспалительные цитокины). На заключительном этапе проводилась оценка результатов исследования на проточном цитофлуориметре FACSCalibur фирмы Becton Dickinson (USA). Обработка данных проводилась на Macintosh Quadra 650 в программе Cell Quest.

CD4+ лимфоциты определяли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител фирмы Becton Dickinson. Th 1 и Th 2 лимфоциты определяли по коэкспрессии ИФ-у (Th 1) и ИЛ-4 (Th 2) на CD4+ лимфоцитах.

IgE в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Статистический анализ материалов проводился методом вариационной статистики с помощью пакетов прикладных программ Excel и Statistica. Данные наблюдений обрабатывались с использованием ПК Intel Celeron НОТ.

Результаты исследования и их обсуждение.

В наших исследованиях у 40 больных АД была исследована спонтанная и индуцированная экспрессия основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-a, противовоспалительного цитокина ИЛ-4, а также ИФН-у и MA ICAM-1 и VCAM-1.

Контрольную группу составили 10 условно здоровых детей.

Оценка внутриклеточных молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 у детей, больных АД (рис.1,2).У больных АД при исследовании спонтанной экспрессии молекулы адгезии VCAM-1 (CD10o+) в миелоидном гейте не было выявлено достоверных различий по сравнению со здоровыми детьми.

Так, спонтанная экспрессия CD 106+ у больных АД не отличалась от показателей, полученных у здоровых детей. Вместе с тем следует отметить, что индуцированная экспрессия VCAM-1 у пациентов с АД оказалась вдвое

ниже данных, зарегистрированных у здоровых лиц (3,6±0,06% - у больных и 7,9±0,09% - у здоровых детей).

У больных АД детей индуцированная колсспрессия MA VCAM-1 и CD 14 клеток также оказалась в два раза ниже по сравнению с показателями, полученными у здоровых детей (2,56+0,05% - у больных и 5,31+0,08% - у здоровых детей).

При исследовании внутриклеточного содержания CD 106+ в лимфоидном гейте было выявлено снижение числа клеток, экспрессирующих эту молекулу адгезии у детей с АД.

Так, если у здоровых детей CD 106+ экспрессировали 14,2% клеток, то у больных АД - втрое меньше - 4,98±0,05%. Молекула адгезии VCAM-1 выявлялась преимущественно в клетках лимфоидного ряда (CD 14+ клетки составили только 0,79±0,01%). Следует отметить, что индуцированная экспрессия CD 106+ у детей с АД вдвое превышала показатели спонтанной экспрессии (7,12±0,08% - индуцированная и 4,98±0,05% - спонтанная экспрессия). Вместе с тем как спонтанная, так и индуцирпованная экспрессия CD 106+ у больных АД детей оказалась вдвое ниже показателей, полученных у здоровых детей.

Миелоидный гейт

Рис. 2. Индуцированная экспрессия ICAM-1 у детей, больных атопическим дерматитом.

Условные обозначения:

-экспрессия СБ54+

- коэкспрессия СБ54+СВ14+

- коэкспрессия СВ54+СОЗ+

Следовательно, у больных атопическим дерматитом детей снижается экспрессия VCAM-1 как моноцитами/макрофагами, так и лимфоидными клетками. Причем в клетках миелоидного ряда нарушается и синтез этой молекулы адгезии Снижение экспрессии MA CD 106+ лимфоидными клетками помимо ингибиции ее синтеза может быть обусловлено и миграцией лимфоцитов в очаг воспаления.

Аналогичные данные получены у больных АД детей при исследовании внутриклеточного содержания молекулы адгезии ICAM-1 (CD54), имеющей большое значение в межклеточном взаимодействии, в презентации антигенов (аллергенов) и их распознавании

При исследовании MA CD54+ в клетках моноцитарно-макрофагального ряда было установлено, что число клеток миелоидного ряда, экспрессирующих ICAM-1, достоверно не отличалось как у здоровых (25,4±1,25%), так и больных АД детей (28,7+1,32%; р>0,05). Однако индуцированная экспрессия исследуемой молекулы адгезии у больных АД детей снижалась до 19,5± 1, 13% (р<0,05), в то время как у здоровых детей -повышалась до 32,5+1,34% (р<0,05), что свидетельствует о нарушении функции клеток миелоидного ряда у больных АД детей

Изучение экспрессии ICAM-1 в лимфоидном гейте показало значительное усиление ее синтеза лимфоцитами. Так, спонтанная коэкспрессия CD3+CD54+ у больных АД детей вдвое превышала показатели, полученные у здоровых детей (44,0 ±2,81% -у больных и 22,7±1,82% - у здоровых детей, р<0,05) Причем, спонтанная и

индуцированная экспрессия CD54+ достоверно не отличались, что свидетельствует об истощении клеточных резервов. В то же время у здоровых детей индуцированная экспрессия CD54+ превышала показатели спонтанной (39,2±2,17% - индуцированная и 32,8+1,19% - спонтанная экспрессия; р<0,05).

Таким образом, исследование спонтанной и индуцированной экспрессии молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 показало нарушение их синтеза клетками миелоидного ряда и усиление синтеза ICAM-1 лимфоцитами, что свидетельствует об активации иммунных процессов у больных АД детей. Значительное повышение числа CD54+ лимфоцитов свидетельствует о нарушении процессов дифференцировки клеток лимфоидного ряда и возможном развитии аутосенсибилизации.

Провоспалительные цитокины у детей, больных атопическим дерматитом. Межклеточные взаимодействия в иммунной системе опосредуются продуктами взаимодействующих клеток - цитокинами. Цитокины являются медиаторами межклеточных взаимодействий в иммунном ответе и развитии воспаления и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма. Выработка цитокинов клетками миелоидного происхождения индуцируется главным образом под влиянием бактериальных продуктов. Кроме того, иницировать синтез цитокинов могут различные метаболиты, сами цитокины, процессы адгезии и фагоцитоза.

В связи с изложенным представляло интерес изучить синтез таких провоспалительных цитокинов как ФНО-а и ИЛ-1 с целью уточнения патогенеза развития воспаления при атопическом дерматите у детей.

ФНО-а участвует в реализации местных и системных проявлений воспаления, усиливает экспрессию МА на эндотелии, влияет на макрофаги, моноциты, нейтрофилы, усиливает апоптоз. Участвует в реализации цитотоксического действия NK и ЛАК-клеток и др.

При исследовании экспрессии ФНО-а у больных АД детей в миелоидном гейте не было выявлено достоверных различий между показателями здоровых и больных АД детей. Так, у пациентов с АД 2,44±0,05% клеток миелоидного ряда экспрессировали ФНО-а (у здоровых - 2,11 ±0,02%; р<0,05). Причем следует отметить, что индуцированная экспрессия исследуемого цитокина не нарушалась (3,75±0,09% - у больных и 3,84±0,04% - у здоровых детей).

Экспрессия ФНО-а в лимфоидном гейте оказалась минимальной: 1,29±0,01% - у больных и 1,31 ±0,01% - у здоровых детей, причем, преимущественно за счет CD 14+ клеток (0,82±0,01% - у больных и 1,72±0,02% - у здоровых детей).

Следовательно, у больных АД детей не было зарегистрировано усиление синтеза ФНО-а.

Синергически с ФНО-а действует провоспалительный цитокин ИЛ-1. ИЛ-1 участвует в запуске начальных этапов иммунного ответа. Это один из

наиболее полифункциональных цитокинов, осуществляющих связь иммунной с другими системами opi анизма.

При оценке экспрессии ИЛ-1 клетками миелоидного ряда было выявлено ее достоверное повышение у больных АД детей (3,54±0,09%; р<0,05) по сравнению со здоровыми детьми (2,23±0,01%).

Индуцированная экспрессия ИЛ-1 у пациентов с АД не отличалась от показателей, полученных у здоровых детей. При этом следует отметить, что индуцированная экспрессия ИЛ-1 у больных АД детей не отличалась от спонтанной экспрессии этого цитокина, что свидетельстывует о нарушении функции моноцитов.

Экспрессия ИЛ-1 в лимфоидном гейте регистрировалась в незначительном числе клеток (0,81+0,01%), причем за счет CD 14+ клеток (0,81 ±0,01%).

Следовательно, у больных АД детей не было выявлено изменения синтеза клетками миелоидного ряда. Усиление спонтанной

экспрессии ИЛ-1 указывает на участие этого цитокина в межклеточном взаимодействии.

Поскольку ИЛ-1 участвует во взаимодействии Т-клеток с моноцитами/макрофагами в запуске иммунного ответа, в частности в 1ечении в него Т-хелперов (CD4+), a ^2 лимфоциты имеют рецепторы для ИЛ-1, представляло интерес изучить содержание CD4+ лимфоцитов и экспрессию синтезируемых ими цитокинов у больных АД детей. Известно, что ТЫ лимфоциты синтезируют ИЛ-2, ИФ-у, ИЛ-3, ФНО-(3 и осуществляют Т-клеточный иммунный ответ, а ТЬ2 лимфоциты синтезируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-3, ИЛ-10, ИЛ-13 и осуществляют гуморальный иммунный ответ. В наших исследованиях была изучена экспрессия ИЛ-4 и ИФ-у,поскольку по коэкспрессии с CD4+ антигеном можно диагностировать ТЫ и ТЬ2 лимфоциты.

Экспрессия ИЛ-4, ИФ-у и уровень у больных атопическим дерматитом детей. При исследовании экспрессии ИФ-у у детей, больных атопическим дерматитом (рис.3) было установлено двукратное снижение числа лимфоцитов, синтезирующих ИФ-у. Так, у здоровых детей число клеток, экспрессирующих ИФ-у составило 4,82±0,19%, а у больных АД -2,12±0,05% (р<0,05). Вместе с тем необходимо отметить, что функция клеток. Экспрессирующих не была нарушена, так как индуцированная

экспрессия как у больных, так и у здоровых детей значительно

превышала спонтанную (19,6+0,45% - у здоровых и 14,0+0,83% - у больных детей). Следует отметить, что ИФ-у синтезировали преимущественно ТЫ лимфоциты (CD4+ ИФ-у+ лимфоциты составили 9,83+0,51%).

При оценке экспрессии ИЛ-4 у больных АД детей была выявлена обратная картина: двукратное увеличение числа клеток, экспрессирующих ИЛ-4 (22,0± 1,17% - у больных и 11,8+0,21% - у здоровых детей). Индуцированная экспрессия ИЛ-1 значительно превышала показатели

спонтанной (33,7± 1,21%) как у больных, так и здоровых детей, что свидетельствует о высокой активности ИЛ-4 синтезирующих клеток.

Оценивая коэкспрессию CD4+HJT-4 положительных клеток было установлено, что ИЛ-4 экспрессировали преимущественно ^2 лимфоциты (18,6±0,37% - спонтанная и 27,9±0,89% - индуцированная экспрессия ИЛ-4+С1М+)

Необходимо отметить, что если число ТЫ лимфоцитов у больных АД детей оказалось достоверно ниже показателей, полученных у здоровых детей, то число ТЪ2 лимфоцитов почти вдвое превышало показатели здоровых детей. Поскольку количество CD4+ лимфоцитов у больных детей (37,2±1,49%) статистически достоверно не отличалось от аналогичного показателя у здоровых детей (41,9±0,81%), становится очевидным, что у детей, больных АД, выявлен дисбаланс выработки цитокинов. Усиленная выработка цитокинов, характерных для ^2, приводит к усилению продукции антител. ИЛ-4 усиливает выработку 1^0 и 1я01, вызывая переключение С-генов иммуноглобулинов. Он повышает экспрессию на В-лимфоцитах и тучных клетках и секрецию CD23+ - низкоафинного рецептора для который потенцирует выработку Эти эффекты

имеют прямое отношение к развитию аллергических реакций.

В связи с изложенным представляло интерес изучить содержание у больных АД детей. Уровень у детей, больных атопическим

дерматитом более чем в 6 раз превышал показатели, полученные у здоровых детей.

Таким образом, у детей, больных атопическим дерматитом, выявляется дисбаланс цитокинового статуса. У больных АД детей изменяется синтез молекул адгезии клетками мчелоидного и лимфоидного происхождения. Угнетение синтеза УСАМ-1 может приводить не только к

происхождения. Угнетение синтеза VCAM-1 может приводить не только к нарушению процессов межклеточного взаимодействия, но и усилению миграции лимфоцитов в очаг воспаления. Усиление экспрессии ICAM-1 и ИЛ-1 лимфоцитами свидетельствует не только о вовлечении иммунной системы в развитие патологического процесса, но и о нарушении процессов дифференцировки Т-лимфоцитов, что и было подтверждено при изучении числа ТЫ и ^2 лимфоцитов. Усиленный синтез ИЛ-4 и увеличение числа "Ш2 лимфоцитов, коррелирующее с нарастанием уровня IgE свидетельствует о дисбалансе -соотношения ТЫ и ^2 клеток, являющемся ведущим механизмом в развитии аллергического воспаления.

Выявленные нарушения в цитокиновом статусе у больных АД обосновывают необходимость использования препаратов, обладающих способностью модулировать уровень цитокинов у пациентов. К таким препаратам относится галавит, обладающий противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Его основные фармакологические эффекты обусловлены способностью воздействовать на функционально-метаболическую активность макрофагов, восстанавливать антиген-представляющую и регулирующую функцию макрофагов, индуцировать продукцию ИЛ-2, изменять дисбаланс CD4 лимфоцитов в сторону ТЫ клеток. Тем самым, снижая активность ^2 лимфоцитов и уменьшая степень сенсибилизации организма.

Методы лечения больных АД детей. На основании установленных нарушений иммунного статуса у больных с атопическим дерматитом нами предпринята попытка усовершенствования лечения этого заболевания, с использованием иммунномодулятора галавита. Этот препарат был избран для терапии исходя из его фармакологических эффектов.

Под наблюдением находились 104 ребенка, больных атопическим дерматитом детей в возрасти от 4 до 7 лет со средней степенью тяжести заболевания (индекс SCORAD от 40 до 60).

Для оценки результатов терапии больные были разделены на две группы. Пациенты первой группы (40 детей) получали традиционное лечение, а второй группы (64 ребенка) - традиционное лечение в сочетании с галавитом. В начале терапии оценивали клинические параметры, а также иммунный статус. Первые 20-30 дней, в зависимости от тяжести процесса, пациенты проводили в стационаре. Далее наблюдение велось амбулаторно (2 визита с интервалами 10-15 дней). По завершению лечения вновь комплексно оценивалось состояние и показатели иммунного и цитокинового статуса. Традиционное лечение включало внутривенное введение 30% натрия тиосульфата, пероральный прием антигистаминных и вазоактивных препаратов, витамины группы А и Е. Наружно у больных с легкой степенью тяжести заболевания использовали 2% ихтиоловую мазь, 2% папавериновую мазь. При пиодермических осложнениях присоединяли мази с 1-2%эритромицина. У больных со средней степенью тяжести и при тяжелом течении АД наружно назначали глюкокортикостероидные мази и кремы (преимущественно пятого поколения - адвантан, элоком, афлодерм), так как

эффектов, чем другие топические глюкокортикостероиды и, следовательно, более приемлемы для использования у детей, особенно, средней и младшей возрастных групп. Системно глюкокортикостероидные гормоны все наблюдаемые нами дети не получали. Это же касается других лекарственных средств, характеризующихся иммуносупрессивным действием. Больным АД детям 2 группы наряду с традиционным лечением назначили иммуномодулятор галавит по 100 мг внутримышечно 1 раз в день на протяжении в среднем 20 дней. При видимом разрешении клинических проявлений заболевания курс инъекций галавита сократили до 15 (4 случая). В целом отмечалась хорошая переносимость препарата. Лишь у одного пациента его введение было прекращено из-за развития индивидуальной непереносимости (аллергический дерматит). У 3 детей отмечалась тошнота через 20-30 минут после введения галавита. Однако эти явления были мало существенны и позволили проводить лечение в полном объеме.

Результаты лечения нами оценивались с использованием следующих критериев. Клиническое выздоровление фиксировали при полном исчезновении основных клинических проявлений АД - эритемы, инфильтрации, шелушения кожи, практически полном исчезновении зуда. При этом сохранялись сухость кожи, особенно в периоральной, параназальной, и парорбитальной областях, на разгибательных поверхностях верхних и нижних поверхностей, преимущественно, в ряде случаев, белый дермографизм.

Значительное улучшение определяли при уменьшении индекса SCORAD на 75 и более процентов, что предполагает значительное, но не полное разрешение основных клинических проявлений АД. Отмечалось наличие на коже пациентов остаточных явлений инфильтрации кожи, субъективно сохранялся незначительный зуд.

Улучшение отмечали при снижении индекса SCORAD после лечения от 40 до 75 процентов. При этом выраженность клинических проявлений АД изменялась незначительно. В случаях отсутствия динамики индекса SCORAD, либо его снижения менее чем на 40% регистрировали отсутствие терапевтического эффекта.

Положительными результатами лечения считали клиническое выздоровление и значительное улучшение, а неудачей — ухудшение или отсутствие положительной динамики.

Результаты лечения детей со средней степенью тяжести АД. Группа 1 состояла из 40 детей АД, получивших традиционное лечение, за 36 больными удалось пронаблюдать до завершения лечения у одного отмечено явление аллергического дерматита на введение препарата, а судьбу троих пациентов проследить не удалось.

Анализируя результаты лечения, мы отметили положительные результаты у 17 детей, что составило 41%. Динамика основных клинических проявлений АД выражалась следующим образом.

Цитокины у больных атопическим дерматитом, получавших симптоматическое лечение. У 40 больных 1 группы до лечения были

исследованы показатели цитокинового статуса, а после лечения у 17. При этом анализировались только показатели пациентов с положительными результатами лечения.

У больных 1 группы, получавших общепринятую терапию, в миелоидном гейте отмечается достоверное повышение числа клеток, экспрессирующих VCAM-1 (4,89+0,06% - до лечения и 11,89+0,29% - после лечения; р<0,05). Повышается и уровень индуцированной экспрессии этого цитокина от 3,61±0,08% до 5,58±0,14% (р<0,05), хотя он не достигает показателей здоровых детей (7,91 ±0,17%; р<0,05). Также отмечается и увеличение числа CD 14+ клеток, коэкспрессирующих CD106+. При оценке экспрессии VCAM-1 в лимфоидном гейте у больных, получавших симптоматическое лечение, выявлено усиление только спонтанной экспрессии исследуемой молекулы адгезии за счет CD 14+ клеток (4,98±0,05% - до лечения и 11,2±0,62% - после лечения; р<0,05). Следует отметить, что как спонтанная, так и индуцированная экспрессия VCAM-1 не достигла показателей, полученных у здоровых детей.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что после завершения традиционной терапии у детей даже со значительным улучшением и клиническим выздоровлением не наблюдалось нормализации цитокинового статуса. Можно говорить лишь о незначительной активации межклеточного взаимодействия иммунокомпетентных клеток.

Исследование экспрессии другой молекулы адгезии - ICAM-1, играющей ведущую роль во взаимодействии антигенпрезентирующих клеток и лимфоцитов показало двукратное увеличение CD54+ клеток в миелоидном гейте (51,1 ±2,92% - после лечения и 28,7±1,32% - до лечения; р<0,05). Однако индуцированная экспрессия этой молекулы адгезии не отличалась от показателей больных АД, не получавших лечение (19,5 ±1,13%); и получивших его (16,1 ±0,83%). Поскольку индуцированная экспрессия MA ICAM-1 не достигла показателей здоровых детей (32,5±1,34%) можно думать о сохраняющемся нарушении функции клеток моноцитарно/ макрофагального ряда.

При исследовании внутриклеточной продукции MA ICAM-1 в лимфоидном гейте также было установлено ее усиление у больных АД после проведения традиционного лечения. Спонтанная экспрессия CD54+ составила 64,6+3,29%, хотя индуцированная экспрессия этой МА не изменялась. При этом следует отметить, что у пациентов после лечения снизилось число активированных CD3+ лимфоцитов. Только 27,3±1,95% Т-лимфоцитов коэкспрессировали MA ICAM-1. Индуцированная экспрессия этой МА не превышала 11,9±0,93% (43,5±2,37% - у больных до лечения). Такая низкая экспрессия CD54+ у больных после лечения (в 2 раза ниже по сравнению со здоровыми детьми -22,5±1,96%) свидетельствует об истощении клеточных резервов и нарушении иммунных процессов, обеспечивающих презентацию антигенов и запуск пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.

При исследовании спонтанной и индуцированной экспрессии в миелоидном гейте практически не было выявлено достоверного изменения исследуемого цитокина после проведения симптоматической терапии.

Аналогичные данные были получены при исследовании этого цитокина в лимфоидном гейте.

В миелоидном гейте спонтанная экспрессия ИЛ-1 составила 6,78±1,01%, в то время как у больных до лечения она не превышала 3,54±0,09% (р<0,05). Причем ИЛ-1 экспрессировали преимущественно CD 14+ клетки - 5,42±0,06%. В то же время, индуцированная экспрессия ИЛ-1 оказалась ниже - 5,16+0,09%, что еще раз подтверждает высказанное предположение о нарушении функции клеток

моноцитарно/макрофагального происхождения.

Число ИЛ-1 положительных клеток лимфоидного гейта оказалось невысоким (3,21+0,08%), хотя и превышало показатели, полученные у детей до лечения (1,38+0,02%; р<0,05), но не отличалось от данных, выявленных у здоровых детей (3,63±0,02%).

Таким образом, после проведенной симптоматической терапии у больных АД выявлено незначительное усиление экспрессии MA ICAM-1 моноцитами. Низкий синтез внутриклеточной MA CD54+ свидетельствует о нарушении процессов презентации антигена и межклеточного взаимодействия. Это подтверждается данными, полученными при оценке числа клеток, синтезирующих внутриклеточные провоспалительные цитокины ИЛ-1 и ФНО-а.

Исследование экспрессии ИЛ-4 у детей после проведенного общепринятого лечения не выявило достоверных изменений по сравнению с данными, полученными у детей до лечения. Так, спонтанная экспрессия ИЛ-4 у больных до и после лечения практически не отличались, а индуцированная экспрессия ИЛ-4 у детей, больных АД, после лечения имела тенденцию к снижению (33,7± 1,21% - до лечения и 28,7±1,43% -после лечения). Количество "Ш2 лимфоцитов практически не изменялось (27,9±0,89% - до лечения и 26,8±1,21% - после лечения).

При изучении индуцированной экспрессии ИФ-у также не было выявлено достоверных изменений этого пчтокина в динамике лечения (14,0+0,83% - до лечения и 11,4+0,71% - после лечения). Следует отметить, что показатели индуцированной экспрессии ИФ-у оставались достоверно более низкими по сравнению с данными, полученными у здоровых детей (19,6±0,45%; р<0,05). Необходимо обратить внимание на тот факт, что коэкспрессия ИФ-у и CD4+ антигена на лимфоцитах у больных АД детей после проведенного лечения оказалась достоверно ниже по сравнению с результатами, полученными у этих детей до лечения.

Полученные данные свидетельствуют о том, что проведенные лечебные мероприятия не оказали положительного влияния на выявленные нарушения цитокинового каскада. Сохраняющийся дисбаланс ТЫ и "Ш2 лимфоцитов, усиление гуморальной составляющей иммунного ответа не

позволило добиться значительного снижения уровня IgE. Несмотря на снижение этого класса иммуноглобулинов у детей, больных АД, он достоверно превышал показатели, полученные у здоровых детей (417,9±18,3 МЕ/мл - до лечения, 231,7+15,4 МЕ/мл - после лечения и 67,3+5,32 МЕ/мл -у здоровых детей).

Результаты комплексного лечения больных АД средней степенью тяжести с использованием галавита. Больным АД детям (63 лиц) группы 2 в комплексную терапию был включен иммуномодулятор галавит. Положительные результаты лечения (значительное улучшение и клиническое выздоровление) зарегестрированы у 46 больных (80%).

Цитокины у больных атопическим дерматитом на фоне лечения галавитом. Исследование цитокинового статуса у 46 (значительное улучшение и клиническое выздоровление) пациентов с легким течением АД, которые в комплексной программе лечения получали галавит, была выявлена положительная клинико-лабораторная динамика. Так, после введения галавита у больных АД в миелоидном гейте отмечено увеличение числа позитивных клеток по MA ICAM-1 до 35,1 ±1,73% (до лечения-19,5+1,13%; р<0,05). Показатели спонтанной и индуцированной экспрессии CD54+ достоверно не отличались от данных, полученных у здоровых детей (

Аналогичные данные были получены при изучении экспрессии МА ICAM-1 у больных АД детей в лимфоидном гейте. В динамике лечения галавитом индуцированная экспрессия CD54+ достоверно снизилась (от 45,7±2,56%; р<0,05). Спонтанная экспрессия исследуемой молекулы адгезии оставалась повышенной (52,9+2,93%), но была достоверно ниже показателей больных, получавших симптоматическое лечение.

При оценке внутриклеточной MA VCAM-1 отмечено усиление ее индуцированной экспрессии (3,61+0,08% - до лечения и 5,62±0,)3% - после лечения). Следует отметить, что экспрессия рецепторов исследуемого цитокина оказалась ниже показателей здоровых детей (7,91 ±0,17% -индуцированная экспрессия CD 106+ у здоровых детей).

При исследовании этого показателя у больных АД в лимфоидном гейте установлено усиление синтеза внутриклеточной MA VCAM-1 после лечения галавитом (7,12±0,08% - до лечения и 18,3± 1,38% - после лечения; р<0,05). Отмечено также повышение спонтанной экспрессии CD 106+ у этой группы больных. Выявленные изменения динамики MA VCAM-1 статистически достоверно не отличались от результатов исследования, полученных у здоровых детей.

Следовательно, положительная динамика экспрессии молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 свидетельствует о восстановлении антиген-представляющей и регулирующей функции макрофагов, влияющих на этапы запуска иммунного ответа и дальнейшую дифференцировку Т-лимфоцитов.

Большое значение, на наш взгляд, имеет активация выработки провоспалительных цитокинов. Как в миелоидном, так и в лимфоидном

гейте выявлена повышенная спонтанная и индуцированная экспрессия ФНО-а иИЛ-1.

В миелоидном гейте спонтанная экспрессия ФНО-а составила 4,91 ±0,09%, что достоверно превышает показатели больных детей до лечения (2,44+0,05%) и здоровых детей (2,11+0,02%). Индуцированная экспрессия ФНО-сс оказалась выше по сравнению с детьми остальных групп. Следует отметить, что ФНО-а продуцировали преимущественно клетки моноцитарного ряда (коэкспрессия СБ 14+ и 'ФНО-а составила 4,31+0,09% - спонтанная и 3,95±0,06% - индуцированная).

Более высокие показатели индуцированной экспрессии ФНО-а получены при ее изучении в лимфоидном гейте (8,38+0,21%). Причем клетки моноцитарного ряда составили 55,8%. Продукция внутриклеточного ФНО-а почти в три раза превысила показатели здоровых детей.

Аналогичные данные были получены при исследовании провоспалительного цитокина ИЛ-1. У больных АД в миелоидном гейте отмечено повышение как спонтанной, так и индуцированной экспрессии исследуемого цитокина (6,37±0,09% - спонтанная и 8,08+1,02% -индуцированная экспрессия ИЛ-1). ИЛ-1 экспрессировали преимущественно клетки моноцитарно/макрофагального ряда (коэкспрессия СБ14+КЛ-1 составила 6,81±0,10% и 5,83±0,19% - для индуцированной и спонтанной экспрессии).

При исследовании ИЛ-1 в лимфоидном гейте было установлено менее значимое повышение внутриклеточного содержания этого цитокина. Так, индуцированная экспрессия ИЛ-1 составила 3,61+0,07%, в то время как спонтанная - 3,08+0,12%. Необходимо отметить, что ИЛ-1 синтезировали клетки моноцитарного ряда.

Таким образом, введение галавита в комплексную программу лечения больных атопическим дерматитом способствовало нормализации функционирования их цитокинового статуса, заключающейся в стабилизации процессов межклеточного взаимодействия и запуска цитокинового каскада начальных этапов иммунного ответа. Выявленное повышение экспрессии провоспалительных цитокинов (в большей степени ИЛ-1) ведет к урегулированию процессов дифференцировки Т-лимфоцитов, поскольку ТИ клетки имеют рецептор для ИЛ-1. Кроме того, ИЛ-1 способствует экспрессии генов ИЛ-2 и рецепторов для него, что, по-видимому, способствует переключению синтеза противовоспалительных цитокинов и повышает число ТЫ лимфоцитов.

Это предположение было подтверждено при исследовании экспрессии ИЛ-4 и ИФ-у у больных АД детей после лечения галавитом.

При исследовании экспрессии ИФ-у у больных 2 группы было установлено значительное повышение его спонтанной экспрессии (10,6+0,62% - после лечения и 2,12+0,05% - до лечения). Индуцированная экспрессия ИФ-у имела тенденцию к увеличению (16,3+0,78% - после

лечения и 14,0+0,83% - до лечения). По сравнению с больными 1.1 группы, получавшими симптоматическую терапию, отмечено достоверное увеличение экспрессии этого цитокина.

При исследовании числа ТЫ лимфоцитов установлено их достоверное повышение от 9,83±0,51% (до лечения) до 12,5±0,21% (после лечения; р<0,05). Полученные данные вдвое превышали показатели, установленные у детей, получавших симптоматическое лечение (5,36+0,17%; р<0,05).

Увеличение числа ТЫ коррелировало со снижением количества ТЬ2 клеток. У боьных 12 группы отмечено снижение как спонтанной (14,6+0,32% - после лечения и 22,0± 1,17% - до лечения; р<0,05), так и индуцированной (25,8±1,32% - после лечения, 33,7± 1,21 % - до лечения; р<0,05) экспрессии ИЛ-4. Соответственно снижению экспрессии ИЛ-4 снизилось и число ТЬ2 лимфоцитов, коэкспрессирующих CD4+HЛ-4. До лечения их количество составило 27,9±0,89%, а после лечения - 21,0+0,67% (р<0,05).

Уменьшение числа ТЬ2 лимфоцитов повлекло за собой и снижение активности В-лимфоцитов, являющихся продуцентами ^Е. Уровень ^Е у больных Ш группы снизился от 417,9±18,3 МЕ/мл до 122,2±9,04 МЕ/мл (р<0,05) и оказался достоверно ниже по сравнению с больными, находившимися на общепринятой терапии (231,7±15,4 МЕ/мл; р<0,05), но еще не достиг показателей здоровых детей (67,3±5,32 МЕ/мл; р<0,05).

Таким образом, введение галавита в комплексную программу лечения больных атопическим дерматитом способствовало восстановлению нарушенного механизма синтеза цитокинов от начальных этапов инициации иммунного ответа с участием молекул адгезии 1САМ-1 и VCAM-1 с последующим подключением провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1, способствовавших изменению направления дифференцировки ТЬ лимфоцитов за счет усиления синтеза и снижения ИЛ-4. В конечном

итоге у больных отмечено снижение степени аллергического воспаления, подтвержденное достоверным снижением уровня ^Е.

На основании вышеизложенного можно полагать, что выявленные нарушения цитокинового статуса при АД носят патогенетический характер и системное использование иммуномодуляторов, оказывающих влияние на цитокиновый каскад при АД имеет серьезную терапевтическую перспективу.

Выводы

1. У больных атопическим дерматитом детей наблюдаются выраженные нарушения цитокиновой регуляции. Такие изменения зафиксированы как в миелоидных, так и в лимфоидных клетках и проявляются в повышении спонтанной и индуцированной экспрессии проваспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-альфа, молекулы

межклеточного взаимодействия УСАМ-1, снижения экспрессии ИНФ-у и повышении ИЛ-4

2. Выявленные изменения цитокинового статуса носят глубокий патогенетический характер и приводят к нарушениям иммунного статуса следствием чего являются увеличение числа ^2 лимфоцитов и гиперпродукция иммуноглобулинов класса Е. Такие нарушения в сочетании с триггерными факторами способствуют формированию аллергического воспаления и стимулируют основные клинические проявления АД.

3. Традиционное лечение среднетяжелой формы атопического дерматита у детей даже при положительных результатах лечения не сопровождается нормализацией цитокинового статуса. Сохраняется повышенная индуцированная и спонтанная экспрессия провоспалительных цитокинов, низкие показатели ИФН-у и повышение ИЛ-4.

4. Нарушение цитокинового статуса при АД требует терапевтической коррекции. Включение в комплексную терапию среднетяжелой формы заболевания препарата галавит оказалось эффективным. При его использовании отмечалось улучшение клинической картины заболевания, сочетающейся с благоприятными изменениями цитокинового статуса. Положительная динамика экспрессии молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 свидетельствует о восстановлении функции макрофагов, способствует снижению уровня IgE и нормализации дифференцировки Т-лимфоцитов, ведущих к снижению степени сенсибилизации организма.

5. Клиническое применение комплексной программы лечения среднетяжелой формы атопического дерматита у детей позволяет добиться более высокой эффективности, чем при традиционной терапии. Быстрее регрессировали явления зуда, эритемы, инфильтрации. Количество положительных клинических результатов было в 2 раза выше, чем при традиционном лечении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Каблави Н.Ф. Особенности иммунного статуса у детей с атопическим дерматитом. // Конференция молодых ученых и специалистов Рост ГМУ. - 2002. С. 86.

2. Зотова В.В., Темников В.Е., Ефремова Е. Ф., Каблави Н.Ф. Цитокиновый статус у детей с атопическим дерматитом. // Первый Российский конгресс дерматовенерологов. -С.Петербург.-2003Л.1.-С. 193.

3. Темников В.Е., Зотова В.В., Ефремова Е.Ф., Каблави Н.Ф. Галавит в комплексной терапии больных атопическим дерматитом.// Там же. -С. 210

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч -изд.-л. Заказ № 573. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул Суворова, 19, тел. 247-34-8