Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Оценка клеточно-метаболических адаптивных реакций организма при действии экологических и техногенных факторов

На правах рукописи

АЛЧИНОВА ИРИНА БОРИСОВНА

ОЦЕНКА КЛЕТОЧНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ И ТЕХНОГЕННЫХ

ФАКТОРОВ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003175837

Работа выполнена в лаборатории полисистемных исследований Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН (Москва)

Научные руководители

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

М.Ю Карганов ИИ Пелевина

Официальные оппоненты.

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

ГН Сушкевич Б И. Сынзыныс

Ведущее учреждение - Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится « Л »щх^клА. 2007 г в -(ч часов на заседании Диссертационного совета Д001. ()03. 01 при ГУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., д 8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан «ЯЗ- » сиххи^ём) Н2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук ЛН Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Здоровье организма обеспечивается разнообразными механизмами, которые реализуются на всех структурно - функциональных уровнях В своей совокупности они определяются как саногенетические механизмы Патологический процесс возникает и развивается лишь в том случае, если первичные саногенетические механизмы оказываются нарушенными и недостаточными для противостояния действию патогенных агентов Но и сам патологический процесс вызывает активацию подавленных и возникновение новых саногенетических механизмов, обеспечивающих его ликвидацию (ГН Крыжановский, 2003-2006). Активация адаптационных ресурсов является неотъемлемой частью развития состояния стресса, степень выраженности и скорость протекания которого зависят от индивидуальных особенностей организма

По существу, адаптация зависит от того, «каким образом потенциальные генетически детерминированные возможности организма в ответ на требования среды преобразуются в его реальные возможности» (Ф.З. Меерсон, 1984)

Оценка качества адаптации производится в основном на физиологическом уровне, при этом прогноз состояния функционального резерва организма дается на небольшой период времени Дать долгосрочную картину последствий воздействия в большинстве случаев невозможно И, несмотря на то, что реакции организма, меняющиеся под действием факторов среды, исследуют в основном на системном уровне, современный этап развития науки предполагает поиск причин развития патологии на тканевом, клеточном, биохимическом уровнях Для определения качества механизмов адаптации на уровне клетки используют традиционные цитогенетические методы Частота встречаемости аберраций хромосом, микроядер являются достоверными критериями для оценки как популяционных эффектов влияния факторов внешней среды, так и индивидуальной реакции организма на воздействие

Удобным инструментом для моделирования таких клеточных ответов является радиация При использовании ионизирующего излучения возможно достаточно точно рассчитать дозу воздействия, можно избирательно действовать на различные компоненты клетки, контролируя их роль в развитии патологических состояний. В тоже время, известно, что малые дозы радиации запускают неспецифические механизмы защиты, то есть результаты исследований могут быть с известными допущениями экстраполированы на действие любых других повреждающих агентов

Целью исследования являлось изучение цитогенетических аномалий и метаболических сдвигов в биологических жидкостях организма для определения индивидуальной чувствительности в условиях действия экологических и техногенных факторов

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1 Исследовать особенности клеточных реакций и метаболических сдвигов в различных экологических условиях и определить критерии оценки степени экологического неблагополучия.

2. Изучить влияние факторов полета на адаптивные возможности низма на клеточном и метаболическом уровне

3 Выявить закономерности в характере обнаруженных индивидуальных реакций и на их основе сформулировать критерии для формирования групп риска и повышенной устойчивости.

4 Изучить механизмы наблюдаемых эффектов при действии ионизирующей радиации и реализации адаптивного ответа

Научная новизна работы. Сопоставление данных, полученных с помощью лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) биологических жидкостей, с результатами цитологического обследования детей, проживающих и обучающихся в разных условиях, обнаружило высокую корреляцию между показателями, полученными различными методами, и продемонстрировало значительную информативность разработанного подхода В работе данные, полученные с помощью этих методов, рассматриваются с позиции качества функционирования адаптивных механизмов При обработке результатов учета аномалий ядра (АЯ) в буккальных эпителиоцитах предложено использовать два коэффициента (число аномалий на клетку и отношение клеток с кариолизисом к общему числу АЯ) Первый коэффициент отражает состояние репаративных механизмов, второй - скорость устранения клеток с повреждениями

Получены экспериментальные данные по адаптивному ответу (АО) на лимфоцитах периферической крови военных летчиков, в которых учитывалось число аберраций хромосом Впервые показано, что частота встречаемости пилотов с АО уменьшается с увеличением часов налета. Кроме того, с использованием ряда методов проанализированы адаптивные возможности организма летчиков в зависимости от различных факторов (возраста, высоты полетов, часов налета, наличия либо отсутствия АО) Обнаружены изменения частоты встречаемости и соотношений отдельных типов АЯ буккальных эпителиоцитов и различия в характере метаболических сдвигов в зависимости от часов налета и высоты

Показано, что при облучении лимфоцитов периферической крови в куль-туральную жидкость высвобождаются вещества, возможно, принимающие участие в реализации долгосрочных эффектов техногенных факторов Они были выделены и предварительно охарактеризованы как нуклеопротеиды, в упакованной форме соответствующие размеру 1500 п.н., а в форме свободной ДНК -20000 п.н

Кроме того, действие повреждающих доз облучения вызывает у лиц с наличием либо отсутствием АО разнонаправленные сдвиги в продукции у-интерферона

Теоретическое и практическое значение работы. Основные трудности в выявлении эффектов воздействия экологических и антропогенных факторов окружающей среды связаны со слабой выраженностью проявлений и ограниченной чувствительностью методов исследования Использованный в работе методический подход показал свою перспективность для профотбора и мониторинга состояния здоровья военнослужащих и работников потенциально опасных отраслей промышленного производства, населения экологически неблагополучных территорий Сопоставление и обобщение данных, полученных при обследовании больших выборок людей, позволяет определить точный критерий для оценки адаптированности организма к среде

Кроме того, популяционные данные не позволяют осуществлять индивидуальные прогнозы Впервые обнаруженные в работе различия в частоте встречаемости и соотношениях отдельных типов АЯ буккальных эпителиоцитов и

различия в характере метаболических сдвигов в группах людей с наличием либо отсутствием АО являются теоретической основой для дальнейшей разработки комплекса тестов, позволяющих выявлять лиц с повышенной устойчивостью или чувствительностью к действию экологических и техногенных факторов

Разработанные критерии оценки адаптивных возможностей организма были применены для массовых обследований работников предприятия ядерно-топливного цикла Это позволило оценить изменения, возникающие в метаболизме индивидуумов в результате действия различных производственных факторов

Использование облучения как фактора, запускающего неспецифический ответ m vitro, возможно, позволит осуществлять прогноз клеточно- метаболических реакций m vivo, и, в конечном итоге, проводить оценку риска срыва систем адаптации Раннее выявление особенностей АО, изменений в метаболизме и уровне цитогенетических повреждений для конкретного человека позволит своевременно проводить индивидуальные профилактические мероприятия

Положения, выносимые на защиту:

1 Характер клеточно-метаболических реакций организма при воздействии различных экологических факторов различается в зависимости от наличия или отсутствия адаптивного ответа

2 Сочетанное применение методов выявления адаптивного ответа на лимфоцитах периферической крови, цитогенетического исследования клеток буккального эпителия и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека информативно для оценки адаптивных возможностей организма в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды

Внедрение в практику. Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях работников предприятий ядерно-топливного цикла внедрен в практику Федерального медико-биологического агентства РФ (акт от 5 10.07)

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Природные факторы и социальные условия успешности обучения», Санкт-Петербург, 2005; Пленуме «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки», Москва, 2005, Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт - Петербургские научные чтения», СПб, 2005, Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005, V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность», Москва, 2006, 6-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Belgium, Ghent, 2006, III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Москва - Дубна, 2007, XX съезде физиологического общества им И П Павлова, Москва, 2007

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 236 источников отечественной и иностранной литературы Работа содержит 37 рисунков, 5 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на сыворотке крови, рото-глоточных смывах (РГС), лимфоцитах и эпителиоцитах 517 человек, в том числе

• работников предприятия ядерно-топливного цикла 328 чел

• учащихся образовательных учреждений

с Нагово Новгородской области 23 чел

с. Джеракай, Республика Адыгея 23 чел

г Майкоп, Республика Адыгея 80 чел

г Москва 25 чел

• летчики военной авиации 38 чел

Многофакторность изучаемых воздействий и разнообразие ответов на них обусловило необходимость формирования нескольких референтных групп Так, для изучения роли экологических факторов была избрана детская популяция, поскольку в этом случае можно исключить влияние производства Техногенные воздействия исследовали на взрослых, проживающих в одинаковых экологических условиях, но в разной степени вовлеченных в ядерно-топливную технологию Влияние факторов полета анализировали на группе военных летчиков, близких по возрасту, но различающихся по высотам и продолжительности своей профессиональной деятельности

1. Оценка цитогенетического статуса буккального эпителия с помощью теста ядерных аномалий.

Клетки слизистой оболочки щеки являются удобным объектом для оценки функционального состояния организма, изменяющегося под действием эндогенных и экзогенных факторов Критерием оценки влияния разных цитогене-тических и цитотоксических агентов служат наличие и частота встречаемости цитогенетических нарушений клеток с микроядрами, пикнозом, кариорекси-сом, кариолизисом и другими аномалиями ядра

Перед взятием образцов буккального эпителия человеку предлагали тщательно прополоскать рот физиологическим раствором Затем деревянным шпателем со слизистой оболочки щеки в области коренных зубов брали соскоб Эпителий в этой области многослойный, плоский, неороговевающий, поверхностно расположенные ьслетки здесь представлены зрелыми эпителиоцитами

Соскоб эпителиальных клеток шпателем аккуратно методом мазков наносили на чистое предметное стекло, на которое предварительно была помещена капля физиологического раствора. Препараты высушивали на воздухе и фиксировали метанолом (СН3ОН) в течение суток, после чего окрашивали по Фельге-ну ядра приобретают фиолетовый цвет, цитоплазма - зеленоватый

Препараты анализировали с помощью светового микроскопа в проходящем свете, используя объектив с масляной иммерсией хЮО Подсчитывали от каждого человека не менее 1000 отдельно лежащих неповрежденных клеток с хорошо окрашенной цитоплазмой и неповрежденной клеточной оболочкой В образцах буккального эпителия определяли наличие и частоту встречаемости клеток с двумя ядрами, кариорексисом, кариолизисом, «битым яйцом», микроядрами

2. Постановка схемы выявления адаптивного ответа на ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови человека

Группы людей, подвергаемые комплексным обследованиям для оценки влияния факторов среды на здоровье, обычно неоднородны и являются условно

здоровыми В нашей работе использовали данные, полученные при обследовании военных летчиков Преимуществом этой группы является постоянный медицинский осмотр для определения профпригодности В тоже же время на организм пилота действует целый комплекс экстремальных факторов среды

Вредные последствия действия на клетки высоких концентраций мутагена могут в ряде случаев быть снижены, если клетки предварительно подвергнуть действию низкой концентрации этого же мутагена В стимулированных к делению лимфоцитах периферической крови человека, подвергнутых in vitro острому облучению в дозе нескольких Гр редкоионизирующей радиации, наблюдаемый выход повреждений ДНК оказывается меньше ожидаемого, если лимфоциты предварительно облучить дозой в десятки мГр Этот эффект малых доз получил название индукции адаптивного ответа (АО) В литературе принято называть малую, «предварительную дозу» адаптирующей (АД), а вторую -основной, повреждающей (ПД) (И В.Филиппович, 1991, А.Ф.Цыб, 2005) АО тесно связан с клеточным метаболизмом и с теми изменениями клетки, которые принято называть ответом на генотоксический стресс

Материалом для работы послужили ФГА-стимулированные лимфоциты периферической крови человека Взятие крови осуществляли в стерильные флаконы с гепарином. Для культивирования клеток использовали' эмбриональную телячью сыворотку стерильную, тестированную на цитотоксичность и отсутствие микоплазм ('Terbio- HyClone", США) (1,6 мл на флакон), питательную среду RPMI- 1640 с 25 мМ HEPES и бикарбонатом натрия (6,2 мл на флакон) и ФГА (фитогемагглютинин-П из Phaseolus vulganos, "Sigma", США) (0,15 мл на флакон). В каждый флакон вносили по 1 мл цельной гепаринизированной крови Для оценки индивидуальной чувствительности к облучению была выбрана одна из схем выявления адаптивного ответа, использовали две дозы - 0,05 Гр как адаптирующую и 0,5 Гр как повреждающую

Облучение проводили на у-установке лучом мощностью 0,25 Гр/мин на расстоянии 65 см (ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН», г Обнинск)

Адаптирующую дозу 0,05 Гр наносили при посеве на стадии G0 митоти-ческого цикла, облучали два флакона один для оценки действия самой адаптирующей дозы, второй для последующего облучения повреждающей дозой, которое проводили через 48 часов. Кроме того, интактный флакон с кровью облучали 0,5 Гр для оценки влияния повреждающей дозы. От посева до фиксации клетки инкубировали в термостате при 37°С Контрольный флакон с кровью содержался таких же условиях культивирования

Фиксацию клеток проводили через 52 часа За два часа до фиксации вводили демикальцин (0,17 мл на флакон) для остановки деления клеток на стадии метафазы и получения метафазных пластинок После инкубации клетки центрифугировали в течение 15 мин при 1000 об/мин Надосадочную жидкость удаляли, оставляя 0,5 мл осадка К осадку добавляли 10 мл гипотонического раствора (0,1М KCl), тщательно перемешивая, и инкубировали в термостате при 37 С 15 мин Суспензию клеток снова центрифугировали при 1000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость Осадок перемешивали на магнитной мешалке и добавляли по каплям фиксатор (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты 3 1)

Препараты готовили раскапыванием 0,5 мл суспензии клеток в фиксаторе на влажные холодные стекла и высушивали на воздухе в течение нескольких часов. Препараты для рутинного анализа окрашивали краской Giemsa и микро-скопировали в проходящем свете под масляной иммерсией при увеличении хЮОО Учитывали следующие типы аберраций хроматидные фрагменты, хро-матидные симметричные и ассиметричные обмены, изохроматидные аберрации Для каждого донора просчитывали 100 метафаз на каждой из точек исследования

3. Исследование субфракционного состава биологических жидкостей методом лазерной корреляционной спектроскопии

В основе метода лежит изменение спектральных характеристик монохроматического когерентного излучения гелий-неонового лазера в результате светорассеяния при прохождении через дисперсную систему (плазма, сыворотка крови, моча, РГС) (А Д Лебедев и др., 1987) Дня измерения использовали лазерный корреляционный спектрометр ЖС-63-«ИНТОКС», собранный в лаборатории молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского института ядерной физики РАН и утвержденный Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ для определения размеров микрочастиц в биологических жидкостях (Сертификат RU С 39 003 А N 5381)

Образец в объеме 0,2 мл заливали в кювету ЛК-спектрометра Измерение проводили в частотном диапазоне 16 кГц (для крови, культуральной жидкости) и 8 кГц (для РГС) в количестве 2000 накоплений. Регуляризацию спектра проводили с использованием нелинейной шкалы (программы "Spectrometer", "RGS", "Blood", входящие в программное обеспечение спектрометра) Результатом расчета при таком способе обработки является гистограмма, по оси ординат которой отложен процентный вклад частиц в светорассеяние, а по оси абсцисс - их размер в нанометрах

В работе использовали различные способы представления данных, полученных методом ЛКС.

Подробные ЛК-гистограммы, сформированные управляющей программой спектрометра, состоят из 32 столбцов Количество столбцов отражает число учитываемых субфракций молекул при обработке (минимизации) спектра (Ю И Бажора, 2002)

Менее подробный, но более удобный способ представления данных связан с использованием зон, в которые входят частицы определенного размера Так, весь диапазон спектра для РГС делится на 4 информативные дискретные зоны (по размерам светорассеивающих частиц)-1 - 0-50 нм, II - 51-400 нм, III -400-2000 нм, IV - выше 2000 нм Для крови и культуральной жидкости - на 5 дискретных зон I - 0-10 нм, II - 11-30 нм; Ш - 31-70 нм, IV - 71-150 нм, V -150нм и выше

В зависимости от увеличения (или снижения) процентного вклада в светорассеяние частиц той или иной фракции, предложенная семиотическая классификация ЛКС сыворотки/плазмы крови предполагает идентификацию 8 различных направлений сдвигов в обмене веществ и гуморальном иммунитете «интоксикационно»-, «катаболически»-, «дистрофически»-, «аллерго»- и «аутоиммунно-подобные», нормологические спектры и 2 типа смешанных спектров Данные симтомокоплексы были получены эмпирическим путем на больших выборка людей с верифицированными диагнозами

При необходимости среди полученных симптомокомплексов относительно нормологической группы выделяли два основных направления сдвигов го-меостаза при преобладании в сыворотке крови или РГС частиц мелких размеров выделяли группу «катаболических» сдвигов, при преобладании крупных частиц - «анаболических»

Рото-глоточный смыв представляет собой многокомпонентную водную среду, содержащую клеточные элементы (эпителий, лейкоциты), часть из которых частично или полностью разрушена, а также различные ферментные и неферментные молекулы, входящие в состав слюны

Обследование проводили натощак. Человеку предлагали в течение 30 с прополоскать полость рта и глотки дистиллированной водой комнатной температуры, затем 20 с прополоскать полость глотки 10-15мл физ раствора Из полученного смыва отбирали 1,0-1,5 мл в пробирку «эппендорф» Центрифугировали на протяжении 10 мин при 3000 об/мин Надосадочную жидкость отбирали в стерильную пластиковую пробирку Образец замораживали в морозильной камере при температуре -24-30°С

Взятие крови осуществляли натощак в утренние часы, путем пункции одной из периферических вен с помощью инъекционных игл Для приготовления сыворотки образцы в пробирках экспонировали при комнатной температуре от 40 мин до 2 часов После образования сгустка пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3 тыс об/мин Надосадочную жидкость отбирали с помощью дозатора в пробирку в объеме 1мл

При постановке схемы адаптивного ответа была получена надосадочная жидкость, в которой клетки крови человека росли в течение 52 часов без воздействия или были облучены разными дозами у-излучения Культуральная жидкость в объеме 1,5 мл была отобрана в пробирки типа «эппендорф» и заморожена для транспортировки.

Пробы надосадочной жидкости, полученные при постановке эксперимента по адаптивному ответу, содержат смесь различных белков, ДНП, РНП и др Для выяснения соотношения процентных вкладов частиц этих веществ была проведена обработка проб ферментами ДНК-азой и проназой Сравнивали между собой ЛК-гистограммы исходной надосадочной жидкости и после ее обработки ДНК-азой и проназой.

4. Методика обработки проб культуральной жидкости ДНК-азой и проназой.

Использовали препарат ДНК-азы ("Sigma", США) с удельной активностью 410KU (Kumtz, J , 1950) из поджелудочной железы быка Фермент растворяли в 0,15М растворе NaCl до концентрации 80 KU/мл К культуральной жидкости объемом 50 мкл добавляли 50 мкл 1М ацетатного буфера рН 5 0, 20 мкл 0,1М раствора сульфата магния и 200 мкл раствора ДНК-азы. Пробы инкубировали 10 мин при комнатной температуре

Использовали препарат проназы из Strep gnseus с удельной активностью 77000 PUK ("Calbiochem-Behnng Corp", США). Реакцию проводили в 0,01М Трис-буфере рН 7,8 с добавлением 0,01 М ЭДТА и 0,5% додецилсульфата натрия Раствор фермента в буфере концентрацией 40 мг/мл инкубировали 2 ч при 37°С для устранения ДНК-азной и РНК-азной активности, затем добавляли 50 мкл раствора проназы к 50 мкл культуральной жидкости Реакционную

смесь инкубировали при 37°С 2 ч. Полученные образцы измеряли с помощью ЛЕС - спектрометра

5. Выделение фрагментов внДНК, определение их состава и размеров

Для выделения внеклеточной ДНК из проб, полученных при постановке эксперимента по АО, использовали стандартный метод выделения фенолом (Т Маниатис и др., 1984) Концентрацию выделенной внДНК определяли флуори-метрически на флуоресцентном спектрометре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) с использованием ДНК-связывающегося красителя Hoechst 33258 (квозб = 350 нм, ^фяу=450 нм)

Пробы культуральной жидкости, полученные при постановке схемы АО, обработанные ферментами, и выделенную внДНК исследовали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (Т Маниатис и др, 1984) При разделении в геле положение ДНК отслеживали по включению флуоресцентного красителя -бромистого этидия Для контроля наличия белков в пробах использовали окраску Кумасси ярко-голубым R-250

В пробах культуральной жидкости, полученных при постановке схемы АО, определяли концентрацию у-интерферона Количественное определение у-интерферона проводили с помощью иммуноферментного набора (Bender MedSystems, Австрия)

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием стандартных пакетов программ "Primer Biostatistics", "StaWin", "Ststistica 6" Использовали t-критерий Стьюдента, однофакторный дисперсионный анализ, U-критерий Манна-Уитни Различие в пределах каждой группы между показателями оценивали по парному Т-критерию Вилкоксона

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение клеточно-метаболических адаптивных реакций в группах детей при действии экологических факторов среды

Попытки выявлять действие потенциально опасных факторов окружающей среды на организм (в особенности детский) на донозологической стадии предпринимались неоднократно (Юдина Т Д., 1997;; Рахманин Ю А, 2001, Ма-сюта Д.И и др, 2002, Тахауов Р М, 2003; Худолей В В , 2006) Одним из обстоятельств, осложняющих процесс раннего обнаружения негативных последствий действия антропогенных факторов на здоровье человека, является сравнительно узкий диапазон подходов, пригодных для этой цели В нашей работе мы использовали целый комплекс методов для оценки качества адаптации детей, проживающих в разных экологических условиях Здоровье детей оценивали с помощью неинвазивных методик учета АЯ в клетках буквального эпителия и метода лазерной корреляционной спектроскопии РГС

Преимущество метода учета АЯ в буккальном эпителии - это доступность и простота получения клеток Слизистая оболочка ротовой полости выстлана многослойным плоским неороговевающим эпителием, обновление которого происходит за счет деления базальных клеток По мере созревания клетки переходят в промежуточный, а затем - в поверхностный слой, в котором и подвергаются слущиванию Цитогенетические повреждения, в частности, микроядра, возникающие в базальном слое, сохраняются и могут быть зарегистрированы в поверхностных слоях

Однако, для оценки действия экологических факторов большинство авторов использует подсчет МЯ в клетках буккального эпителия, при этом оценка остальных АЯ (кариорексиса, кариолизиса, пикноза, клеток «битое яйцо», дву-ядерных клеток) (То1ЬеП, 1992) не проводится. В норме существует фоновый уровень АЯ, но встречаемость патологий и их соотношение в разных группах не является постоянной величиной. Не существует также данных о частоте встречаемости этих аномалий для групп условно здоровых людей. Наши данные показывают, что возможно использовать АЯ буккального эпителия для оценки адаптированности исследуемой группы к факторам среды.

Для этого были предложены два коэффициента: среднее количество АЯ на клетку и отношение числа клеток с лизисом к общему числу клеток с АЯ.

Первый коэффициент является принятым в цитогенетических исследованиях, но он не применялся в отношении буккального эпителия. Мы рассматриваем его как параметр, который характеризует качество репаративных механизмов. Если принять во внимание, что кариолизис является завершающей стадией нормальной гибели клетки, то можно предположить, что клетки со всеми АЯ (двуядерные клетки, клетки с кариорексисом и пикнозом) переходят в стадию лизиса. При этом отношение должно быть приблизительно равно 1, то есть, чем больше будет число АЯ превышать долю клеток с лизисом, тем больше коэффициент будет стремиться к 0. Низкий процент лизиса при этом можно рассматривать как недостаточность механизмов устранения поврежденных клеток.

Данные коэффициенты были использованы для оценки адаптивных реакций при обследовании больших групп детей, различающихся условиями проживания. В наиболее экологически чистом районе (с. Нагово Новгородской области) отношение коэффициента АЯ (0,040) и коэффициента лизиса (0,241) показывает, по нашему мнению, что возникающие АЯ устраняются в процессе лизиса. Для сравнения, в школе №735 г.Москвы высоко значение повреждений на клетку, которые не устраняются в процессе лизиса (0,187 / 0,018), что говорит о недостаточности механизмов устранения поврежденных клеток (Рис.1).

□ АЯ на одну клетку ш лизис/АЯ

0,3

«8 & ш

шн

♦♦♦♦♦ 'У,' ■ \ ***** V. *****

с.Нагово с. Джеракай р. Школы г.Майкоп Школа №735

Новгоодская обл. Адыгея г.Москва

Рис.1. Соотношение показателей АЯ в буккальном эпителии в разных группах школьников

У детей обследованных школ встречались все АЯ. При этом наиболее динамичными показателями являются частоты встречаемости клеток с кариорексисом и пикнозом. Если в московской выборке была значительна частота ка-

риорексиса (170 на 1000 клеток), то в выборках г Майкоп - Джеракай отмечается повышенная частота клеток с пикнозом (по сравнению с г Москвой и с Нагово) В зависимости от роста антропогенной нагрузки увеличивается вклад клеток с кариорексисом в общее число аномалий ядра

В этих же группах детей были собраны РГС, субфракционный состав которых определяли методом ЛК- спектроскопии

Анализ ЛК-спектров с учетом преобладающего типа метаболических процессов показал, что в группе детей из сельской школы Нагово преобладают «нормальные» спектры (45,0%), велика доля спектров «анаболического» типа (40,0%) при низком представительстве спектров «катаболического» типа (15,0%) У детей из московской школы по сравнению с сельской снижена доля спектров «анаболического» типа (Р<0,05), и высока доля «катаболических» сдвигов (50%).

В выборках г. Майкоп — с Джеракай наблюдалось некоторое снижение процента нормологических спектров (23-29%), и увеличение «катаболических» сдвигов, при этом их процент в городе (48,5%) близок к московскому

Подробный анализ ЛК — гистограмм, полученный с помощью специальной компьютерной программы Viewer показал, что значимые различия между школами наблюдаются в области частиц размером 1,9 - 2,56; 4,64 - 8,24 нм, 37,34 - 50,50 нм, 404,65 - 545 нм, 988 - 1332 и 3255 4385 нм (дисперсионный анализ one-way ANO VA) р<0,05

Для каждой совокупности экологических условий при обследовании условно здоровых детей было получено характерное соотношение метаболических сдвигов, при этом в городских популяциях наблюдается более высокий процент катаболических сдвигов, чем в сельских По-видимому, существует связь между числом и типом АЯ и вкладом в светорассеяние частиц определенного размера в ЛК-спектрах

При оценке частот встречаемости АЯ в выборках детей, различающихся условиями проживания, было показано, что наиболее вариабельным показателем является кариорексис. Поэтому из общей выборки были отобраны данные об АЯ и ЛК-спектры людей, в буккальном эпителии которых частота встречаемости клеток с кариорексисом была выше 100 на 1000 клеток

Высокий процент клеток с карирексисом положительно коррелирует с зоной мелких частиц (2,56 - 6,25 нм) (г=0,4, р<0,05) При этом частота встречаемости двуядерных клеток коррелирует с зоной крупных частиц (545,06 -1332 нм) (г=0,38 р<0,05)

Таким образом, сопоставление размеров частиц, определенных методом ЛКС, и частоты встречаемости АЯ в буккальном эпителии при разных вариантах сравнения показывают наличие положительной корреляционной связи между АЯ, связанных с деструкцией ядра (кариорексис, пикноз) и мелких частиц Лизис ядер буккальных эпителиоцитов положительно коррелирует с вкладом в светорассеяние крупных частиц в ЛК-спектрах.

Корреляции, обнаруженные в ходе исследования, свидетельствуют о сопряженности изменений, происходящих во внутри- и внеклеточном пространстве Таким образом, применение двух неинвазивных методов показало, что они, в конечном итоге, отображают различные звенья одного процесса адаптации организма к условиям окружающей среды. Если это предположение верно, то, несмотря на популяционные различия, должны существовать жесткие критерии, определяющие степень экологического неблагополучия, отражающуюся

на цитологическом и обменном статусе населения, а также индивидуальные адаптивные возможности людей, отличающиеся от популяционных. 2. Определение клеточно-метаболических адаптивных реакций в группах условно здоровых взрослых людей при действии экологических и техногенных факторов среды.

2.1. Изменения в частоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия.

Данные, полученные на выборках детей, позволили применить сходный подход к определению устойчивости организма для групп взрослых людей. Оценка воздействий на выборки взрослых работающих условно здоровых людей затруднена разнообразием факторов среды, к которым добавляются производственные условия. Кроме того, организм взрослого человека представляет собой реализованную генетическую программу, определяющую предрасположенность к различным заболеваниям.

Для оценки состояния буккального эпителия по собственным и литературным данным (H.H. Беляева, 2005) были использованы введенные ранее коэффициенты.

Показано, что для групп взрослых людей характерно преобладание клеток с кариолизисом. Если в детских выборках частота встречаемости клеток с кариолизисом достигает максимум 25% (с.Нагово), то в группах взрослого населения, обследованных нами, этот показатель значительно выше 50%, а по данным литературы может достигать 90% (Р. Tolbert, 1992) от общего числа аномалий.

:В НА КЛЕТКУ ВЛИЗИС/АЯ

0,60 0,50 0,40 I 0,30 |

; 0,20 -

i

0,10 -

0,00 -

женщ г.Москва с.д, служащие г.Москва мужчины г.Москвз с.д.

Рис. 2. Соотношение коэффициентов буккального эпителия в разных группах взрослых людей. По оси ординат значения коэффициентов АЯ и лизиса в долях.

При анализе коэффициентов наши результаты, полученные при обследовании буккального эпителия условно здоровых мужчин, совпали с данными по распределению АЯ, представленными в работе Н.Н.Беляевой (2005). В сходных группах, являющихся частью одной популяции, наблюдаются сходные значения коэффициентов (служащие - 0,55, мужчины - 0,56) (Рис.2).

Таким образом, оценка состояния АЯ буккального эпителия может использоваться как критерий оценки реакции организма на действие факторов среды. Однако, при этом необходимо учитывать, что соотношение коэффициентов буккального эпителия будет меняться в зависимости от выборки, на которую оказывает действие совокупность различных факторов; и для каждой

выборки необходимо подбирать адекватный контроль При проведении попу-ляционных исследований, при оценке действия токсических или радиационных факторов, необходимо подбирать группу сравнения из условно здоровых людей

2.2. Изменения в направлении метаболических процессов при массовых скрининговых обследованиях в условиях действия производственных факторов.

При массовых обследованиях практически здоровых людей были выявлены популяционные особенности Ж- спектров сыворотки крови в зависимости от климатических и экологических условий (Ю.И Бажора и др , 1996). Методом ЖС проводили изучение сыворотки крови лиц, подвергшихся многократному радиационному воздействию и лиц, перенесших его однократно Исследования в этой области показали, что уже однократное радиационное воздействие приводит к метаболическим сдвигам в организме в сторону нарастания ка-таболических процессов (А В. Аклеев и др , 1996, С К Терновой и др, 1998)

На предприятии ядерно-топливного цикла г Электросталь были обследованы работники, контактирующие с открытыми (цех № 13, уран и его продукты, уровень ПДК) и закрытыми источниками (цех № 55) радиоактивных излучений и с комбинацией факторов радиационной опасности (цех № 66, уран и его продукты, выше уровня ПДК), химическими и другими воздействиями В качестве контрольной группы были использованы пробы сыворотки крови работников, не задействованных на работах с радиоактивными материалами (п=16)

При сравнении процентного соотношения метаболических сдвигов в различных цехах можно отметить низкий процент нормологических спектров в цехе № 13 Во всех цехах по сравнению с контролем значительно снижен процент анаболических сдвигов Высокий процент «катаболических» сдвигов характерен для всех цехов, что говорит о сходстве условий проживания и действии одинаковых факторов среды.

Более подробный анализ суммарных Ж - гистограмм с учетом вклада в светорассеяние частиц определенного размера позволяет определить, что в значительном количестве точек наблюдаются значимые отличия усредненных Ж-гистограмм работников различных цехов от суммарной ЛК—гистограммы сыворотки крови контрольной группы Существуют также значительное количество точек, по которым данные о субфракционном составе сыворотки крови работников 13 цеха отличаются от двух других цехов, что позволяет рассматривать производственные факторы как основную причину различного распределения метаболических сдвигов в данной выборке.

Одним из ведущих производственных факторов является ионизирующее излучение, представляющее собой в основном у- излучение При сравнении накопленных среднегодовых доз показано, что они значительно ниже, чем допустимые санитарно - гигиеническими нормами (50мЗв)

Накопление дозы, наблюдаемое у рабочих во всех цехах, с течением времени, может вызвать изменения в метаболических сдвигах, поэтому необходимо было провести анализ динамики соотношения преобладающих направлений метаболических сдвигов с интервалом 12 мес

;Вцех13 И цех 55 Оцехбб

25 4--

-15 -1

Рис. 3. Изменение соотношения метаболических сдвигов за 12 мес. По оси ординат - разность между долей соответствующих сдвигов при первом и втором обследовании, в %.

При этом был выявлен сходный характер изменений: нарастание доли ка-таболических сдвигов (Рис.3). Наиболее выраженное изменение наблюдается в цехе № 55 (работа с закрытыми источниками радиации) - значительный прирост катаболических метаболических сдвигов при внешне, казалось бы, менее повреждающих воздействиях.

3. Оценка клеточно-метаболнческих адаптивных реакций у военных летчиков при воздействии факторов полета.

3.1. Проявление адаптивного ответа у летчиков в зависимости от факторов полета.

Известно, что летный состав в ходе выполнения своих профессиональных обязанностей подвергается воздействию многих потенциально опасных факторов. Основная проблема оценки биологического риска антропогенных и иных воздействий в условиях современной авиации относится к дозам, не превышающим предельно допустимый уровень, или незначительно его превышающим. Именно в этом диапазоне ответ организма на действие изучаемых факторов предельно персонифицирован. Биологические последствия таких воздействий могут быть выявлены только с помощью многоуровневых исследований.

В нашей работе мы попытались оценить адаптивные способности организма летчиков с помощью ряда методик: постановки одной из схем адаптивного ответа на лимфоцитах периферической крови, учета аномалий ядра в бук-кальном эпителии и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей.

В процессе работы было выделено три группы: контрольная группа (9 человек) А, сюда вошли люди без часов налета, но по роду своей деятельности имеющие отношение к авиации. Это прежде всего руководители полетов, технический персонал и парашютисты. В зависимости от часов налета выделены группа Б (17 человек) пилоты с общим налетом до 1000 и свыше 1000 (В) (12 человек) часов.

Последние две группы представляют собой людей, находящихся под строгим регулярным медицинским контролем. В тоже время, они подвержены целому комплексу факторов полета: вибрации, перегрузкам, эмоциональному стрессу и ионизирующему излучению.

В нашей работе изучаемым признаком была радиочуствительность. Критерием для оценки было выбрано развитие адаптивного ответа. Наличие адаптивного ответа регистрируется по соотношению числа аберраций хромосом при разных дозах (АО=(ПД+К)/(АД+ПД)). Величина соотношения > 1,5 свидетельствует о наличии адаптивного ответа.

Адаптивный ответ наблюдали у 7 человек в контрольной группе, что составляет 78%, средний возраст в контроле составил 23 года. В группе с часами налета до 1 ООО часов средний возраст составил 33 года, АО наблюдали у 10 человек, что составило 59%. В группе с налетом более 1000 часов средний возраст 39 лет, АО зафиксирован у 4 человек (33%).

Рассматриваемая нами выборка летчиков попадает в одну возрастную группу, таким образом, возраст не будет иметь определяющего значения в повышении процента аберрантных клеток.

Подробное рассмотрение частот встречаемости людей с АО при разном количестве полетных часов показало, что с увеличением часов налета наблюдается уменьшение доли людей с адаптивным ответом (Рис. 4).

0,9 -0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 о

250

часов

напета

750

часов

налета

1200 часов налета

контроль

п=7 АО-5 нетАО-2

п=10 АО-5 нет АО - 5

п=7 АО- 2 нет АО 5

2500 часов налета

л=5 АО-1 нет АО- 4

Рис. 4. Изменение доли людей с АО в зависимости от часов налета

Отношение числа аберраций при повреждающей дозе к этому же показателю при дозе АД+ПД всегда рассматривалось как качественный признак, однако анализ показал, что большая часть выборки по коэффициентам АО попадает в интервал 2 о. За пределы этого интервала выпадают в группе до 1000 часов один человек (с коэффициентом 2,4) и в группе больше 1000 часов один человек (с коэффициентом 2,5). Это говорит о том, что они обладают повышенной устойчивостью к действию радиации.

Дисперсионный анализ групп без учета выброса (Н (2, п=36)=6,32 р<0,05) позволил провести попарное сравнение групп, в результате чего было выявлено различие групп А и В (р<0,01) по коэффициенту АО. Критерий СЫ-эдиаге (сН=1) показал различие между группами А и В по процентному соотношению частоты встречаемости АО. Аналогичная тенденция наблюдается между группами Б и В (р = 0,16).

Также была обнаружена корреляционная связь между часами налета и коэффициентами АО ( г =-0,37, р = 0,02): при увеличении часов налета регистрируются меньшие значения коэффициентов АО.

Представленные данные позволяют говорить о том, что общим признаком для группы является снижение качества неспецифических адаптивных механизмов с увеличением часов налета. Хроническое действие генотоксических

факторов в дозах, превышающих среднестатистические значения, нарушает защитное действие репарационных процессов, которое проявляется в отсутствии адаптивного ответа.

В формировании АО на уровне целого организма значительную роль играют иммунная и гуморальная системы (И.А. Гончарова, 2003; А.Н. Котеров, 1999). Степень выраженности АО может быть связана с соотношением форменных элементов крови, в частности, лимфоцитов.

Так как проводилось исследование здоровых людей, нельзя было ожидать каких-либо выраженных отличий в картине крови. Тем не менее, наблюдали определенные различия в количестве лимфоцитов и моноцитов. При сравнении с данными литературы о нормальном содержании этих форменных элементов в крови здоровых людей (Г.И. Козинец и др., 2004) можно отметить некоторое повышение количества этих клеток в исследуемой когорте. Обращает на себя внимание и тот факт, что число лимфоцитов выше у людей с АО, чем без него. Общее количество лимфоцитов снижается с увеличением продолжительности полетов. Совершенно противоположная картина наблюдается в отношении моноцитов, их число возрастает с увеличением часов налета и с отсутствием АО.

Такое изменение в форменных элементах крови может быть следствием приспособления к факторам полета, которое на молекулярном уровне, возможно, является причиной наличия или отсутствия АО.

3.2. Влияние факторов полета на изменение в чистоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия.

При рассмотрении в качестве основного фактора высоты увеличивается значимость такого воздействия как облучение. Показано значительное увеличение клеток с кариорексисом у летчиков, совершавших полеты на высоте более 10000 Метров.

Подробное рассмотрение групп с учетом как высоты, так и длительности полетов показало, что в группах с одинаковым числом часов налета число клеток с кариорексисом возрастает с увеличением высоты полетов: в группе Б - 25 клеток при высоте 4000м и 50 клеток при высоте 10000м, в группе В - 50 и 110 клеток, соответственно (Рис. 5).

□ контроль г.Москва

двуяд.кл

к-рексис

■ контроль группа А

ИЗ группа Б 5000 метров

В группа В 5000 метров

0 группа Б больше 10000 метров

В группа В больше 1ООООметров

Рис. 5. Частота встречаемости основных АЯ в зависимости от высоты полетов и общего числа налета. По оси ординат - абсолютные значения АЯ.

Кроме того, обращает на себя внимание то, что в группе Б с большой высотой полетов и в группе В с небольшой высотой полетов соотношение аномалий ядра близкое Показатели лизиса во всех исследуемых группах имеют аналогичные значения, что, по нашему мнению, свидетельствует о сходных показателях качества устранения поврежденных клеток, высокие значения карио-рексиса (в группе В, высота полета больше 10000 м), между тем, свидетельствует о недостаточности процессов репарации

Опираясь на два коэффициента, характеризующие адаптивные механизмы на уровне буккального эпителия, можно отметить, что по сравнению с жителями г Москвы по данным литературы и собственным, полученным при обследовании группы здоровых людей, наблюдается тенденция к увеличению числа аномалий на клетку и снижение отношения лизис/АЯ с увеличением часов налета. Это означает, что с увеличением часов налета репаративные механизмы и возможность устранения поврежденных клеток становятся все более недостаточными

При сравнении данных групп по наличию или отсутствию АО в группе Б (до 1000 часов налета) наблюдается тенденция к увеличению числа клеток с ка-риорексисом у людей без АО, в группе В эта тенденция является более выраженной

3.3. Изменения в субфракционном составе сыворотки крови при действии факторов полета.

Метод ЛКС позволяет по составу биологических жидкостей определить изменение направлений метаболических сдвигов Перераспределение вклада частиц разного размера в общее светорассеяние образца определяет необходимость и направление дальнейшего поиска

С помощью программы-классификатора все ЛК-гистограммы первоначально были разделены на группы с соответствии с общим количеством полетных часов

Было показано, что при сравнении ЛК-гистограмм наблюдается уменьшение вклада в светорассеяние совсем мелких частиц до 10 нм и увеличение 3 зоны (31-70 нм) и 5 зоны (больше 150 нм) у летчиков по сравнению с контролем, у летчиков с часами налета больше 1000 увеличение 5 зоны более выражено

При рассмотрении ЛК-гистограмм, включающих значение процентного вклада в светорассеяние частиц определенного размера, не было отмечено значимых отличий в зависимости от часов налета Видимо, выделенные крупные группы содержат спектры, которые на общих гистограммах суммируются и не позволяют определить достоверно значимые различия

В связи с этим вся выборка была разделена на более узкие группы группа с часами налета до 1000 часов была разделена на две группы - 200 - 500 и 800 часов налета, группа с налетом более 1000 часов - на группу с часами налета от 1000 до 2000, группу больше 2000 часов.

При сравнении ЛК-гистограмм наибольшее отличие от контроля обнаружено при 200-500 и 1000 - 2000 ч В обоих случаях наблюдается увеличение диапазона крупных частиц Однако рост вклада этой зоны происходит за счет разных частиц при 200-500 часах основной вклад вносят частицы размеров 300- 545 нм, при 1000 - 2000 часах - частицы 545 - 989 нм

Таким образом, незначительные отличия ЛК - гистограмм от контроля говорят о том, что количество полетных часов не является ведущим фактором в изменении метаболизма на системном уровне. Наиболее выраженные изменения в функционировании организма наблюдаются при часах налета 200- 500 и 1000 - 2000, однако изменения происходят различным образом, что указывает на преобладание различных механизмов адаптации.

При анализе АЯ в буккальном эпителии одним из факторов, от которого зависели адаптивные возможности, была высота полета. В зависимости от нее меняется интенсивность ионизирующего излучения. Дозы, которые получают летчики даже при налете в 1000 часов, сравнимы с фоновыми. Тем не менее, как уже подчеркивалось, именно в диапазоне таких доз можно рассматривать индивидуальные реакции организма.

Анализ ЛК-гистограмм с учетом высот и общего числа часов налета показал, что при их возрастании в сыворотке крови происходят такие изменения, которые отражаются в снижении вклада частиц второй зоны (11-30 нм) и снижения вклада частиц пятой зоны (больше 150 нм). Как и в случае с буккальным эпителием, наблюдается сходство ЛК-гистограммы при небольшом числе налета и большой высоте с ЛК-гистограммой при большом числе налета и небольшой высоте.

[Б0-10 HM~S 11- 30 нм И31-70 нм 071-150 нм Ибольше150нм

40,00

Рис. 6. ЛК-гистограммы сыворотки крови в зависимости от высоты и часов налета. По оси ординат - процентный вклад в светорассеяние частиц определенного размера. # - отличие от контроля, * - отличие ЛК-гистограмм в группе В, р< 0,05 критерий Мапп-\УЫ(пеу

В группе В наблюдается достоверно значимая разница в третьей зоне (3170 нм), что, вероятно, связано только с увеличением часов налета.

При рассмотрении групп по наличию АО наибольшие изменения относительно контроля отмечали в первой, второй и пятой зонах. Наблюдали значимое уменьшение вклада первой зоны в группах с АО по сравнению с контролем.

Кроме того, наблюдали снижение вклада второй зоны в группах без АО, тогда как в группах с АО значения вклада второй зоны совпадает с контролем. Увеличение вклада пятой зоны наблюдали у группе Б у людей без АО. В группе В отмечается обратный процесс, вклад частиц пятой зоны снижается у людей без адаптивного ответа.

3.4. Изменения содержания у-интерферона в надосадочной жидкости, полученной при культивировании лимфоцитов крови летчиков, в ходе постановки схемы радиоадаптивного ответа.

Известно, что интерфероны могут оказывать антикластогенный эффект, в частности, в работе Македонова ГП (1993), было показано, что лимфоциты человека, обработанные лимфобластоидным интерфероном, менее чувствительны к последующему у-облучению в дозе 2 Гр. Авторы объясняют этот эффект тем, что интерферон стимулирует эксцизионную и пострепликативную репарацию, и, кроме того, индуцирует восстановление двойных разрывов ДНК, Гамма-интерферон, в свою очередь, оказывает необратимое цитотоксиче-ское действие на трансформированные клетки Таким образом, количество у-интерферона позволяет оценить степень гибели клеток Содержание гамма-интерферона в культуральной жидкости оценивали с помощью иммунофер-ментного метода Используемый в опыте ФГА сам по себе является сильным индуктором у-интерферона, чем, видимо, объясняются незначительные изменения его содержания в условиях действия адаптирующей и повреждающей доз радиации В то же время двойная доза (0,05+0,5 Гр), вызывала разнонаправленные изменения в продукции у-интерферона у групп лиц с наличием (7,92+5,42%) либо отсутствием (14,82+16,67%) адаптивного ответа

Поскольку у доноров с отсутствием адаптивного ответа не происходит достаточной активации механизмов репарации, повышение уровня интерферона, возможно, является гуморальной регуляцией на клеточном уровне, которая стимулируется сохраняющимся уровнем хромосомных аберраций при 0,5 Гр

4. Выделение и характеристика нуклеопротеинов, высвобождающихся из лимфоцитов при постановке схемы радиоадаптивного ответа.

Адаптивный ответ является сложной приспособительной реакцией, в реализации которой принимает участие большое количество механизмов и факторов Из данных литературы известно, что при действии излучения в сыворотке накапливаются различные вещества, представляющие собой как продукты жизнедеятельности клеток, так и их деструкции, в частности, одним из таких веществ является свободная ДНК

Для определения свободной ДНК нами была использована надосадочная жидкость, полученная при культивировании ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека при постановке эксперимента по АО В зависимости от дозы облучения, интенсивности гибели клеток, межклеточных взаимодействий состав исследуемой жидкости будет меняться Исследование такой многокомпонентной системы достаточно проблематично, поэтому для предварительной характеристики процессов, происходящих в культуральной жидкости, применяли метод ЖС. Для упрощения анализа использовали не сами ЛК-спектры, а разности между ЛК-гистограммами облученных и контрольных проб Такая обработка данных позволяет определить увеличение или снижение различных компонентов системы.

Изменение субфракционного состава надосадочной жидкости облученных проб происходит сходным образом. В контрольной группе и группах летчиков с разным числом полетных часов при действии ПД и АП+ПД наблюдали, по сравнению с контрольными пробами, увеличение вклада в светорассеяние частиц размером 67- 223 нм, при этом в спектрах проб людей без АО наблюда-

ется сдвиг распределения в сторону более крупных частиц, что является показателем неспецифического ответа клеток на облучение.

9 а+п-к АО □ а+п-к нет АО

Рис. 7. Разность ЛК-гистограмм надосадочной жидкости в группе Б. По оси абсцисс - размер частиц в нм, по оси ординат - отличие от контроля в процентах. А- при воздействии ПД, Б - при воздействии дозы АД+ПД

Для определения концентрации внДНК в пробах культуральной жидкости использовали мягкий фенольный метод. При этом было показано, что содержание внДНК как в контрольных, так и в облученных пробах сильно варьировало у разных доноров. Размер фрагментов внДНК, определенный с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, составил 20 ООО п.н. Таким образом, концентрация свободной ДНК, выделяющейся при облучении, является индивидуальным признаком, характеризующим механизмы репарации повреждений и гибели клеток.

Внеклеточная ДНК, выделенная из надосадочной жидкости после облучении в дозе 0,5 Гр с помощью колонок «Отшх», на Ж - гистограммах соответствовала зоне частиц размером 67,75 - 734,2 нм, исходная проба содержала частицы от 20,56 — 165,57 нм. В ЛК - спектрах проб до выделения ДНК и после содержится общая зона частиц размером 67,75 - 165,57 нм. Поставленная параллельно с выделением серия из 5 электрофорезов показала наличие в исходных пробах и компонентов ДНК, и присутствие белка, о чем свидетельствовало совпадение пятен при окраске этидиумом бромидом и Кумасси.

Таким образом, основная часть вещества, находящегося в образцах, представляет собой нуклеопротеидные фрагменты размером 1000 - 1500 п.н. Обращает на себя внимание различие в размерах фрагментов при выделении фе-нольным методом и находящихся в культуральной жидкости или выделенных на колонках. Размер фрагментов ДНП, равный 1000 - 1500 п.н., при освобождении в результате обработки фенолом от гистоновых и негистоновых белков, обеспечивающих упаковку ДНК, увеличивается и вполне может составлять 20 тыс п.н.

Для подтверждения нуклеопротеидной природы внДНК дальнейшие исследования были связаны с воздействием на фрагменты ДНП ферментами ДНК - азой и проназой. Воздействие ферментов должно приводить к разрушению одного из компонентов комплекса ДНП.

Воздействие и ДНК-азы и проназы приводят к таким изменениям в надосадочной жидкости, которые в ЛК — гистограммах проявляются разрушением частиц размером 67-91 нм и 223-405 нм и сохранением зоны 123 - 166 нм.

При обработке ферментами ДНК, выделенной на колонках «Отшх», наблюдается сходная ситуация - сохраняется зона 123 - 166 и разрушаются участки 67,8 - 91,3 и 300-500 нм

Полученные данные позволяют утверждать, что фрагменты, находящиеся в культураяьной жидкости, являются нуклеопротеинами, состав которых отличается различной, в зависимости от структуры, устойчивостью к воздействию ферментов

Разрушение белковой части этих нуклеопротеинов значительно увеличивает размер фрагментов и снижает устойчивость к действию ДНК-азы Фрагменты внДНК выполняют иммуностимулирующую функцию, повышение уровня фрагментов ДНК у людей без АО согласуется с данными по повышенною у них уровня гамма - интерферона

ВЫВОДЫ

1 Действие экологических и техногенных факторов среды проявляется в возрастании частоты встречаемости аномалий ядра буккальных эпителиоцитов с одновременным снижением доли клеток с кариолизисом

2 Техногенные факторы ядерно-топливного производства обусловливают преимущественно катаболическую направленность сывороточного гомеостаза у работников, непосредственно занятых в технологических операциях

3 По мере увеличения количества полетных часов наблюдается снижение доли летчиков с радиоадаптивным ответом, выявленном на клеточном уровне

4 В зависимости от наличия либо отсутствия радиоадаптивного ответа в группе военных летчиков выявлены различия всех исследованных показателей частоты встречаемости буккальных эпителиоцитов с кариорексисом, содержания частиц размером 0-10 нм в сыворотке крови, продукции у-интерферона

5 Вещества, выделяющиеся из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека при постановке схемы радиоадаптивного ответа, представляют собой нуклеопротеины размером 1000 - 1500 п н.

Автор выражает глубокую благодарность за сотрудничество, консультативную помощь и ценные рекомендации ведущему научному сотруднику лаборатории молекулярной и клеточной радиобиологии ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН» М М. Антощиной, руководителю лаборатории Медико-генетического центра РАМН НН. Вейко, ведущим научным сотрудникам Института биохимической физики РАН им НМ Эмануэля А В АлещенкоиА М Серебряному

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Алещенко А.В , Дмитриева О С, Алчинова И. Б., Дмитриева Г П, Карганов М Ю, Кожевникова М И, Носкин Л.А, Серебряный А М, Хлебникова Н Н, Пелевина ИИ Использование цитогенетического метода исследования бук-кального эпителия и метода лазерной корреляционной спектрометрии для мониторинга нарушений в организме детей // Цитология - 2006 - Т 48,- № 2 -С 169-172

2 Панкова Н Б Труханов А.И., Быков А Т, Подцубная Р Ю , Дмитриева О С , Алчинова И. Б., Карганов М Ю , Лебедева М А, Афанасьева Е В , Черепов А Б Комплексная оценка состояния здоровья, функциональных резервов орга-

низма и эффективности их восстановления у военнослужащих // Вестник восстановительной медицины - 2006.- №1 - С 43-53

3 Алчинова И. Б., Вейко Н Н, Дмитриева О С , Ланда С Б , Хлебникова Н Н, Карганов М.Ю Применение метода лазерной корреляционной спектроскопии для оценки метаболических сдвигов у работников радиационно- опасного производства // Гигиена и санитария - 2006 - № 5 - С 77-79

4 Карганов М Ю , Алчинова И. Б., Чамокова А Я, Мамгетов К Ю , Алещенко А В , Серебряный А М, Пелевина И И Определение информативных параметров при использовании методов лазерной корреляционной спектроскопии и патогенетического исследования буккального эпителия для экологической экспертизы // Экология человека Приложение 4/2 - 2006 - С 128-130

5 Карганов М Ю , Труханов А И, Алчинова И. Б., Дмитриева О С, Маркина И Е Полисистемная оценка функционального баланса работников предприятий ядерно-топливного цикла // Труды VIII Международная конференция «Современные технологии восстановительной медицины» - Сочи - 2005 - С 315-319

6 Алчинова И. Б. Использование саногенетического мониторинга для выявления состояний функциональной напряженности организма у работников предприятия ядерно - топливного цикла // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» - Суздаль -2005-С 416-417

7 Карганов М Ю , Дмитриева О С , Алчинова И. Б. Саногенетический подход к прогнозированию риска ущерба здоровью, обусловленного техногенными факторами // Материалы пленума «Экологически обусловленные ущербы здоровью методология, значение и перспективы оценки» - Москва - 2005 - С 133134

8 Дмитриева О С , Алчинова И. Б. Использование метода лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей для выявления метаболических сдвигов, происходящих в организме под воздействием ионизирующего излучения // Тезисы докладов Санкт - Петербургские научные чтения Международный молодежный медицинский конгресс - 2005 - С 112

9 Алчинова И. Б., Дмитриева О С Совместное использование лазерной корреляционной спектроскопии и цитогенетического метода для оценки функционального состояния организма // Тезисы докладов Санкт - Петербургские научные чтения. Международный молодежный медицинский конгресс - 2005 -С 110

10 Карганов М Ю , Дмитриева О С , Алчинова И. Б., Вейко Н Н , Ланда С Б , Носкин Л А Изменения в составе биологических жидкостей человека в условиях действия малых доз радиации // Тезисы докладов V съезда по радиационным исследованиям.- Москва - 2006 - Т1-С 151

11 Karganov М , Kozhevmkova М, Aleschenko А, Khlebmkova N., Dmitneva О , Alchmova I., Dmitneva G, Pelevma I and Noskrn L Correlation between cytogenetic abnormalities in cells and metabolic shifts m children with spinal deformities // Studies m Health Technology and Informatics Research into Spinal Deformities 5 -2006.-Vol.123.-P. 9-13

12 Алчинова И. Б. Характер адаптивного ответа лимфоцитов, аномалий ядра буккальных эпителиоцитов и метаболических сдвигов у летчиков с различным стажем // Доклады П1 Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» - Москва - Дубна - 2007 - С 79-80

13 Труханов А.И., Панкова Н.Б , Алчинова И. Б., Ежова О А, Комаров А В , Маркаров А К., Карганов M Ю Полисистемная оценка функциональных характеристик здоровья военнослужащих различных специальностей. // Материалы XII международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации».- М.- 2007.- С 450-452

14 Карганов M Ю, Алчинова И. Б., Чамокова А Я, Мамгетов К.Ю, Алещенко А В , Серебряный A M, Пелевина И И. Региональные особенности встречаемости аномалий ядра клеток буккального эпителия и характера метаболических сдвигов // Тезисы докладов XX съезда Физиологического общества имИП Павлова - M - 2007 - С.123

15 Архипова Е H, Алчинова И. Б. Клеточные и молекулярные проявления индивидуальной радиочувствительности. // Материалы II Всероссийской Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» - Рязань - 2007 - С 1-2

16 Носкин JIА, Ланда С.Б., Карганов M Ю. Алчинова И. Б. Оценка радиационных последствий методом лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека. // Тезисы докладов Международной конференции «Новые направления в радиобиологии» - M - 2007 - С 62-65

ORGANISM CELL-METABOLIC ADAPTIVE REACTIONS EVALUATION ON ECOLOGICAL AND ANTHROPOGENIC FACTORS

INFLUENCE.

Alchinova I.B.

Ecological and anthropogenic factors modulate metabolic processes m the organism, they activate adaptive processes and determine dynamic state of human health Our aim was to evaluate the peculiarities of metabolic shifts and nucleus abnormalities depending on flight factors, nuclear plant conditions and the place of residence Correlation was found between the pattern of metabolic shifts and the incidence of some nucleus abnormalities m buccal epitheliocytes. Lymphocyte ra-dioadaptive response was found to be a key sign in consequences of studied effects as well as y-mterferon production It was shown that 1500 b p nucleoprotems are liberated from irradiated lymphocytes during radioadaptive response procedure The applied approach opens prospects for the prognosis of biological risks in populations exposed to unfavorable factors

Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к Тел. 162-00-16 Тираж 100 шт

Актуальность темы. Здоровье организма обеспечивается разнообразными механизмами, которые реализуются на всех структурно - функциональных уровнях. В своей совокупности они определяются как саногенетиче-ские механизмы. Патологический процесс возникает и развивается лишь в том случае, если первичные саногенетические механизмы оказываются нарушенными и недостаточными для противостояния действию патогенных агентов. Но и сам патологический процесс вызывает активацию подавленных и возникновение новых саногенетических механизмов, обеспечивающих его ликвидацию (Г.Н. Крыжановский, 2003-2006). Активация адаптационных ресурсов является неотъемлемой частью развития состояния стресса, степень выраженности и скорость протекания которого засвистит от индивидуальных особенностей организма.

По существу, адаптация зависит от того, «каким образом потенциальные генетически детерминированные возможности организма в ответ на требования среды преобразуются в его реальные возможности» (Ф.З. Меерсон, 1984).

Оценка качества адаптации производится в основном на физиологическом уровне, при этом прогноз состояния функционального резерва организма дается на небольшой период времени. Дать долгосрочную картину последствий воздействия в большинстве случаев невозможно. И, несмотря на то, что реакции организма, меняющиеся под действием факторов среды, исследуют в основном на системном уровне, современный этап развития науки предполагает поиск причин развития патологии на тканевом, клеточном, биохимическом уровнях. Для определения качества механизмов адаптации на уровне клетки используют традиционные цитогенетические методы. Частота аберраций хромосом, микроядер являются достоверными критериями для оценки как популяционных эффектов влияния факторов внешней среды, так и индивидуальной реакции организма на воздействие. 7

Удобным инструментом для моделирования таких клеточных ответов является радиация. При использовании ионизирующего излучения возможно достаточно точно рассчитать дозу воздействия, можно избирательно действовать на различные компоненты клетки, контролируя их роль в развитии патологических состояний. В тоже время, известно, что малые дозы радиации запускают неспецифические механизмы защиты, то есть результаты исследований могут быть с известными допущениями экстраполированы на действие любых других повреждающих агентов.

Целью исследования являлось изучение цитогенетических аномалий и метаболических сдвигов в биологических жидкостях организма для определения индивидуальной чувствительности в условиях действия экологических и техногенных факторов.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности клеточных реакций и метаболических сдвигов в различных экологических условиях и определить критерии оценки степени экологического неблагополучия.

2. Изучить влияние факторов полета на адаптивные возможности организма на клеточном и метаболическом уровне.

3. Выявить закономерности в характере обнаруженных индивидуальных реакций и на их основе сформулировать критерии для формирования групп риска и повышенной устойчивости.

4. Изучить механизмы наблюдаемых эффектов при действии ионизирующей радиации и реализации адаптивного ответа.

Научная новизна работы.

Сопоставление данных, полученных с помощью лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) биологических жидкостей, с результатами цитологического обследования детей, проживающих и обучающихся в разных условиях, обнаружило высокую корреляцию между показателями, полученными различными методами, и продемонстрировало значительную информа8 тивность разработанного подхода. В работе данные, полученные с помощью этих методов, рассматриваются с позиции качества функционирования адаптивных механизмов. При обработке результатов учета аномалий ядра (АЯ) в буккальных эпителиоцитах предложено использовать два коэффициента (число аномалий на клетку и отношение клеток с кариолизисом к общему числу АЯ). Первый коэффициент отражает состояние репаративных механизмов, второй - скорость устранения клеток с повреждениями.

Получены экспериментальные данные по выявлению адаптивного ответа (АО) на лимфоцитах периферической крови военных летчиков, в которой учитывалось число аберраций хромосом. Впервые показано, что частота встречаемости пилотов с АО уменьшается с увеличением часов налета. Кроме того, с использованием ряда методов проанализированы адаптивные возможности организма летчиков в зависимости от различных факторов (возраста, высоты полетов, часов налета, наличия либо отсутствия АО). Обнаружены изменения частоты встречаемости и соотношений отдельных типов АЯ буккальных эпителиоцитов и различия в характере метаболических сдвигов в зависимости от часов налета и высоты.

Показано, что при облучении лимфоцитов периферической крови в культуральную жидкость высвобождаются вещества, возможно, принимающие участие в реализации долгосрочных эффектов техногенных факторов. Они были выделены и предварительно охарактеризованы как нуклеопротеи-ды, в упакованной форме соответствующие размеру 1500 п.н., а форме свободной ДНК - 20000 п.н.

Кроме того, действие повреждающих доз облучения вызывает у лиц с наличием либо отсутствием АО разнонаправленные сдвиги в продукции у-интерферона.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Основные трудности в выявлении эффектов воздействия экологических и антропогенных факторов окружающей среды связаны со слабой выраженностью проявлений и ограниченной чувствительностью методов исследова9 ния. Использованный в работе методический подход показал свою перспективность для профотбора и мониторинга состояния здоровья военнослужащих и работников потенциально опасных отраслей промышленного производства, населения экологически неблагополучных территорий. Сопоставление и обобщение данных, полученных при обследовании больших выборок людей, позволяет определить точный критерий для оценки адаптированности организма к среде.

Кроме того, популяционные данные не позволяют осуществлять индивидуальные прогнозы. Впервые обнаруженные в работе различия в частоте встречаемости и соотношениях отдельных типов АЯ буккальных эпителио-цитов и различия в характере метаболических сдвигов в группах людей с наличием либо отсутствием АО являются теоретической основой для дальнейшей разработки комплекса тестов, позволяющих выявлять лиц с повышенной устойчивостью или чувствительностью к действию экологических и техногенных факторов.

Разработанные критерии оценки адаптивных возможностей организма были применены для массовых обследований работников предприятия ядерно-топливного цикла. Это позволило оценить изменения, возникающие в метаболизме индивидуумов в результате действия различных производственных факторов.

Использование облучения как фактора, запускающего неспецифический ответ in vitro, возможно, позволит осуществлять прогноз клеточно-метаболических реакций in vivo, и, в конечном итоге, проводить оценку риска срыва систем адаптации. Раннее выявление особенностей АО, изменений в метаболизме и уровне цитогенетических повреждений для конкретного человека позволит своевременно проводить индивидуальные профилактические мероприятия.

10

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер клеточно-метаболических реакций организма при воздействии различных экологических факторов различается в зависимости от наличия или отсутствия адаптивного ответа.

2. Сочетанное применение методов выявления адаптивного ответа на лимфоцитах периферической крови, цитогенетического исследования клеток буккального эпителия и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека информативно для оценки адаптивных возможностей организма в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды.

Внедрение в практику. Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях работников предприятий ядерно-топливного цикла внедрен в практику Федерального медико-биологического агентства РФ (акт от 5.10.07).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Природные факторы и социальные условия успешности обучения», Санкт-Петербург, 2005; Пленуме «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки», Москва, 2005; Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт - Петербургские научные чтения», СПб, 2005; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005; V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность», Москва, 2006; 6-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Belgium, Ghent, 2006, III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Москва - Дубна, 2007, XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 2007. И

выводы

1. Действие экологических и техногенных факторов среды проявляется в возрастании частоты встречаемости аномалий ядра буккальных эпителио-цитов с одновременным снижением доли клеток с кариолизисом.

2. Техногенные факторы ядерно-топливного производства обусловливают преимущественно катаболическую направленность сывороточного го-меостаза у работников, непосредственно занятых в технологических операциях.

3. По мере увеличения количества полетных часов наблюдается снижение доли летчиков с радиоадаптивным ответом, выявленном на клеточном уровне.

4. В зависимости от наличия либо отсутствия радиоадаптивного ответа в группе военных летчиков выявлены различия всех исследованных показателей: частоты встречаемости буккальных эпителиоцитов с кариорексисом, содержания частиц размером 0-10 нм в сыворотке крови, продукции у-интерферона.

5. Вещества, выделяющиеся из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека при постановке схемы радиоадаптивного ответа, представляют собой нуклеопротеины размером 1000 - 1500 п.н.

117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Завершая изложение работы, следует отметить, что при ее выполнении мы отошли от классической схемы изучения реакций организма при низко-дозовых воздействиях, когда вначале определяется уровень действующих доз или концентраций, а затем определяется эффект (заболеваемость, смертность или снижение продолжительности жизни). В данной работе в основу оценки биологических реакций организма, возникающих при низкодозовых воздействиях, положен учет интегральных воздействий всех стрессов (радиационного, химического, а также влияние климатогеографических условий и экологической ситуации) на систему гомеостаза и адаптационный потенциал. В этом случае необходимо учитывать изменения в организме, которые развиваются на фоне длительного компенсаторного напряжения его адаптационных возможностей, обусловленного действием изучаемых факторов.

В силу вероятностной природы возникновения эффекта так называемые показатели риска всегда носят усредненный характер. Есть только разная степень усреднения показателей риска: по миру, по населению страны, по когорте с заданными значениями пола и возраста и др. Чем меньше степень усреднения, тем значимее могут быть данные по риску для поддержки принятия решений по защитным или компенсационным мерам. К сожалению, во многих моделях оценки риска присутствуют, как правило, коэффициенты риска высокой степени усреднения. Понизить эту степень не представляется возможным из-за недостаточной статистической мощности эпидемиологических исследований и по другим причинам.

Настоящая работа посвящена попытке сформировать комплекс методов и выработать критерии для оценки индивидуального риска в условиях действия разнообразных средовых факторов. Оценку проводили, основываясь на результатах, полученных в экспериментах на буккальных эпителиоцитах, лимфоцитах и сыворотке периферической крови здоровых людей, подвергающихся действию разнообразных факторов внешней среды.

Ill

Многофакторность изучаемых воздействий и разнообразие ответов на них обусловило необходимость формирования нескольких референтных групп. Многочисленные детские выборки позволили оценить реакции организма только на экологические факторы среды и ввести, при исследовании буккального эпителия, два коэффициента, позволяющие оценить качество репаративных процессов и скорость устранения поврежденных клеток. На усилении антропогенной нагрузки детский организм реагирует значительным увеличением процента клеток с кариорексисом и снижением клеток с карио-лизисом, в субфракционном составе рото-глоточных смывов это отражается увеличением частоты встречаемости катаболических сдвигов.

Использование введенных коэффициентов буккального эпителия показало возможность их применения и для групп взрослых людей. На собственных и литературных данных было показано, что в разных группах, являющихся частью одной популяции, значения этих коэффициентов близки. Кроме того, отмечено, что для групп взрослых людей характерен высокий процент клеток с кариолизисом по сравнению с детскими выборками.

Работу адаптивных механизмов попытались оценить в условиях сходных экологических условий и разной степени вовлеченности в ядерно-топливную технологию. В ситуации многофакторного воздействия, характерного для ядерно-топливного предприятия, обнаружились различия в последствиях влияния условий производства. Несмотря на заметную дифференциацию производственного риска в отдельных группах, прогнозировать уровень риска только на основе представленных результатов достаточно сложно в силу двух обстоятельств. Во-первых, по степени выраженности перечисленные трансформации преимущественно представлены начальными и умеренными сдвигами. Во-вторых, сдвиги в регуляции обменных процессов могут нивелироваться другими регуляторными процессами в организме. Поэтому уровень и направленность сдвигов в системе плазменного гомеостаза надо анализировать в сравнении с другими гомеостатическими сдвигами.

112

Влияние факторов полета анализировали на группе военных летчиков, близких по возрасту, но различающихся по высотам и продолжительности своей профессиональной деятельности. На организм пилота действует целый комплекс экстремальных факторов среды, однако, действие каждого фактора дозировано и последствия воздействия могут быть отслежены при регулярном медицинском осмотре. Было показано, что все факторы тем или иным образом оказывают влияние на клеточно-метаболические адаптивные реакции.

При исследовании АЯ в клетках буккального эпителия показано значительное увеличение клеток с кариорексисом у летчиков, совершавших полеты на высоте более 10000 метров

Обращает на себя внимание то, что в группе Б с большой высотой полетов и в группе В с небольшой высотой полетов соотношение аномалий ядра близкое. Показатели лизиса во всех исследуемых группах имеют сходные значения, что, по нашему мнению, свидетельствует об одинаковых значениях качества устранения поврежденных клеток; высокие значения кариорексиса (в группе В, высота полета больше 10000 м), между тем, свидетельствуют о недостаточности процессов репарации.

При сравнении данных групп по наличию или отсутствию АО в группе Б (до 1000 часов налета) наблюдается тенденция к увеличению числа клеток с кариорексисом у людей без АО, в группе В эта тенденция является более выраженной.

Незначительные отличия ЛК-гистограмм сыворотки крови пилотов и контрольной группы говорят о том, что количество полетных часов не является ведущим фактором в изменении метаболизма на системном уровне. Наиболее выраженные изменения (увеличение вклада в светорассеяние частиц крупного размера) в функционировании организма наблюдаются при часах налета 200-500 и 1000-2000, однако изменения происходят различным образом, что указывает на преобладание различных механизмов адаптации.

113

Как и в случае с буккальным эпителием, наблюдается сходство ЛК-гистограммы при небольшом числе налета и большой высоте с JIK-гистограммой при большом числе налета и небольшой высоте.

Немаловажным является и тот факт, что одним из факторов является облучение, невысокие дозы которого могут вызывать развитие различных ответов организма. Для оценки адаптивных возможностей, дополнительно к ранее использованным методам, был добавлен тест, позволяющий определить наличие или отсутствие феномена адаптивного ответа в экспериментах in vitro. Феномен адаптивного ответа заключается в том, что клетки, подвергнутые облучению в малых дозах, становятся более резистентными к воздействию радиации (или других агентов) в высоких дозах. Впервые показано, что факторы полета вызывают монотонное снижение частоты встречаемости адаптивного ответа у летчиков. Наличие корреляционной связи коэффициентов АО с увеличением часов налета свидетельствует о том, что у большинства обследованных пилотов происходит постепенное истощение адаптивного ресурса. Показано, что наличие либо отсутствие АО, являющееся генетически детерминированным свойством организма, влечет за собой и разницу в клеточно-метаболических реакциях на всех исследованных уровнях. Используя этот подход, удалось выявить индивидуумов с повышенной устойчивостью к факторам полета, одним из которых является облучение.

В работах ряда авторов описано, антикластогенное действие интерфе-ронов, которое объясняется тем, что интерферон стимулирует эксцизионную и пострепликативную репарацию, и, кроме того, индуцирует восстановление двойных разрывов ДНК. Исследование уровня интерферонов в группе летчиков показало, что у доноров с отсутствием адаптивного ответа не происходит достаточной активации механизмов репарации, и, повышение уровня интерферона, возможно, является гуморальной регуляцией на клеточном уровне, которая стимулируется сохраняющимся уровнем хромосомных аберраций при облучении в 0,5 Гр.

114

Гамма-интерферон, в свою очередь, оказывает необратимое цитотокси-ческое действие на трансформированные клетки. Таким образом, количество гамма-интерферона позволяет оценить степень гибели клеток

Изменения на уровне различных клеточных и метаболических систем, которые проявляются под действием факторов полета, в частности, облучения, а также в продукции одного из важнейших цитокинов - у-интерферона, побудили нас исследовать некоторые молекулярно-клеточные механизмы, обеспечивающие наблюдаемые эффекты. Так как были обнаружены отличия в метаболических профилях летчиков с различными часами налета, можно предположить, что и этом случае существуют гуморальные факторы, задействованные в реализации наблюдаемых эффектов.

Постановка эксперимента для исследования АО позволила использовать надосадочную культуральную жидкость, полученную в результате культивирования ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека. Эта жидкость включает в себя среду 11РМ1- 1640, сыворотку эмбриональную телячью, компоненты крови и вещества, образовавшиеся в процессе жизнедеятельности и гибели клеток в течение 51 часов. Именно эти вещества будут меняться в зависимости от дозы, интенсивности гибели клеток, межклеточных взаимодействий. Проведенные исследования позволили определить, что после облучения в надосадочной жидкости увеличивается концентрация свободной ДНК, которая представляет собой нуклеопротеидные фрагменты размером 1000 - 1500 п.н. При осаждении свободной ДНК мягким фенольным способом, при котором происходит освобождение ДНК от белков, размеры этих фрагментов составляют 20000 п.н. Количество свободной ДНК, выделяющейся при облучении, является индивидуальным признаком, характеризующим механизмы репарации повреждений и гибели клеток. Дальнейшие исследования, возможно, позволят определить критерий, точно демонстрирующий соотношение этих процессов.

Есть все основания полагать, что предложенный комплекс методов, будучи дополненным способами оценки адаптивных возможностей организма с

115 учетом функционального состояния других его систем, может быть полезен для профотбора и мониторинга состояния здоровья лиц, чья профессиональная деятельность или условия проживания связаны с действием неблагоприятных средовых факторов.

116