Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Оценка состояния гидроксилирующих систем печени и надпочечников в условиях антиканцерогенного действия ретиноида

'Ы и.1! а ъ \

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ, ОНКОЛОГИИ И РАДИОБИОЛОГИИ им. Р. Е. КАВЕЦКОГО

На правах рукописи

ПЯТЧАНИНА Татьяна Витальевна

оценка состояния гидроксилирующих

систем печени и надпочечников в условиях антиканцерогенного действия ретиноида

14.00.14 — онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев — 1992

Работа выполнена в Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е. П. Сидорик

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е. А. Баглей доктор биологических наук А. Л. Воронцова

Ведущее учреждение: НИИ онкологии и медицинской радиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск.

Защита состоится «

1992 г. в_

.мин.

на заседании специализированного совета Д 016.38.01 по защите диссертаций при Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины (252022, г. Киев-22, ул. Васильковская, 45).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

_1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ю. в. яниш

»

»

ЗТЕГАктуальность проблемы. Профилактика рака остается одной из осн'овнь^х нерешенных проблем современной медицины. Этот факт активизирует поиск средств, воздействующих непосредственно на кан-Jji3gçjpgife3, с целью предупреждения возникновения и задержки роста "опухолей. В этом плане несомненный интерес представляют ретиноиды - природные и синтетические аналоги витамина А, используемые в качестве химиопрофилалтических агентов при новообразованиях различных локализаций. Среди представителей этой группы средств ретиноиды ввделяются многообразием оказываемых юли эффектов и способностью к ингибированию всех стадий канцерогенеза - ш;;циа-ции, лромоции и прогрессии опухолей (Александров З.А. и др., 1991, Bolli-i- W. et al, 1983, :.;оод n.C. et CLl., 1983).

Ретиноиды, как свидетельствуют многочисленные экспериментальные исследования, являются эффективными ингибиторами канцерогенеза молочной железы у крыс, индуцированного полициклическими ароматическими углеводородами и нитрозосоодинениями ( ;/.cGo.T.ioic D.L. et til. , 1980,1982, ïisioch c.w. et 1964). Антикан-

церогенное действие ретиноидов выражается в уменьшении вероятности возникновения предопухолевых образований к опухолей, увеличении продолжительности жизни животных с опухолями и снижении количества рецидивов ( Gar.dilhon Ph. vit ni, 1982,xtind-irkar о.Y. ut al. , 1983, l'oCorixlcic D.L.

et.;.l, 1983,1985).

Изучение молекулярных механизмов действия витамина А, осуществляющееся по нескольким взаимосвязанным направлениям, позволило выдвинуть ряд гипотез, касающихся предотвращения ретиноида-ми инициации канцерогенеза - модулирование процессов, связанных с энзиматически опосредованной активацией канцерогенов, детокси-кацией их метаболитов, блокирование взаимодействия электрофиль-ных продуктов с макромолекулами клетки (Кханяуджа К.Л., Есакова Т.Д. И др., 1977, :.:tatv. H.G. et cl. , I960, ¿¿„ar.liy Ù.L. et r.l, 1967). Антибластическая активность ретиноидов включает подавление пролиферации трансформированных клеток и индукцию их диффе-ренцировки (Ьутенко З.А. и др., IS9I, Lot ,п л. , I960, .;рсхт. et Л , 1984).

Одно из направлений, исследующее способ действия витамина А, состоит в выяснении его роли в функциональном состоянии биологических мембран и процессах, протекающих с участием момбр^носм-эанннх ферментов (Богданов К.Г. и др., 1966, л .

¡••;ll et r-l , 1986). Особенно значимым в плане изученил ан-

тиканцерогенных свойств ретиноидов при химически ■/H;:j\i/y,r

канцерогенезе является аспект влияния витамина А на мембрано -зависимые ферментные системы гидроксилирования эндогенных и экзогенных соединений. Важность отого аспекта становится очевидной, если учесть, что различные изозимы цитохрома Р-450 - терминальной окскдазы электронтранспортной цепи в мембранах микросом, вовлечены в детоксикацию и/или активацию ксенобиотиков, также как и деградацию эндогенных субстратов, таких как, например, стероидные гормоны (Эмануэль Н.М., Сидорик Е.П., 1976,1979, Худолей В.В. и др., 19Ш, i?ci;:on.;fi О. ct -jl', 1962).

Другим важным аспектом, подчеркивающим актуальность изучения функционального состояния детоксицирующей системы, при выяснении механизмов антиканцерогенного действия витамина А является многогранная связь между метаболизмом ретиноидов и ксенобиотиков, приводящая к снижению степени обеспеченности организма витамином А (Knnnvrlrth J.V.. «t .-1 , 1976, Kv.lin .т.п. ct ni, 19Ь9). Способность ксенобиотиков к индукции цитохром Р-450-зависимой моноокси-гелазной системы приводит к уменьшению в печени содержания ретиноидов, деградация которых, как считают (Конь И.Я., 1980,1987, i/.-o I.'.;.. i-t гД, 1985,1966), в определенной степени связана с функциональным состоянием этой системы. Снижение степени обеспеченности витамином А, как естественным регулятором гомеостаза, отразится не только на протекании ряда ключевых процессов жизнедеятельности, но также на скорости развития предопухолевых поражений и характере точения опухолевого процесса.

Как известно, опухолевый процесс в молочной железе крыс, индуцированный А'.'ЬА, протекает на фоне гормонального дисбаланса в организме, вызванного адренолитическкм и токсическим действием ка!1церэгена и его метаболитов, нарушением процессов стероидогене-за, изменением функционального состояния ферментных систем, ответственных за биосинтез и инактивацию стероидных гормонов Cfyp-кеьич Н.М. и др., 1968,1975, Сачуедкан Е.М. и др., 1979).

• Таким образом, все вышеизложенное определяет актуальность исследований, направленных на выяснение механизмов молекулярного действия витамина Л при канцерогенезе в плане установления связи мезду регуляторным влиянием его на ключевые звенья систем гидроксилирования в мембранах ряда органов, обеспечивающих биосинтез и ферментативную инактивацию стероидов^ и его ингибирующим действием при канцерогенеза молочной железы.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение роли ги-дроксилируюшис систем печени и надпочечников в молекулярных меха-

ннэмах антиканцерогенного действия ретиноида на модели канцерогенеза молочной железы у крыс, индуцированного 7,12-диметилбенз/а/ антраценом (ДМЬА).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ряд показателей канцерогенеза, индуцированного ДМБА (средняя продолжительность жизни (СПл) животных с опухолями молочной железы (ОШь), латентный период (ЛП) возникновения опухолей, скорость возникновения и роста OMJu, частота медленно-, умеренно- и быстрорастутцих опухолей), при различных режимах введения ацетата ретинола (АР) с обеспечением патоыорфологического контроля.

2. Изучить степень обеспеченности животных витамином А на ранних этапах канцерогенеза молочной железы, в условиях антиканцерогенного действия АР и у животных с ОМл.

3. Оценить методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) содержание феррицитохрома Р-450 на ранних этапах канцерогенеза молочной железы, в условиях химиопрофилактического действия АР и у животных с ОШ при различных режимах введения ретиноида.

4. Оценить методом ЭПР-спектроскопии содержание феррицитохрома Р-450 и железосерного белка адренодоксина в надпочечниках крыс на ранних этапах канцерогенеза молочной железы, в условиях химиопрофилактического действия АР и у животных с ОДОк при различных режимах введения ретиноида.

Научная новизна. В результате комплексных исследований влияния АР на канцерогенез молочной железы у крыс, индуцированный даБА, установлена возможность получения ингибирующего эффекта на стадии инициации и прогрессивного роста опухолей посредством применения ретиноида в различных режимах как одного, так и совместно с гормонами; установлена наибольшая эффективность его антиканцерогенного действия при профилактическом применении и при терапии массивными дозами одновременно с гормонами. Впервые установлено снижение обеспеченности организма животных витамином А на ранних этапах канцерогенеза;в условиях профилактического введения повышенных количеств АР (суммарная доза 100 тыс. ME) на фоне сохранения высокого уровня содержания ротиноидов в печени крыс выявлена нормализация содержания феррицитохрома Р-450 и адренодоксина в надпочечниках животных. В печени животных с опухолями енервы ч установлено повышение (однако не до уровня ноукы) содержания феррицитохрома Р-450 при профилактическом введении массивных количеств А? (суммарная доза 1-М и 20U тис, MIC). У.'ул отсутствии у 1-53^ 3

животных симптомов интоксикации (в рамках изучаемых параметров) в период введения препарата и незначительный период после окончания его применения впервые выявлено под влиянием массивных доз АР (суммарная доза 200 тыс. ME) снижение содержания феррицитохрома Р-450 как в печени, так и в надпочечниках и адренодоксина в надпочечниках крыс через 2,0 й 3,5 мес. после окончания введения препарата, что свидетельствует о повреждении мембран органелл клетки АР, поступающим в массивных дозах.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы обосновывают принципиальную возможность использования АР в повышенных и массивных дозах в качестве ингибирующого агента канцерогенеза молочной железы при различных режимах его применения. Получены доказательства в пользу мембранной теории действия витамина А, включающие влияние его на уровень ыембраносвязанных ферментов и процессов, протекающих с их участием, при канцерогенезе молочной железы как на ранних стадиях, так и в процессе роста опухолей. Доказана возможность применения показателя содержания и активности ключевых компонентов гидрокислирующих систем печени и надпочечников в качестве критериев эффективности действия ретиноида. Результаты работы, свидетельствующие о снижении обеспеченности организма витамином А при токсическом влиянии канцерогена, могут быть использованы для обоснования рационального применения рети-ноидов в группах риска.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на 1У Национальном онкологическом конгрессе с международным участием (София, 1965), на УП Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Москва, 1989), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990), на УП Международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрома Р-450; структура и функция, биотехнологические и экологические аспекты" (Москва, 1991), на заседании экспертного совета по апробациям докторских и кандидатских диссертаций Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого АН Украины 30 января 1992 г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 8 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего

260 источников (70 отечественных и 190 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 18 рисунками и 23 таблицами.

СОДЕРШИЕ РАЬОТЫ Материалы и методы исследований

Исследования выполнены на 525 нелинейных крысах-самках разводки вивария Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого АН Украины, которые содержались на стандартном рационе. ОМк индуцировали у крыс в возрасте 50-60 сут. посредством введения /ЩБА (Р1и3са, 'зивсь , Швейцария) двумя способами: 1-кратным пероральным в дозе 20 мг/жив. и 3-кратным внутривенным в составе водно-жировой эмульсии в суммарной дозе б мг/жив. с интервалом I неделя. В работе использовали АР - 3,44% масляный раствор (аптечный препарат, Уманский витаминный завод, Украина), который вводили перорально в дозе 10 тыс. МЕ ежедневно. Применяемую однократную дозу Ю тыс. МЕ считали повышенной, так как она значительно превышает суточную физиологическую потребность.

Использовали различные режимы применения АР: профилактический (10 тыс.МЕхМ) - введение витамина А, предшествующее введению ДМЬА; (10 тнс.МЕх20) - 5 раз до введения ДМЬА, 15 раз одновременно с 3-кратным введением канцерогена; (10 тыс.МЕх15) одновременно с 3-кратным введением ДМЬА. Введение АР с терапевтической целью, после пальпаторного обнаружения ОМл. и вплоть до гибели животных (максимальный срок воздействия - 6,5 мес.). Введение АР с терапевтической целью в том же режиме, одновременно с гормонами. Гормоны вводили посредством 4-компонентньк циклов, в физиологических дозах, в ритме нормального эстрального цикла животных. Последовательно I раз в сутки подкожно или внутримышечно вводили: инсулин - 0,1 ед. в 0,5 мл физиологического раствора, преднизолон - 280 мкг в 0,2 мл спиртосолевого раствора, 17сС -оксипрогест'ерон капронат - 200 мкг в 0,2 мл абрикосового масла, тестостерон - 30 нг в 0,5 мл спиртосолевого раствора. После одно-суточного перерыва цикл введения гормонов повторяли.

При постановке эксперимента проводили несколько серий исследований. Изучали эффективность различных режимов введения ретинои-да в ингибиропании канцерогенеза молочной железы. С этой целью ¡ги-вот!!мх распределяли на 5 групп: I - крысы, подвергнутые 3-кратному внутрирсннону введению ДлЬА, 4 опытные группы получали АР в различных режимах: профилактическом (200 тыс,Ж) - 2 гр., одновременно с Д!.ЬА 0.50 тыс.Мг.) - 3 гр., терапевтическом - 4 гр.,

терапевтическом одновременно с гормонами - 5 гр.

Изучали на ранних этапах канцерогенеза влияние АР, введенного в профилактическом режиме, на состояние ключевых компонентов гидроксилирущих систем печени и надпочечников, а также на обеспеченность организма крыс витамином А. I гр. интактный контроль, 2 гр. получала ДМЬА 1-кратно перорально, 3 гр. - АР (100 тыс.МЕ), 4 гр. - АР (как в гр.З) перед введением ДЦВА (как в гр.2). Исследования проводили в следующие сроки - 1,5; 4,0; 6,0; 10,0 час., I; 3; 5; 14 сут. после введения Д«БА.

Изучали влияние АР на состояние ключевых компонентов гидро-ксилирующих систем при введении его интактным животным (200 тыс. МЕ). Исследуемые параметры оценивали через 2,0 и 3,5 мес. после окончания введения препарата.

Оценивали состояние компонентов гидроксилирующих систем как у животных с Оподвергнутых влиянию только ДМЬА, так и в условиях применения АР в различных режимах. Исследования проводили через различные периоды времени после введения Д'АВА у крыс с разной длительностью ЛП. Б печени животных с ОМк оценивали также концентрацию ретинола и его эфира.

В ходе эксперимента крыс еженедельно пальпировали. При выявлении опухолевых узлов фиксировали сроки их появления и место расположения, вычисляли площадь опухоли посредством измерения двух вэаимноперпендикулярных диаметров. О характере течения опухолевого процесса и эффективности действия АР судили по оценке следующих параметров: И к животных с ОМд» (сут.), увеличение С1Ж крыс опытных групп по сравнению с контролем (%), скорость возникновения ОМл. (количество О'.Ь./жив.), скорость роста 0М& (см^/жив.), частота медленно-, умеренно-, быстрорастущих опухолей №).

Для проведения гистологической верификации* опухоли после изъятия фиксировали в Ь% формалине, заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Определяли гистологический тип опухоли, соотношение стромы и паренхимы, интенсивность лимфо-цитарчоН инфильтрации и некробиотических процессов, наличие секреторных изменений в клетках опухолей (^оши; й. с^ а1 , 1973).

Степень обеспеченности организма витамином А оценивали посредством определения суммарной концентрации ретинола и ретинило-вого эфира в печени методом прямого спектрофотометрирования на

*-Гистологические исследования проводили с консультативной помощью кандидата Отологических наук Н.С.Гутник.

СФ "зреоога ист!"" с предварительной очисткой образца омылением. Критерием применимости СФ-метода для определения витамина А в образце служили следующие показатели: I) четко выраженный максимум на спектральной кривой при Л = 324-227 ны., 2) отношение Едвд : Е325^0>73 • отношение Е^цгЕ^^О.бО . (А.А.дмитровский, 1979). Концентрацию витамина А выражали в мкг/г печени или в мкМ/г. Образцы для определения витамина А замораживались непосредственно после декапитации и хранились в жидком азоте.

Исследование парамагнитных центров печени и надпочечников проводили методом ЭПР-спектроскопии на радиоспектрометре РЭ 1307 при 77 К. Образцы готовились из нативных органов непосредственно после декапитации при помощи стандартной пресс-формы, замораживались и хранились в жидком азоте. Измеряли интенсивность сигналов ЭПР, амплитуда которых пропорциональна содержанию в тканях соответствующих парамагнитных центров, оценивали ее относительно амплитуды эталона (кристалл рубина) и выражали в относительных единицах (отн.ед.). Исследовали парамагнитные металлопротеины цитохром Р-450 (цит.Р-450) с гемовым железом в окисленной низкоспиновой форме, количественную оценку которого проводили по наиболее интенсивной компоненте с ^-фактором 2,25 в тканях печени и надпочечников (НасЬ.1по-ьо у. et г.1,1962) и парамагнитный железо-серный белок коры надпочечников адренодоксин с негемовым железом в восстановленном состоянии, количественную оценку которого проводили по компоненте с ^--фактором 1.94 (7.'а4аг1 И. еЪ 1966).

Фактический материал обрабатывали статистически с помощью параметрических и непараметрических критериев вариационной статистики. Для оценки достоверности различий использовали ^ -критерий Стыодента и критерий ^-Вилкоксона-Манна-Уитни (Г.Ф.Лакин, 1968, Е.В.Гублер и др., 1973).

Основные результаты исследований и их обсуждение

Антиканцерогенное действие АР и состояние А-витаминного статуса животных при различных режимах применения ретиноида в период канцерогенеза молочной железы.

При изучзнии эффективности различных режимов применения роти-ноида руководствовались фактом многостадийности канцерог^нзза молочной железы у крыс, а также даншии об антиканцерогенно," активности ретиноидов при канцерогенезе молочной железы у ку>л в условиях хронического эго введения путем вклкчония р. диету ( яу1з\-.-опЬ. С, et Г.1 . 1966, »Л1'.гт. С."/, гс -1 .

?

ТАБЛИЦА

влияние витамина А на среднюю продолжительность е13ни, латентный период и частоту распределения он по скорости роста у крыс / м + гп /.

показатели группа а шотных

I 2 3 4 5

лп возникновения первой оме, сут. 52,1 + 6,5 90,3 + 17.3 51,ь + 7,8 /ЪТ,2%/ 149,0 + 23,9 /467то/ 68,1 + 9,9 53,4 + 4,2 /8775%/ 177.7 +24,6 л 2,5*/ - -

с1ш, сут. 92,6 + 14,4 128,3 + 12,/ 109,9 + 17,8 137,0 + 13,2х 145,0 + 9,8 х

увеличение спл опытных крыс по сравнению с контролем, % - 38,5 2 18,7 % 47,9 Ъ 56,6 %

частота медленнорастущих ош, % частота умеренно-растущих омж, % частота быстрорастущих от, у, 19,2 + 4,0 28,2 ± ь,0 ь2,6 + 6,0 X 45,9 * 8,0 29,7 + 8,0 X 24,3 + 7,0 35,3 + 6,0 26,5 + 5,0 38,2 + 6,0 X 53,3 + 8,0 40,0 + 8,0 X 6,7 + 4,0 X 51,8 + 7,0 44,6 + 6,0 X 3,6 + з,и

x - различия показателей опытных и контрольной 1рупп статистически значимы /р/ 0,05/.

щий эффект АР, поступающего в организм крыс ежесуточно (10 тыс. ME) короткий (2-3 нед. гр.2 и 3) промежуток времени в стадию инициации канцерогенеза и более длительный период (гр.4 и 5) в стадию опухолевого роста, проявился в увеличении СПк животных с ОМЗа всех групп по сравнению с контрольной (таблица).

Наиболее выраженный терапевтический эффект был получен в гр.5, что отразилось наряду с увеличением СГйг. и в распределении опухолей по скорости роста. При изучении активности ретиноида, введенного на стадии инициации опухолей, получено увеличение средней продолжительности ЛП возникновения 0М& в гр.2, получившей АР в суммарной дозе 200 тыс. ME. Наблюдалась тенденция к распределению животных 2 и 3 гр. в зависимости от продолжительности ЛП - от I до 3 мес. (ранние опухоли ) и свыше 3 мес. (поздние опухоли ) (таблица).

При анализе распределения 0I&. короткого ЛП по гистологиче- ' скому типу отмечена более высокая частота (%) аденокарцином и солидных карцином (35,2 + 8,0) в контроле, в гр.2 преобладали папиллярные (28,4+ 11,0) и криброзные (14,2+ 10,0) карциномы. Среди ОШ длительного ЛП аденокарциономы также встречались чаще в контроле (33,3+ 7,0), чем в гр.2 (12,0 + 7,0), а в гр.З они не обнаружены. В опытных группах отмечено достоверно большее число {%) доброкачественных ОМл. с длительным ЛП: контроль - 38,0 + 8,0, гр.2 - 72^0 + 9,0, гр.З - 8б14 + 14,0 и достоверно большее число ОМл со слабой степенью лимфоцитарной инфильтрации: контроль - 7,7 + 5,0, гр.2 - 50,0 + 15,0, гр.З - 37,6 + 12,0. Для ОШи контроля характерна умеренная лимфоцитарная инфильтрация -57,6+ 10,0, что согласуется с данными (Картавова Н.С. и др., 1986). В 66,6% злокачественных 0Мь> 2 гр. и 52,9% 3 гр. короткого ЛП отмечены секреторные изменения, которые отсутствовали в ОМь контроля. У 67% доброкачественных ОМь длительного ЛП только 2 гр. на разрезе секретирующих опухолей макроскопически обнаруживали большое количество молокоподобной жидкости. Подобные секреторные процессы возникают в OMfo овариэктомированних крыс при применении 17 ß -эстрадиола ( Rees ¿.о. "Л г.1 , IS66) и по мнению (Archer P.E. et al » 1968) свидетельствуют о стимуляции клеточной диффе-рекцировки. Таким образом, можно предполагать проявление свойства ретиноида способствовать клеточной дифференцировке и приводить к фенотипическим изменениям эпителиальных клеток С!<1л (Плецютй К.Д. и др., 1984,Sporn et гД , 1584).

2*-53«к

При оценке распределения ОМЗи крыс, получавших АР в терапевтическом режиме, по гистологическому типу установлено, что частота (%) адснокарцином в гр.4 достоверно вше (47,0+ 12,0), чем в контроле (35,2 + 8,0), а в гр.5 находится на уровне контроля -37,5 + 10,0. Слабая степень гистолимфоцитарной инфильтрации выявлена в 70,0% ОМа крыс, леченых АР и в 33,0/», получавших АР совместно с гормонами, против 7,7% в контроле. Б этих группах также отмечено увеличение частоты возникновения секреторных изменений в 75,0% 01.Ь. крыс 4 и 5 гр. против 2,6% в контроле.

Таким образом, дня опытных групп в большей степени было характерно наличие доброкачественных 014., при этом профилактическое введение АР способствовало проявлению функции секреции как в злокачественных, так и в доброкачественных ОМи.

Особенность проявления действия АР, введенного на различных стадиях канцерогенеза, раскрывается при изучении кинетических закономерностей опухолевого роста - скорости возникновения и скорости роста 014.. Выявлено, что наибольшей активностью в торможении возникновения новых опухолевых узлов обладает АР, введенный на стадии инициации (гр.2 и 3). Однако, в этих группах происходит эффект обратимости действия АР, отмеченный и другими авторами (1,юсогп1о1с а.ь. еь п1 , 1982). Объяснением прогрессирующей со временем потери профилактического действия АР может быть как зависимость эффекта от дозы, так и высокая скорость персистенции ретиноидов из печени. Задержка в моменте начала введения АР в постканцерогенный период и применение его в терапевтическом режиме (гр.4 и 5) не влияла на скорость возникновения новых ОМк. Наиболее выраженный эффект по подавлению скорости роста ОМк получен в гр.2 и в гр.5.

Следовательно, общая доза играет значительную роль в реализации активности АР, однако, определяющее значение в его эффективности имеет выбор сроков и режимов применения. Сравнение полученных данных позволяет предположить, что АР, введенный на разных стадиях канцерогенеза, действует посредством различных механизмов и торможение кащерогенеза молочной железы витамином А -продолжительный процесс, охватывающий как стадию инициации, так и длительный поспгадцерогенный период. К возможным механизмам антиканцерогенного действия АР следует отнести его способность влиять на весь спектр метаболических реакций, связанных с попаданием канцерогена в организм (кпс-,п<1иог. к.Ь. ел а1 , 1962,1.:сСглЧЬу г.. и ¿1 йЗ , 1967) и влиянием его на ткань молочной железы

в период ее формирования ( Moon R.c. et а1 , 1979), что отражается на чувствительности этого органа к ДМБА.

Для того, чтобы исключить возможность реализации ингибирую-щего эффекта АР вследствие проявления его токсичности на организм крыс, была проведена оценка изменения массы тела животных, подвергнутых как влиянию АР, ДмЪА, так и совместному их применению. Полученные данные показали, что в эксперименте с профилактическим введением АР (ДО тыс.МЕхЮ) и 1-кратным введением ДМБА наибольшим токсическим эффектом обладал канцероген: относительное изменение средней массы тела крыс за 21 сут. составило 18%, за 26 сут. при введении АР - 45%, в контроле за 24 бут. - 56%. При введении ДМБА замедлялся рост животных и отмечалась их гибель, как выявлено ранее (iuggiiw с. et , 1961). Эффект наиболее выраженного замедления интенсивности роста крыс, получивших ДДОЬА, отмечен и в остальных сериях, при этом введение АР (10 тыс.МЕх20) приводило к относительному изменению средней массы тела крыс на 54% против 66% в контроле за 28 сут. При введении АР отсутствовали какие-либо симптомы интоксикации, из которых только можно указать на снижение плотности волосяного покрова на голове крыс в результате незначительного контакта с препаратом при его применении.

Полученные данные свидетельствуют (в пределах изучаемых показателей) об отсутствии выраженных токсических эффектов витамина А, которые могли бы быть фактором, вносящим вклад в антиканцерогенные свойства АР.

Проявление биологической активности витамина А возможно при достаточной обеспеченности им органов- и тканей-мишеней и опредз-ляется, прежде всего, А-витаминным статусом, который в наших исследованиях оценивался на основании определения концентрации ре-тиноидов в печени ( 01зоп J.A. , 1984, Goodman D.G. , 1984). На ранних этапах канцерогенеза молочной железы (рис.1) отмечено стойкое падение концентрации ретиноидов уже с I сут. после введения даБА (20 мг), уровень которых не восстанавливается к 14 сут. (Р< 0,01 - Р< 0,001, кроме значения в 10 час.).

Коэффициент вариации V составляет 3-27% и находится в пределах физиологических значений. Введение АР (10 тыс.МЕхЮ) приводит к значительному повышению исследуемого показателя. При введении ДМБА на фоне профилактического введения АР концентрация ретиноидов в печени остается выше нормы (Р ^ 0,001). Следовательно, можно отметить благоприятный эффект профилактического введанга

Рис Л. Изменение концентрации витамина А в печени ин-тактных крыс (I), крыс, подвергнутых влиянию ДИБА (2), АР (3) и совместному их применению (4). I + 4 - группы животных. Стрелкой указан момент введения ДМЬА. АР на сохранение высокого уровня обеспеченности витамином А при введении ДЧБА, что создает основу для реализации антиканцерогенных свойств ретиноида в стадию инициации.

Оценка состояния микросомальной монооксигенааной системы печени при канцерогенезе молочной железы в условиях регуляторного воздействия ретинодом.

Согласно современным представлениям (Б1;) 1оуапп1 .1. еЬ а1 , 1980, Сиаак и. ët , 1989) ДМЬА для проявления своих цитотокси-ческих, мутагенных и канцерогенных свойств требует энзиматически опосредованной активации, осуществляемой системой микросомальных монооксигеназ печени и молочной железы. Было изучено состояние терминальной оксидазы микросомальной монооксигеназной системы -цит.Р-450 в печени животных на ранних этапах канцерогенеза молочной железы, у животных с 0М& и в условиях применения АР в различных режимах.

На ранних этапах канцерогенеза исследования проводили в сроки, соответствующие времени протекания основных этапов метаболизма даЬА и инициации опухолевого процесса (Лппзз 2.II. сЛ ,1970,. 1972, ЛьЪ-.гс! А. а. а а1 , 1975). Анализ кинетических кривых (рис.2), отрх'-ающих содержание цит.Р-450 в печени, привел к выво-

ду, что ранняя реакция цит.Р-450-зависимой моноокскгеназной системы печени на введение ДМЪА будет обусловлена соотношением токеи-ческих и индукционных свойств канцерогена и его метаболитов.

Рис.2. Динамика содержания окисленной низкоспиновой фор.!ы цитохрома Р—450 в печени крыс, подвергнутых влиянию ДЧЬА (I), АР (2) и совместному их применению (3). Стрелкой указан момент введения ДОЬА.

Влияние АР будет выражаться в индукции цит.Р-450, которая через б сут. приобретает устойчивый характер. Профилактическое введение АР приводит к нормализации уровня цит.Р-450 в течение первых 6 час. (отклонения показателей в сроки 1,5; 4 и 6 час. недостоверны, Р ^ 0,2), а в следующие 13 сут .-к стойкой индукции цит.Р-450. Анализ по обеспеченности витамином А (рис.1) и индукции бессубстратной формы цит.Р-450 в печени (рис.2) свидетельствует о значении профилактического введения АР для адекватного функционирования цит.Р-450-зависимой ферментной системы в условиях действия канцерогенного агента.

Данные литературы (Комов В.П. и др., 1987, Melnlkov o.R. . et а0,1991) свидетельствуют о том, что состояние монооксигеназной системы и каталитическая активность ее компонентов в печени крыс с опухолями подвергается разнонаправленным изменениям в различные стадии опухолевого процесса. В результате наших исследований установлено, что на.степени снижения цит.Р-450 в печени крыс с ОМи отражается длительность ЛП, интенсивность опухолевого процесса, соотношение доброкачественных и злокачественных опухолей. Наиболее низкий уровень цит.Р-450 наблюдается у крыс в стадии прогрессивного роста и терминальной стадии: 0,25 + 0,04 через 3,0-3,5мес., 0,37+ 0.03 через 6,0-8,0 мес. и 0,41 + 0,06 через 7,0 мес. после

введения ДОБА против 0,59 +. 0,02 в норме, Р < 0,01 - Р< 0,001. Концентрация витамина А (мкг/г) в печени животных с Ol.to. снижена по сравнению с возрастной нормой: 161,90+ 18,86 , 224,67 + 24,01 против 365,37 + 6,08 в норме (Р < 0,001)."

Введение АР (150 тыс. ME и 200 тыс. ME) на стадии инициации обеспечивает сохранение концентрации витамина А в печени крыс с ОМл на уровне возрастной нормы: 1606,13+. 321,60 против 1449,66+ + 39,25 и повышение его уровня по сравнению с животными, получавшими только ДЧЬА (Р < 0,001). Наряду с сохранением обеспеченности организма витамином А на уровне нормы при профилактическом введении АР изменяется состояние детоксицирующей системы печени:через 2,7-3,5 мес. и 4,0-5,0'мес. после введения Д\ЪА в микросомах печени крыс с Ol.íii. опытных групп повышено содержание цит., Р-450 : 0,36 + 0,03 против 0,25 +0,04 в канцерогенном контроле через тот же период времени и 0,51 + 0,05 через 7,0 мес. после введения ДМБА в опыте против 0,37 + 0,03 в канцерогенном контроле (везде Р < 0,02).

При терапии АР и гормонами через 3,0 мес. после введения ÍMbA не выявлено положительного влияния АР на состояние микросо-мальной гидроксилирующей системы печени крыс с 0М&, что, вероятно, связано с нарушением метаболизма витамина А при онкогенезе или же, при физиологическом протекании этих процессов, с токсическим влиянием массивных доз АР, с учетом его тропности к мембранам (Конь И.Я. и др., 1985, 1986).

Оценка состояния системы гидроксилирования стероидов в коре надпочечников при канцерогенезе молочной железы в условиях регу-ляторного воздействия ретиноидом.

Известно (Хаггинс Ч., 1964), что избирательное поражение пучковой зоны коры надпочечников при действии ДМБА и его метаболитов приводит к нарушению процессов стероидогенеза, которое ведет к дисгормональнын изменениям,и является патогенетическим звеном в развитии С!А... В связи с этим проведено изучение металлофермент-ных комплексов, играющих ключевую роль в процессах бисинтеза стероидных гормонов в надпочечниках, в условиях регуляторного действия АР.

При исследовании влияния,АР (10 тыс.МЕхЮ), введенного в профилактическом режиме, на ранних этапах канцерогенеза молочной железы выявлено (рис.3 и рис.4), что АР оказывает нормализующее действие на содержанке как цит.Р-450, так и адренодоксина в надпочечниках коыс. Влияние АР на уровень цит.Р-450 и адренодоксина

14

связано, вероятно, с проявлением свойства ретиноида в силу амфи-патической природы его молекулы, встраиваться в мембраны и оказывать действие на их структуру и функцию, которое особенно сильно проявляется в митохондриальных и микросомальных мембранах (Конь И.Й. и др., 1980,1985). Кроме того, следует принять во внимание возможность влияния витамина А на синтез белков, посредством модификации генной экспрессии (sporn ы.з. et а1 , 1984).

Рис.3. Динамика содержания окисленной низкоспиновой формы цитохрома Р-450 в надпочечниках крыс, подвергнутых влиянию даБА (I), АР (2) и совместному их примене-.щда (3). Стрелкой указан момент введения ДОЗА.

Рис.4. Динамика содержания эдренодоксина в надпочечниках крыс, подвергнутых влиянию ДМЬА (I), АР (2) и совместному с пг"менению (3), Стрелкой указан I/O!,10нт I) у-Г.С;' JvbA.

Опухолевый процесс в молочной железе крыс приводит к снижению эффективности функционирования холестерингидроксилирующей системы коры надпочечников: через 3,0-3,5 мес. после введения ДМЬА в коре надпочечников крыс с ОМл. содержится в среднем 49% цит.Р-450 и 46% адренодоксина от уровня нормы, а через 7,0 мес. уровень цит. Р-450 снижается и составляет в среднем- 38%, адренодоксина - 54% уровня нормы (Р < 0,001). Подобные изменения приводят к извращению гормонообразовательной функции коры надпочечников и нарушению гормонального равновесия.

Введение АР (150 тыс.МЕ и 200 тыс.МЕ) на стадии инициации не оказывает значительного положительного влияния на уровень компонентов гидроксилирующей системы коры надпочечников через 2,75,0 мес. после введения ДМЬА. Можно отметить отсутствие различий в содержании цит. Р-450 у крыс .с 0!&., получивших только ДМБА, и при профилактическом введении АР через 3,5 мес. после введения ДМЬА (Р < ОД), через 5,0 мес. после введения Д'ИБА (Р < 0,2), а также в содержании адренодоксина в те же периоды - Р< 0,5 и Р < 0,2, соответственно. Объяснение отсутствия влияния АР на исследуемые показатели можно связать, вероятно, с решением вопроса о периферической недостаточности витамина А, вследствие дефицита различных компонентов системы его метаболизма, а также зависимости уровня клеточных связывающих белков от гормонального статуса (KalCnno Р. et al, 1983, ¡ioltarac¡n а. f 1988).

При введении массивных доз АР в терапевтическом режиме наблюдается наиболее низкий уровень цит.Р-450 и адренодоксина по сравнению с другими опытными группами, отмечено снижение (Р 0,001) содержания цит.Р-450 при A-витаминной терапии по сравнению с канцерогенным контролем. Введение АР и гормонов привело к значительному повышению содержания цит.Р-450 при сравнении с группой, получившей А-витаминнуга терапию (Р < 0,02), но усилило снижение уровня адренодоксина (Р ( 0,05), который оказался ниже, чем у крыс с 0.45" , не получивших никаких дополнительных воздействий (Р < 0,02).

Таким образом, применение массивных доз АР наряду с получением незначительного терапевтического эффекта (гр.4) приводит к усугублению нарушений в функционировании холестерингидроксилирующей системы коры надпочечников и, вероятно, этот факт можно отнести к ч;:слу причин, сникающих терапевтический эффект витамина А. Приндаая во Еиимание данные литературы (Картаропа Н.С. и др., 1966) о снп.-.ении уровня рецепторов эстрадиола и прогестерона в цчтос-оле С:.С;. кп;с, подвергнутое терапии витамином А, можно ппед-

16

положить различие в механизмах действия применяемых с тералэЕги-ческой целью АР и гормонов.

Известно (Покровский A.A., 1974, Халмурадов А.Г. и др.,1980, Пентхж A.A. и др., 1987), что лабилизирующее действие витамина А на мембраны носит фазный характер - стабилизация мембранных структур в оптимальных пределах применяемых концентраций и обратный эффект при избытке или недостатке витамина А. Мембранотокси-ческое действие применяемых массивных доз АР выявлено при оценке содержания цит.Р-450 и адренодоксина гидроксилирующих систем печени и надпочечников через 2,0 и 3,5 мес. после введения АР (200 тыс.МЕ). В микросомах печени через 2,0 мес. содержание цит. Р-450 снижено по сравнению с нормой и составляет в среднем 76,27% (Р < 0,05), в надпочечниках - 77,63й (Р ¿ 0,01). Через 3,5 мес. происходит восстановление содержания цйт.Р-450 в печени, вероятно, обусловленное адаптацией систем, участвующих в метаболизме ретинола или снижением его содержания в печени до физиологических значений. Однако, в надпочечниках происходит снижение уровня адренодоксина, который становится ниже нормы (Р < 0,01) и составляет 67,63%, а также дальнейшее снижение уровня цит.Р-450 в среднем до 34,21% (Р < 0,001).

Следовательно, введение массивных количество АР выражается в токсическом влиянии его на мембраны, как первичный объект биологического действия витамина А, вызывает их дестабилизацию, которая приводит к изменению состояния мембраносвязанных ферментов и проявляется раньше, чем симптомы интоксикации. Полученные данные свидетельствуют о том, что при действии массивных доз АР происходит нарушение функционирования гидроксилирующих систем печени и надпочечников.

ВЫВОДЫ

I. Анализ ряда показателей канцерогенеза молочной железы у крыс, индуцированного ДМЬА,(латентный период возникновения опухолей, средняя продолжительность жизни животных с опухолями, частота распределения опухолей по скорости роста, скорость возникновения и роста новообразований, соотношение доброкачественных и злокачественных опухолей) при различных режимах введения ацетата ретинола на стадиях инициации и прогрессивного роста опухолей позволил установить наибольшую эффективность антиканцерогенного действия витамина А при профилактическом его введении и терапии совместно с го^онами.

2. Обнаружена взаимозависимость между регуляторным действием ретиноида на ключевые звенья гидроксилирующих систем печени и надпочечников и уровнем обеспеченности организма витамином А на ранних стадиях канцерогенеза молочной железы у крыс.

3. Высокая степень обеспеченности витамином А при его введении интактным животным в суммарной дозе 100 тыс.ME приводит к устойчивой индукции феррицитохрома Р-450 в печени и к индукции фер-рицитохрома Р-450 и адренодоксина в надпочечниках, имеющей обрат-тимый характер.

4. Профилактическое введение ацетата ретинола в суммарной дозе 100 тыс.ME на ранней стадии канцерогенеза молочной железы обеспечивает нормализацию уровня феррицитохрома Р-450 и адренодоксина в надпочечниках, сниженного вследствие избирательного адреполитического действия ДМБА.

5. Профилактическое введение ацетата ретинола в массивных дозах способствует поддержанию активности феррицитохрома Р-450 в печени животных с опухолями молочной железы в различные сроки после введения ДМЬА.

6. Массивная суммарная доза ацетата ретинола (200 тыс.ME) вызывает дестабилизацию мембран микросом и митохондрий клеток печени и коры надпочечников, что проявляется в значительном изменении содержания феррицитохрома Р-450 и адренодоксина, являясь наиболее ранним показателем проявления токсичности.

7. Дитохром P-450-зависимые ферментные системы печени и надпочечников, состояние которых оценивается посредством применения ЭПР-спектроскопии в низкотемпературном режиме, могут использоваться в качестве критерия эффективности регуляторного действия ретиноидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние циклических гормональных воздействий и витамина

А на гормоночувствительность опухолей и молекулярные переносчики, обеспечивающие гидроксилирование стероидов, при канцерогенезе молочных желез // Тез.докл. 1У Национального онкологического конгресса с международным участием, София, 31.5.-2.6.1985 г. - София. - 1985. - тЛ, I 247. - C.II2-ÍI3 / Соавторы Н.С.Картавова, Д.П. Ьурлака, Н.С.Гутник, О.И.Дасюкевич/

2. Cell тешЬгапе electron-transfer chaina in vitamin A anti-carcinogenic end antiblaatic effect in шашлаГ! carcinogenesis // Abst. Second Intern. Conf. of Anticancer Research, 11-15 october 19B6, Saronis, Greece-Anticancer Res. -193Ö. ~8,N5. -P.1071.

/ E.P.Sidorik/.

3. Модифицирующее действие ретиноида и изменение молекулярных переносчиков электронов, участвующих в гидроксилировании, на ere-i™ ингииации канцерогенеза молочных келоз // Тез.докл. УН

Всес. конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород, май 1989 г. - Черноголовка. - 1989. - С.133-134 /Соавторы Е.П.Сидорик/.

4. Антиканцерогенное и антибластическое действие витамина А при различных режимах его введения нелинейным крысам в период канцерогенеза молочной железы, индуцированного 7 Д2-диметклсен-зантраценом // Экспериментальная онкология. - 1989. - II, 1» 5. -С.20-23 / Соавторы Н.С.Картавова, Н.С.Гутник, Е.П.Сидорик/.

5. Роль мембран в механизмах антиканцерогенного действия ре-тиноидов (обзор) // Экспериментальная онкология. - 1989. - II,

>? 6. - С.27-33 / Соавторы Е.П.Сидорик/.

6. Регуляторное влияние ретиноида на содержание и активность, нитохрома Р-4Ь0 и адренодоксина при канцерогенезе молочных желез. '1ез. докл. Всес. симп. "Биохимия опухолевой клетки, 'Минск, 1990г. - Минск. - 1990. - C.I46-I47 / Соавторы Е.П.Сидорик/.

7. Роль белковых рецепторов витамина А в механизмах противоопухолевого действия ретиноидов (обзор) // Экспериментальная онкология. - 1990. - 12, Гр 6. - Б.8-13 / Соавторы Е.П.Сидорик/.

8. Improved, anticarcinogenic and antitumor vitamin A efficacy regimen baa^d on assesinfr cytochrome P-450 and adrcnodoxin function under mammary carcinogenesis // Abatr. 7-th Intern, conf. "Biochemistry and biophyaic of cytochrome P-450; structure and function, biothechnological and ecological sapects", Mocow, Jule 28- August 2, 1991. -ltosoovi.-H5-55.-P.1 26 /E.P.Sidorik/