Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Оценка андрогенного статуса и качества эякулята у мужчин после оперативного лечения варикоцеле

На правах рукописи

Усачёва Ольга Александровна

ОЦЕНКА АНДРОГЕННОГО СТАТУСА И КАЧЕСТВА ЭЯКУЛЯТА У МУЖЧИН ПОСЛЕ ОПЕРАТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ ВАРИКОЦЕЛЕ

14.01.23 - урология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ИЮЛ 2014

Москва-2014

005550402

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.» Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Чалый Михаил Евгеньевич

профессор

Официальные оппоненты:

Ефремов Евгений Александрович доктор медицинских наук, заведующий отделом андрологии и репродукции человека ФГБУ «Научно-Исследовательский Институт урологии» Минздрава России.

Кадыров Зиератшо Абдуллоевич доктор медицинских наук, заведующей

кафедрой эндоскопической урологии факультета повышения квалификации медицинских

работников Российского Университета Дружбы Народов.

Ведущая организация - ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России.

Защита диссертации состоится « 2014 года в 14 часов на

заседании диссертационного Совета Д 208.040.11 в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет» им. И. М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119992 г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России по адресу: 117998 г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте www.mrna.ru.

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Тельпухов Владимир Иванович

Общая характеристика работы Актуальность темы

Широкое эпидемиологическое исследование, проведённое под контролем Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), показало, что частота варикоцеле составляет 11,7% во всей популяции мужчин, и достигает 25,4% в группах мужчин с бесплодием. В настоящее время относительно большую частоту выявления варикоцеле у мужчин можно объяснить самим фактом бесплодия. При этом врач целенаправленно выявляет варикоцеле, а если варикоцеле нет, то предпринимается диагностика субклинических форм заболевания. Иными словами, зачастую диагностика варикоцеле при бесплодии выносится на первое место, игнорируя при этом множество других причин, которые могут приводить к нарушению фертильности. Нарушение репродуктивной функции мужчин обусловлено увеличением частоты заболеваний половых органов, ростом аномалий развития, влиянием вредных факторов внешней среды, аллергизацией населения, бесконтрольным применением лекарственных препаратов и другими факторами. Мужское бесплодие довольно распространённое явление, которое в настоящее время приобретает социальное значение, т.к. отмечается тенденция к росту удельного веса мужского фактора в бесплодном браке. В течение последних 20 лет он изменился с 30 до 50% и продолжает расти, поэтому исследование репродуктивной функции мужчин является в настоящее время актуальной задачей. В опубликованных работах отечественных и зарубежных исследователей не отражена единая концепция в отношении патогенеза патозооспермии на фоне варикоцеле и после оперативного лечения. Имеющиеся данные нуждаются в дальнейшей разработке и накоплении дополнительного материала, для решения этих вопросов. Исследования, направленные на изучение механизмов патозооспермии после оперативного лечения варикоцеле актуальны и будут способствовать формированию более эффективных методов лечения этого заболевания и профилактики патозооспермии.

Цель Исследования.

Цель настоящей работы - улучшить результаты диагностики и лечения андрогенодефицита и патозооспермии после оперативного лечения варикоцеле. Задачи исследования

1. Изучить особенности гормонального фона и показателей спермограммы пациентов после оперативного лечения варикоцеле.

2. Разработать персонифицированную шкалу расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона.

3. Определить значимость делеции в генах ОБТИ С8ТМ1 в развитии андрогенодефицита и патозооспермии.

4. Изучить металл-лигандный гомеостаз у пациентов после оперативного лечения варикоцеле и оценить коэффициенты распределения бионеорганических элементов в эякуляте.

5. Определить прогностическую ценность исследования генотипа ОЗТТ1 05ТМ1 и металл-лигандного гомеостаза в диагностике патозооспермии. Научная новизна исследования

1. На основании проведенного исследования интерпретация полученных значений общего тестостерона крови проводилась в соответствии с персонифицированной шкалой расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона в крови, разработанной совместно с кафедрой информатики Московского Физико-Технического Института (член-корр. РАН, проф., зав. кафедрой информатики И.Б. Петров).

2. Впервые изучен металл-лигандный гомеостаз на основании анализа бионеорганических элементов в эякуляте здоровых добровольцев и пациентов после оперативного лечения варикоцеле.

3. Определены нормативные показатели содержания бионеорганических элементов в эякуляте.

4. Впервые изучен механизм развития патозооспермии на фоне делеции

гена 08ТМ1 у пациентов после оперативного лечения варикоцеле.

Практическая значимость

Впервые разработано и предложено к практическому применению:

1. Определение концентрации бионеорганических элементов в эякуляте;

2. Исследование металл-лигандного гомеостаза эякулята;

3. Анализ делеционных полиморфизмов в генах 08ТТ1 08ТМ1

4. Персонифицированная оценка уровня содержания общего тестостерона крови согласно разработанной шкале.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У пациентов с делецией гена С8ТМ1 после оперативного лечения варикоцеле выявлен риск развития андрогенодефицита в возрасте 38-47 лет.

2. Причиной патозооспермии после оперативного лечения варикоцеле является нарушение бионеорганического состава эякулята и металл-лигандного гомеостаза вследствие дефицита генетически детерминированного механизма обезвреживания генотоксичных соединений.

3. Исследование генотипа в ЯТИ 08ТМ1 позволяет определить прогноз оперативного лечения варикоцеле. Выявление делеции гена 08ТМ1 подтверждает отрицательный репродуктивный прогноз после варикоцелеэктомии.

Личный вклад автора

Автор лично участвовала в отборе больных, оценивала их клиническое состояние, участвовала в процессе лабораторно-инструментального обследования; осуществляла контроль за состоянием пациентов в послеоперационном периоде и наблюдении через 6 месяцев после

оперативного лечения. Интерпретация полученных результатов и их статистическая обработка также осуществлена автором. Апробация диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Первом Национальном Форуме «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» в Ростове - на Дону (18-19 октября 2012г.), IX конгрессе «Мужское здоровье» в Санкт-Петербурге (1-3 июля 2013 г.). Апробация диссертации состоялась 4 ноября 2013 г. на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и слушателей кафедры урологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Диссертация рекомендована к защите.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 3. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав, приложения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель включает 79 отечественных и 43 зарубежных источника. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста. Диссертация содержит 18 таблиц, 18 графиков, 9 гистограмм, 1 схему и 3 рисунка. Диссертация соответствует паспорту научной специальности 14.01.23 - «урология». Работа является фрагментом комплексной темы в рамках которой выполнялось исследование «Совершенствование образовательных технологий до дипломного и после дипломного медицинского и фармацевтического образования» Номер гос. регистрации №01.2011.68237.

Собственные исследования Организация, материалы и методы исследования На базе НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека ГБОУ

ВПО «Первый МГМУ имени И.М. Сеченова» обследовано 40 пациентов

после оперативного лечения варикоцеле слева (лапароскопическое

клипирование яичковой вены 15 чел.(37.5%), операция Мармара 15 чел.

(37.5%), операция Иваниссевича 10 чел. (25%)). Средняя длительность

послеоперационного периода составила 1.3±1.1 лет. Средний возраст

составил 22.4±1.9. Исследование было открытое, контролируемое, не

рандомизированное. Группу контроля составили 40 здоровых добровольцев

от 18 до 35 лет. В исследование не включались пациенты, возраст которых превышал 35 лет или был менее 18 лет, в анамнезе имевшие оперативные вмешательства на органах половой системы, больные с острыми или хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, с первичными эндокринными нарушениями или тяжёлые соматические и психические заболевания. В ходе обследования проводили ультразвуковое исследование органов мошонки на аппарате «УОЬиЭОЫ» 730 с наружным линейным датчиком 7 Гц. Функциональное состояние репродуктивной системы оценивали по показателям спермограммы и по уровню ингибина В, ЛГ, ФСГ, пролактина, и тестостерона в сыворотке венозной крови. Исследования проводились в клинической лаборатории НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека. Показатели спермограммы оценивались согласно протоколу Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 2010). Эякулят исследовался в два этапа. На первом этапе оценивалась концентрация, подвижность, агрегация и агглютинация сперматозоидов, а также наличие других клеточных элементов. Исследование проводилось с использованием микроскопии. На втором этапе проводилась морфологическая классификация сперматозоидов, а также оценивалась жизнеспособность сперматозоидов. Определение концентрации лютеинизирующего гормона проводилось с помощью прибора для иммуноферментного анализа («Гонадотропин ИФА-ЛГ») на планшетном ридере АпШоб 2020 (Австрия) с заданным нормальным уровнем 1.5-9 МЕ/л. Измерение уровня фолликулостимулирующего гормона, тестостерона, пролактина, эстрадиола проводилось также на планшетном ридере Апйюэ 2020 наборами для иммуноферментного анализа («Гонадотропин ИФА-ФСГ», «Стероид ИФА-Тестостерон - 01», «ИФА-пролактин-01»). За нормальные значения ФСГ были приняты колебания 2-13 МЕ/л, тестостерона 12-33 нмоль/л, пролактина 60-560 мМЕ/л, эстрадиола 70-200 пмоль/л. Пробы для анализа брали из вены натощак в утренние часы с 8.00 до 10.00. ЛГ, ФСГ, пролактин, тестостерон и эстрадиол определяли в день сдачи

7

анализа. Концентрацию ингибина В определяли во всех пробах одновременно после завершения сбора материала и замораживания сыворотки при -20°С, избегая повторного оттаивания-замораживания. Совместно с кафедрой информатики Московского Физико-Технического Института на базе отдела андрологии НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека Первого МГМУ им. И.М. Сеченова разработана персонифицированная шкала расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона (таблица 1). Основу шкалы составил математический анализ снижения андроген-продуцирующей функции гонад с возрастом. По-вертикали представлен возраст, по горизонтали уровень общего тестостерона крови (нмоль/л). Сопоставление фактического содержания общего тестостерона и возраста позволит прогнозировать риск развития андрогенодефицита.

Таблица 1. Персонифицированная шкала расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона.

возраст 30 лет Тестостерон 12 нмоль/л 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

11 11.89 12.8 13.8 14.8 15.8 16.8 17.8 18.8 19.8 20.8 21.8 22.8 23.7 24.7

32 11.78 12.7 13.7 14.7 15.7 16.7 17.7 18.7 19.7 20.6 21.6 22.6 23.5 24.5

33 11.56 12.6 13.6 14.6 15.6 16.5 17.5 18.5 19.5 20.4 21.4 22.4 23.3 24.3

34 11.46 12.5 13.5 14.4 15.4 16.4 17.3 18.3 19.3 20.2 21.2 22.2 23.1 24.1

35 11.36 12.4 13.3 14.3 15.3 16.3 17.2 18.1 19.1 20.0 21.0 21.9 22.9 23.9

36 11.25 12.3 13.2 14.2 15.1 16.2 17.0 18.0 18.9 19.8 20.9 21.7 22.7 23.7

37 11.15 12.1 13.1 14.0 15.0 16.1 16.9 17.8 18.7 19.7 20.7 21.5 22.5 23.5

38 11.09 12-0 13.0 13.8 14.8 15.9 16.8 17.6 18,6 19.6 20.5 21.3 22.3 23.1

39 10.94 11.9 12.9 13.7 14.7 15.8 16.7 17.5 18.5 19.4 20.3 21.2 22.1 23.0

40 10.84 11.8 12.7 13.6 14.6 15.6 16.4 17.3 18.3 19.2 20.1 21.0 21.9 22.9

41 10.74 11.7 12.6 13.5 14.5 15.5 16.1 17.2 18.1 19.0 20.0 20.8 21.7 22.7

42 10.64 11.6 12.5 13.4 14.3 15.4 16.0 17.0 17.9 18.9 19.9 20.6 21.5 22.5

43 10.55 11.5 12.4 13.3 14.2 15.2 15.8 16.9 17.7 18.7 19.7 20.4 21.3 22.3

44 10.46 11.4 12.3 13.1 14.1 15.1 15.7 16.7 17.6 18.5 19.5 20.2 21.1 22.1

45 10.37 11.3 12.2 13.0 14.0 14.9 15.5 16.5 17.5 18.3 19.3 20.0 20.9 22.0

46 10.28 11.2 12.1 12.9 13.9 14.8 15.5 16.3 17.3 18.1 19.1 19.8 20.7 21.9

47 10.19 11.1 12.0 12.8 13.8 14.7 15.4 16.2 17.1 18.0 18.9 19.7 20.5 21.7

48 10.01 11.0 11.9 12.6 13.7 14.6 15.3 16.1 16.9 17.9 18.7 19.5 20.3 21.5

49 9.9 10.9 11.7 12.5 13.6 14.5 15.1 16.0 16.8 17.7 18.5 19.3 20.1 21.3

50 9.8 10.8 11.6 12.4 13.4 14.4 15.0 15.9 16.6 17.5 18.3 19.1 19.9 21.1

51 9.7 10.7 11.5 12.3 13.2 14.3 14.8 15.7 16.5 17.3 18.2 19.0 19.7 20.9

52 9.6 10.6 11.4 12.2 13.1 14.2 14.7 15.5 16.3 17.2 18.1 18.8 19.5 20.7

53 9.5 10.5 11.3 12.1 12.9 14.1 14.6 15.4 16.1 17.0 17.9 18.7 19.3 20.5

54 9.4 10.4 11.3 12.0 12.8 13.8 14.4 15.3 16.0 16.9 17.8 18.5 19.1 20.3

55 9.39 10.3 11.2 11.9 12.7 13.7 14.3 15.2 15.9 16.7 17.6 18.3 19.0 20.1

Инновационные исследования

1.Генетические факторы нарушения системы детоксикации ПЦР-анализ делеционных полиморфизмов в генах GSTT1, GSTM1

Выявление делеций в генах GSTT1, GSTM1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR). ПЦР анализ включал несколько стадий: 1. Денатурация ДНК 2. Отжиг праймеров 3. Амплификация генов. Исследования образцов крови проводились в лаборатории иммуногистохимии и электронной микроскопии централизованного патологоанатомического отделения Перового МГМУ им. И.М. Сеченова. Специальной подготовки пациентов к исследованию не требовалось. 2.Определение концентрации бионеорганических соединений в эякуляте Исследования проводились в центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Министерства Сельского хозяйства Российской Федерации с использованием индуктивно-связанной плазменной масс-спектрометрии (ИСП-МС, ELAN, Perkin Elmer). Пробоподгатовка для многоэлементного анализа проводилась согласно методическим указаниям Федерального центра Госсанэпиднадзора РФ МУК 4.1.1483-03. Для пробоподготовки использовалась посуда из фторопласта, тщательно промытая в УЗ ванне разбавленной 1:1 HN03 и трижды ополоснутая деионизированной Н20. Многоэлементный анализ включал: 1 .Пробоподготовка. 0.5 мл эякулята помещали в тефлоновый сосуд микроволновой печи MWS-2 (Berghof), добавляли 5 мл смеси концентрированной HN02 и Н202 2:3. Озоление по программе печи Р6. На стадии пробоподготовки рассчитывался удельный вес сперматозоидов в каждой пробе (п=80) в зависимости от объема эякулята и количества сперматозоидов. 2.Анализ. Аналит поступал на определение элементов в масс-спектрометр ИСП-МС ELAN (Perkin Elmer). Результат рассчитывался с учётом разбавления компьютером прибора и выдавался в ppb (мкг/л).

Для исследования металл-лигандного гомеостаза полученные данные из ppb переводились в ppm (ppb/1000). Расчёты коэффициентов распределения бионеорганических элементов в эякуляте и металл-лигандного гомеостаза проводился по формулам:

- . , . _ концентрация элемента в семенной плазме

коэффициент распределения ppm = ppb/1000---

концентрацию элемента в эякуляте

коэффициент металл — лигандного гомеостаза = ме™л

Статистическая обработка результатов

Обработка данных проводилась с помощью пакета программ Statistica 6.0 и Microsoft Exell 2007 for Windows. В случае распределения, близкого к нормальному, количественные показатели представлялись в виде средних значений (Mean) ± стандартное отклонение (SD). Все статистические тесты выполнялись для уровня статистической значимости р<0.05. Для установления корреляции между признаками вычислялся коэффициент Пирсона.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Участники исследования разделены на две группы. Первую составили пациенты после различных видов оперативного лечения варикоцеле слева (лапароскопическое клипирование яичковой вены, операция Мармара, операция Иваниссевича) (п=40), вторую здоровые добровольцы (п=40). Таблица 2. Показатели спермограмм участников исследования.

показатель 1 группа (п=40) M±SD 2 группа (п=40) M±SD 1 группа разброс показателей 2 группа разброс показателей Р

количество сперматозоидов (млн/мл) 17.20±5.87 46.78±21.06 10-32 15-90 <0,001

подвижность сперматозоидов (а+в) % 30.93±13.95 49.20±8.62 4-52 32-59 <0,001

патологические формы сперматозоидов % 83.25±9.97 64.25±9.23 50-98 52-82 <0,001

В таблице 2 представлены основные параметры спермограмм участников исследования. У пациентов после оперативного лечения варикоцеле в сравнении с группой контроля отмечалось статистически достоверное снижение количества и подвижности сперматозоидов с преобладанием патологических форм (р<0,001).

Таблица 3 демонстрирует панель эссенциальных бионеорганических элементов полученную на основании многоэлементного анализа эякулята участников исследования. У пациентов 1 группы выявлено статистически достоверное снижение концентрации в эякуляте Ыа, К, Са, Р, Ре, Со (р<0,001) и повышение концентрации Мп, Сг (р=0,004, р=0,001). Не выявлено статистически достоверного отличия между группами в содержании других представленных элементов.

Таблица 3. Панель эссенциальных бионеорганических элементов.

показатель (мкг/л) 1 группа (n=40) M±SD" 2 группа (n=40) M±SD 1 группа разброс показателей 2 группа разброс показателей Р

Na 20.95±979 3157±1660 564-3800 1500-7400 0,001

К 1245±1802 3039±1484 110-6000 900-5800 <0,001

Ca 572±455 1069±341 106-2000 512-1900 <0,001

Р 1019±589.6 2006±1067 207-2600 500-3822 <0,001

Zn 222±124.35 309.05±149 60-470 100-560 0.06

Mg 269±149.61 365±231.80 70-600 100-800 0.29

Fe 3.08±1.86 4.30±0.65 0-5 3-5 0,000

Mn 31.7±27.7 16.5±16.5 2-96 2-46 0,004

Си 40.05±27.05 37.10±18.16 10-96 20-76 0,569

Se 13.3±13.56 14.20±7.36 0-46 5-31 0,721

V 14.28±21.8 11.5±9.30 0-88 1-33 0,461

Cr 128.9±140.8 49.6±33.54 1-500 12-125 0,001

Co 1.10±1.77 4.75±2.92 0-6 1-10 0,000

" Mean — арифметическое среднее Std. Deviation - среднее квадратичное (стандартное) отклонение

И

Таблица 4. Коэффициенты распределения бионеорганических элементов в эякуляте.

показатель 1 группа 2 группа норма

N» 0.6 1.7 >1.5

Mg 1.03 1.03 0.5-1

Р 0.5 1.3 0.5-1

К 1.05 0.5 <0.5

с» 0.5 1.4 >1.5

Zn 0.7 0.7 <0.5

TI 0.4 1.03 0.5-1

V 0.4 0.3 <0.5

Сг 0.4 1.03 0.5-1

Ми 0.4 1.03 0.5-1

Со 0.9 1.03 0.5-1

№ 0.4 0.4 <0.5

Си 0.6 1.5 >1.5

Se 0.4 1.5 >1.5

Fe 0.9 0.3 <0.5

AI 1.3 1.03 0.5-1

Таблица 5. Коэффициенты металл-лигандного гомеостаза.

показатель 1 группа 2 группа

Na/K 0.7 1.3

Mg/Ca 0.3 0.3

P/Ca 1.3 1.7

Zn/Ca 0.2 0.2

Tl/Ca 0.03 0.01

V/Ca 0.03 0.01

Cr/Ca 0.2 0.05

Mn/Ca 0.04 0.01

Co/Ca 0.002 0.004

Ni/Ca 0.01 0.009

Cu/Ca 0.05 0.03

Se/Ca 0.02 0.01

Fe/Ca 0.002 0.003

Al/Ca 0.04 0.02

В таблицах 4-5 представлены коэффициенты распределения бионеорганических элементов в эякуляте участников исследования и коэффициенты металл-лигандного гомеостаза. В группе контроля нормы коэффициентов распределения находились в пределах референтных значений. У пациентов после оперативного лечения варикоцеле отмечалось нарушение распределения бионеорганических элементов в сторону избытка или недостатка в семенной плазме и сперматозоидах вне зависимости от количественного (абсолютного) содержания металлов в эякуляте.

Таблица 6. Коэффициенты корреляции параметров спермограммы и бионеорганических элементов.

показатель количество сперматозоидов подвижность сперматозоидов патологические формы сперматозоидов

г Р г Р г Р

Яа 0.538 0,000 0.569 0,000 -0.616 0,000

К 0.457 0,000 0.443 0,000 -0.457 0,000

Са 0.290 0,009 0.308 0,005 -0.305 0,006

Р 0.433 0,000 0.597 0,000 -0.524 0,000

Ъп 0.425 0,000 0.273 0,014 -0.285 0,010

Ге 0.347 0,002 0.508 0,000 -0.418 0,000

0.158 0,162 0.147 0,192 -0.193 0,086

Яе 0.028 0,802 0.012 0,919 0.52 0,650

Мп -0.402 0,000 -0.571 0,000 0.500 0,000

Таблица 6 демонстрирует коэффициенты корреляции Пирсона параметров спермограммы и основных бионеорганических элементов. Отмечалась положительная статистически достоверная корреляционная связь между содержанием и подвижностью сперматозоидов с концентрацией Ыа, К, Са, Р, Бе в эякуляте. Отрицательная статистически достоверная корреляционная связь между содержанием патологических форм сперматозоидов в эякуляте и концентрацией вышеперечисленных металлов. Не выявлено достоверной корреляционной связи между содержанием и Бе в эякуляте с

параметрами спермограммы.

Натрий. Калий. Нариевый насос. ^а/К- обменивающая АТФ-аза)

Среднее содержание Ыа в 1 гр. 2095±979 мкг/л, 2 гр. 3157±1660 мкг/л, К в 1 гр.1245±1802 мкг/л, 2 гр. 3039±1484 мкг/л. В 1группе концентрация Ыа составила 66.3% от концентрации в группе контроля, К 41% соответственно. Различие между группами статистически достоверное (р=0,001). Коэффициент распределения Ыа в норме>1.5, К<0.5. Указанные коэффициенты отражают активность №+/К+-обменипающей АТФ-азы. За счёт энергии АТФ из клетки выталкиваются 3 иона Иа+ а в клетку поступают 2 иона К+. После ионообменной реакции на наружной стороне

13

мембраны фермент отщепляет 2 иона К+ и неорганический фосфат внутрь клетки. Затем цикл повторяется. Внешняя клеточная мембрана обычно непроницаема для К. Рисунок 1 демонстрирует проницаемость клеточной мембраны за счёт ионно-обменной реакции натрия и калия. О нарушении проницаемости свидетельствуют снижение общей концентрации элемента, в частности в эякуляте, и повышение в семенной плазме (увеличение Кр>0.5). В 1 группе Кр Na составил 0.6, 2 гр. 1.7. Кр К в 1 гр. 1.05 2 гр. 0.5. Для оценки металл-лигандного гомеостаза рассчитан коэффициент равный в 1 гр. 0.7, 2 гр. 1.3. У пациентов после оперативного лечения в сравнение с группой контроля отмечались отклонения: 1. Снижение общей концентрации в эякуляте Na, К. 2. Косвенные признаки нарушения проницаемости клеточных мембран и электролитного гомеостаза в сперматозоидах за счёт снижения активности Na/K-обменивающей АТФ-азы. 3.Увеличение коэффициента металл-лигандного гомеостаза вследствие нарушения распределения элементов: избытка натрия и недостатка калия в сперматозоидах, при количественно-сниженном содержании металлов в эякуляте.

Рис. 1. Ионно-обменная реакция клеточной мембраны.

Кальций. Фосфор. Кальциевый насос (Са - АТФ-азы)

Среднее содержание Са в 1 гр. 572±455мкг/л, 2 гр. 1069±341 мкг/л. Среднее содержание Р в 1 гр. 1019±589 мкг/л, 2 гр. 2006±1067 мкг/л. В 1 группе концентрация Са составила 53.5% от концентрации в группе контроля, Р 50.7% соответственно. Различие между группами статистически достоверное (р<0,001). Коэффициент распределения Са в норме >1.5, Р 0.5-1. Указанные коэффициенты отражают активность Са - АТФ-азы.

Кальциевые каналы — это тип ионных каналов, избирательно проницаемых для ионов кальция Са2+. Молекулы кальциевого насоса занимают треть поверхности мембран. При гидролизе одной молекулы АТФ транспортируется 2 иона Са2+. Как и у натриевого насоса, здесь активный центр связывается с АТФ и 2 Са2+ на мембране со стороны цитозоля, затем, выбрасывает Са2+ и АДФ, после чего принимает исходное положение. Общим для натриевого и кальциевого насосов являться свойство переносить положительные заряды ассиметрично из клетки во внеклеточную среду. В 1 группе Кр Са составил 0.5 2 гр.1.4, Кр Р 1 гр. 0.5 2 гр. 1.3. Коэффициент металл-лигандного гомеостаза 1 гр. 1.3 2 гр. 1.7. У пациентов после оперативного лечения в сравнении с группой контроля отмечались отклонения: 1. Снижение общей концентрации в эякуляте Са, Р. 2.Нарушение электролитного гомеостаза вследствие недостатка Са в семенной плазме и избытка в сперматозоидах. 3. Низкий коэффициент МЛГ в первой группе обусловлен сниженным количественным содержанием Р в эякуляте. Коэффициент распределения Р находился в пределах нормы.

Цинк

Среднее содержание гп в 1 гр. 222±124.35 мкг/л 2 гр. 309±149.28 мкг/л. В 1 группе концентрация Ъх\ составила 72% от концентрации в группе контроля. Различие между группами статистически не достоверное (р=0,06). Коэффициент распределения в норме <0.5. В 1 гр. 0.7 2 гр. 0.7. Коэффициент МЛГ 1 гр. 0.2. 2 гр. 0.2. Коэффициент распределения оказался незначительно выше нормы в обеих группах. Он демонстрирует превалирование распределения металла в семенной плазме над сперматозоидами. Известно, что Ъ\\ - неорганический гормон, который входит в состав более 300 металлоферментов. Относительно гонад и простаты основная функция синтез тестостерона и ингибирование активности 5-альфа редуктазы. Недостаток 20% общей концентрации Ъл в эякуляте 1 группы следует расценивать как сниженное содержание Ъп в сперматозоидах, т.к. в норме металл имеет преимущественно внутриклеточное распределение.

Коэффициенты распределения и МЛГ идентичны в двух группах. Назначение цинк содержащих препаратов пациентам с патозооспермией после оперативного лечения варикоцеле без определения содержания цинка в эякуляте нецелесообразно в связи с нормальным гомеостазом металла и неуклонно приведёт к увеличению содержания в ткани предстательной железы выше физиологических концентраций. Элементы повышенной токсичности. Алюминий. Таллий.

Таблица 7. Содержание элементов повышенной токсичности в эякуляте участников исследования.

ПОКАЗАТЕЛЬ 1 ГРУППА (N=40) \liSD 2 ГРУППА (N=40) м±во 1 ГРУППА РАЗБРОС ПОКАЗАТЕЛЕЙ 2 ГРУППА РАЗБРОС ПОКАЗАТЕЛЕЙ р

Аь (мкг/л) 25.2±25 13.0±14.08 0-93 2-57 0,009

Ть (мкг/л) 15.6±20.6 13.2±3.55 0-69 9-19 0,006

Среднее содержание А1 в 1 гр. 25.23±25 мкг/л 2 гр. 13±14.08 мкг/л.

В 1 группе концентрация А1 на 93% превышала концентрацию в группе

контроля. Различие между группами статистически достоверное (р=0,009).

Коэффициент распределения в норме 0.5-1. В 1 гр. 1.3 2 гр. 1.03.

Коэффициент МЛГ 1 гр. 0.04 2 гр. 0.02. Среднее содержание Т1 (талия) в 1

гр. 15.6±20.6 мкг/л 2 гр. 13.2±3.55 мкг/л. В 1 группе концентрация

элемента превышала на 20% концентрацию в группе контроля. Различие

между группами статистически достоверное (р=0,006). Коэффициент

распределения в норме 0.5-1. В 1 гр. 0.4, 2 гр. 1.03. Коэффициент МЛГ 1

гр. 0.03 2 гр. 0.01. У пациентов после оперативного лечения отмечались

отклонения: 1. Увеличение общего содержания в эякуляте алюминия и

таллия. 2. Незначительное увеличение коэффициентов распределения и МЛГ

алюминия в сторону преимущественного распределения элемента в семенной

плазме. 3. Перераспределение талия из семенной плазмы в сперматозоиды.

Таблица 8 демонстрирует коэффициенты корреляции Пирсона талия и

бионеорганических элементов. Отмечалась положительная статистически

достоверная корреляционная связь элемента с селеном и марганцем,

отрицательная с алюминием и калием. Накопление талия в сперматозоидах

16

сопровождалось нарушением проницаемости клеточных мембран вследствие ингибирования натрие-калиевого насоса и АТФ.

Как упоминалось ранее, у пациентов после оперативного лечения

варикоцеле отмечалось нарушение распределения элементов в сторону

избытка натрия и недостатка калия в сперматозоидах, что сопровождалось

также нарушением распределения в эякуляте селена и марганца.

Проведённый корреляционный анализ отражает взаимоотношения металлов,

которые могут проявляться антагонистически или синергично.

Таблица 8. Коэффициенты корреляции таллия и бионеорганических элементов.

показатель К А1 ве Мп

Т1 г Р г р г Р г Р

-0,255 0,002 -0,313 0,005 0,744 0,000 0,285 0,001

Таблица 9. Коэффициенты корреляции талия и алюминия с параметрами спермограммы.

показатель количество сперматозоидов подвижность сперматозоидов патологические формы сперматозоидов

А1 г Р г Р г Р

-0,217 0,05 -0,066 0,5 0,188 0,096

Т1 -0,142 0,2 -0,176 0,01 0,222 0,04

В таблице 9 представлены коэффициенты корреляции Пирсона талия и алюминия с параметрами спермограммы. Отмечалась положительная статистически достоверная корреляционная связь талия с количеством патологических форм сперматозоидов и отрицательная с подвижностью сперматозоидов, а также отрицательная корреляционная связь алюминия с количеством сперматозоидов.

График 1. Корреляционная связь Т1-патологические формы сперматозоидов.

талий (мкг/л)

59 ВА 59 54 64 32 вО ее 83 96

62 54 во 82 82 £!7 86 86 96

патологические формы сперматозоидов (%)

График 1 демонстрирует зависимость морфологии сперматозоидов от содержания талия в эякуляте. У пациентов с концентрацией талия в эякуляте >60 мкг/л уровень тератозооспермии достигал 86-96%. При содержании талия <20 мкг/л уровень тератозооспермии находился в диапазоне 54-82%. График 11 отражает зависимость подвижности сперматозоидов от концентрации талия в эякуляте. У пациентов с концентрацией элемента в эякуляте > 60 мкг/л, подвижность сперматозоидов составляла 4-20%. Оценка андрогенного статуса

Пациенты после оперативного лечения варикоцеле разделены на две подгруппы по 20 человек в каждой. Критерием разделения послужили результаты ПЦР анализа делеционных полиморфизмов в генах ОБТП, ОБТМГ Подгруппа 1 генотип 08ТТ1(+) С8ТМ1 (+). Подгруппа 2 генотип 08ТТ1(+) ОБТМ! (-).

Таблица 10. Результаты обследования пациентов после оперативного лечения варикоцеле.

показатель норма подгруппа 1 генотип С8ТТ1(+) С8ТМ1(+) (п=20) \IiSD подгруппа2 генотип С8ТТ1(+) С8ТМ1(-) (п=20) М±8Б разброс подгруппа 1 разброс подгруппа 2

ФСГ (МЕ/л) 2-13 4.6±0.67 8.25±0.9 2.33-6.9 2.5-14

Л Г (МЕ/л) 1.5-9 4.73±0.68 6.5±0.8 3.6-5.8 4.0-9.17

Эстраднол (пмоль/л) 70-200 129±3.59 102±3.1 117-142 52.2-220

Пролактин (мМЕ/л) 60-560 187±4.33 112±3.3 109-266 49-175

В таблице 10 представлены результаты исследования репродуктивных гормонов крови пациентов после оперативного лечения варикоцеле. Уровни гипофизарных гормонов находились в пределах референтных значений, что связано с исключением из исследования пациентов с (гипо) гипергонадотропным гипогонадизмом.

Таблица 11. Результаты обследования пациентов после оперативного лечения варикоцеле.

показатель СвТМ1(+) (п=20) \IiSD ввтми-) (п-20) М±вО Разброс показателей С8ТМ1(+) Разброс показателей СвТМЦ-) Р

Тестостерон (нмоль/л) 21.5±4.82 15.55±1.57 17-28 13-17 <0,001

Ингибин В (нг/мл) !62.3±19.5 161.5± 12.9 143-211 142-186 >0,001

количество сперматозоидов (млн/мл) 20.7±6.01 13.7±2.98 13-22 10-19 <0,001

подвижность сперматозоидов (% а+в) 40.4±7.08 21.4±П.08 31-52 4.42 <0,001

патологические формы сперматозоидов (*/в) 77±6.27 88.75±10.6 66-87 50-98 <0,001

В таблице 11 представлены параметры спермограммы и результаты исследования тестостерона и ингибина В у пациентов после оперативного лечения варикоцеле. Среднее содержание ингибина В в 1 подгруппе 162.3±19.5, 2 подгруппе 161.5±12.9. Различие между подгруппами статистически не достоверное (р>0,001). Среднее содержание тестостерона в 1 подгруппе - 21.55±4.82 нмоль/л, 2 подгруппе - 15.55±1.57 нмоль/л. Различие по указанному признаку статистически достоверное (р<0,001), однако у всех обследованных пациентов содержание тестостерона находилось в пределах референтных значений от 12 до 33 нмоль/л. В таблице 1 представлена персонифицированная шкала расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона, согласно которой у 50% пациентов (2 подгруппа п=20) выявлен прогнозируемый риск развития андрогенодефицита в возрасте 38-47 лет.

График 2. Зависимость концентрации сперматозоидов в эякуляте от уровня общего тестостерона.

концентрация сперматозоидов в эякуляте (млн/мл)

График 2 демонстрирует зависимость концентрации сперматозоидов от уровня тестостерона в крови. При содержании общего тестостерона < 20 нмоль/л, концентрация сперматозоидов составила 10-13 млн/мл. С увеличением уровня тестостерона до 28 нмоль/л, прямо пропорционально увеличивалась концентрация сперматозоидов в эякуляте с 18 до 86 млн/мл.

Таблица 12. Коэффициенты корреляции тестостерона и бионеорганических элементов.

Бнонеорганнческий элемент тестостерон

г Р

N8 0,27 0,001

К 0,66 <0,001

Са 0,420 <0,001

Р 0,424 <0,001

Ха 0,345 0,001

Бе -0,116 0,001

Т1 -0,253 0,002

А1 0,29 0,7

Мп -0,602 <0,001

Сг -0,542 <0,001

В таблице 12 представлены коэффициенты корреляции Пирсона тестостерона и бионеорганических элементов. Отмечалась положительная статистически достоверная корреляционная связь уровня тестостерона в

крови с содержанием в эякуляте N3, К, Са, Р, Ъл, отрицательная с содержанием Т1, 8е. Не выявлено достоверной корреляционной связи между уровнем тестостерона и концентрацией алюминия в эякуляте.

Таблица 13. Содержание в эякуляте элементов повышенной токсичности в зависимости от генотипа.

ПОКАЗАТЕЛЬ 1ПОД ГРУППА (N-20) M±SD 2 ПОДГРУППА (N-20) M±SD 1 ПОДГРУППА РАЗБРОС ПОКАЗАТЕЛЕЙ 2ПОД ГРУППА РАЗБРОС ПОКАЗАТЕЛЕЙ р

AL (МКГ/Л) 13.0± 14.08 30.0±28.47 0-57 4-93 0,01

TL (МКГ/Л) 4.8±4.6 26.4±24.4 0-20 20-69 0,000

Таблица 13 демонстрирует содержание генотоксичных элементов в эякуляте

в зависимости от генотипа. У пациентов с делецией гена С8ТМ1 (подгруппа 2) отмечалась тенденция к более высокому содержанию в эякуляте алюминия и талия вследствие генетически детерминированного дефицита механизма обезвреживания ксенобиотиков и эндогенных метаболитов.

Таблица 14. Коэффициенты металл-лигандного гомеостаза.

показатель GSTMl(-) (п=20) GSTM1(+) (п=20) 1 группа (п=40) 2 группа (добровольны) (п=40)

Na/K 0.2 0.7 0.7 1.3

P/Ca 1.2 1.4 1.3 1.7

Fe/Ca 0.04 0.04 0.04 0.02

Al/Ca 0.04 0.04 0.04 0.02

Т1/Са 0.05 0.04 0.03 0.01

В таблице 14 представлены коэффициенты МЛГ наиболее клинически значимых бионеорганических элементов. У пациентов с делецией гена 08ТМ1 отмечалась тенденция к более выраженным нарушениям МЛГ в сравнении с пациентами С5ТМ1(+). Изменения МЛГ Ре в зависимости от генотипа не выявлено.

Выводы

1.Установлено, что у пациентов с делецией гена С8ТМ1(п=20) после оперативного лечения варикоцеле отмечалась тенденция к снижению андроген-продуцирующей функции гонад и нарушению сперматогенеза.

2.На основании персонифицированной оценки содержания общего тестостерона у пациентов с делецией гена 08ТМ1(п=20) выявлен прогнозируемый риск развития относительного андрогенодефицита в возрасте 38-47 лет.

3.На основании анализа делеционных полиморфизмов в генах ОБТП 08ТМ1, у пациентов с делецией гена в8ТМ1 выявлено статистически достоверное снижение содержания общего тестостерона до 13-17 нмоль/л и отклонения в показателях спермограммы (олиго, астено, тератозооспермия) в сравнении с пациентами 08ТМ1(+) (р<0,001).

4.Установлено, что причиной относительного андрогенодефицита и патозооспермии на фоне делеции гена С8ТМ1 является накопление токсичных металлов в эякуляте: А1>93% Мп>93% Т1>20%, нарушающих металл-лигандный гомеостаз, синтез АТФ и проницаемость клеточных мембран.

5. Показано, что обнаружение генотоксичных бионеорганических элементов и нарушение металл-лигандного гомеостаза является неблагоприятным фактором для улучшения качества эякулята после оперативного лечения варикоцеле.

Практические рекомендации

1. Персонифицированная шкала расчёта возрастной нормы содержания общего тестостерона может применяться в амбулаторной практике для оценки прогнозируемого риска развития андрогенодефицита у мужчин.

2. Исследование металл-лигандного гомеостаза эякулята и генотипа GSTT1 GSTM1 рекомендовано в качестве уточняющих методов диагностики для включения в алгоритм обследования пациентов с патозооспермией после оперативного лечения варикоцеле.

3. Пациентам с делецией гена GSTM1 после оперативного лечения варикоцеле рекомендовано назначение специфической терапии направленной на элиминацию генотоксичных соединений, улучшение проницаемости клеточных мембран, трофики и обменных процессов в ткани яичка, а также восстановление металл-лигандного гомеостаза.

4. Пациентам с патозооспермией после оперативного лечения варикоцеле не рекомендуется назначение цинк и селен содержащих препаратов без определения содержания элементов в эякуляте и расчётов коэффициентов распределения и металл-лигандного гомеостаза.

Список научных работ опубликованных по теме диссертации

1. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Усачёва O.A. Андрогенный статус мужчин после оперативного лечения варикоцеле //материалы первого национального форума «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» Ростов-на-Дону, 2012 с.155-156.

2. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г. Чалый М.Е., Усачёва O.A. Молекулярно-генетические исследования в диагностике патозооспермии после оперативного лечения варикоцеле // материалы первого национального форума «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» Ростов-на-Дону, 2012 с. 156-157.

3. Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Усачёва O.A. Гипогонадизм мужчин после оперативного лечения по поводу варикоцеле//материалы VII международного конгресса по андрологии ПААР. Сочи, 2012 с. 83-84.

4. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Усачёва O.A.

Роль полиморфизма генов глутатион трансфераз Т1 М1 в развитии паТозооспермии после оперативного лечения варикоцеле // материалы конференции «Фундаментальная и практическая андрология» М., 2012.

5. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Камалов A.A., Усачёва O.A. Роль генетических факторов в диагностике патозооспермии у мужчин с варикоцеле // материалы XII съезда Российского общества урологов. М., 2012 с. 19-20.

6. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Усачёва O.A. Репродуктивная функция мужчин после оперативного лечения варикоцеле // Фарматека. 2012 №12 с 46-48.

7. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Усачёва O.A. Персонифицированный подход к оценке андрогенного статуса мужчин с варикоцеле // Сеченовский вестник. 2012 №12 с 4-6.

8. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Григорян В.А., Барашков Г.К., Усачёва O.A. Роль нарушения металл-лигандного гомеостаза в развитии патозооспермии после оперативного лечения // Врач. 2013 №1 с 33-35.

9. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Чалый М.Е., Барашков Г.К., Усачёва O.A. Бесплодие и патозооспермия после оперативного лечения варикоцеле //Фарматека. 2013 №3 35-37.

Подписано в печать 28.05.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 80 Экз. Заказ № 4536 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39