Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Острая фаза воспаления: С-реактивный белок и его роль в регуляции иммунитета

РГб од

На правах рукописи

ТОКСЛМБАЕВЛ САУЛЕ ХШСОБНА

ОСТРАЯ ФАЗА. ВОСПАЛЕНИЯ : С-РЕАКТИВНШ БЕЛОК И ЕГО РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ИШГЯИТЕТА.

14.00.36 - АЛЛЕРГОЛОГИЯ И 1ЙШН0Л0ГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации нэ соискаш1е ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА - 1ЭЭ6

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени института эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи, РАМН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биолотачеысих наук,чл.-корр.РАЕН,профе ссор А.А.ЯРИЛИН доктор медицинских наук, профессор И.С.ГУЩИН дбктор медицинских наук, профессор А.М.МОРОЗ

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательсгасй институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского, МЗ РФ

Защита диссертации состоится года

а часов на заседании диссертационного совета

Д 001.07.01 в Научно-исследовательском института эпидемиологии и микробиологии.имени Н.Ф.Гамалеи, РАМН по адресу: I23098,Москва,ул.Гамалеи,18.

С диссертацией иохно ознакомиться в библиотеке НИШ имени Н.Ф.Гамалеи,РАМН

Автореферат разослан года.

Уче1шй секретарь ■ Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук ' Е.И.КОПТЕЛОВА

"ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблема. До настоящего времени не вызывал сомнения тот факт,что формированию иммунного ответа, в том числе антиин^кциошюго,предшествует активация не специфических по своей направленности механизмов, интегрировашшх в более общую систему икмунореактивности и одновременно выполняющих са?юстоятельше адаптационные функции. В га ряду ведущее место занимает острофаз-шй ответ- сложный комплекс ранних гематологических и метаболических реакций, направленных на коррекцию различных по своей природе нарушит! иммунного гомеостаза [инфекЦия, онкогонез, ■ вагащнация и т.д.]. Как известно, острофазный ответ и его сыво-вороточные оффектсрные молекулы рассматриваются в качестве важнейших факторов естественной резистентности организма [James К. et al.,1981, Pepys M.B. et al.,19941. Вместе с тем появились даншо о взаимосвязи острофазной рэакщш с. иммуногенезом.Выяснилось, что ее индукторами являются ключевые медиаторы воспаления-' Ш1-6, 11Л-1, определенный баланс которых, по-видимому,обеспечивав г весь спектр остроФазных протешюв [Perlmutter H.D. et al.,1986, Schllrcgen F.K; et all.,1995].В свою очередь,реактанты острой фазц воспаления обладают гаялуномодулирующшли свойствами и по некоторым данным способны усиливать продукцию собственных индукторов. Поэтому изучение острофазного ответа является необходимым условием получе-чения целостной картшш механизмов поддержания неспецифической резистентности организма к инфекщш и закономерности формирования иммутштета, начиная с самих ранних этапов.

Таким образом, в решении проблемы взаимосвязи острой фазы воспаления с иммунным ответом может иметь существенное значение изучение иммунобиологических свойств основного острофазного реактанта -С-реактивного белка.

Существование закономерности "структура-активность" подтверждается исследовашями по изучению лигандной специфичности эффекторной молекулы СРБ. Вопрос о роли сайтов связывания СРВ и участии ионов Ca2+,Hg2+n Ва^+ в механизмах взаимодействия с. лигандами остается по прежнему открытым и дисскусиошшм. Решение

данной проблемы может способствовать выяснению типа сайтов

- г -

связывания,игравших доминирующую роль в механизмах взаимодействия с лигавдами, что в свою очередь даст возможность определить более специфический метод выделения протеина из биологических жидкостей организма. Разработка оптимального метода выделения СИЗ предусматривала получение высокоочшценного препарата бежа, для последующего изучения его иммунорегуляторных свойств. Не исключено что отсуствие высокоочищещшх препаратов является одной из причин противоречивости имеющихся в настоящее время данных. Все это определило цель и , задачи, наших исследований.

- Цель работы :Выяснение роли основного острофазного реакт-анта -С-реактивного. белка в механизмах регуляции и . формировании иммунитета.'

При этом работа логически разбивается на 2 этапа: первый - подготовительный, обусловленный необходимостью получения высокоочищенного препарата С-реактивного белка и включает следующие задачи:

-Изучение механизма взаимодействия фосфохолиновых и поликатионовых сайтов СРВ с лигавдами и роль ионов Ca2t Hg?+ и Ва2+в процессе связывания; -Создание новых биоспецифических сорбентов для выделения СРВ с использованием Синтетических соединений фосфэхолино-вого ряда в виде лигавдов белка ' . >

-Сравнительный анализ полученных биоспецифических сорбентов для выделения СРВ;

Второй этап - изучение действия СРВ. на иммунную систему в эксперименте, включает следующие задачи: -Воздействие СРВ на функциональную активность макрофагов, влияние на бактерицидный потенциал клеток, фагоцитоз; -Изучение влияния СРВ на реакции клеточного иммунитета (реакция гиперчувствительности замедленного тщ1а(ГЗТ) ин виво, реакция бласттрансформашга лимфоцитов, митогенные и комитоген-ные свойства in vivo и In vitro );

-Исследование влияние ОРТ на гуморальный иммунный ответ (определение специфических антителообразупцих клеток (АОК) к эритроцитам барана (ЭБ) я спонтанных АОК в реакции Ернэ);

Научная новизна и практическая ценность исследования

Впервые разработана схема получения высокоочишен-югэ препарата СРБ, отвечашая требованиям современной биоток-юлогии;

Впервые установлено, что в реализации взаимодействия Еосфохолиновых сайтов связывания С-реактивного белка с шгандами участвуют ионы Са2+;

Разработан новый способ получения фосфохолинсодеркащих био-

ягацифических сорбентов на основе производных глицерофосфохолина i аминозамещенных агарозных матриц для получения СРВ; определена иггимальная концентрация иммобилизованных лигаддов и охарактеризовано влияние катионннх группировок в структуре спейсера :а степень чистоты выделяемого СРВ;

Впервые показано, что наиболее эффективными являются сорбенты с незаряженными спейсерными группировками;

Разработана схема получения СРВ высокой степени чистоты пу-^ ем сочетания методов аффинной и ионообменной хроматогрфии;

Впервые установлено, что СРВ, определяя острую фазу оспэления повышает функциональную активность, стимулирует актерицидные свойства макрофагов и их фагоцитиирушую' пособность;

). Впервые показано действие СРВ на реакции клеточно-Ь ешкл» нитет. ВЕедоН>\е СрБ им В»во меняет «нте^ивность ГЗТ ь ависимости от сроков введения (угнетение реакции п|и ведении после сенсибилизации и ' усиление-при введении до энсибилизации);

Впервые показано, что введение СРВ in vivo влияет на уровень эолиферативной активности лимфоцитов мышей и показано, что СРВ 5лалает митогенными и комитогенными эффектом in vitro;

Впервые установлено, что введение СРБ in vivo влияет на ¡акции антителообразования,меняет "количество специфических и (специфических АОК в'зависимости от динамики введения СРБ;

Впервые доказано, иммуннорегуляторная активность' СРВ не 1Лько в системе in vitro, но и при введении в организм. Действие >епарата зависит от дозы и сроков обработки животных;

Таким образом, получе! существенные доказательства

участия СРБ в поддержании неспецифической резистентности орго1шзма к инфекции, регуляции иммуногенеза и взаимосвязи острофазной реакции оргашзма с последующим иммунным ответом.

На основе метода выделения СРБ из биологической кидкости человека создан производственный регламент для выпуска тест-системы для определения уровня СРБ в сыворотке крови.

! Вместо с тем, данные о дамунорегуляторном действии СРБ in vivo открывают перспективу ого дальнейшего использовать с качестве иммуномодулятора. ■ .

Исследования проводились в рамках государственной . программы 0.69.07."Иммунорегуляция и шмунокоррекция", финансиро- • ваиие осуществлялось по гранту Министерства Оборони РФ:"Разработка новых высокоэффективных иммуномодуляторов на основе гшдогешгого фактора С-реактивного белка для неспецифической профилактике и лечения особо опасных инфекциошшх заболеваний."

Результаты исследования защищены авторским свидетельством на изобретете за N 5036548/13/017084.

Метод .выделения СРБ из асцитной кидкостн человека бил использован в исследовательских работах лаборатории клеточного иммунитета НИ1Ш имени Н.Ф.Гамалеи ,РАШ, лаборатории сравнительной вирусологии 1ШИ вирусологии И.Д. ,РАШ1 и лаборатории НИИ микробиологии МО РФ.

Апробация работы.¡«йультати изложенные- в диссертации, докладывались на IV Международной конференции по воспаления (Швейцария,1991), на Международном симпозиуме по аллергологи! i клшшческой иммунологии (Алматьг,1992), на Международно! конференции по1 иммуномодуляторам' бактериального происхождения синтетическим адыпвантам (Румшшя,1993), на ■ конфоренщш эндогенных иммуномодуляторов Университета Юга-Парижг (Франция,1995). Диссертационная работа апробирована на научно! конференции отдела иммунологии НШЭМ имени Н.Ф.Гамалеи РАМН .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статьи и V тезисов.

- S'V.

Обьсн и структура работы.Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста, содержит 21 таблиц,б схем и 25 рисунков. Работа состоит из введения, обзора- литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения выводов, списка литературы, содержащего 320 источника литературы, из которых 294 зарубежных.

. материалы и методы.

В качестве исходных агарозкнх сорбентов в работе использовали сефарозу 4В, BrCH-активированную сефарозу 4В ("Pharmacia", Швеция), ЕАН-агарозу■4 % ("Chemotech", Эстония), а также DEAE-ce-фадекс А-50 и сефадакс G-15 ("Pharmacia", Швеция), ионообменную смолу АРА-8п ("Реохгел", Россия).

Содержание аминогрупп в'замещенных агарозних матрицах определяли методом кислотно-основного титрования ! [Ларина Н.и. и соаБт.19921 и , а также' проводили кулонометрическое определение азота после разложения проб по Кьелъдалга Марина Н.И. и соавт.19921.

' Концентрацию таю'бижзованных лигандов устанавливали по содержанию фосфора методом Бартлота [Досон Р. и соавт.1991] после минерализации проб 70 %-ной НСЮ^ при 250-300 °С.

Содержание. общего белка детектировали с помощью прибора "1М-qord S 2133" ("LKB", Швеция), снабженного фильтром 280 им, или с помощью метода Лоури [Досон и соавт.1992]..

Концентрацию С-реактивного белка определяли методом простой радиальной иммунодаффузии по Манчини в модификации Стефани Д.В.[1987], для построения калибровочной кривой использовали стандарт. СРВ человека ("Behring", Германия).

Иммуноэлектрофорез выполнялис использованием антисывороток против С-реактивного белка ("Calbiochem", Швейцария) и нормальных белков сыворотки крови человека (ШИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия).

Для идентификации примесей использовали метод двойной ра-ди^.ъной иммунодаффузии по Оухтерлони и антисыворотки про-, тив сывороточного амилоида П ('-Sirina", США), аполипопротеина В [Остерман Л.А. 1983)..(Институт Экспериментальной Кардиологии КНЦ

РАМН, Россия), компонентов комплемента Сц, С1а, С3, С4 ("Sigma", США), альбумина, IgG.IgM.IgA и нормальных белков сыворотки крови человека (НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия). БШ-электрофорвз в полиакриламидном геле выполнен по известной методике (Остерман Л.А.1983] на приборе "Multiphor" ("LKB", Швеция).

Получение биоспецифических сорбентов

Приготовление аминозамещенных агарозных матриц ■ Матрица типа(Х), 2,5 г сухой ВгС1,'-активированной сефарозы 4В суспендировали в 100 мл 1 мМ HCl,выдерживали 1ч, гель промывали 2 л 1 мМ HCl и 200 мл карбонатного буфера II (pH 8,3 4 отфильтровывали через стеклянный фильтр Затем к гелю добав ляли 7,5 мл буфера II, содержащего 0,35 мл триэтилтетраамина, пере - машивали 2 ч при 18-20 °С, промывали 200 мл буфера II и 20Q мл трис-буфера III {pH 8,0), отфильтровывали. К влажному гелю добавляли 10 мл буфера III и встряхивали еще 2 ч при 18-20 °С (блокирование непрореагировавших групп носителя). Аминозамещенную матрицу промывали 200 мл карбонатного буфера (pH 8,3) и отфильтровывали. [Ш21=31 мкмоль/г сухого сорбента.

Матрица типа (II). .50 мл сефарозы <1В промывали 1,5 л дистиллированной воды, 150 мл карбонатного буфера I (пН 10,2), выдерживали в буфере 20-30 мин и отфильтровывали. К влажно му гелю добавляли 50 мл буфера I, охлаждали с помощью льда, затем осторожно при перемешивании добавляли по каплям 2,5 мл раствора BrCN в ацетонитриле (2 г/мл). Реакционную смесь.выдеркивали 10-15 мин при 4 °С. Активированный бромцианом носитель отфильтроЕ-^али, промывали 200 мл буфера I, 200 мл дистиллированной воды, 20 мл 25 8-ного водного раствора ацетона, 100-мл карбонатного буфера II <рН 8,3) и отфильтровывали. Далее к гелю добавляли 90 мл буфера II, содержащего 8 мл триэтилтетраамина, перемешивали 2 ч при 18-20 °С, промывали 200 мл буфера II и 200 мл трис-буфера III (pH 8,0), отфильтровывали. К сорбенту добавляли 100 мл буфера III еще 2 ч при 18-20 °С, промывали 200 мл карбонатного буфера II (pH 3,3) и отфильтровывали. (Ши 1=198 мкмоль/г.

Матрица типа (III). 10 мл эпоксиактивированной ашшогексилагарозы (ЕАН-агарозц 4 %) промывали Б00 мл 1 мМ HCl (pH 2-3), 100 мл карбонатного буфера II (pH 8,3) и отфильтровывали. [NH2 мкмоль/г сухого сорбента.

Матрица т и п а (IV). 20 мл сефарозы 4В промывали 1,5 л дистиллировать Л воды, отфильтровывали, добавляли 20 мл 0,2 м НаЮ4. и встряхивали в полиэтиленовой посуде 2 ч при 18-20 °С, Активированный гель промывали 300 мл дистиллированной воды, • отфильтровывали добавляли 20 мл водного раствора гексаметиленди-амина (20 миоль/мл) и с помощью HCl устанавливали pH 6,0. Реакци-энную смесь перемешивали 6 ч при 18-20 °С. К аминозамещенному сор-Зенту добавляли 1,2 г NaBH4 , растворенного в 10 глл дистиллирований воды, и перемешивали в открытом сосуде 18 ч при 18-20 °С. Матрицу промывали 500 мл 1 М IlaCl и 300 мл карбонатного буфера II (pH 8,3). пгая]=90 мхмоль/г сухого сорбента.

Получение ц иммобилизация фосфохолинсодер\ащх лигандов па аышюзамощонпцх'матрицах Получение лигандов <

an-Г л и ц о р o-3-ф осфохолин (1) получали путем [ропускшшя метапольного раствора 9,4 г яичного фосфзтидилхолина 50 мг/мл) через иок обменную смолу АРА-8П. Фракции, содержащие 9 глиц°рг!-0-фзсфохолин, пере осаждали из метанольного раствора фиром и высушивали в вакууме. Выход 2,6 г (89 %). Rj 0,2 (В).

Импдокарбонатное производное n-г л и ц е р о-З-ф о с ф о х о л и н а (2). К 640 мг sn-глице-о-3-фосфохол!ша (1>, растворенного в 12,8 мл карбонатного буфе-а I (pH 10,2) и охлаэденного с'помощью льда, осторожно прика-ывалк 0,5'мл раствора ВгСН в ацетонитриле (2 г/мл). Реакционную м-эсь перемешивали 10-15 мш при 4 °С. ВгСН-активированный sn-гли-эро-З-фосфохолин без обработки иммобилизовали на аминозамещешшх гарозшх матрицах типа (I) или типа (II).

Гликоле ввй альдегид фосфохоли-а v3). К раствору 2,1 г БП-глицеро-З-фосфохолина (1) в 80 мл ди-галлированной воды добавляли 3,5 г сухого NaI04 и перемешивали 3 мин при 18-20 °с. К реакционной смеси добавляли 1 мл этиленгли-

\

- о

коля, перемешивали еще 30 мин, и лиофилыю высушивали. Сухой остаток растворяли в 30 мл 0,01 Н СН3С00Ии хроматографировали в четыре приема на колонке с сефадзксом С-15 (1,6x76 см). Элюцию проводили 0,01 Н СН3СООН со скоростью потока 5 мл/ч,Фракции о0ъемом • 3,5 мл тестировали с помощью фуксинсернистой кислоты (определение альдегидных групп) и молибденового реактива (определение фосфатны: групп). Фракции, содеркащие гликолевый альдегид фосфохолина, лио-фил^но высушивали. Выход 1,0 г (55 Ж). 0,5 (В).

Иммобилизация днгавдов на ашшрзацещашшх-иатрццах

Биоспецифиче,ский сорбеит типа (1) К 9 мл уплотненного геля матрицы типа (I) добавляли 1,3 мл имидо-карбонатного производного ап-глицеро-З-фосфохолина (2) и 10 м карбонатного буфера II (рИ 8,3). Реакционную смесь перемешивали 2 ч при 18-20 °С, отфильтровывали. Сорбент промывали 100 мл буфера II и 100 мл трис-буфера III (рН 8,0), отфильтровывали. К сланному гелю добавляли 10 мл буфера III и встряхивали еще 2 ч при ■ 18-20 °С. Далее сорбент отфильтровывали и троекратно промывали 50 мл ацетатного буфера IV (рН 4,0) и 50. мл трис-буфора .V _ (р 8,0). Концентрация иммобилизованного лиганда 7 мкмоль/г сухог сорбента.

£7 и о с п е ц и ф й ч е -с к и й сорбент типа /(2) 5 мл уплотненного геля матрица типа (I), 1 Мл щидокарбонатног производного вп-глицеро-3-фосфохолина (2) и 6 мл карбонатного буфера II (рН 8,3) перемешивали 2 ч при 18-20 °С. Полученный сорбв! обрабатывали аналогично предыдущему опыту. Содержание лиганда 12 мкмоль/г сухого сорбента.

Биоспецифический сорбент типа (3: получали аналогично вышеописанным из 7,8 мл уплотненного геля ма: рицы типа (I) и 2,5 мл имидокарбонатного производного зп-глииоро--3-фосфохолина (2) с добавлением 10 мл карбонатного буфера II (р! 8,3). Концентрация иммобилизованного' лиганда 26 мкмоль/г.

Биоспецифический сорбент типа (4 К 14,8 мл уплотненного геля матрицы типа (II) добавляли 8 Мл ига докэрбонатного производного зп-глицеро-З-фосфохолина (2), 23 1

опытных группах вычисляли в процентах по отношению к контрольной группе.Препарат CFB вводили за I, 3 и 7 суток до сенсибилизации мышей ЭБ, одновременно с ней и спустя I и 3 суток юсло сенсибилизации ЭБ.

Реакция блаоттранформации лимфоцитов.

Постановку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) эсуществляли по общепринятой методике Брондз и соввтЛ1977] в . модификации Хачикяна и соавтЛ1978]. В опытах использовели '.шшей(СВА*С57В1/б)Р1 и мышей линии СБА и СЗН/Не J. Зпленоциты мышей готовили как описано выше,

три раза отмывали при помощи центрифугирования (800об/мин). Подсчет клеток производили при помощи камеры Горяева. Цля этого готовили суспензию клеток на среде культивирования (спленоциты -5x106 кл/мл ). .Одновременно готовили растворы митогенов. В качестве Т-митогенов были использованы: конканазапин А (Кон А) (Signa.США) в концентрации 0,5 мкг/tüi и 2 sctr/мл и Зитогемагглютинйн (ФГЛ) (PIIA-P,Sigma,США) в концентрации I мкг/мл. В качестве В-митогенов были использованы: шшолисахарид из E.coli (0127:B3;Sigma,CM) в концентрации 10 гясг/мл и 40 мкг/мл и декс'тран сульфат (ДС)(Fluka,Швейцария) в концентрации 50 мзсг/ил.

Микропластины для культивирования (Nunk,ДанияЧ закрытые крышками, помещали в С02 инкубатор (С02-5£,37оС). Культивирование продолжалось 72 часа. За 16 часов до окончания культивщ вания в каждую лунку вносили раствор ^-тимщцша (удельная активность 1 Кю/мкМ) ("Медрадиопрепараг", Россия) в среде KPMI-1640, по 5 мкл в каждую лунку. По окончании культивирования ¡слетки из каждой лунки осаждали на фильтры Tltertek ("Flow Laboratories", Великобритания) с помощью у станов ¡си для фильтрования.

При этом клетки промывали изотоническим раствором хлорида натрия, 5 % трихлоруксусной кислотой и осаждали этанолом. Фильтры высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов и помещали во флаконы со сцинтиляционной жидкостью следующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО) и 0,1 г 1,4-ди-(5-фэнил-2-оксазолил)-бензола (РОРОР) на 1 л толуола. Уровень включения изотопа измеряли на

евтй-спектромотро ("Beckman", США), '/сходя из полученных результатов, определяли индекс стимуляции:

^ имп/мин в опытной груше имп/мин в контрольной группе

С помощью РБТЛ исследовали влияние препаратов на ьролифе- . ративше процессы в нормальной и стимулированной митогенами культурах спленоцитов, изучали митогенные и комитогешше свойства препаратов в культурах спленоцитов и тимоцитов.

• Определение фагоцитарной активности иакрофагов , k перитонеального экссудата шшей.

Фагоцитарную активность ГШЭ шшей оценивали по способности • к захвату и выведению меченых 51Сг ЭБ. Захват меченых ЭБ исследовали через 30 минут, а выведение - чврез 7 суток после внутрибришшно-го введения мышам меченых ЭБ. Определение фагоцитарной активности МПЗ проводили согласно методике , описанной Зайцевой Л.Г. с соавт. [1988]. Полученный монослой клеток перитонеального экссудата освобождали от неприлиотш. клеток и определяли уровень радиоактивности и концентрацию бежа по Лоури . Результаты выражали в . имл/мин/мг белка. Для оценки утилизации меченых ЭБ вычисляли индекс переваривания (ИП) - отношение уровня радиоактивности в МПЭ через 30 минут после введения меченых ЭБ к аналогичному показателю через 7 суток.

Непрямой бактерицидный тест.

Нормальную кроличью сыворотку разливали -в пробирки по 0,02 мл и добавляли инокуЛярную дозу S.pyogenes. В первой серии ончтов шскулг.рная доза соответствовала ' 269 КОЕ в 0,04 мл культуры S.pyogenes. После этого в npoOir-u дорбавляли нормальную донорскую кровь группы 0(1), до 0,3 мл. Тестовые пробирки плотно закрывали резиновыми пробками и инкубировали на роллере при 8 об/мин в течение з часов при 37°С. Пробирки с пробками вращали параллельно оси

барабана роллера, ось наклонена к горизонтальной плоскости только на 10-15 Через 3 часа инкубацию заканчивали, помещая роллершй барабан с тестовыми пробирками в водяную баню (-10°С). Из каждой пробирки после встряхивания отбирали микропипеткой по 0.1 мл пробы II переносили на чашку Петри диаметром 9 см, содержащую 2,5 мл среды Todd-Hewit (Difco Laboratories, США). Затем добавляли 15 мл свежеприготовленного кровяного 2,5 55 агара и содержимое чашки тщательно перемешивали, достигая равномерного распределения колоний то всей поверхности чашки. Залитые чашки Петри инкубировали в течение 12 часов при 37°С.

Подсчет образовавшихся колоний на чашке проводили с помощью линзы и механического счетчика. Колонии стрептококка подсчитывали в отдельных секторах или квадратах в зависимости от густоты зоста культуры и пересчитывали затем их число на всю площадь чат-ai. Степень ийгибирования роста инокулярной дозы S.pyogenes С-ре-ястивнцм белком или антетелами по отношению к размножению иноку-1яриой дозы стрептокогаса в контрольных пробах с нормальной сыво-юткой определяет бактерицидный индекс (БИ). Оценку результатов ?есто проводили по шкале Столермана.

Статистическая обработка результатов.

При обработке экспериментальных данных использовали среднее фифлетическое М и ошибку среднего арифметического il Статистическую достоверность различий получешшх величин >предоляли путем вычисления критерия Стыодента. Б работе был [ринят критерий значимости Р 0,01 и Р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящее исследование представляет собой частный случай бшей и весьма актуальной проблема,которая заключается в выяснение оли основного острофазного реактанта С-реактивного белка в ех&низмах регуляции и формировании иммунитета.

В решении проблемы взаимосвязи острой фазы воспаления с ммунным ответом существенное значение имеет прежде всего зучение существующей-закономерности структура- активность.

Вопрос о структуре и о роли сайтов связывания СРВ, участии ионов кальция,магния и бария в механизмах взаимодействия с лигандами остается по прежнему открытым. Наши .исследования позволили прежде всего выяснить наиболее оптимальный вариант связывания СРВ с лигандами-это взаимодействие фосфорилхолинового сайта СРВ с глицерофосфохолином.Кроме того выяснена роль ионов кальция в механизме связывания СРВ с ГФХ и определена оптимальная концентрация ионов Са 2+. Полученные данные позволили нам перейти к разработке способов выделения СРВ с использованием сорбентов содержащего фосфохолин (ГФХ) в качество лиганда.

- . В качестве исходных матриц в работе использовались агарозные Гели - наиболее широко применяемые носители в аффинно хроматографии белков. Химическая структура агарозы позволяет применять различные способы для ее активации и последующей иммобилизации лигандов или спейсерних груш. В известных способах полу-1 чения биоспецифических сорбентов для выделения С-р-э активного белка в большинстве случаев применяются ВгСН-активировакше агарозные матрицы.

На начальных отапах работы представляло интерес получить аминозамещешше матрицы на основе коммерческой ВгСН-активирован-но'л сафарозы 4В ( матрица типа I ) и сефарози 4В, активированной ВгСИ в лабораториях условиях -{матрица типа II), характеризующихся различной степенью активации геля (схема 1). Использование свежеприготовленной ВгСЫ-активировашюП сефарозы 4В позволяло получать аминозамещешше сорбенты с большим содержанием ашшогру!ш по сравнению с коммерческой ВгСИ-активированной сефарозой 4В. Определение аминогрупп проводи«! методом кислотно-основного титрования. Схема I.

ын, п

-0-С-МН-(СНа)в-МН2 [МН31^=51 ШШОЛЬ/Г

|

Л 1^=198 шшоль/г

матрица «гша I или II

опытных группах вычисляли в процентах по отношению к контрольной группе.Препарат CF3 вводили за I, 3 и 7 суток до сенсибилизации мышей ЭБ, одновременно с ней и спустя I и 3 суток после сенсибилизации ЭБ.

Реакция блаоттранфорнации лимфоцитов.

Постановку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) осуществляли по общепринятой методике Брондз и соавтЛ1977) в . модификации Хачикяна и соавт.(1978]. В опытах использовели* мышей(СВЛ*С57В1/6)Р1 и шшей линии СБА и СЗН/Не J. Спленоциты мышей готовили как описано выше,

три раза отмывали при помощи центрифугирования (800об/мин). Подсчет клеток производили при помощи камеры Горяева. Для этого готовили суспензию i елоток на среде культивирования (спленоциты -5x105 кл/мл ). Одновременно готовили растворы митогенов. В качестве, Т-митогенов были использованы: конканавалин А (Кон A)(Sigma.США) в концентрации 0,5 мкг/Мл и 2 мкг/мл и фитогемагглютинйн (ФГА)(РНА-Р,Sigma,США) в концентрации I мет/мл. В качестве В-митогенов были использованы: липолисахарид из E.coli (0127:B8;Slgma,CIIIA) в концентрации 10 мкг/мл п 40 мкг/мл и декс'тран сульфат (ДС)(Hulea,Швейцария) в концентрации БО^мкг/лл.

,1 Микропластины для культивирования (Nurik,Дания11. закрытие крышками, помещали в С02 инкубатор (С02-5%,37оС). Культив1фование продолжалось 72 часа. За 16 часов до окончания культивщ вания в каждую лунку вносили раствор "^{-тимидина (удельная активность 1 Кю/мкМ) ("Медрадиопрепарат", Россия) в среде RPMI-1640, по 5 шел в кавдую лунку. По окончашш культивирования метки из каждой лунки осаждали на фильтры Titertsk ("Flow Laboratories", Великобритания) с помощью установки для фильтрования.

При этом клетки промывали изотоническим раствором хлорида натрия, 5 % трихлоруксусной кислотой и осаждали этанолом. Фильтры высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов и помещали во флаконы со сцинтиляционной жидкостью следующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО) и 0,1 г 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолил)-бензола (РОРОР) на 1 л толуола. Уровень включения изотопа измеряли на

еста-спектрометре CBeckman", США). Исходя из полученных результатов, определяли индекс стимуляции:

ИСх имп/мин в опытной группе ймп/мин в контрольной группе

С помощью РБТЛ исследовали влияние препаратов на ьролифе- . ратйвше процессы в нормальной и стимулированной митогенами культурах спленоцитов, изучали митогенные и комитогешше свойства препаратов в культурах спленоцитов и тимоцитов.

■ Определение фагоцитарной активности иакрофагов , t перитонеалыюго экссудата шшэй.

Фагоцитарную активность МПЭ мышей оценивали по способности ■ к захвату и выведению меченых 51Сг ЭБ. Захват меченых ЭБ исследовали через 30 минут, а выведение - чьрез 7 суток после внутрибрншшно-го введения мышам меченых ЭБ. Определение фагоцитарной активности МПЭ проводили согласно методике , описанной Зайцевой Л.Г. с соавт. (1988]. Полученный монослой клеток перитонеального экссудата освобождали от неприлипших клеток и определяли уровень радиоактивности и концентрацию балка по Лоури . Результаты выракали в имп/мин/мг белка. Для оценки утилизации меченых ЭБ вычисляли индекс переваривания (ИП) - отношение уровня радиоактивности в ЫГЭ через 30 минут после введения меченых ЭБ к аналогичному показателю ' через 7 суток.

Непрямой бактерицидный тест.

Нормальную кроличью сыворотку разливали в пробирки по 0,02 мл и добавляли инокулярную дозу S.pyogenes. В первой серии опчтов инокулсрнап доза соответствовала ' 265 КОЕ в 0,04 мл культуры S.pyogenes. После гтого в пробили дорбавляли нормальную донорскую кровь группы 0(1), по 0,3 мл. Тестовые пробирки плотно закрывали резиновыми пробками и инкубировали на роллере при 8 об/мин в течение 3 часов при 37°С. Пробирки с пробками вращали параллельно оеи

барабана роллера, ось наклонена к горизонтальной плоскости только на 10-15 Чэрзз 3 часа инкубацию заканчивали, помещая роллерный барабан с тестовыми пробирками в водяную баню М0°С). Из каждой пробирки после встряхивания отбирали микропипеткой по. 0.1 мл пробы и переносили на чашку Петри диаметром 9 см, содержащую 2,5 мл среды Todd-Hewlt (Dlfco Laboratories, США). Затем добавляли 15 мл свежеприготовленного кровяного 2,5 % агара и содержимое чашки тщательно перемешивали, достигая равномерного распределения колоний по всей поверхности чашки. Залитые чашки Петри инкубировали в течение 12 часов при 37°С.

Подсчет образовавшихся колоний на чашке проводили с помощью линзы и механического счетчика. Колонии стрептококка подсчитывали в отдельных секторах дли квадратах в зависимости от густоты роста культуры и пересчитывали затем их число на всю площадь чашки. Степень ийгибирования роста инокулярной дозы S.pyogenes С-ре-активным белком-или антвтелами по отношению к размножению инокулярной дозы стрептококка в контрольных пробах с нормальной сыво- ■ роткой определяет, бактерицидный индекс (БИ). Оценку результатов теста проводили по шкале Столермана.

Статистическая обработка результатов.

При обработке экспериментальных данных использовали среднее арифметическое М и ошибку среднего арифметического мЮтатистическую достоверность различий полученных величин определял! путем вычисления критерия Стьюдента. В работе был принят критерий значимости IVO.OI и К£0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

- Настоящее исследование'представляет собой частный случай общей и весьма актуальной проблемы.которая заключается в выяснение роли основного острофазного реактанта С-реактивного белка в механизмах регуляции и формировании иммунитета.

В решении проблемы взаимосвязи острой фазы воспаления с иммунным ответом существенное значение имеет прежде всего изучение существующей .закономерности структура- активность.

Вопрос о структуре и о роли сайтов связывания СРВ, участш ионов кальция,магния и бария в механизмах взаимодействия с лигандами остается по прежнему открытым. Наши .исследования, позволили прежде всего выяснить наиболее оптимальный вариант связывания СРВ с лигандами-ето взаимодействие фосфорилхолинового . сайта СРВ с глицерофосфохолином.Кроме того выяснена роль. ионов кальция в механизме связывания СРВ с ГФХ и определена оптимальная концентрация ионов Са 2+. Полученные данные позволили нам перейти к разработке способов выделения СРВ с использованием сорбентов содержащего фосфохолин (ГФХ) в качестве лиганда.

-В качестве исходных матриц в работе использовались агарозше гели - наиболее широко применяемые носители в афф!тной хроматографии белков. Химическая структура агарозы позволяет применять различные способы для ее активации и последующей иммобилизации лигандов или спейсерных групп. В известных способах полу-*-чения биоспецифических сорбентов для выделения С-реактивного белка в большинстве случаев применяются ВгСН-шшшированше агарозщо матрицы.

На начальных отапах работы представляло интерес получить аминоз'амещенные матрицы на основе коммерческой ВгСИ-активирован-ной сзфарозы 4В ( матрица типа I ) и сефарозы 4В, активированной ВгСИ в лабораторных условиях -{матрица типа II), характориэувдих-ся различной степенью активации геля (схема 1). Использование свежеприготовленной ВгСН-активированной сефарозы 4В позволяло получать аминозамещенные сорбенты с большим содержанием аминогрупп по сравнению с коммерческой ВгСН-активированной сефарозой 4В. Определение аминогрупп проводил! методом кислотно-основного титрования.' Схема I.

ына

и

-а-С-Ж-(СН;,)в-МН2 шшоль/г

1мн3)11:=198 шшоль/г

матрица типа I или II

-0CH2CHCHa0(CH3)tt0CH2CHCHaNH(CHa)8NH2 INH2]JJJ=40 шшоль/г OH OH

матрица типа III -СН2-КН-(СН2)В-МНЯ tNHj] 5^=90 шшоль/г.

матрица типа IV

Несмотря на традиционное использование BrCN-активирован--ных агарозшх гелей в аффинной хроматографии, они обладают рядом существенных недостатков. Активация агарозных матриц с помощью ВгСН однозначно приводит к получению сорбента с ионообменными свойствам;. Это обусловлено, образованием заряженных изомочевинных групп в результате лрисоедйпонго^жгшотомпонвнти к активированному гелю.

В связи р этим в дальнейшем представлялось целесообразным при получении ачинозамещенннх айэрозных матриц опробовать способы активации агарозы и присоединения аминокомпоненты, не приводящие к,появлению в структуре геля заряженных группировок и характеризующиеся более прочной связью диамина с носителем. Такими способами являлись активация агарозы о помощью эпоксисоединешф и метод периодатного окисления агарозы.

На следующем этапе работы при получении биоспецифических сорбентов была использована промышлённо доступная эпоксиактивиро-ванная аминогексилагароза - ЕАН-агароза 4 % (матрица типа III).

Однако наиболее удобным и эффективным при получении амино-замещенных матриц оказался метод периодатного окисления агарозы. Обработка сефарозы 4 В мета-периодатом натрия переводила ее вици- . нальные диольные группы в альдегидные, реагирующие далее с первичными аминами с образованием Шиффовых оснований. Двойные связи оснований Шиффа и непрорезгировавшие альдегидные группы затем восстанавливались борогидридом натрия. Содержание аминогрупп в заме-

щенных матрицах на основе периодатноокисленной.агарозы (матрица тша IV) более, чем вдвое превышало концентрацию Ш2-групп в матрице типа III, полученной на основе эпоксиактивированной агарозы.. Определение аминогрупп проводили кулонометрическш методом после разложения проб по Кьельдалю, а также с помощью мэтода кислотно-основного титрования.

Следующим этапом при получерна биоспецифических сорбентов для1 выделения С-реактивного белка являлось получение.лигавдов, содержащих функциональные группы, необходимые для ковалентной иммобилизации на аминозамещенных носителях.

Среди лигандов, обычно используемых при получении сорбент тов для выделения СРВ можно выделить две основные группы. Первая . - фосфохолинсодержащие лиганды, а именно, С-полисахарид клеточной стенки S.pneumoniae, и различные синтетические производные фосфо-холина, такие как, п-даазонийфонилфосфохолщ, капроилфосфохолин, конъюгат гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином и другие..Вторую группу составляют лиганды, но содержащие фосфохоли-новых остатков. Это - фосфоэтаноламин, аргинин, антитела к СРВ и прочие.

Наиболее перспективны фосфохолицсодержащио лпгачда, так как они обладают высоким сродством к С-реактивному белку и позволяют проводить его сорбцию и элюцию в условиях,(наиболее близких к физиологическим. Описанные в литературе фосфохолинсодержащие аф финзше сорбенты предполагают сложный многостадийный синтез лиган-да, а в ряде случаев и модифицированной матрицы, применение труднодоступных реагентов.

• В данной работе использовались более доступные в препар" ■ тивном отношении лиганды - производные sn-глицеро-З-фосфохолинв '■(1), получаемые при его взаимодействии с B,rCN (2) или NaI04 (2)' • (схема 2). Эти соединения далее достаточно просто иммобилизуются на аминозамещенных агарсзных матрицах.

Схема 2

вг-си

сн3-он

ни=с

но-сн

0

1

СНа-0-Р_0-СН2-снэ-М(сн,)3

л о

(1)

МаЮ»

/0-СН-,

( I

\o-CH „ i ii

СН2-0-Р-0-СН3-СНа-М(СНэ)3

о" . (2)

имидбкарбонатное производное вп-глицеро-З-фосфохолина

С

I4" о

II +

сн2-о-р-о-сна-сн2-н(снэ)э

вп-глицеро-3-фосфохолин

(3)

гликольфосфохолин ,

Исходное соединение (вп-глшдеро-З-фосфохолин) получали путем омыления выпускаемого" промышленностью яичного фосфатидалхоли-иа. При взаимодействии оп-глицоро-3-фосфохолина с бромцианом пол. -, чаш лпганд (2) - циклическое имлдокарбонатное производное вп-глицеро-З-фосфохолина. Это высокореакциошюспособное, но неустойчивое соединение,- поэтому его без обработки иммобилизовали на ашшозамещенных матрицах типа I и II (схема 3).

В зависимости от соотношения аминозамещенной матрицы и лиганда (2), а также времени иммобилизации были получены биоспецифические сорбенты типа (1-4) с розной степенью посадки игандэ: 7, 12, 26 и 50,8 мкмоль/г соответственно (схема 3). Количество иммобилизованного лиганда определяли по содержанию фосфора методом Бартлета;

ОднакЬ в результате ковалентного присоединения этого лиганда (2) к аминозамещенным матрицам типа (I) и (II) появлялась дополнительная изомочевинная группировка. Это способствовало усилению ионообменных свойств сорбентов, а при высокой степени посадки лиганда (2), например, (более 50 мкмоль/г ) наблюдалось преобладание ионообменных свойств над биоспецифическим взаимодействием

с С-реактивным белком.

Схема 3

/О-СН,

-о-с-мн-(сна)в-нна о-сн 0

' II +.

матрица типа I или II

СНа-0-Р-0-СНа-СНа-Н(СНа)з

о"

N«3 ЫН, ОН О • . _

11 , 11 1 11 / » »О-С-МН-(СНа)в-Ш-С-0-СН3-СН-СН,-0-Р-0-СН2-СНа-М(СН3>а

о"

биоспецифические сорбепти типа (1-4)

В дальнейшем при синтезе биоспецифических сорбентов были разработаны подходы, позволяющие избежать образования заряженных группировок как в процессе приготовления матрица, так и при посадке лиганда. С этой целью в качестве лиганда использовали гликоль-фосфохолин (3), получаемый путом окисления исходного вп-глицеро-3-фосфохолина (1) мета-периодатом натрия (схема 2). Содержащий альдегидную группу гликольфосфохолин далее ковалентно иммобили-зовывали на аминозамещенных агарозных матрицах с образованием' Шиф-фовых оснований (схема 4).

Первоначально проводили восстановление образовавшейся двойной связи -N=011- с помощью ЫаВНд,однако в экспериментах с невосстансапенной формой сорбентов была выявлена их высокая стабильность (более 22 циклов выделения СРВ), что позволило впоследствии отказаться от дополнительной стадии восстановления. Ув9ой-, чивость Шиффова основания в данном случае может быть объяснена тем, что выделение СРВ проводилось в слабощелочных условиях, а гидролиз этого основания, как правило, осуществляется в кислой средэ.

В случае использования аминозамещенных матриц типа (I) или (II) были получены биоспецифнчвские'сорбенты типа (5-9) о различным содержанием гликольфосфохолина: 7, 11, 24, 48 и 109 мкмоль/г сухого сорбента соответственно. Данные сорбенты в отлцчие от пре-

дыдуишх содержали в структуре спейсера только одну катиоииую группировку- (схема 4). * Схема 4

матрица типа I или II у. :-1

I

матрица типа III х

н

сна-о-р-о-(сн3)2n(ch3)3 о"

(3)

матрица типа IV 2 -

NHa , О.

П II *

-0-C-NH-R-N=CH-CH;,-0-P-0- (сна )3N(CH3 )э

о"

биоспецифические сорбенты т^па (5-9)

-ОСНаСНСНаО(СНа)»OCHaCHCHaNHRN=CHCHa«X

он он

биоспецифический сорбент (10)

-CHa-fJH-R-N=CH-CH2-0-P-0-CHa-CHa-N(CH3)a О"

биоспецифический сорбент (11)

?

ФХ =1 - о-р-о-сна-сна-м(снэ)э: R = -(сна)в 0~

В результата иммобилизации гликолъфосфохолина (3) на ами-нозамещеншх матрицах типа III и тша IV были получены биоспецифические сорбенты тша (10) и (11), спейсерные группы которых не были заряжены.

Таким.образом,'на основе четырех вариантов аминозамещенных агарозных матриц (типы I-IV) и двух фэсфохолинсодержащих лигандов (2,3) на?® было получено 11 биоспецифических сорбентов, отличающихся концентрацией иммобилизованных лигандов и степенью заряжен-ности геля. Кэк будет показано далее эти различия оказывали-влияние на эффективность полученных сорбентов при выделении СРВ.

В настоящее время наиболее эффективным и распространенным

Буфер А: Буфер Б:

трис-НС1, рН 7,8 (20 мМ), трис-НС1, рН 7,8 (20 мМ),

ЫаС1 (НО мМ), СаС12 (2 мМ) №С1 (140 мМ), Щ1трат натрия (50 ,

' мМ)

Рис. Элюентние профили аффшшой хроматографии СРБ. Парамъ-грц колонки: с) 8 мм, Ь •= 140 мм.

__- общий белок (А 280)

------------------------- С-реакгивный белок (мкг/ыл?

методом выделения С-реактивного белка является аффшшая хромате графия. В ее основу положено использование свойства С-реактивного белка в присутствии ионов кальция специфически и обратимо взаимодействовать с фосфохелиновыми группировками. Применение метода биоспецифической хроматографии в огромной степени облегчает еада-чи исследователей по выделения СРВ, особенно при исподьзованпи исходного сырья с невысоким его содерзшнием.

В качестве источника С-реактивного белка наш использовалась аоцитная кидкость человека, полученная от больных с оикопатологн-ей. концентрация СРБ в ее разных партиях колебалась, от 20 до 60 мкг/мл.:

Ход аффинной хроматографии С-реактивного белка на полученных биоспецифических сорбентах представлен на рис.1.

Сорбцию СРВ и вымывание носвязавшихся компонентов асцитной жидкости проводили используя Са2+-содеркащий трис-буфер (буфер А: трис-НС1,рН 7,8 (20 тМ), НаС1 (0,14 М), СаС12 (2 тМ)). Элюшго С-реактивного бежа обеспечивало удаление ионов Са2+, что вызывало разрушение аффинного комплекса СРБ-лиганд. Для удаления ионов Са2+ использовали цитратсодеркащий буфэр (буфер Б: трис-НС1, рН 7,8 (20 тМ), НаС1 (0,14 М), цитрат натрия (50 пМ)).

В хода экспериментов было выявлено, что не все полученные биоспецифические сорбенты эффективны при выделении С-реактивного белка (табл.1). Биоспецпфические сорбента (1) и (5), характеризующиеся низкими концентрациями иммобилизованных лигандов (около 7 мкмоль/г), слабо связывали С-реактивный белок. Сорбенты (4) и (9) проявляли высокую иэспецифическую сорбцию белков, вызванную, вероятно, преобладанием ионообменных свойств сорбентов вследствие слишком высокой плотности лиганда (более 50 мкмоль/г). Остальные сорбенты (2,3,6-8,10,11) с промежуточными значениями степени посадки лигандов (11-26 мкмоль/г! позволяли вполне успешно выделять

С-рэшстивний белок. Таблица 1

Биоспецифическая хроматография С-ре активного белка

Тип био- Количество Концентра- • • -

специфи- катиошшх ция иммо-.. Выход С-реак- Чистота С-ре-

ческого групп в билизован. тивного белка, активного бел-

Ьорбента спейсере лиганда, мкмолъ/г % ка, %

1 ++ 7 слабо свя: «вал JPB

2 ++ 12 62 52

3 ++ 26 47 49

4 ++ 50,8 зысокая неспецифическая сорбция

5 + 7,3 слабо связывал СРВ

6 + 11 67 72

7 + 24 59 68

8 + 48 68 - '57

9 + 109 высокая неспецифическая сорбция

10 - 17,7 73 88

11 - 15 • 76 91

Полученше биоспецифические сорбенты отличались по степени зарякенности геля, то есть количеству катиошшх группировок в структуре спейсера. Это в значительной мере определяло величину неспецифической сорбции сорбентов, и в конечном счете, влияло на чистоту выделяемого С-реактивного белка. Например, сорбенты (6,7), содержащие только одну катионную группировку в составе спейсера позволяли получать СРБ большей степени чистоты (60-7С %) по сравнению с сорбентами с двумя катионными зарядами в спейсерной группе! Чистота С-реактивного белка, выделенного на сорбентах последнего типа составляла, около 50 %. Также следует отметить, что при выделении С-реактивиого белка на сорбентах с одним катиошшм зарядом в спейсерной группе заметное преобладание неспецифической. сорбции наблюдалось при концентрации иммобилизованного лиганда, равной 109 мкмоль/г (сорбент 9), а в случае сорбентов с двумя положительными группировками в спейсерной группа ,это обнаруживалось уже при концентрации 50,8 мкмолъ/Г (сорбент 4).

Наилучшие результаты при выделении С-реактивного бежа (чистота белка 88-91 %) были получеш. с помощью сорбентов (10 и 11), спэйсерные группы которых не заряжены.

, Таким образом, представленные в таблице данные о выделении С-реактивного белка на полученных биоспецифачоскчх сорбентах, позволили нам сделать выводы о том, что эффективность. сорбента зависит как от концентрации иммобилизованного лиганда, так и от количества катионных группировок в составе спейсера. Оптимально' степенью посадки лиганда можно считать значения в диапазоне 11-26 мкмоль/г сорбента, при зтом наиболее эффективны сорбенты с незаряженными спейсерными группами.

Существующие в настоящее время способы" получения С-репкЯ-тивного белка с высокой степенью чистоты (более 95 %) в большш-стье случаев предполагают сочетание аффинной хроматографии с другими методами очистки. В настоящей работе для.получения СРВ с высокой степенью чистоты использовали сочетание биоспецифнчоской : ионообменной хроматографии. С учетом характера примесей в качеств дополнительной очистки белка дами была Применена хроматография на СЕАЕ-сефадекса А-50 (рис.2).

Рис. 2. Ионообменная хроматография полученных в результате аффийной хроматографии элюатов С-реактивного белка: пик I -сывороточный амилоид П, 1еО, компоненты комплемента Сц, С^, Сз, С4 и "нормальные" белки сыворотки крови человека; пик 11 - С-реактивный белок человека. '

Рис. 3. Иммуноэлеетгрофорез С-реактивного белка:

I - с антисывороткой против С-реактивного белка;

II - с антисывороткой против "нормальных" белков сыворотки крови человека.

I II III IV

Рис. 4. SDS-электрофорез в полиакрнламидном геле""

I - белки с известными молекулярными массами;

II - СРВ, полученный на сорбенте типа 6 (концентрация лнганца 11' мкмоль/г, одна катившая группа в спейсере); !

III - СРВ, полученный на сорбенте типа 11 (концентрация лиганда 15 мкмоль/г, спейсерная группа не заряжена);

IV - СРВ, полученный с помощью аффинной и последующей! ионообменной хроматографии. ; . .

С помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии по иухтерлонм было показано, что в состав первого пика входили сыво] точный амилоид П, Сц, С3, С4, IgG и "нормальные" бежа сыворотки крови человека. Второй пик представлял собой С-роактивный белок, гомогенность которого подтверздена с привлечением методов иммуно-элетрофореза (рис.3) и sds-электрофореза в полиакриламидаом геле (рис. 4).На конечном этапе чистота полученного СРВ составляла не

менее 99 %.

III. ИЗУЧЕНИЕ ЮШНОМОДУЛИРУЩИХ свойств С-РЕАКТИВНОГО БЕШСА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ.

До настоящего времени окончательно не определено место острофазного ответа и его основного сывороточного компонента -СРВ в комплексе гуморально-клеточшх механизмов, обеспечивающих поддержание естественной устойчивости к инфекции. Сегодня не вызывает сомнения факт принадлежности СРВ ■ к системе неспецифических опсонинов. Однако вопрос о возможности иммуномодулируше-го влияния СРВ, не связанного с этим эффектом, на защитные антиин-фекцвошше мезанизмы остается открытым. Поэтому в настоящем разделе работы при изучении свойств препарата СРВ были использованы методические подходы, позволяющие исключить проявление его опсони-зирующего эффекта.

III Л. Изучение действия С-реактивного белка на функциональную активность фагоцитов.

Важнейшая роль в поддержании естественной резистестности организма к инфекции и формировании противоинфекционного иммунитету принадлежит систоле фагоцитирующих клеток . Помимо осуществления своей непосредственной функции по захвату и н 1трализации инфекционного агента, они являются продуцентами, и вместе с тем объектом воздействия различных ауторегуляторных факторов . Одним из этих факторов может быть СРВ. По крайней мере, in vitro он способен активировать фагоцитоз ЭБ не только в комплексе с лиган-дом, но и непосредственно воздействуя на фагоцит . Поэтому представляло интерес исследовать влияние СРВ, не обусловленное эффектом опсонизации, на функциональную активность различных типов фагоцитирующих клеток.

III.I.I. Изучение влияния СРБ на бактерицидный потенциал циркулирующих фагоцитов.

Поскольку наиболее характерной чертой развития острофазного ответа является повышение'концентрации ого основных реактантов в сыворотке крови, имещо здесь долмш в первую очередь реализовы-, ваться функциональные свойства этих молекул. Вместе с тем, важная роль в обеспечении естественной резистентности к инфокции и проти-воинфекционного иммунитета принадлежит бактерицидному потонциалу циркулирующих фагоцитов. Поэтому казалось це/.эсообразным исследовать действие очищенного препарата СРБ на бактерицидную гзтншость втих клеток. С этой целью в опытах использовалась тост-систпма, в условиях которой бактерицидное действие лейкоцитов периферической крови'оценивалось по подавлению роста in vitro S.pyogenes. Указанный тип стрептококка относится к группе Айв отличие от микробных клеток стрептококка группы С обладает слабой способность® фиксировать на своей мембране молекулы СРБ. Эффективный фагоцитоз S.pyogenes клетками крови осуществляется лишь в присутствии специфических антител против субстанции. iL Поэтому в настоящих экспериментах влияние СРВ па функциональную активность макрофагов сопоставлялось с действием нммушшх сывороток»'; Одновременно, исходя из задач работы, проводилось изучение их совместного влияния на рост культуры стрептококка.

В ходе исследования было проведено несколько серий экспериментов, в которых использовались различные по своей активности иммунные сыворотки. К БОцЗ и N 53ц2, в наибольшей степени отличавшиеся по способности угнетения роста S.pyogenes. Доза СРБ во всех случаях составляла 20 мкг/мл, что соответстует его концентрации -в сыворотке на пике развития острофазного ответа.

На предварительных этапах исследования подбиралась оптимальная инокулярная Доза S.pyogenes - количество колониеобразую-щих единиц (КОЕ) в определенном объеме культуральной среда . При постановке данных экспериментов инокулярная доза в объеме 0,04 мл смешивалась с 0,3 мл свежеполученной крови и с одним из следующих компонентов: нормальная сыворотка, антистрептококковая сыворотка в объеме 0,2 мл. СРБ в изотоническом растворе хлорида натрия или в сочетании . с иммунной сывороткор. Во всех

группах, где не использовался СРВ, в культуральную смесь добавлялся СРВ, в культуральную смось добавлялся изотонический раствор хлорида натрия в соответствующем объеме. После этого пробы иноку-лировали при 37°С в течение 3 часов и определяли в них количество КОЕ.путем подсчета числа колоний S.pyogenes в агаре. О наличии бактерицидного эффекта судили по изменению количества КОЕ по сравнению с контролем, которым служили пробы с нормальной сывороткой. Дополнительным критерием-оценки являлся бактерицидный индекс (БИ), который представляет собой отношение числа КОЕ в контрольной и опытной группах.

Было установлено, что инкубация S.pyogenes с клетками крови в среде с.нормальной сывороткой и СРВ в концентрации 20 мкг/мл вызывает существенное, угнетение его роста. При атом выраженность действия препарата мало зависела от величины инокулярной дозы. Ток, в первой серии опытов инокулярная ,доза равнялась 2G9 КОЕ, а по второй - 182 КОЕ. В то же время бактерицидше индексы составляли соответственно 6,0 и 6,6. Следует отметить, что в первой серии экспериментов СРВ вызывает более сильное подавление роста стрептококка, чем иммунная снЕоротка. Количество КОЕ в пробах, где использовалась анти-М-сыворотка N БОцЗ, было сшшшо лишь в 4 раза по сравнению с контролем. Под влиянием сыворотки N 53ц2 наблюда- • лось интенсивное угнетение колониеобразования (БИ составлял 180,0), в то время как различие между сериями опытов в действии СРВ было незначительным. Таким образом, в используемой тест-системе СРВ вызывает эффект, 'аналогичный действию антистрептококковой сываоротки. Однако при изучении их совместного влияния на размножение S. pyogenes получены прямо противоположные данные.

Комбинированная обработка суспензии стрептококка и лейкоцитов крови СРВ ь сочетании с иммушюй сывороткой приводила к снижению величины бактерицидного индокса по сравнению с группами, где они использовались самостоятельно. В первой серии экспериментов уменьшение величины БИ до 3,5 наиболее выражено по отношению к соответствующему показателю в пробах с СРБ. Во второй серии экспериментов, несмотря на высокую активность, наблюдалось снижение значения БИ нике исходного уро'г'я для какдого из..компонентов.

Таким образом, было установлено, что СРБ способен индуци-

-■даровать бактерицидную активность, циркулирующих' фагоцитов в отношении Е.pyogenes. Однако эффект одновременного действия ОРБ и ан-ти-М-сыворотки ниже, чем у каждого из них в отдельности. -

опсонизирушее действие СРБ, по-крайней мере не играло ведущей роли в усилении фагоцитоза, учитывая его низкую константу связывания со стрептококками группы А. Скорее всего , наблюдаемый эффект обусловлен непосредственным взаимодействием СРБ с . нейтрофилами и моноцитами периферической крови. По литературным данным пентпмерная форма СРБ обладает большим сродством к нейтрофилам [Buchta et all.1987] и, по- видимому, бактерицидный потенциал этих клеток вносит наибольший вклад- в угнетение роста S.pyogenes. Наиболее вероятным объяснением^ снижения эффективности действия СРБ и анти-М-антисывороток при созмэ стном использовании является конкуренция за связывания с Fc-рецептором фагоцитов.

III.1.2. Действие С-реактивного белка на фагоцитарную функции перитонеальных макрофагов.

Популяция фагоцитирующих клеток весьма гетерогенна'по степени зрелости, морфологическим и функциональным свойствам, что в значительной мере определяется их органной принадлежностью. В зависимости от локазизации очага воспаления в защите от инфекции участвуют различные типы макрофагов. Поэтому представляло интерес исследовать 'влияние СРБ не только а циркулирующие фагоциты периферической крови, но и на зрелые резидентные тканевые макрофаги. С этой целью в настоящей серии экспериментов изучалась способность прилипающих клеток перитонеального экссудата мышей, предварительно обработанных СРБ, захватывать эритроциты барана, меченые Сг. СРБ способен соединяться с эритроцитами барана только.через специфический лиганд - С-ПС, что в данном случаегпозволяет исключить проявление его опсонизирующих свойств. Поскольку в условиях организма наблюдается постепенное нарастание концентрации СРБ в очаге воспаления, в опытах использовались различные дозы и сроки введения препарата.

СРВ вводили внутрибркшшно однократно интактным мышам-гиб-. ридам (СВАхС57В1/6)Р1 в дозах 2, 10, 20 и 100 мкг в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Одновременно с обработкой мышей

- за -

СГБ или 3<v ■, 2, 3 и 7 суток до нее животным опытной и контрольной групп вводили ЭБ, меченые 51Сг. Фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата оценивали по способности к захвату ЭБ-Ь1Сг через 30 минут после их введения мышам. Затем ■ выделяли клетки перитонеального экссудата, получали их монослой, свободный от неприлипших клеток, и затем определяли уровень радиоактивности и концентрацию белка по Лоури. Полученные результаты выражали в импульсах/минуту на 1 мг белка. Для большей наглядности результатов вычисляли ииндекс стимуляции (ИС), представляющий собой отношение количество импульсов в минуту в опытной группе к соответстующему показателю контрольной группы.

Било показано, что введбние СРВ мышам в различны:: дозах одномометко с мечеными 51Сг эритроцитами барана вызывает лишь незначительные статистически недостоверные колебания фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата (КПЗ). Так, в результате обработки мышей препаратом в дозе 2 мкг отмечалось некоторое угнетение захвата ЭБ макрофагами. Уровень радиоактивности в этой группе составлял 16733¿1402 имп/мин, тогда как в контроле он равнялся 18350-1271 имп/мин (ИС 0,91). Напротив, введение СРВ в дозах 10 и 20 мкг вызывало одинаковое по величине, но также статистиче-' ски незначимое усиление фагоцитоза. Индекс стимуляции в указанной группе раьнялся 1,17.

Предварительная обработка животных СРБ во все исследованных сроки приводила к более выраженным и однотипным изменениям стерени захвата меченых 51Сг ЭБ перитонеальными макрофагами. При введении препарата за 1 сутки до ЭБ уже при дозк 2 мкг отмечалось некоторое повышение уровня радиоактивности в КПЗ (ИС 1,04), которое при использовании доз 10 и 20 мкг становилось статистически достоверным.'(PíO,05). Следует отметить, что СРБ в дозе 10 мкг г; большей степени стимулировал фагоцитоз, чем в дозе 20 мкг. Индексы стимуляции в этих группах равнялись соответственно 1,20 и 1,26. Эта закономерность еще более ярко проявлялась при анализе результатов, полученных при введегот СРЕ за 2 суток до .тестирования.

Было отмечено усиление дойствия препарата во всех исследованных' догах. В группах, где нашей обрабатывали СРБ в дозах 10 и

20 мкг, поъшенче уровня радиоактивности по сравнению с контролем Оило высоко достоверным (Р^0,01). Вместе с тем еще в большей степени проявилось различие эффективности доз 10 и 20 мкг, что можно видеть при' сопоставлении соответствующих значений индексе стимуляции - 1,56 и 1,47.

Однако при обработке мышей СРВ за 3 суток до введения меченых 51Сг ЭБ изменения фагоцитарной активности носили несколько иной характер. Продолжало возрастать, оставаясь статистически недостоверным, стимулирующее действие дозы 2 мкг (ИС 1,08). Вместе с тем, эффект от введения дозы 10 мкг был менее выраженным, хотя и по-прожнему достоверным (Р^0,01). Показатель интенсивности • включения метки в этом случае составлял 24615*1717 имл/мии, г в контрольной группе - 16720-1232 имп/мин (ИС 1,47). Напротив, под влиянием СРВ в дозе 20 мкг наблюдалось еще большее усиление захвата ЭБ перитонеальными макрофагами (Р^0,01), о чем можно было судить, сопоставляя уровни радиоактивности в опытной (74779-4548 имп/мин) и контрольной (47462-4728 имп/мин) группах. Индекс стимуляции в атом случае достигал своего максимального значения -.. ■ ~

1,67..

Через 7 суток после введения мышам'СРВ отмечались различные по направленности изменения фагоцитарной активности макрофагов. В этот срок тестирования практически отсутствовал эффект влияния дозы 2 мкг. Одновременно наблюдалось выравнивание интенсивности захвата моченых 51 Сг ЭБ в грушах, где СРВ использовали в дозах 10 и 20 мкг. Индексы стимуляции составляли соответственно 1,5 и 1.49. Вместе с тем абсолютные значения уровней радиоактивности в этих группах все еще существенно (Р^:0,01) отличаются от соответствующих контрольных показателей.

В результате проведенных экспериментов была установлена способность СРВ при введении в организм интактных мышей регулировать фагоцитарную активность резидентных перитонеальных макрофагов. Действие препарата зависит от используемой дозы и сроков тестирования (см. рис. 5).

Одномоментное введение СРВ и меченых 51Сг ЭБ сопровождалось лишь статистически недостоверными колебаниями интенсивности

суп«

Рис. 5. Влияние С-реактивного белка на захват меченых 51Сг эр1ггроцнтов барана махрофагами пернтонеального экссудата.

фагоцитоза. Предварительная обработка кивотных СРВ вызывала усилэ-1ше захвата меченых 51Сг ЭБ перитонеэльными макрофагами. Выраженный стимулирующий эффект наблюдался при использовании доз 10 и 20 М1 . Времл достижения максимального проявления действия препарата зависело от используемой дозы (для 10 мкг - 2 суток, для 20 мкг - 3 суток). Состояние активации макрофагов после однократного •введения СРВ в указанных дозах достаточно продолжительное, и сохранялось на высоком уровне в течение 7 суток.

Результаты экспериментов, представленные в настоящем разделе, свидетельствуют о способности СРВ регулировать функциональную активность фагоцитов - важнейшего клеточного звена в системе механизмов естественной и специфической устойчивости организма к инфекции. Действие СРВ расг.устраняется как на циркулирующие фаго-

- 34 .

циты периферической крови, тек и ;:на л ффераниировшМ*'^швзио макрофаги в условиях.когда его' свойства опсонина, по-крайней мере, -не играют ведущей роли.

Все эти данные расширяют представления о биологических возможностях СРВ как не специфического антиинфекционного агента. .

II 1.2.Изучение патогенных и коштогенных свойств СРВ в популяции клеток селезанки шшюй.

До сих пор. остается открытым вопрос о одном из важнейших свойств СРВ о митогенной и комитогенной активности белка. Данные несколько противоречивы,вероятно прежде всего это связано из-за чистоты полученного препарата белка.Поэтому представлял интерес изучение этих свойств СРВ.

Исходя из поставленной задачи были получены спленоциты мшегг (СВАХС57В1)F1 .препарат СРВ приготовили в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия в дозах 0,02;0,2;2; 10,; 20 и 100 мкг.в качестве Т- митогенов использовали:Кон А в дозо 0,5мкг/мл и ФГА в дозе I мкг/мл, в качестве В-митогенов:ЛПС в дозе 10 мкг/мл и ДС в дозе 50 мкг/мл.Функциональное состояние лимфоидаых клеток исследовали с помощью РБТЛ (реакции бласт-трансформации лимфоцитов) в культуре спленоцитов in vitro. При этом изучалась исходная пролиферативная активность клеток селезенки и их ответ на стимуляции Т- и В-митогенами - Кой А , ФГА.ЛПС и ДС. Об интенсивности реакции судили по уровню радиоактивности 8 проб, который определялся степенью включения в ДНК клеток тимидина, меченого тритием (^-тимидин). При учете результатов экспериментов вычисляли среднее значение величины радиоактивности в грушах в mm/мин и ошибку ерэднего. Для общей наглядности определяли индекс стимуляции „,ШС), представляющий собой отношение среднего количества имп/мин в опытной группе к. соответствующему показателю контрольной группы. В ходе работы было проведено три серии экспериментов, состоящих из трех опытов. В каждой опытной и контрольной группе использовалось не менее пяти, животных.

III.2.1.Изучение иитогешгшс и ксштогешшх свойств СРБ в полной популяции клеток селезенки.

Действие препарата зависело от дозы и сроков введения в организм. Так, при изучении митогенннх свойств СРБ было обнаружено, что при использовании доз О.СК; 0,2;2 и 10 мкг не наблюдалось существенных изменений уровня радиоактивности по сравнению с контролем.- КС- в этих грушах равнялись соответственно 0,8; 0,9; 1,1 и 1,8 . Шесте с тем, 20 и 100 мкг СРБ достоверно усиливали захват тимидина клетками селезенки. Среднее количество имп/мин в этих группах составляло соответственно 2916±96 и 9393+252, контроле 1393*731. ИС достигал 2,1 (Р,<0,01) в первом . случае и 6,7 (Р^0,01) при введении 100 мкг СРБ.

При добавлении в среду культивирования с СРБ Кон А (0,5мкг/мл) комитогенные свойства белка были лишь незначительно выражены по' ■сравнению с контролем, так при использовании 0,02;3,2; 2;Ю;20 и 100 мкг средняя величина радиоактивности в данной. груше соответствовала 20103±Ш8; 2И77±27П; 17452±420; 18671±591; 18338ШЭ1 и 22135±20П имп/мин, а ИС составлял 1.0: 1.0: 0.8: 0,9;0,9 и 1,1.

При использовании ФГА(1 ыкг/мл)было показано/что СРБ в доза* 0,02; 0,2 я 2 мет вызывал изменения пролиферативной активности спленоцитов на уровни контрольных показателей (ИС 1,1; 1,1 и 1,0), тогда как СРБ в дозах 10; 20 и 100 мкг вызывал нег эчительную стимуляцию пролиферации спленоцитов (ИС 1,2; 1,3 и 1.4). Средняя величина радиоактивности в данной группе соответствовала 15582*2301;1752212119 и 18005±1726.

Следующими митогенами,использованные в наших исследованиях были ЛПС (10 мкг/мл) и ДС(50 мкг/мл).

Так прр использовании ЛПС вновь отмечались изменеия пролиферативной активности спленоцитов на уровне контрольных показателей. Индекс стимуляции соответствовал 0.95;1,2;1,0;1,1;1Л и 1,1.

При совместном использокшии СРВ и ДС отмечались значительные изменения показателей пролиферативной активности .спленоцитов, ' так уке прй использовании 0,2 мкг отмечалась тенденция к- стимуляции пролифер дай (ИС 1,4)(Р<0,01).При использовании СРБ в дозах 2;10

-36-

и 100 мкг индекс стимуляции соответствовел I,J>¡¡J[,7 и 2,2, тогда как 100 мкг СРБ отмечались выраженные комитогенные

свойствам:: 5,2).'Р£0,01).

II1.2.2.Изучение ыитогенных и конитогенных свойств СРБ при удалении прилипающих клеток из популяции спленоцитов.

Величина ИС рассчитывалась относительно среднего .'уровня радиоактивности контрольных проб, в которых спленсциты мышей, обработают изотоническим раствором хлорида натрия. Было установлено, что в отличие от предыдущей серии экспериментов, где использовалась -полная полуляция спленоцитов митогешше свойства СРБ проявились более ярко. Уже при низких концентрациях * CPF 0,02; 0,2 и 2,0 мкг отмечэлась тенденция к увеличению пролиферативного потенциала клеток,.так ИС соответствовал 1,1; 1,4 и 1,4 (FsO.OI), при использовании СРБ в более высоких концентрациях (10; 20 и 100 мкг) индекс стимуляции 2,3;4,1 и 12,4 (P40.0I). Средняя величина радиоактивности равнялась 1449±67;2609±220 и 7885+398.

При изучении комитогенных свойств СРБ при удалении прилипающих и фагоцитирующих клеток из популяции спленоцитов было обнаружено,что использование Т-митогенов (прежде всего ФГА) вызывал проявление у СРБ ярко выра>гнных комитогенных свойств Если при использовании Кон А- (0,5 мкг/мл) и СРВ отмечалась незначительная тенденция к увеличению пролиферативной активности: при использовании доз 0,02; 0,2 и 2 мкг СРБ индекс стимуляции соотвествовал 1,1; 1,1 и 1,2. Средняя величина радиоактивности, в этих группах соотвествовала 2002Ш253;20007±17П и 21824±1845. При использовании более, высоких концентрации балка (10,20 и 100 мкг) индекс стимуляции несколько возрос 1,3; 1,3 и 1,4 (P¿0,05), Следует отметить,что при -изучении комитогенных свойств CFB в полной популяции клоток . и при использовании Кон А показатели соответствовали контрольным' данным.

Следующим митогеном,который использовался в нащих исследова- . ниях это ФГА. Как было показано в предыдущей серии экспериментов - -при изучении комитогенных свойств СРБ в полной популяции ■ клеток уже отмечалась тенденция к стимуляции, однако она была

— "S7 -

не достаточно сильно выражена.''"При удалений^ 'прилипающих '' и Лагоцитиируплих клеток комитогенные свойства СРБ более сильно проявились, так при использовании 2, 10 и 20 мкг СРБ индекс стимуляции уже* соотвествовал 1,8:2,3 и 3,5(Р40,01). Средняя величина радиоактивности в этой группе соответствовала: I?25¿167; 2I70i63; 3398±139 И 7847±201.

При изучении комитогенных ' свойств СРБ при удалении из популяции спленоцитов 'прилипающих клеток и использовании В-митогенов: ЛПС 10 мкг/мл) и ДС (50 мкг/мл) в отличии от показателей другой серии экспериментов, где исследования проводились в полной популяции спленоцитов, было обнаружено, что наиболее . выраженный комитогешшй эффект (ИС 9,1)был обнаружен при использовании СРБ в дозе 100 мкг и ДС в дозе 50 мкг/мл.. При изучении комитогенных свойств более низких концентраций СРБ была показана устойчивая тенденция к повышению пролиферативной активности 'спленоцитов под воздействием СРБ (0,2; 2;10 и '2С мкг),индекс стимуляции равнялся 1,3; 1,8; 2,3 и 3,6.Средняя величина радиоактивности соответствовала I5974±670;2I349±202I; 27575*1812 И 42938*965.

При использовании ЛПС в качестве второго митогена было показано, что .показатели соответствовали скорее контрольным данным.Так индекс стимуляции равнялись 1,0;1,0;0,08 и 1,09 при использовании 0,02;0,2 ,2 и 10 мкг СРБ.При изучении более высоких концентраций СРВ было обнаружено некоторое увеличение пр гаферативной активности спленоцитов под воздействием СРБ (ИС 1,2 и 1,27).' Средняя величина радиоактивности 23500*674 и £5973±1922.

Таким образом нами было показано,что СРБ обладает выраяюнным митогенным и комитогенными свойствами.

- 38r~

III.3.. ЕТОЙЕ С-ШКТИШОГО БЕЛКА BJi ФУНКЦИШАЛЫШ) ^сиюшеть:

ЛИИОИДНЫХ КЛЕТОК Й ТОНИРОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА. '

Одной из основных задач изучения физиологической адаптационной роли острофазного ответа является выяснение его взаимосвязи с функционированием иммунной системы организма. Быстрое развитие острофазной реакции, широта лигандной специфичности ее основных роактантов, и в первую очередь СРВ, создают условия для взаимодействия с различными клеточными системами на всех этапах иммуногенеза. В настоящем разделе работы исследовалось действие СРВ на различные показатели функциональной активности лимфоидных клеток (пролиферативный ответ на Т- и В-митогенн, неспецнфическая активация) и формирование гуморального и клеточного иммунитета в целом.

III.3.1. Действие С-реактивного белка на спонтанную и штогениндуцированную пролифератквную активность спленоцитов.

Важным критерием оценки иммунного статуса организма и его различных изменений является состояние пролифоративной активности лимфоидных клеток и их способность отвечать на симулирующее воз-,, действие лектинов. Поэтому при исследовании нммунорегуляторных -свойств СРВ представляло интерес выяснить возможность его влияния на перечисленные показатели при введении в организм мышей.

Исходя из поставленной задач" мышам (СВАхС57В1)Р1 вводили препарат СРБ однократно внутривенно в 0,2 мл изотоническо-' го раствора хлорида натрия в дозах 2. 10, 20 и 100 мкг за 1, 3 и 7 суток до тестирования. Животным контрольных групп в соответстующие сроки вводился изотонический раствор хлорида натрия. Функциональное состояние лимфоидных клеток исследовали с помощью РБТЛ (реакции бласттрансформэции лимфоцитов) в культуре спленоцитов in vitro. При этом изучалась исходная пролиферативная активность клеток селезенки и их ответ на стимуляцию Т- и В-митогенами - Кон А , ФГА.ЛПС к ДС..

II 1.3.1.1. Влияние СРБ на спонтанную пролифератквную активность спленоцитов мышей.

. Было установлено, что в результате введения СРБ мышам усиливается поглощение спленоцитами "^Н-тимидина при их последующем* культивировании in vitro. Действие препарата зависело от дозы и

■ —-38W •

сроков введения в организм. Так^Ири обработке* шгоотных-пропаратом

СРВ в лозах 2 и 10 мкг ?а 1 сутки до постановки РБТЛ не наблюдалось существенных изменений уровня радиоактивности по сравнению с контролем. ИС в этих грушах равнялись соответствэнно 1,02 к 0,80. Вместе с тем, 20 и 100 мкг СРВ высоко достоверно усиливали захват тимидика клетками селезенки. Среднее количество имп/мин в этих группах составляло соответственно 19517-2013 и 39547^2346, а в контроле - 5136-382.' ИС" достигал 3,80 (Р^0,01 ) в первом случае и 7,70 (Pi0,01) при введении 100 мхг СРВ.

При введении СРВ мышам за 3 суток до тестирования эффективность его действия несколько снижалась, à дозовая зависимость приобретала обратный характер. Наибольшие изменения пролифератвд-нсй активности.сплеиоцитов отмечались под влиянием препарата в дозе 2 мкг. Средняя величина радиоактивности в данной группе равнялась 11299-1207 имп/мин, а ИС составлял 2,2 (Р(0,01). С увеличением дозы CFB его стимулирующее действие становилось менее выраженным.. В груше, где препарат вводился а дозе 10 мкг, ИС равнялся 2,1' (Р^0,01). СРВ в дозе 20 мкг вызывал увеличение среднего уровня радиоактивности (ИС 1,4; Р^0,05), а при введении 100 мкг СРВ КС соответствовал 1,75 (Р«0,01).

Проведеннце эксперименты показали, что действие СРВ прослеживалось спустя 7 суток после его введения мышам- и дака' являлось более интенсивным, чем.через 3 суток после обработки животных. Под влиянием препарата в Дозе 2 мкг отмечалось выраженное yF тичение пролиферативного потенциала клеток селезенки. Среднее количество имп/мин достигало 16435*1732, а ИС - 3,2(Р^0,01). При введении СРВ в дозе 10 мкг его действие ослабевало. Величйна радиоактивности в этой группе выше, чем з контрольной группе только в 2,0 раза (Р$0,05). В результате обработки животных препаратом в доза 20 мкг,включение радиоактивной метки в культуре сплеиоцитов вновь увеличивалось (ИС 2,75; Р<о,01), тогда как при введении 100 мкг СРВ ИС незначительно снижался (ИС 2,65; Р<:0,01).

III.3.1.2.Действие СРВ :ta индуцированную Кон пролиферацию сплеиоцитов.

Было установлено, что в отличив от предыдущих экспериментов, введений СРВ мышам за 1 сутки до тестирования вызвало лишь статистически недостоверные изменения интенсивности включения

^-тимидина г летками селезенки.. Прй этой можно было отметить лишь ; некоторую тенденцию к снижению среднего уровня радиоактивности по мере увеличения дозы препарата. ИС в этих группах составлял соответственно 1,1; 0,90 и 0,90.

Эффект угнетения пролиферативного отвода спленоцитов на ' Кон А становился бол^е выраженным при постановке РБТЛ через 3 суток после введения СРБ и существенно зависел от используемой дозы. При обработке животных СРБ в дозе 2 мкг ИС снижался до 0,86 (Р*0,05). Вместе с тем, препарат в дозе 10 мкг обладал очень слабой активностью (ИС 0,95). После введения мышам 20 мкг СРБ наблюдалось резкое угнетение способности клеток селезенки отвечать на стимул1фущее действие Кон А. Б этой груше среднее количество имп/мин составляло 42232*3566, тогда как в контроле - 13137,5638. В результате ИС равнялся 0,30 (Р^0,01).

При постановке реакции через -7 суток после введения СРБ эффективность его действия падала. Применение препарата в дозах 2 и 10 мкг практически не отражалось на уровне включения радиоактивной метки. ИС в указанных группах равнялся соответственно 1,09 и 0,96. В этих условиях тестирования только доза СРБ 2.0 mict. оказывала статистически значимое супрессивное действие на митоген-инду-цированную пролиферацию спленоцитов (ИО 0,73; Es0,05).

III.3.1.3.Влияние CPS на ЛПС индуцированную

пролиферацию спленоцитов.

Было установлено, что действие СРБ на пролиферацию клеток селезенки, стимулированных ЛПС, имело в целом противоположную направленность при сравнении с результатами опы тов, где использовался Кон А. При введении препарата мышам за 1 сутки до тестирования лишь доза 2 мкг снижала включение ^Н-тимиди на (ИС 0,90: Р^0,05). Во всех остальных случаях Ътот эффект не наблюдался. При тех же условиях СРБ г> дозе 10 мкг вызывал статистически значимую стимуляцию ответа на ЛПС. Средний уровень радиоактивности ь этой группе составлял 28336-2530 имп/мин, а в контроле - 15742-2036; ИС равнялся 1,8 (Р$0,01). Увеличение дозы препарата до 20 мкг приводило к снижению его стимулирующего действия. В данном случае ИС равнялся 1,6 (Р<0,01). При введении 100 мкг СРБ ИС соответствовал 1,58 (Р<0,05).

Через 3 суток после введения СРБ дозовая зависимость вновь '

менялась. При обработкё'гавотныг препаратом*в^дазе 2 мкГ отмечалось усиление митоген-икдуцированной пролиферации спленоцитов (КС 1,6; 140,01). Напротив, СРБ в дозе Ю мкг не влиял на интенсивность включения радиоактивной метки (ИС 1,58). Увеличение дозы препарата до 20 мкг и 100 мкг позволило получить достоверное увеличение среднего уровня радиоактивности до 29206^982 имп/мин (ИС 1,7; Р«0,01), при введении 10 мкг СРБ - до 29550*2710 имп/ Мин (ИС 1,72; P^O.OD.

Постановка РБТЛ через 7 суток после введения животным СРБ продемонстрировала обратную дозовую зависимость его действия. В результате обработки мышей препаратом в дозе 2 мкг был получен наиболее выраженный эффект стимуляции ответа спленоцитов на ЛПС, В этой группе средкео количество имп/мин достигало 32156-3192, а ИС равнялся 1,75 (Р^0,01). Дальнейшее увеличение догы СРБ приводило к снижению его активности. Уровень радиоактивности в группе, где "препарат использовался в дозе Ю мкг, был выше контрольного показателя лишь, в 1:25 раза (Р^0,01). СРБ в дозе 20 мкг практически не оказывал влияния на включение ^-тимидина в культуре спленоцитов, стимулированных ЛПС, при введении 100 мкг ИС соответствовал 1,00.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что СРБ при введении ъ организм мышей способен изменять пролифера-тивный статус клеток селезенки . Препарат существенно Повышал "спонтанную" пролиферацию спленоцитов, в особенности при обработке животных за 1 и 7 суток-до тестирования. На фоне введе-ни СРБ наблюдалось угнетение ответа клеток селезешси на Кон А наиболее выраженное при использовании дозы 100 мкг за 3 и 7 суток до постановки РБТЛ. В целом, СРБ оказывал стимулирующее -действие на пролиферацию спленоцитов, индуцированную ЛПС. Исключение составляла доза препарат 2 мкг, которая через 1 сутки после введения вызывала обратный эффект, а через 3 и 7 суток - стимулировала включение WH- тимидина клетками селезешси.

Таким образом, действие препарата сохранялось на протяжении 7 суток после введения, а в некоторых случаях к этому сроку даже возрастало. Дозовая за исимость действия препарата заметно менялась в различные сроки тестирования. Следует отметить высокую активность СРБ в дозе 2 мкг.

III.Действие СРВ на . <6ГА ив ащировонаув

пролиферацию спленоциуов.

Было установлено, что в отличие от предыдущих экспериментов, введение CFB мышам за 1 сутки до тестирования вызывало лишь статистически недостоверные изменения интенсивности включения 3Н-тими-доша клетками селезёнки. При этом можно было отметить лишь некоторую тенденцию к снижению среднего уровня радиоактивности по мере ■ увеличения дозы препарата. ИС в этих группах составлял соответственно 1,0; 0,91; 0,91 и 0,36.Эффект угнетения пролиферативного ответа спленоцитов на ФГА становился более выраженным при постановке РБТЛ через 3 суток после введения СРБ и существенно зависел от используемой дозы. При обработке животных СРБ в дозе 2 . мкг ИС снижался до 0,66 (Р^ 0,01), а при использовании препарата в дозе 10 мкг ИС соответствовал 0,54. После введения мышам 20 мкг СРБ наблюдалось резкое угнетение способности клеток селезенки отвечать на стимулирующее действие ФГА. В этой группе среднее количество имп/мин составляло 5326^594, тогда как в контроле -17180-1848. В результате ИС равнялся 0,31 (Р^О,01).При постановке реакции через 7 суток после введения СРБ эффективность его действия падала. Применение препарата в дозах 2 мкг и 10 мкг практически не отражалось ка уровне включения радиоактивной метки. ИС в указанных группах равнялся соответственно 0,94 и 0,80.3 зтих условиях тестирования только Доза СРБ в 100 мкг оказывала статистически значимое супрессивное действие на митоген индуцированную пролиферацию спленоцитов (ИС 0,73;р^0,05)

III.3.1.5 Влияние СРБ на декстран-сульфат идуцированную

пролиферацию спленоцитов.

Было показано, что при использовании CFB в дозе 2 мкг уже отмечалась стабильная тенденция к снижению уровня радиоактивности по мере увеличения дозы препарата. ИС в. . этих группах составлял соответственно 0,6; 0,6; .0,5 и.О,5 (Р--0,01).

Эффект угнетения пролиферативного ответа спленоцитов на ДС становился более выраженным при постановке РБТЛ через 3 суток после введения СРБ и существенно зависел от используемой дозы. При I обработке животных в дозе 2 мкг ИС снижался до 0,6 (Рч<0,01). После

введения мышам 10 мкг СРБ наблюдалось резкое угнетение способности клеток селезенки отвечать на стимулирующее воздействие ДС. В . этой группе среднее количество имп/мин составляло 17550±!0£9, тогда как в контрольной груше - 53026-3284. В результате ИС равнялся 0,33. (Fi.0,01). При использовании дод СРБ в ZO и 100 мкг- ИС соответственно равнялся 0,5 и 0,7.

При постановке реакции через 7 суток после введения СРБ отмечалась незначительная тенденция к увеличению, но все жэ показатели HC соответствовали при 2 мкг СРБ - 0,4, при 10 мкг СРБ - 0,84, а при обработке животных 20 мкг и 100 мкг КС соответствовал 0,6.

" III.3.1.6. Изучение способности СРБ к неспещфр^еской

активации B-клеток селезенки ыывей.• В»настоящее время неспецифическая стимуляция "спонтанной" антителопродукции под влиянием экзогенных и эндогенных иммуноре-гуляторных факторов рассматривается в качестве одного из механизмов защиты оргагазыа от инфекции на ранних этапах ее развития. Вместе с тем, этот феномен может служить показателем функционального состояния иммунорвактивности организма. В литературе отсутствуют какие-либо сведения о способности СРБ к поликлональной ак--тивацил B-клеток. Поэтому было решено рассмотреть вопрос в настоящей рас-оте.

СРБ вводили мышам (CBAxC57BiL/6)F1 однократно вн; риЕенно в 0,2 мл изотонического раствора хлориде натрия за 1, 2, 3 и 7 суток до тестирования.

Было показано ,' что при введении СРБ за 1 сутки до тестирования отмечается линейное увеличение числа АОК в селезенках мышей по мере возрастания доза препарата. При обработке животных . СРБ в дозе 2 и Ю мкг наблюдалась статистически недостоверная стимуляция антителогенеза. ИС в указанных группах составлял 1,1 и 1,26. Вместе с тем, при введении мышам СРБ в дозе 20 мкг было отмечено выраженное увеличен:-з числа зон гемолиза. Среднее количество АОК в этой группе достигало 368,5-10,8, тогда как в контроле - 102,8^23,5. ИС повышался, до 3,58 (Р^0,01), Увеличение срока предварительной обработки мышей СРБ до 2

- «•суток приводало к общему увеличению эффективности его действия". В4 данных условиях во всех грушах наблюдалась статистически достоверная стимуляция антитело.генеза. При введении препарата в дозах 2 и 10 мкг среднее количество AQK было выше, чем в контроле соответственно в 1,7 и 2,5 раза (Р^0,01). Однако активность 20 мкг СРБ была несколько ниже, чем при введении за 1 сутки до тестирования. Количество АОК в этом случае превышало аналогичный контрольный показатель в 3,1 раза (Р^0,01).

Через 3 суток после введения СРБ мышам дозовая зависимость ".' ,, его действия менялась. В группе, где СРБ использовался в дозе 2 мкг, эффект стимуляции антителообразования был менее выражен (ИС 1,35; Р.£0,01). Напротив, активность препарата в Дозе -10 мкг продолжала возрастать. ИС в этом случае составлял 2,49 (Р^0,0,*

При введении СРБ мышам в дозе 20 мкг его стимулирующее действие продолжало снижаться по сравнению с предыдущими сроками тестирования, хотя и оставалось высоко статистически значимым (ИС 2,58; Рч<0,01) ■

Постановка тест-реакции через 7 суток после введения СРБ выявила практически полное отсутствие изменений в количестве АОК в опытных грушах по сравнению с контролем. ИС равнялись соответственно использованным дозам препарата - 1,0; 1,0; п 1,04.

Таким образом, было установлено, что СРБ при введении в ' организм мышей обладает свойством повышать количество "спонтанных" АОК, синтезирующих антитела к ЭБ . Действие препарата зависело от дозы и сроков введения в организм. Наиболее выраженный эффект стимуляции антителогенеза был отмечен при введении СРБ за 1 сутки до тестирования в дозе 20 мкг. С увеличением срока тестирования активность указанной дозы СРБ линейно снижалась. Максимум действия препарата в дозе 2 мкг наблюдалс'я на 2-е сутки, а в дозе 10 мкг - на 3-й сутки после обработки животных. При постановке тест-реакции через 7 суток после вьедэния СРБ его действие не проявлялось.

III.3.1.7. Изучение влияния СРВ на формирование первичного

иммунного ответа.

Предыдущие эксперименты продемонстрировали способность СРВ In vivo модифицировать функциональную активность основного клеточного звена иммуногенеза - популяцию лимфоидных клеток. Поэтому,

менялась. При обработке гогвотнш: пропаратда* в*дэзе 2 мк£ отмечалось усиление митоген-шгдуцированной пролиферации спленоцитов (КС 1,6; Р£0,01). Напротив, СРБ в дозе Ю мкг не влиял на интенсивность включения радиоактивной метки (ИС 1,58). Увеличение дозы препарата до 20 мкг и 100 мкг позволило получить достоверное увеличение среднего уровня радиоактивности до 29206-982 имп/мин (ИС 1,7; Р<0,01), при введении 10 мкг СРБ - до 29550*2710 имп/ мин (ИС 1,72; Р^0,01).

Постановка РБТЛ через 7.суток после введения животным СРБ продемонстрировала обратную дозовую зависимость его действия. В результате обработки мышей препаратом в дозе 2 мкг был получен наиболее выраженный эффект стимуляции ответа спленоцитов на ЛПС, В этой группе средкео количество имп/мин достигало 32156*3192, а ИС равнялся 1,75 (Р^.0,01). Дальнейшее увеличение дозы СРБ приводило к снижению его активности. Уровень радиоактивности в груше, где 'препарат использовался в дозе 10 мкг, был выше контрольного показателя лишь, в 1:25 раза (Р^0,01). СРБ в дозе 2С мкг практически не оказывал влияния на'включение 3Н-тимидина в культуре спленоцитов, стшулирэзавных ЛПС, при введении 100 мкг ИС соответствовал 1,00.

В результате просодопше экспериментов было установлено, . что СРБ при введении в организм мышей способен изменять' пролнфера-тивный статус клеток селезенки . Препарат существенно Повышал ■ "спонтанную" пролиферацию спленоцитов, в особенности при обработка животных за 1 и 7 суток до тестирования. На фоне введе-нк СРБ наблюдалось угнетение ответа клеток селезешси на Кон А наиболее выражешюе при использовании дозы 100 мкг за 3 и 7 суток до постановки РБТЛ. В целом, СРБ оказывал стимулирующее -действие на пролиферацию спленоцитов, индуцированную ЛПС. Исключение составляла доза препарат 2 мкг, которая через 1 сутки после введения вызывала обратный эффект, а через 3 и 7 суток - стимулировала

о

включение Н- тимидина клетками селезенки. •

Таким образом, действие препарата сохранялось на протяжении 7 суток после введения, а в некоторых случаях к этому сроку даже возрастало. Дозовая зависимость действия препарата заметно менялась в различные сроки вотирования. Следует отметить высокую активность СРБ в дозе 2 мкг.

III.3LM.Действие СРВ на . ФГА ивдуцированвув

пролиферацию спленоцитов.

Было установлено, что в отличие от предыдущих экспериментов, введение СРВ мышам за 1 сутки до тестирования вызывало лишь статистически недостоверные изменения интенсивности включения 3Н-тими-дгаа клетками селезенки. При этом можно было отметить лишь некоторую тенденцию к снижению среднего уровня радиоактивности по мере увеличения дозы препарата. ИС в этих группах составлял соответственно 1,0; 0,91; 0,91 и 0,86.Эффект угнетения пролифератшзного ответа спленоцитов на ФГА становился более выраженным при постановке РБТЛ через 3 суток после введения СРВ и существенно зависел от используемой дозы. При обработке животных СРВ в дозе 2 . мкг ИС снижался до 0,66 (Р^: 0,01), а при использовании препарата в дозе 10 мкг ИС соответствовал 0,54. После введения мышам 20 мкг СРВ наблюдалось резкое угнетение'способности клеток селезенки отвечать на стимулирующее действие ФГА. В этой группе среднее количество имп/мин составляло 5326±594, тогда как в контроле -17180-1848. В результате ИС равнялся 0,31 (Р*<0,01 ).При постановке . реакции через 7 суток после введения СРВ эффективность его действия падала. Применение препарата в дозах 2 мкг и 10 шсг практически не отражалось ка уровне включения радиоактивной мотки. ИС в указанных группах равнялся соответственно 0,94 и 0,80.В зтих условиях тестирования только Доза СРЕ в 100 мкг оказывала статистически значимое супрессивное действие на митоген индуцированную пролиферацию спленоцитов (ИС 0,73;р^0,05)

III.3.1.5 Влияние СРВ на декстран-сульфат идуцированную

4

пролиферацию спленоцитоЕ.

Было показано, что при использовании CFB в дозе 2 мкг уже отмечалась стабильная тенденция к снижению уровня радиоактивности по мере увеличения дозы препарата. ИС- в этих группах составлял соответственно 0,6; 0,6; 0,5 .и. 0,5 (Р--0.01).

Эффект угнетения пролиферативнэго ответа спленоцитов на ДС становился более выраженным при постановке РБТЛ через 3 суток ■'/. после введения СРВ и существенно зависел от используемой дозы. При

у обработке животных в дозе 2 мкг ИС снвасался до 0,6 (P^0,Q1).'После

введения мишам 10 мкг СРБ наблюдалось резкое угнетение способности клеток селезенки отвечать на стимулирующее воздействие ДС. В . этой группе среднее количество имп/мин составляло 175БС-1059, тогда как в контрольной груше - 53026*3284. В результате ИС равнялся 0,33. (Р*0,01). При использовании доз СРБ в 20 и 100 мкг- ИС соответственно равнялся 0,5 и 0,7.

При постановке реакции через 7 суток после введения СРБ отмечалась незначительная тенденция к увеличению, но все же показатели ИС соответствовали при 2 мкг СРБ - 0,4, при 10 мкг СРБ - 0,84, а при обработке животных 20 мкг и 100 мкг ИС соответствовал 0,6.

III.3.I.6. Изучение способности СРБ к неспецифи^ескоЯ

активации В-клеток селезенки шшей.-В»настоящее время неспецифическэя стимуляция "спонтанной" антителопродукции под влиянием экзогенных и эндогенных ичмуноре-гуляторных факторов рассматривается в качестве одного из механизмов защиты оргагазма от ивфеющи на ранних этапах ее развития. Вместе с тем, этот феномен макет служить показателем функционального состояния иммунореактивности организма. В литературе отсутствуют какие-либо сведения о способности СРБ к поликлональнсй ак-' тивацин В-клеток. Поэтому было решено рассмотреть вопрос в настоящей расоте.

СРБ вводили мышам (СВАхС5731/б)Р1 однократно вн; ривенно в 0,2 мл изотошпеского раствора хлорида натрия за 1, 2, 3 и 7 суток до тестирования.

Было показано что при введении СРБ за 1 сутки до тестирования отмечается линейное увеличение числа АОК в селезенках мышей по мере возрастания дозы препарата. При обработке животных . СРБ в дозе 2 и 10 мкг наблюдалась статистически недостоверная стимуляция антителогенеза. ИС в указанных группах составлял 1,1 и 1,25. Вместе с тем, при введении мышам СРБ в дозе 20 мкг было отмечено выраженное увеличение числа зон гемолиза. Среднее количество АОК в этой груше дог лгало 368,5*10,8, тогда как в контроле - 102,8*23,5. ИС повышайся до 3,58 (Р^0,01), Увеличение срока предварительной обработки штей СРБ до 2

суток привода по к общему увеличению эффек-лшпссти ого действия". В* данных условиях во всех грушах наблюдалась статистически достоверная стимуляция антитело.генеза. При введении препарата ь дозах 2 и 10 мкг среднее количество АОК было выше, чем в контроле соответственно в 1,7 и 2,5 раза (P-fü.OI). Однако активность 20 мкг СРБ была несколько ниже, чем при введении за 1 сутки до тестирования. Количество АОК в этом случае превышало аналогичный контрольный показатель в 3,1 раза (Р^0,01).

Через 3 суток после введения СРБ мышам дозовая зависимость";,, его действия менялась. В группе, где СРБ использовался в дозе 2 мкг, эффект стимуляции антителообразования был менее выражен (ИС 1,35; P-Í0.01). Напротив, активность препарата в дозе 10 ыкг продолжала возрастать. ИС в этом случае составлял 2,49 (Р<:0,0, >.

При введении СРБ мышам в дозе 20 мкг его стимулирующее действие продолжало снижаться по сравнению с предыдущими сроками тестирования, хотя и оставалось высоко статистически значимым (ИС 2,58; Рч<0,01) .

Постановка тест-реакции через 7 суток после введения СРБ выявила практически полное отсутствие изменений в количестве АОК в опытных грушах по сравнению с контролем. ИС равнялись соответственно использованным дозам препарата - 1,0; 1,0; и 1,04.

Таким образом, было установлено, что СРБ при введении б ' организм мышей обладает свойством .»овышать количество "спонтанных" АОК, синтезирующих антитела к ЭБ . Действие препарата зависело от дозы и сроков введения в организм. Наиболее выраженный эффект стимуляции антителогенеза был отмечен при введении СРВ за 1 сутки до тестирования в дозе 20 мкг. С увеличением срока тестирования активность указанной дозы СРБ линейно снижалась. Максимум действия препарата в дозе 2 мкг наблюдалс'Я на 2-е сутки, а в дозе 10 мкг - на 3-й сутки после обработки животных. При постановке тест-реакции через 7 суток после введения СРБ его действие не проявлялось.

III.3.1.7. Изучение влияния СРБ на формирование первичного

иммунного ответа.

Предыдущие эксперименты продемонстрировали способность СРБ in vivo модифицировать функциональную iчтивность основного клеточного звена иммуногенеза - популяцию лимфоидных клеток. Поэтому,

ЭБ по сравнению с контрольной, в которую вводили изотонический

раствор хлорида натрия. При учете реакции определялось среднее зна чение величины отека ( разница в весе лапок) в «г и его процентное

выражение по отношению к контролю, в котором этот показатель пригашался га 100 %.

Было установлено, что при введении СРБ мышам одномоментно с сенсибилизирующей дозой_ЭВ отмечается угнетение меотной реакции ГЗТ. Эффект действия препарата наблюдался уже при использовании дозы' 2 мкг. Величина отека в этой группе была снижена на 15 Ж. При обработке животных СРБ в дозах 10, 20 и 100 мкг интенсивность реакции по сравнению с контролем была снижена соответственно на 18, 22 и 25 %. Хотя абсолютные значения величины отека и их процентные выражения имели небольшие различия мевду опытшми группами, можно отметить тенденцию к возрастанию активности препарата с увеличением его дозы.

Противопожное по своей направленности' действие СРБ обнаружено при его введении мышам в различные сроки, предшествующие моменту сенсибилизации. Как можно видеть из представленных в таблице 10 данных, обработка животных СРБ за 1 сутки до введения ЭБ усиливала проявление кожной реакции. Причем в этих группах наблюдалась, обратная дозовая зависимость действия препарата. Под влиянием СРБ в дозе 2 мкг отек отытной лапки был выше 22 Эффект стимуляции при использовании препарата в доза.х. 1С) и 20 мкг был менее выражен и мало различался в абсолютном и процентном выражении. Интенсивность отека в указанных группах была выше но 15 и 17 % соответственно.

С увеличением срока предварительной обработки животных СРБ до 2 суток наблюдалась заментное ослабление действия препарата. Независимо от дозы СРБ во всех группах усиление отека было незначительным и в процентном отношении не превышало возможной ошибки метода (5, 3, 7 и 8 %), что не позволяло сделать заключение о характере дозовой зависимости.

Напротив, при введешш СРЙ мышам за 3 суток до сенсибилизации наблюдался выраженный эффект стимуляции ГЗ'Г. При этих условиях с увеличением дозы прз.гзрита его'дейгтвио""у6иливалось. Так, СРБ в дозе 2 мкг практически т влиял на величину отека. В группах, где применялся препарат в дозё 10 кот,- этот , показатель но

—W5Q "t- ■

сравнению с контролем бнЛ выше;'на 20 '«/•При введении мышам СРВ в лозах 20 и 100 мкг наблюдалось наиболеь значительное усиление кожных проявлений ГЗТ. В о тих группах увеличение отека было высоко статистически достоверным и составляло 35 и 38 %.

Эксперименты второй серии показали , что CFE оказывает влияние на развитие ГЗТ и в том случае, если вводится мышам после сенсибилизации. Как и в предыдущих экспериментах, действие препарата зависело от сроков обработки животных и его дозы. В опытах, где СРБ вводили спустя 1 сутки после ЭВ, наблюдались слабозыражекные и различные по направленности изменения интенсивности кожной реакции. Под влиянием препарата в дозе 2 мкг величина отека снижалась в среднем на 5 %. Вместе с тем, в результате обработки мышей СРБ в дозах 10, 20 и 100 мкг наблюдался эффект стимуляции ГЗТ. Величина отека в этих группах была выше относительно контроля на 8, 10 и 12 % соотвётстЬенно.

При введении СРБ через 3 суток после сенсибилизации прояв-. ление его действия носило однотипный характер. Во всех группах отмечалось подавление, развития ГЗТ в прямой линейной зависимости от дозы препарата. Так, если доза 2 мкг угнетала кожную реакцию лишь на Ю %, то 10 мкг препарата вызывала высоко достоверное снижение величины отека на 38 % (Р^0,01). При использовании СРБ в дозах 20 и 100 мкг были получены наиболее выраженные эффекты его действия на интенсивность ГЗТ из всех проведенных опытов. В этих грушах очен лапок, в отв>?т на введение разрешающей дозы ЭБ, снижался на 47 и ЬЗ % но сравнению с контролем (Р<0,01).

Таким образом, было показано, что СРБ человека при введении в организм мышей способен модулировать развитие ГЗТ на ЭБ Интенсивность и характер действия препарата определялись ого дозой и сроком обработки животных относительно момента сенсибилизации. Предварительное введение СРБ усиливало местные проявления ГЗТ. Максимальный стимулирующий оффокт наблюдался при обработке животных за 3 суток до сенсибилизации.

Введение СРВ одномоментно с антигеном и после него приводило к угнетению кожной тест-реакции. Супрессорноь действие было наиболее выражено при обработке мышей препаратом через 3 суток после сенсибилизации. Дозовый эффект менялся в зависимости от сроков применения и имел как пряг.ой , так и обратный характер. •

выводы

1. Установлено, что в реализации взаимодействия фосфохо-линовых сайтов связывания С-реактивного белка с лигандами. участвуют ионы .Са*"4, данный тип связывания

является доминирующим и может быть использован для выделения СРВ из биологических жидкостей.

2. Разработаны новые способы получения фосфохолинсодержащих биоспецифических сорбентов на основе производных вп-глицеро-з-фосфохолина и аминозамещешшх агарозных матриц.

3. Впервые обнаружено, что'для получения СРВ наиболее эффективны сорбенты с' незаряженными спейсерными группами. Определена оптимальная концентрация иммобилизов лшых лигандов, охарактеризовано влияние катионных группировок в структуре спейсора на степэнь чистоты выделяемого СРВ.

4. Впервые для нолучения высокоочищеннсго препарата С-реактивного белка (SSÍ5 чистоты) разработан комплекс методов из аффинной и ионообменной хроматографии.

б. СРВ повышает функциональную активность фагоцитов в условиях, где его опсошзирувдее действие полностью исключается. Препарат стимулирует проявление бактерицидных свойств у циркулирующих фагоцитов и усиливает захват антигена резидентными по-ритонеальными макрофагами.

6. Обнаружено, что СРВ усиливает спонтанную пролифорацию лимфо-идных 1слеток In vivo и обладает выраженным митогенным эффектом In vitro; впервые доказано, что СРВ обладает иммунорегулируицей активностью не только в системе

In vitro, но и In vivo.

7. Установлено, что при введении в организм мышей СРБмодифицн-рует способность лимфоцгшх клеток отвечать на Т- и В-митс>ге-ны, подавляя их ответ, наи КонА,

' фга и декстран-сульфат, -т незначительно стшулируя ответ спл-.-;::)ЦИТов на Л 1С.

8. Впервые показано, что в результате удаления из культуры спле-нэцитэе фагоцитирующих и прилипающих клеток в присутствии С-реактивного белка возрастает проитферативная активность Л"кстран--сульфаг стимултоованшх клеток.

9. СРВ модулирует уровень первичного иммунного ответа мышей на эритроциты Охрана. Предварительное, и одномоментное введение СРВ с антигбном угнетает антителогенез. При введении препарата после иммунизации наблюдается стимуляция иммунного ответа.

10. Показано, что под влиянием СРВ меняется интенсивность ГЗТ в зависимости от сроков введения препаратов относительно момента сенсибилизации. Предварительная обработка мышей СРВ симулирует формирование ГЗТ, его .введение после сенсибилизации угнотзст кожные проявления реакции.

11. Получение новые• данные о влиянии СРВ на функциональную активность макрофагов, пролиферацию -лимфоидных клеток, реакцию ГЗТ и уровень первичного иммунного ответа свидетельствуют об участии СРВ-в регуляции иммуногене-неза и взаимосвязи с последующим иммунным ответом.

-*:'БЗ -

. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Стофани Д. В..Токсамбаева С.К.Острофазный ответ организма теоретические аспекты,клишгчоское значение).//Педттрил-1937 -НЗ.-С.62-68.

2. Рябинская Г.В.,Шторенгарц Б.П. .Xaprai В.Г..Токсамбаева С.Ж.

' Использование CPß-теста для диагностики деструктивных процессов у детей с хирургическими формами острых гнойных заболеваний.// Хирургия,Журнал им.Пирогова H.H..-1987.-n 8.-C.I29-I3I,

3. Токсамбаева С.Я.«Мысякин Е.Б.«Стефани Д.В. Изучение способности С-реактивного белка it,. ' иеспецифической активации антптолообразунцих клеток y'v" [ялпэй. // Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии,Механизмы мы противоинфекциошого кшунитета:Тез.докл.П Всесоюзной конференции 1ю теорат. и прикладной инфекционной иммунологии. -Саратов.-1987.-С ЛСб.

4. Токсамбаева С.Н. .Мысякин., Е.Б.Иммуномодулирующая активность очше1шого препарата С-реактивного белка человека.// Факторы клеточного иммунитета ; при различных физиологических' ' п патологических состояшшх.:Тез.

док л .IX негвдотят-утской кон'юро mam. Чо лябинск. ICC8.-С Л 86.

5.Стефана Д,В.,Токсамбаева . С.Е. Влияние.. С-реактивного белка на фушахпональнцЬ активность лимфоидпых клеток.// Актуалыше вопроси педиатрии:Твз.локл. I съезда детских вп'псй.ШгЛ W. -

6. Молчанова (Зотова) Е.Г., Токсамбаева С.К., Мысякин Е.Б., Евст-ратова Н.Г., Сероброшшзсова Г.А. Способ получения аффгашого сорбента для выделения С-ровктивного белка.-Решение о выдаче патента на изобротение.-Заявка N 5036548/13/017084 от 03.04.92.

7. Зотова Е.Г., Дружинина И.Б., Токсамбаева С.К., f&cnram Е.Б., Рубцов К.С., Серебренникова Г.А. Выделение С-роактнвного белка методом аффшшой хроматографии // Биотехнология.- 1995.-Н'3-4,- С. 15-19.

8. Зотова Е.Г., Мысякин E.D., Токсамбаева С.Ж., Рубцов К.С., Серебренникова Г.А. С-реактивный белок: строение, свойства и способы получешш // Виоорг.гшческая химия.-1995.-Н 10.-С.739-752.

5. Myslaklne 2.В., ТокзатЬа^а S.G., Krasny ana Kaya T.A., Molcha-nova E.G. (Зотова Е.Г.), ítefanl U.V., Bouret'J-P.« Barot-Clor-baru R. Action in vivo of C-reactive protein (CRP) • on Immune response In rnlcp // Abstr. lor the 4"1 Interscler.ce World _Con-

• «"V »

- 54 -

rence on Inflammation.- Geneva, '1991abs. 126.

10. Молчанова Е.Г. (Зотова Е.Г.), Мысякин Е.Б., Токсамбаева С.Ж. Моделирование образования комплексов С-реактивного белка человека с р-липопротеинами. // Тез. докл. Международного симпозиума по аллергологии и клинической иммунологии.- Алма-Ата, 1992.- С. 205..

11.Токсамбаева С.Я.,Мысякин Е.Б.Влияние С-реактивного белка на бактерицидный потенциал фагоцитирующих клеток

//Тез.докл.Меадунарозного симпозиума, по аллергологии и ■ клинической иммунологии.-Алма-Ата.1992.-С.204.

12. Myslaklne Е.В., Toksambaeva S.G., Krasnyanskaya Т.А., Mo" -Па-, nova H.G. (Зотова Е.Г.), Ryabova Е.А., Barot R. Studies on mechanism of immunoregulatory(action of human c-reactive protein //. Abstr. for the 1st International conference on cell wall-de-rlved lmmunomodulators and synthetic adjuvants.- Slnaya, Roma-mla, 1993.- P.45-46. .. .

КЗ.Чекнев С.Б..Токсамбаева C.Z..Нысякнн Е.Б.Фибронектин как фактор компенсации естестве,тной щгготоксичаости при интеферонзависи-мом иммунодефиците.//Еюлл.акспер.биологии и мед.-N7.1994.-С.67-70.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН_

Подп. к печати 2?А, 94 Заказ ?9 Тираж 1 00 экз.