Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РЕАКТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ЭПИТЕЛИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ ОТДЕЛЬНЫХ ФОРМАХ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА

На правах рукописи

005044472

НИКИТИН СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РЕАКТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ЭПИТЕЛИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ ОТДЕЛЬНЫХ ФОРМАХ ХРОНИЧЕСКОГО ГАСТРИТА

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 мдм 2012

Челябинск - 2012

005044472

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории и на кафедре патологической физиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук

Косарева Полина Владимировна, доктор медицинских наук, профессор Самоделкин Евгений Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Кривохижина Людмила Владимировна,

доктор медицинских наук, профессор Сыропятов Борис Яковлевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития Российской Федерации, г. Москва

Защита диссертации состоится «29» мая 2012 г. в _ часов на заседании

специализированного Совета Д 208.117.02 Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Автореферат разослан «_» _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Тишевская Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В структуре заболеваний желудочно-кишечного тракта основное место принадлежит так называемым кислотозависимым состояниям, к которым традиционно относят гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, хронические гастрит и гастродуоденит, язвенную болезнь [Приворотский В.Ф., 2003]. По частоте распространения и патогенетической связи с язвенной болезнью и раком желудка хронический гастрит является одной из основных медико-социальных проблем современного общества [Кветной И.М. и др., 2010; Степанов И.В. и др., 2010].

Хронический гастрит (ХГ) - понятие полиэтиологическое, в его развитии участвуют различные экзогенные и эндогенные факторы [Щербаков П.Л., 2002]. При этом морфологические изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ) и патогенез хронического гастрита для каждой из его форм имеют свои особенности [Минушкин О.Н. и др., 2003].

При хроническом гастрите реактивные процессы наряду с хроническим воспалением СОЖ включают также дистрофические (дегенеративные) и дисрегенераторные изменения, то есть нарушение процесса клеточного обновления [Приворотский В.Ф. и др., 2003]. Известно, что как при Helicobacter /n'/oW-нндуцированном гастрите (тип В), так и при химическом гастрите (тип С) имеют место не только пролиферация эпителиоцитов, но и их усиленный апоптоз, активация которого может быть опосредована различными экзогенными и эндогенными факторами [Zhang Z. et al., 2001; Hansen-Petrik M.B. et al., 2002; Hoshino T. et al., 2003; Шелехова K.B., 2004; Kohli M. et al., 2004; Nardone G. et al. , 2004; Honjo S. et al., 2005; Tsuji S. et al., 2006; A. von Herbay J.R. et al., 2008; Ganten T.M. et al., 2007]. Тем не менее, отдельные аспекты этой проблемы до настоящего времени остаются до конца не выясненными.

В настоящее время изучение механизмов апоптоза при различной патологии привлекает внимание многих исследователей в связи с возможностью направленного терапевтического воздействия на выявленные процессы. Изучение факторов инициации апоптоза может играть ключевую роль в понимании патогенеза того или иного заболевания и разработке на основе полученных данных оптимальных путей терапии. В связи с этим, исследование пусковых факторов апоптоза эпителиоцитов СОЖ у больных с хроническим гастритом представляется интересным и актуальным.

Благодаря исследованиям последних лет удалось существенно пополнить знания о регуляции клеточного цикла. Эта информация очень важна, так как судьба делящихся клеток зависит от целого ряда обстоятельств - генетической программы, действия гистогормонов (цитокинов и факторов роста), влияния внешних факторов. В результате этих влияний клетка может вступить в процесс дифференцировки, подвергнуться апоптозу или бласттрансформации [Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л., 2007]. Управление всеми этими

процессами происходит на молекулярном уровне, то есть за чисто морфологическими явлениями стоит множество молекул-регуляторов, воспринимающих митогенные сигналы и последовательно инициирующих строго определенные события [Мушкамбаров H.H., Кузнецов C.JL, 2007]. Жизнь и смерть клетки являются соревнованием между белками-эффекторами, обладающими противоположными функциями [Маянский А.Н., 2006].

Регуляция клеточного цикла в эпителиальных клетках и эффекты действия на эпителиоциты митогенных и антимитогенных факторов в настоящее время также активно изучаются. Тем не менее, в литературе содержится мало сведений, описывающих регуляцию апоптоза клеток СОЖ при хронических гастритах, что также определило актуальность исследований в этом направлении.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: исследовать течение реактивных процессов в слизистой оболочке желудка при отдельных формах хронического гастрита.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительную оценку реактивных изменений (воспалительных, дегенеративных и дисрегенераторных) слизистой оболочки желудка у пациентов с геликобактерным и негеликобактерным хроническим гастритом.

2. Исследовать факторы инициации апоптоза в слизистой оболочке желудка при геликобактерном и негеликобактерном хроническом гастрите.

3. Охарактеризовать роль митогенных (EGF) и антимитогенных (TGF-ß) факторов в патогенезе геликобактерного и негеликобактерного хронического гастрита.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Течение реактивных процессов в слизистой оболочке желудка при хроническом геликобактерном и негеликобактерном гастрите имеет существенные отличия, обусловленные особенностями патогенеза различных форм хронического гастрита.

2. Апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне, в частности, FasL и TNF-a, значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ; вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный нарущениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53.

3. В патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и NFkB-сигнального пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ — гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-ß (TGF-ß).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Установлено, что течение реактивных процессов в слизистой оболочке желудка (воспалительных, дегенеративных и

дисрегенераторных) при хроническом геликобактерном и негеликобактерном гастрите имеет существенные отличия, что объясняется особенностями патогенеза различных форм хронического гастрита. Выявлено, что негеликобактерный ХГ в большинстве случаев обусловлен приемом пациентами НПВП, о чем свидетельствует выявление специфичных для НПВП-гастропатии морфологических признаков поражения СОЖ.

Впервые выявлено, что апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне, в частности РэбЬ и ТЫР-а, значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ. Вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный нарушениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53.

Впервые установлено, что в патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора эпидермального фактора роста (ЕОИ1) и ОТкВ-сигнального пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ - не только гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза, но и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-Р (ТСТ-Р).

Впервые выявлено, что роль ТОТ-а в патогенезе геликобактерного и негеликобактерного ХГ неоднозначна: при негеликобактерном ХГ ТОТ-а ответственен за индукцию апоптоза, обусловленного воспалительными и дегенеративными изменениями в СОЖ; при геликобактерном ХГ ТОТ-а опосредует активацию ОТкВ-сигнального пути, следствием чего является выживание поврежденных клеток.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Результаты исследований, свидетельствующие о роли р53, Т№-а и РаяЬ в инициации апоптоза, ЕвР и ТСР-[]3 - в регуляции клеточного цикла эпителиальных клеток СОЖ при различных формах хронического гастрита, позволяют расширить представление о патогенезе хронического гастрита.

Установленные в исследованиях иммуногистохимические признаки геликобактерного и негеликобактерного ХГ дают возможность применения полученных закономерностей на практике - в качестве дополнительных диагностических критериев при исследовании гастробиоптатов пациентов с хроническим гастритом.

Выявленные изменения сывороточных уровней ТОР-р1 и гастрина-17 у пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным ХГ (тип С) определяют целесообразность включения в комплексную программу обследования больных с хроническим гастритом исследование ТОР-Р1 и гастрина-17 в сыворотке крови.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ПГСХА. им. акад. Д.Н. Прянишникова, (Пермь, 18 нояб. 2010).- Пермь, 2010; Материалы науч. сес.

ПГМА, посвящ. 95-летию медицинского образования на Урале и 80-летию ПГМА им. акад Е.А. Вагнера. -Пермь, 2011; Молодежная наука 2011: технол., инновац. Матер. Всеросс. науч.- практ. конф. молод, учен., аспир., и студ. 16-17 марта 2011, ПГСХА, Ч. 1 г. - Пермь, 2011; Материалы науч. сес. «Современная гастроэнтерология. Что нужно знать практическому врачу?» Н.-Новгород, 2012.; Материалы науч. сес. ПГМА. - Пермь, 2012; ИННОВАЦИИ АГРАРНОЙ НАУКИ - ПРЕДПРИЯТИЯМ АПК. Материалы Международной научно-практической конференции (Пермь, 24-25 апреля 2012 года), Часть 3. - ПГСХА, Пермь, 2012.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 работы, опубликованы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований результаты используются в учебном процессе на кафедре патологической физиологии, кафедр гистологии, эмбриологии и цитологии, кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии, оперативной хирургии; внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ ГБОУ ВПО «ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ.

СВЯЗЬ РАБОТЫ С НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ. Работа выполнена в соответствиис планом НИР ГБОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития России. Регистрационный номер 01.2.00709666.

СТРУКТУРА II ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 171 печатной странице, содержат 29 таблиц, 30 рисунков, включают 183 литературных источника, из которых 67 -отечественных и 116 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствие с поставленными задачами проведено обследование 87 человек в возрасте от 18 лет до 81 года, госпитализированных в специализированное гастроэнтерологическое отделение МУЗ ГКБ №4 г. Перми в 2010-2012 гг. Все пациенты на момент госпитализации имели диагноз «хронический гастрит» или «хронический гастродуоденит», который уточнялся в процессе проведения комплекса лечебно-диагностических мероприятий.

Критерии включения пациентов в исследование: наличие синдрома язвенноподобной или неязвенной желудочной диспепсии (абдоминальный болевой синдром и/или синдром желудочной диспепсии). Критерии не включения пациентов в исследование: прием больными антибактериальных

или антисекреторных препаратов в течение 2-3 месяцев, предшествующих госпитализации, наличие аллергической и иммунной патологии, способной оказать влияние на течение основного заболевания, табакокурение и систематическое употребление алкогольных напитков. Необходимо отметить, что в анамнезе 41 из 87 пациентов сформированной выборки отмечалось употребление (систематическое - по назначению врача, или эпизодическое -при болях различного характера) нестероидных противовоспалительных препаратов.

В процессе исследования было сформировано 2 группы больных, основанием для разделения всей изучаемой выборки на две группы послужило обнаружение в биоптатах слизистой оболочки желудка микробных тел Helicobacter pylori. Таким образом, I группу составили пациенты, у которых при микроскопии гистологических препаратов, полученных при проведении биопсии, выявлены микробные тела Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка (n=55); II группа была образована пациентами, у которых при гистологическом исследовании образцов СОЖ при окрашивании метиленовым синим не удалось выявить Helicobacter pylori (п=32). При дополнительном изучении анамнеза пациентов выявлено, что систематическое употребление НПВП отмечали 12 пациентов I группы и 29 пациентов II группы.

Группу сравнения (гистологическая норма СОЖ) составили 22 человека, погибших в результате несчастных случаев от причин, не связанных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Также объектом исследования явилась сыворотка крови больных, которую забирали одновременно с проведением эндоскопического исследования и забором гистологического материала. Серологически обследовано 39 человек: 15 больных с геликобактерным гастритом, подтвержденным бактериологическими, серологическими и гистологическими методами исследований; 15 человек с хроническим негеликобактерным гастритом. Группу сравнения составили 9 здоровых добровольцев, не имевших в анамнезе и на момент обследования заболеваний органов желудочно-кишечного тракта.

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Пермской государственной медицинской академии имени академика Е.А. Вагнера. Пациенты были ознакомлены с целью и программой обследования, что было зарегистрировано в информированном согласии пациентов на участии в исследовании и публикацию его результатов в открытой печати. Все исследования проведены в соответствие с Хельсинской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (рекомендациями для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях), пересмотренной на 48-й Генеральной Ассамблее, Сомерсет Уэст, ЮАР, октябрь 1996 г., с дополнениями от 2000 г., Основами Законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан», Приказом МЗ РФ № 266 от 19.07.03 г. «Об утверждении правил клинической практики в Российской Федерации», Национальным

стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика», 2005 г.

Для точной верификации диагноза и определения распространенности патологического процесса в СОЖ всем пациентам выборки проводилась фиброэзофагогастродуоденоскопия (ФЭГДС) при помощи фиброгастроскопа «Olympus» (Япония) под местной анестезией 5%-5,0 мл раствором новокаина с прицельной биопсией СОЖ. Образцы получали из антрального и фундального отделов желудка (по одному биоптату).

Стерилизацию инструментов, исключающую дополнительную контаминацию биоптатов, проводили в соответствии с Федеральным Законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г., № 52-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, № 14, с. 1650), «Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденным Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г., № 554 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, № 31, с. 3295), СанПиН (С.П. 3.1.125-03, МУ3.5 1937-04 «Дезинфектология, очистка, дезинфекция и стерилизация эндоскопов и инструментов к ним, МУ от 04.03.2004 № 35.1937-04, Постановление главного санитарного врача РФ от 04.03.2004).

Идентификацию Я.ду/ои'-инфекции проводили с использованием гистобактериоскопического метода. Также инфицирование пациентов Helicobacter pylori подтверждали серологически, выявляя суммарные антитела (IgM, IgA и IgG) к антигену CagA Helicobacter pylori в сыворотке крови. Использовали набор реагентов D-3752 для иммуноферментного выявления суммарных антител к антигену CagA Helicobacter pylori (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Новосибирск, Россия).

Морфологическое исследование гастробиоптатов проводилось с учетом рекомендаций модифицированной Сиднейской классификации ХГ [Аруин Л.И., 2002] и методических рекомендаций «Морфологическая диагностика гастрита на биопсийном материале» [Кокшаров В.Н., 2007]. Гистологическое исследование гастробиоптатов проводили в соответствие со стандартными методиками; для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей, приготовленные общепринятыми методами [Ромейс Б., 1954; Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Методы окрашивания депарафинированных срезов для световой микроскопии, использованные в работе, приведены в табл. 1.

Морфометрический анализ включал измерение толщины слизистой оболочки и ее составляющих - эпителия, собственной (lamina propria) и мышечной пластинок (lamina muscularis) слизистой оболочки, измерение глубины желудочных ямок, подсчет количества главных (ГК) и обкладочных (OK) клеток на единицу фундальных желез слизистой оболочки [Аджисалиев Г.Р., Пикалкж B.C., 2008], а также измерение площади сечения (S) и диаметра (D) обкладочных клеток, измерение площади сечения (Sn) и диаметра (Dn) ядер

обкладочных клеток (париетальных экзокриноцитов) [Terminología hystologica, 2009]..

Таблица 1

Гистологические и гистохимические методы, использованные для светооптического исследования образцов слизистой оболочки желудка пациентов

Методика окрашивания Выявляемые гистологические структуры Количество препаратов

Гематоксилином и эозином Обзорная микроскопия 218

Пикрофуксином по ван Гизону Коллагеновые волокна, гладкомышечные клетки 218

ШИК-реакция с постановкой контрольных реакций (диастаза) Выявление нейтральных муцинов 218

Альциановый синий (рН 2,5) Выявление кислых несульфатиро-ванных гликозаминогликанов 218

Альциановым синим (рН 0,5-1,0) Селективная идентификация сульфомуцинов 218

Метиленовым синим Визуализация микробных тел Н. pylori 218

В полученных образцах иммуногистохимическими методами исследовали экспрессию белка р53, Fas Ligand (FasL), фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а, TNF-а), нуклеарного фактора каппа В (NFkB), трансформирующего фактора pocTa-ß3 (TGF-ß3), рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR), а также экспрессию гастрина G-клетками. Результаты реакции оценивались полуколичественным методом [Коган Е.А. и др., 2011]. Количество G-клеток, вырабатывающих гастрин, в эпителии СОЖ подсчитывали на тестовой площади 0,042 мм . Иммуногистохимические исследования выполнены по стандартным протоколам с использованием полного диагностического набора компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенного для проведения экспериментальных исследований и системы визуализации KP50L (Diagnostic BioSystems, USA). Парафиновые срезы докрашивали гематоксилином Майера, наклеивали на стекла, обработанные специализированным адгезивным покрытием (Diagnostic BioSystems, USA). Использовали позитивные контроли, рекомендованные фирмой-производителем. Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании, приведена в табл. 2.

Уровень TGF-ßl в сыворотке крови исследовали в течение 48 ч от момента поступления больных в стационар с помощью твердофазного метода иммуноферментного анализа. Использовали «Иммуноферментный набор для количественного определения человеческого TGF-ßl в человеческой сыворотке, плазме, моче и супернатанте культур клеток», кат. № BMS249/3 TGF-ßl (Bender MedSystems, ЗАО «БиоХимМак», Москва, Россия), предназначенный для исследовательских целей и иммуноферментный анализатор STAT FAX 2100 (Германия).

Таблица 2

Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании

МКАТ/ПКАТ* Клон Рабочее разведение Количество выполненных исследований

NFkB р65 Polyclonal antibody 1 50 109

TNF-а Clone: 28401.111 1 50 109

EGFR Clone: SP9 1 50 109

TGFß3 Polyclonal antibody 1 50 109

р53 Clone: SP5 1 50 109

Gastrin Polyclonal antibody 1 50 109

Fas Ligand Polyclonal antibody 1 50 109

* моноклональные антитела/поликлональные антитела

Уровень гастрина-17 (тип I) в сыворотке крови пациентов исследовали методом твердофазного иммунохемилюминесцентного анализа, используя набор реагентов IMMULITE® 2000 Gastrin для количественного определения гастрина-17 в образцах сыворотки (S-G-17) крови человека и автоматический иммунохемилюминесцентный анализатор IMMULITE® 2000 XPi фирмы Siemens Healthcare Diagnostics Inc, США.

Статистический анализ выполнен при помощи приложения Microsoft® Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007 и программного пакета Biostat [Гланц С., 1999]. За критический уровень значимости выявленных различий принимали значение р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении эндоскопического исследования диагноз «хронический гастрит» был поставлен всем пациентам. Патология пищевода в форме рефлюкс-эзофагита была обнаружена у 6 пациентов (6,89%), недостаточность привратника и дуоденогастральный рефлюкс (ДГР) - у 4,59% больных.

При микроскопическом исследовании образцов СОЖ, окрашенных метиленовым синим, микробные тела Helicobacter pylori выявлены в слизистой оболочке и - в отдельных случаях - в подслизистой основе, а также в слизи, покрывающей покровно-ямочный эпителий, у 55 из обследованных пациентов (63,22%), что послужило основанием для разделения всей изучаемой выборки на две группы.

При исследования гастробиоптатов с учетом рекомендаций модифицированной Сиднейской классификации ХГ [Аруин Л.И., 2002] установлено, что у больных с выявляемыми в СОЖ микробными телами Helicobacter pylori выявлялась морфологическая картина, типичная для геликобактерного гастрита (тип В), а также преимущественно II степень тяжести ХГ, II и III степень активности воспалительного процесса в СОЖ и наличие II и III типов кищечной метаплазии.

У пациентов с негеликобактерным гастритом наблюдалась несколько иная морфологическая картина патологических изменений в СОЖ; в данной группе

больных в слизистой оболочке желудка превалировали гистоморфологические изменения, типичные для ХГ, обусловленного химическими факторами (тип С) [Комптон К.К., 1998]: гиперплазия клеток ямочного эпителия, гиперплазия гладкомышечных клеток в мышечной пластинке СОЖ, инфильтрация эозинофилами глубоких слоев СОЖ, наличие язв и эрозий. Поскольку на этапе сбора анамнеза мы исключали из изучаемой выборки больных, злоупотребляющих алкоголем и курящих, можно предположить, что в этой группе ХГ, по-видимому, обусловлен приемом лекарственных препаратов и, прежде всего, нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП). У большинства пациентов (56,24%; р<0,05 по сравнению с группой I) выявлена I степень тяжести ХГ и I степень активности воспалительного процесса в СОЖ (62,5%; р<0,05 по сравнению с группой I). У небольшого количества пациентов (15,38%) выявлена неполная кишечная метаплазия (II тип).

При проведении морфометрических исследований гастробиоптатов установлено, что в группе пациентов с негеликобактерным ХГ отмечалось статистически значимое (по сравнению с гистологической нормой) увеличение средних размеров париетальных экзокриноцитов на фоне неизменных размеров их ядер, то есть, их гиперплазия.

При проведении гистохимических исследований при окрашивании ШИК в СОЖ пациентов группы сравнения интенсивная реакция выявлялась в эпителиальных клетках в области желудочных ямок и шеек желудочных желез. Отношение ШИК-реакции к диастазе позволяло считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины, что не противоречит литературным данным [Лининг Д.А., 2006; Вусик М.В. и др., 2006]. У пациентов с геликобактерным ХГ нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ) выявлялись в большинстве случаев (90,91%) не только в покровно-ямочном эпителии, но и в эпителии глубоких отделов желез. В группе больных с негеликобактерным ХГ нарушение зонального распределения нейтральных ГАГ выявлено в 75% случаев.

Кислые ГАГ (сиаломуцины) в эпителии СОЖ группы сравнения не выявлялись. У пациентов с геликобактерным ХГ мы выявляли кислые ГАГ в клетках ямочного эпителия и эпителия желудочных желез как один из признаков кишечной метаплазии эпителиоцитов в 63,64% случаев. У пациентов с негеликобактерным ХГ ввиду того, что кишечная метаплазия в данной клинической группе встречалась значительно реже, кислые ГАГ в эпителии СОЖ выявлялись у 12,5% больных. Сульфомуцины выявляли исключительно в группе больных с геликобактерным гастритом в 16,34% случаев. Таким образом, гистохимические исследования образцов СОЖ выявили нарушение зонального распределения муцинов в эпителии СОЖ как у пациентов геликобактерным, так и с негеликобактерным ХГ, однако, в группе больных с ХГ, обусловленным инфицированием Helicobacter pylori, эти изменения наблюдались у большего числа больных и проявлялись не только в перераспределении нейтральных муцинов в СОЖ, но и в появлении кислых

(сиаломуцины) и сульфатированных ГАГ (сульфомуцины) в эпителиальных клетках.

Проводя иммуногистохимические исследования, мы стремились изучить механизм апоптотической гибели клеток СОЖ при хроническом гастрите.

В группе сравнения (гистологическая норма образцов СОЖ) ТОТ-а-позитивные эпителиоциты обнаруживались лишь в качестве единичных слабоокрашенных клеток. У больных с ХГ (как с Нр+, так и с Нр-) мы наблюдали значительное увеличение количества ТОТ-а-позитивных эпителиоцитов, особенно в дне желудочных желез (табл. 3). То есть, опираясь на полученные данные, можно говорить о том, что при хроническом гастрите имеет место апоптоз эпителиоцитов СОЖ, обусловленный действием провоспалительных цитокинов. То, что в обеих клинических группах в эпителиоцитах ямок маркер обнаруживался в небольшом проценте случаев, свидетельствует о том, что клетки поверхностного эпителия гибнут, преимущественно, по типу некроза под непосредственным воздействием повреждающих факторов, особенно при негеликобактерном ХГ, а не по типу апоптоза.

Таблица 3

Количество ТОТ-а-позитивных клеток в СОЖ пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)__

Клиническая группа Количество TNF-a-позитивных клеток в дне желез, %, М±ш Количество TNF-a-позитивных клеток в теле желез, %, М±ш Количество TNF-a-позитивных клеток в шейках желез и желудочных ямках, %, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 2,2±0,35 2,7±0,21 3,5±0,18

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 71,7±3,35* 59,2±6,78* 3,9±1,55

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 86,5±5,92* 78,4±5,78* 12,9±2,81*

Примечание: * - по отношению к количеству TNF-a-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому t критерию; р<0,05

При исследовании экспрессии Fas Ligand в клетках СОЖ пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ выявлено, что в обеих клинических группах выявлялась выраженная экспрессия маркера в эпителиоцитах тела и дна желудочных желез на фоне практически полного ее отсутствия в препаратах СОЖ пациентов группы сравнения (табл. 4). Эти данные свидетельствуют о важной роли в апоптозе эпителиоцитов желудка апоптоза, опосредованного взаимодействием FasL с Fas-рецепторами, что согласуется с

результатами, полученными при исследовании экспрессии Т№-а, и подтверждает значимость в патогенезе ХГ апоптоза, индуцированного внешними негативными факторами.

Таблица 4

Количество РавЬ-позитивных клеток в СО Ж пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)__

Клиническая группа Количество FasL -позитивных клеток в дне •желез, %, М±ш Количество FasL -позитивных клеток в теле желез, %, М±ш Количество FasL -позитивных клеток в шейках желез н желудочных ямках, %, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 0,8±0,14 0,9±0,21 1,2±0,32

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 38,9±4,48* 28,7±2,24* 6,7±0,83*

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 33,1±3,67* 22,8±4,71 * 4,8±1,12*

Примечание: * - по отношению к количеству РаэЬ-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому I критерию; р<0,05

Во всех препаратах СОЖ пациентов группы сравнения и пациентов с негеликобактерным ХГ выявлен низкий уровень экспрессии субъединицы р65 ОТкВ. Маркер выявлялся в цитоплазме единичных клеток и не обнаруживался в клеточных ядрах, что говорит о его неактивном (связанном) состоянии. Поэтому выявление достоверно большей выраженности экспрессии этого маркера в клетках СОЖ пациентов с геликобактерным ХГ и обнаружение его в клеточных ядрах свидетельствует об активации ИРкВ у ряда больных этой группы (табл. 5, рис. 1).

Таблица 5

Количество ОТкВ-позитивных клеток в СОЖ пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)__

Клиническая группа Количество NFkB-позитивных клеток в дне желез, %, М±ш Количество NFkB-познтивных клеток в теле желез, %, М±т Количество NFkB-позитив-ных клеток в шейках желез и желудочных ямках, %, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 2,2±0,12 0,8±0,18 1,43 ±0,14

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 12,9±2,32* 8,9±1,34* 3,95±0,18*

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 2,3±0,01 1,01±0,01 0,47±0,01

Примечание: * - по отношению к количеству №кВ-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому I критерию; р<0,05

Рис. 1. Большое количество NFkB-позитивных ядер в эпителиоцитах желез желудка пациента с геликобактерным ХГ х 1500

Что касается экспрессии белка р53, являющегося, как и NFkB, транскрипционным фактором, установлено, что в группе с нормальной гистологической картиной СОЖ так же, как и в клинической группе с ХГ, обусловленном инфицированием Helicobacter pylori, в эпителии СОЖ выявлялись единичные клетки с окрашенными ядрами. Тем не менее, в СОЖ пациентов с негеликобактерным ХГ наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии этого маркера (табл. 6).

Таблица 6

Количество р53-позитивных клеток в СОЖ пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500) _

Клиническая группа Количество р53-позитивных клеток в дне желез, %, М±ш Количество р53-позитивиых клеток в теле желез, %, М±ш Количество р53-позитивных клеток в шейках желез и желудочных ямках, %, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 0,22±0,002 0,28±0,13 0,33±0,11

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 1,33±0,006 0,29±0,001 0,29±0,09

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 5,45±0,006* 4,534±0,002* 0,43±0,12

Примечание: * - по отношению к количеству ТОР-рЗ-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому I критерию; р<0,05;

# - по отношению к количеству TGF-рЗ-позитивных клеток в СОЖ у пациентов с геликобактерным ХГ, по непараметрическому t критерию; р<0,05

Таким образом, сопоставляя полученные данные, можно утверждать, что в патогенезе ХГ, обусловленного инфицированием Helicobacter pylori, и негеликобактерного ХГ значимую роль играет апоптоз, запускаемый посредством активации провоспалительными цитокинами соответствующих рецепторов. В то же время, для негеликобактерного ХГ определенное значение имеет и апоптоз, обусловленный нарушениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53.

Тем не менее, мы считаем, что роль TNF-a в патогенезе заболевания у пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ неоднозначна. У пациентов с негеликобактерным ХГ мы выявили одновременное повышение уровня экспрессии белка р53. Известно, что белок р53 стимулирует гены ряда «киллерных» рецепторов, то есть рецепторов, воспринимающих команду об апоптозе (в частности, Fas-рецептор), что повышает чувствительность клетки к соответствующим сигналам; тем не менее, на сегодняшний день пока нет данных об аналогичных рецепторах TNF и ряда других сходных факторов [Мушкамбаров H.H., Кузнецов C.JL, 2007]. По-видимому, в патогенезе негеликобактерного гастрита указанный механизм может играть определенную роль.

У больных с геликобактерным ХГ мы не выявили статистически значимого повышения уровня экспрессии р53, но при этом в данной группе больных отмечался высокий уровень экспрессии субъединицы р65 NFkB и признаки его активации (ядерная локализация), в отличие от группы больных с негеликобактерным ХГ, в которой экспрессия этого маркера была крайне низкой. Известно, что TNF-a может при определенных условиях активировать NFkB, что, в свою очередь, запускает в СОЖ процессы репарации посредством синтеза TFF1 [Koike Т. et а1., 2007]. То есть в этой группе больных TNF-a посредством активации NFkB-сигнального пути способствует выживанию клеток в условиях воспалительного процесса. На сегодняшний день в зарубежной литературе имеются немногочисленные данные относительно того, что TNF-альфа может способствовать длительной выживаемости клеток при воспалении путем подавления Fas-опосредованного апоптоза, и этот процесс связан с трансактивацией NFkB и подавлением активности каспаз [Qin Y. et al., 2007]. Выявленные в работе закономерности могут выступать в поддержку этой гипотезы.

В группе сравнения в эпителии СОЖ выявлялись единичные TGF-ß3-позитивные клетки, в то время как в обеих клинических группах (с геликобактерным и негеликобактерным ХГ) отмечалось статистически значимое увеличение экспрессии этого маркера. Тем не менее, в группе пациентов с геликобактерным ХГ экспрессия TGF-ß3 в СОЖ была достоверно менее выражена, нежели у пациентов с негеликобактерным ХГ (табл. 7, рис. 2,3).

TGF-бета относятся к факторам, подающим клеткам сигнал о необходимости остановить деление, он ингибирует клеточную пролиферацию и способствует дифференцировке клеток, особенно клеток СОЖ - через пара- и

Примечание:* р<0,05 по отношению к количеству ТвР-рЗ-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому I критерию; р<0,05,

# р<0,05 по отношению к количеству ТОР-рЗ-позитивных клеток в СОЖ у пациентов с геликобактерным ХГ, по непараметрическому I критерию; р<0,05

аутокринные ростовые факторы [Aubin J. Et al., 2002; de Andrade Sa E.R. et al., 2003]. Таким образом, в патогенезе негеликобактерного ХГ имеет значение не только гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза, но и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-Р (TGF-P).

Таблица 7

Количество ТОР-рЗ-позитивных клеток в СОЖ пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)__

Клиническая группа Количество TGF-РЗ-ИОЗИТИВНЫХ клеток в дне желез, %, М±т Количество TGF-ß3-позитивных клеток в теле желез, %, М±т Количество TGF-ß3-позитивных клеток в шейках желез и желудочных ямках, %, М±т

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 2,2±0,19 0,82±0,12 0,38±0,01

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 28,1±2,52* 22,6± 1,86* 4,85±0,96*

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 78,9±2,27*# 55,2±4,65*# 13,96±1,55*

Рис. 2. Большое количество ТСР-рЗ-позитив-ных клеток в дне желудочных желез в СОЖ пациента с негеликобактерным ХГ х 600

Рис. 3. Экспрессия ТОР-рЗ в клетках эпителия СОЖ в дне желудочных желез у пациента с геликобактерным ХГ х 600

При исследовании экспрессии рецептора эпидермального фактора роста (ЕОРЯ) установлено, что в группе сравнения в эпителии СОЖ выявлялись единичные клетки с окрашенной цитоплазмой. Между тем, у пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ экспрессия этого маркера была достаточно интенсивной. При этом у пациентов с геликобактерным ХГ экспрессия ЕОИ1 была статистически значимо более выражена, чем у больных с негеликобактерным ХГ (табл. 8).

Таблица 8

Количество ЕОРЯ-позитивных клеток в СОЖ пациентов с ХГ (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)__

Клиническая группа Количество EGFR-позитивных клеток в дне желез, %, М±т Количество EGFR-позитивных клеток в теле желез, %, М±т Количество EGFR-позитивных клеток в шейках желез и желудочных ямках, %, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма) (п=22) 1,98±0,13 1,22±0,67 1,19±0,34

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 62,01±8,55*# 44,7±2,56*# 7,32±1,19*

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 36,35±4,22* 21,22±3,28* 5,41±1,78*

Примечание: * - по отношению к количеству EGFR-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ у пациентов группы сравнения, по непараметрическому t критерию; р<0,05,

# - по отношению к количеству EGFR-позитивных клеток в СОЖ у пациентов с негеликобактерным ХГ, по непараметрнческому t критерию; р<0,05

То есть, в патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации не только NFkB-сигнального пути, но и рецептора эпидермального фактора роста. Известно, что при ХГ, обусловленном Helicobacter pylori, многие вирулентные штаммы бактерий способны активировать рецептор к эпидермальному фактору роста (EGFR) [Yokoyama К. et al., 2005], так как помимо инициации процессов воспаления посредством активации провоспалительных цитокинов, инфицирование Helicobacter pylori сопровождается активацией многих ростовых факторов [Malfertheiner P. et al., 2006; Казимирова А.А., 2009]. Вместе с тем, EGF не только стимулирует клеточную пролиферацию, но и угнетает процессы дифференцировки в эпителии СОЖ [Степанов И.В. и др., 2010].

Иммуногистохимическими методами проведено также определение экспрессии гастрина в G-клетках дисперсной эндокринной системы (ДЭС) желудочно-кишечного тракта, локализующихся в СОЖ. Установлено, что количество G-клеток, вырабатывающих гастрин, в эпителии СОЖ на тестовой

площади у пациентов с ХГ - как с геликобактерным (тип В), так и с негеликобактерным (тип С) статистически значимо превышало количество О-клеток в СОЖ в группе сравнения (гистологическая норма). При этом у пациентов с негеликобактерным ХГ отмечались более высокие показатели (табл. 9).

Таблица 9

Количество G-клеток, вырабатывающих гастрин, в эпителии СОЖ (на тестовой площади 0,042 мм2)__

Клиническая группа Количество G-клеток, п, М±ш

Группа сравнения (гистологическая норма СОЖ), п=22 5,8±1,01

Пациенты с геликобактерным ХГ (п=55) 11,5±0,26*

Пациенты с негеликобактерным ХГ (п=32) 14,6±0,12*

Примечание:* - по сравнению с группой сравнения, по непараметрическому t критерию; р<0,05

При проведении серологических исследований мы получили статистически значимые отличия между уровнем TGF-ßl в сыворотке здоровых доноров и в сыворотке крови больных с хроническим гастритом - как геликобактерным (тип В), так и негеликобактерным (тип С). Статистически значимые отличия выявлены и при сравнении двух клинических групп - уровень TGF-ßl был достоверно выше в сыворотке крови пациентов с хроническим гастритом, обусловленным геликобактерной инфекцией. Возможно, выявленное в наших исследованиях повышение уровня TGF-ßl в сыворотке крови пациентов с геликобактерным гастритом обусловлено более выраженной воспалительной реакцией в СОЖ, активным участием лимфоцитов в воспалении при инфицировании Helicobacter pylori [Levings М.К., Roncarolo M.G., 2000].

Таблица 10

Уровень ТОР-р1 в сыворотке крови (пг/мл) обследуемых больных и здоровых доноров__

Категория обследуемых Уровень TGF-ßl в сыворотке, пг/мл Р

Здоровые доноры' 13930±636,6

Пациенты с геликобактерным гастритом2 37330±426,9 pl/p2<0,05, Т=40

Пациенты с негеликобактерным гастритом3 16020±414,9 pl/p3<0,05, Т=12,5 р2/рЗ<0,05, Т=40

При сравнении всех трех выборок р<0,05 (р=0,013)

Таблица 11

Уровень гастрина-17 в сыворотке крови (пг/мл) обследуемых больных и здоровых доноров___

Категория обследуемых лиц Уровень гастрина-17 в сыворотке, пг/мл Р

Здоровые доноры1 61,53±12,72

Пациенты с геликобактерным гастритом2 46,4±3,076 pl/p2>0,05, Т=16,5

Пациенты с негеликобактерным гастритом3 113,6±10,78 pl/p3>0,05, Т=7,8 р2/рЗ<0,05, Т=40

При сравнении всех трех выборок р<0,05 (р=0,016, Н=8,2)

Установлено, что у пациентов с геликобактерным ХГ отмечались низкие средние значения уровня гастрина-17 в сыворотке крови (по сравнению с нормой). У больных с гастритом типа С — значения, превышающие как нормальный уровень, так и уровень гастрина-17 в группе пациентов с геликобактерным ХГ (табл. 11).

Согласно данным отечественных и зарубежных авторов, НПВП оказывают стимулирующее влияние на процессы секреции соляной кислоты, пепсиногена [Шептулин А.А., 2006], гистамина [Peterson W.L., 1996]. Все эти факты подводят нас к мысли о том, что НПВП, прежде всего, оказывают стимулирующее влияние на секрецию гастрина, так как все вышеперечисленные эффекты могут быть объяснены его действием на клетки слизистой оболочки желудка. На сегодняшний день в литературе имеются данные относительно того, что прием НПВП приводит к повышенной секреции гастрина [Salih В. et al„ 2007; Martin D.F. et al., 2008; Abdul-Aziz K.K., 2011].

По-видимому, выявленные закономерности в различных уровнях сывороточного гастрина у пациентов с хроническим гастритом могут быть объяснены именно с этих позиций.

Подводя итоги, можно отметить, что выявленные морфологические различия при хроническом геликобактерном и негеликобактерном гастрите являются отражением особенностей патогенеза этих двух форм гастрита. Разнонаправленные изменения, возникающие в клетках слизистой оболочки желудка при развитии хронического воспаления под действием либо Helicobacter pylori, либо химически агрессивных факторов, и отражающие различные варианты течения реактивных процессов в СОЖ, определяют принципиально разные пути прогрессирования заболевания у пациентов.

ВЫВОДЫ:

1. При сравнении характера патологических изменений в СОЖ пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным (тип С) гастритом в соответствии с рекомендациями модифицированной Сиднейской классификации ХГ выявлены статистически значимые различия: у

пациентов с геликобактерным гастритом преимущественно отмечается II степень тяжести ХГ, II и III степень активности воспалительного процесса в СОЖ и наличие II типа кишечной метаплазии; у пациентов с негеликобактерным ХГ - I степень тяжести ХГ и I степень активности воспалительного процесса в СОЖ.

2. При хроническом гастрите, обусловленным инфицированием Helicobacter pylori, наблюдается не только перераспределение нейтральных муцинов в СОЖ, но и выявление в значительном проценте случаев кислых (сиаломуцины) и сульфатированных ГАГ (сульфомуцины) в эпителиальных клетках.

3. У пациентов с геликобактерным гастритом отмечается повышение уровня TGF-ßl в сыворотке крови, что обусловлено выраженной воспалительной реакцией в СОЖ, активным участием лимфоцитов в воспалении при инфицировании Helicobacter pylori; у пациентов с негеликобактерным гастритом - повышение уровня гастрина-17, что объясняется пролиферацией G-клеток ДЭС, подтвержденной иммуногистохимическими методами исследований.

4. Апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне, в частности, FasL и TNF-a, значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ; вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный нарушениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53

5. В патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и NFkB-сигнального пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ - гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-ß (TGF-ß).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Установленные в исследованиях иммуногистохимические признаки геликобактерного и негеликобактерного ХГ дают возможность применения полученных закономерностей на практике - в качестве дополнительных диагностических критериев при исследовании гастробиоптатов пациентов с хроническим гастритом.

2. Выявленные изменения сывороточных уровней TGF-ßl и гастрина-17 у пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным ХГ (тип С) определяют целесообразность включения в комплексную программу обследования больных с хроническим гастритом исследование TGF-ßl и гастрина-17 в сыворотке крови.

Список сокращений, использованных в автореферате

ГАГ гл икозаминогл и каны

ДГР дуоденогастральный рефлюкс

нпвп нестероидные противовоспалительные средства

сож слизистая оболочка желудка

ФНО-а фактор некроза опухоли-a

ХГ хронический гастрит

ЭФР эпидермальный фактор роста

EGF эпидермальный фактор роста

EGFR рецептор к эпидермальному фактору роста

FasL Fas Ligand, Fas лиганд

NFkB нуклеарный фактор каппа-В

р53 белок р53

TFF1 трефоиловый пептид TFF1

TGF-P трансформирующий фактор роста-бета

TNF-a фактор некроза опухоли-альфа

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Результаты морфометрических исследований слизистой оболочки желудка пациентов с хроническим гастритом / C.B. Никитин, П.В. Косарева, Е.И. Са-моделкин и др. // Вест. Урал. мед. академ. науки № 2 (39). - Екатеринбург, 2012. - С.91-92.

2. Современные особенности хронического геликобактерного гастрита (по данным биопсийного материала / C.B. Никитин // Мед. альманах. - 2012. - № 4 - С. 54-57.

3. Нарушение зонального распределения муцинов в эпителии слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим гастритом / C.B. Никитин // Перм. мед. жури,- 2012. - Том 30, № 2, - С. 76-78.

4. Результаты гистохимических исследований слизистой оболочки желудка при хроническом гастродуодените /C.B. Никитин, Н.И. Аверьянова, П.В. Косарева и др. //Материалы науч. сес. ПГМА.-Пермь, 2011. С.- 138-140.

5. Гистологические изменения слизистой оболочки желудка / C.B. Никитин, Г.Д. Федоровых // Молодежная наука 2011: техно-л., инновац. Матер. Всерос. науч.- практ. конф. молод, учен., аспир., и студ.16-17 марта 2011, Ч. 1. - Пермь, 2011.-С. 225-229.

6. Исследование экспрессии маркеров апоптоза в эпителии слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим гастритом/ C.B. Никитин, П.В. Косарева, Е.И. Самоделкин, Н.В. Ложкина// Материалы науч. сес. ПГМА. -Пермь, 2012.-С,- 67-70.

7. Оценка гистологических изменений слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите В и С (по данным биопсийного материала / C.B. Ники-

тин, Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева // Материалы науч. сес. ПГМА. - Пермь, 2012.-С.-71-74.

8. Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров апоптоза в эпителии СОЖ пациентов с хроническим гастритом позиций / Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева, C.B. Никитин и др. // ИННОВАЦИИ АГРАРНОЙ НАУКИ -ПРЕДПРИЯТИЯМ АПК: Материалы Междунар. научно-практ. конф. (Пермь, 24-25 апреля 2012 года), Часть 3. - ПГСХА, 2012. - С. 207-212.

9. Иммуногистохимическое исследование экспрессии факторов регуляции клеточного цикла в эпителии СОЖ пациентов с хроническим гастритом позиций / Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева, C.B. Никитин и др. // ИННОВАЦИИ АГРАРНОЙ НАУКИ - ПРЕДПРИЯТИЯМ АПК: Материалы Междунар. научно-практ. конф. (Пермь, 24-25 апреля 2012 года), Часть 3. - ПГСХА, Пермь, 2012. -С. 213-217.

10. Морфология хронического гастрита с этиологических позиций / Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева, C.B. Никитин и др. // ИННОВАЦИИ АГРАРНОЙ НАУКИ -ПРЕДПРИЯТИЯМ АПК: Материалы Междунар. научно-практ. конф. (Пермь, 24-25 апреля 2012 года), Часть 3. - ПГСХА, Пермь, 2012. - С. 218-223.

Подписано в печать 25.04.2012. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1363/2012.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства Пермского национального исследовательского политехнического университета. Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113. Тел. (342)219-80-33.

Актуальность проблемы. В настоящее время в структуре хронических заболеваний органов пищеварения одно из первых мест занимают неэрозивные и эрозивно-язвенные поражения верхних отделов желудочно-кишечного тракта - хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь [10]. По частоте распространения и патогенетической связи с язвенной болезнью и раком желудка* хронический гастрит является одной из основных медико-социальных проблем современного общества [41; 57].

Хронический гастрит (ХГ) - понятие полиэтиологическое, в его , развитии участвуют различные экзогенные и эндогенные факторы. При этом морфологические изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ) и патогенез хронического гастрита для каждой из его форм имеют свои особенности [35]. К настоящему времени достаточно полно исследован характер морфологических изменений в СОЖ, сопровождающих различные формы ХГ, охарактеризованы воспалительные процессы, определено участие в них многих провоспалительных цитокинов. Вместе с тем, данные, касающиеся этого вопроса, на сегодняшний день неполные, нередко противоречат друг другу, что определяет актуальность дальнейших исследований в этой-области.

При хроническом гастрите реактивные процессы наряду с хроническим воспалением СОЖ включают также дистрофические (дегенеративные) и дисрегенераторные изменения, то есть нарушение процесса клеточного обновления [65; 50].

Известно, что как при Helicobacter /ту/ог/'-нндуцированном гастрите (тип В), так и при химическом гастрите (тип С) имеют место не только пролиферация эпителиоцитов, но и их усиленный апоптоз, активация которого может быть опосредована различными экзогенными и эндогенными факторами [183; 112; 120; 66; 126; 144; 119; 170; 75; 103].

В целом, на сегодняшний день имеется большое количество работ, посвященных изучению апоптоза в многоклеточном организме. Тем не менее, сведения о роли апоптоза в патогенезе хронического гастрита неполные, процессы апоптоза при разных формах хронического гастрита недостаточно изучены. Вместе с тем, в настоящее время изучение механизмов апоптоза при различной патологии привлекает внимание многих исследователей в связи с возможностью направленного воздействия на выявленные процессы. Изучение механизмов запуска процессов апоптоза при различной патологии может играть ключевую роль в понимании патогенеза того или иного заболевания и разработке на основе полученных данных оптимальных путей терапии. В связи с чем, исследование путей инициации апоптоза при изучаемой* патологии - хроническом гастрите, также представляется интересным и актуальным.

Известно, что все пусковые факторы апоптоза можно свести к двум моментам - «апоптозу изнутри», включающемуся? при нарушениях в самой клетке, и «апоптозу по> команде», возникающему вследствие негативной сигнализации снаружи, передающейся через специальные рецепторы [36]. При «апоптозе изнутри» пусковым фактором являются чрезмерные (нерепарируемые) повреждения хромосом и серьезные повреждения внутриклеточных мембран (особенно митохондриальных) [85]. I

Конформация* ДНК может нарушаться под воздействием как внешних факторов, так и под воздействием экзогенно образующихся^ при стрессовых ситуациях соединений (оксида азота, супероксидного радикала и пр.), а также при нарушениях питания, клетки; при этом во всех случаях «апоптоз изнутри» реализуется через белок р53 [91]. Белок р53 наиболее известен среди большого» числа открытых к настоящему времени транскрипционных факторов [174]. Это объясняется тем, что он контролирует исключительно важные клеточные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количество различных регуляторных цепей [174]. Другим не менее важным транскрипционным фактором, влияющим на активность генов апоптоза, является нуклеарный фактор каппа В (№1<сВ) [165].

Через посредничество белка р53 клетка в ответ на повреждения своей структуры либо задерживается на той или иной стадии митотического цикла и исправляет выявленные повреждения, либо (при невозможности исправлений) полностью прекращает деления и вступает в процесс клеточного старения, либо (при потенциальной опасности поврежденной клетки для ее окружения) осуществляет апоптоз [156].

Белок р53 стимулирует гены ряда «киллерных» рецепторов - Fas рецептор и рецептор KILLER/DR5, что повышает чувствительность клетки к соответствующим сигналам [36]. Тем не менее, на сегодняшний день пока нет данных об аналогичных рецепторах актора некроза опухоли (ФНО, TNF) и ряда других сходных факторов.

В случае «апоптоза по команде» процесс апоптоза вызывается внешней «негативной» сигнализацией, передающейся через мембранные (реже через ■ внутриклеточные) рецепторы [36]. Посредством «апоптоза по команде» в патологических условиях осуществляется элиминация клеток, содержащих на поверхности рецептор Rl-ФНОа к провоспалительному цитокину ФНО-а [178].

Также одним из внешних факторов, запускающих в клетке апоптоз, является лиганд белка CD95 (Fas/APO-1) - Fas лиганд (FasL) [20]. Это интегральный белок мембраны, который может выходить во внеклеточную среду и действовать как растворимый цитокин (фактор роста) [143]. FasL является цитокином и относится к семейству TNF [142]. Аминокислотная последовательность FasL имеет значительную гомологию с TNF -цитокином.

FasL экспрессируется преимущественно в активированных лимфоцитах и NK-клетках (натуральных киллерах). Он существует в двух формах -нерастворимый или мембраносвязанный FasL (mFasL, mFas/mCD95) и растворимый FasL (sFasL, sFas/CD95) [166]. Специфический ингибитор блокирует отщепление как TNF, так и FasL, что заставляет предположить, что один и тот же фермент участвует в процессинге растворимых TNF и FasL [109, 16]. Рецептор к Fas Ligand обозначается как CD95 - Fas (CD95) протеин

- и является одним из рецепторов, инициирующих клеточную гибель. Молекула СБ95 экспрессируется на мембране клеток различных; типов, и участвует в передаче апоптотического сигнала.

Благодаря исследованиям последних лет удалось существенно пополнить знания о регуляции клеточного цикла. Между тем, эта информация очень важна, так как судьба делящихся клеток зависит от целого ряда обстоятельств — генетической программы, действия гистогормонов (цитокинов и факторов роста), влияния внешних факторов [36]. В результате этих влияний; клетка может вступить в процесс дифференцировки, подвергнуться апоптозу или бласттрансформации, то есть превратиться в опухолевую- клетку. Управление всеми этими процессами происходит на молекулярном уровне, то: есть за чисто морфологическими^явлениями стоит множество молекул-регуляторов, воспринимающих митогенные; сигналы и последовательно инициирующих строго определенные события [36]. Жизнь и смерть клетки являются соревнованием между белками-эффекторами, обладающими противоположными функциями [34].

Практически все сигнальные пути, регулирующие пролиферацию клеток, ориентированы на. комплексы (^-периода. При ., этом для: эпителиальных клеток важнейшим является: сигнальный; путь, относящийся к стволовым клеткам эпителия и начинающийся со связывания эпидермального фактора роста (ЭФР,Е6Р) [36] .

Среди, соединений, действующих как антимитогены, прежде всего, следует упомянуть ФНО: ФНО запускает в клетках сразу несколько, сигнальных путей, среди которых один содержит ферментативный каскад МАПК; при этом возбуждение соответствующего рецептора приводит к торможению МАПК, в результате чего пролиферативная активность уменьшается и деления прекращаются [36]. Действие ФНО через другие сигнальные пути будет инициировать апоптоз - известно, что апоптоз опухолевых и других клеток может инициироваться ФНО-а, взаимодействующим со специальным рецептором (Ш-ФНОа), имеющимся на поверхности многих клеток, после чего процесс апоптоза развивается каскадно с участием каспаз. Трансформирующий фактор роста-бета (ТФР-р, ТОБ-Р) также угнетает пролиферацию многих клеток; рецепторы ТОБ-р сходны по структуре с рецепторами эпидермального фактора роста (БОР) [36].

В процессе клеточного цикла состояние наследственного материала -хромосом подвергается постоянному контролю; устранение дефектов в наследственном материале клетки требует времени, вследствие чего происходит остановка клеточного цикла, в которой центральную роль играет белок р53, синтезирующийся в клетке постоянно, но в обычных условиях очень быстро разрушающийся [163]. При этом если повреждения хромосом достаточно велики и их исправление затягивается, то длительно сохраняющий высокую активность белок р53 начинает стимулировать (как транскрипционный фактор) серию генов, запускающих апоптоз, в результате чего в клетке начинает выполняться сложная программа самоуничтожения [36]. Таким образом, регуляция клеточного цикла в эпителиальных клетках и эффекты действия на эпителиоциты митогенных и антимитогенных факторов в настоящее время активно изучаются. Тем не менее, в литературе нам не встретилось данных, описывающих эти явления при хронических гастритах, что также определило актуальность исследований в этом направлении.

Цель - исследовать течение реактивных процессов в слизистой оболочке желудка при отдельных формах хронического гастрита.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку реактивных изменений (воспалительных, дегенеративных и дисрегенераторных) слизистой оболочки желудка у пациентов с геликобактерным и негеликобактерным хроническим гастритом.

2. Исследовать факторы инициации апоптоза в слизистой оболочке желудка при геликобактерном и негеликобактерном хроническом гастрите.

3. Охарактеризовать роль митогенных (EGF) и антимитогенных (TGF-ß) факторов в патогенезе геликобактерного и негеликобактерного хронического гастрита. Положения, выносимые на защиту:

1. Течение реактивных процессов в слизистой оболочке желудка при хроническом геликобактерном и негеликобактерном гастрите имеет существенные отличия, обусловленные особенностями патогенеза различных форм хронического гастрита.

2. Апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне - провоспалительными цитокинами семейства TNF (FasL и TNF-a), значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ; вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения^ СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный' нарушениями конформации ДНК и< опосредованный^ активацией р53.

3. В1 патогенезе геликобактерного' ХГ имеет значение1 выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора* эпидермального фактора роста (EGFR) иМ^В-сигнального. пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ - гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-ß (TGF-ß).

Научная новизна. Выявлено,5 что течение реактивных процессов1 в слизистой оболочке желудка (воспалительных, дегенеративных и дисрегенераторных) при хроническом геликобактерном и негеликобактерном гастрите имеет существенные отличия, что объясняется особенностями патогенеза различных форм хронического гастрита. Установлено« что негеликобактерный ХГ в большинстве случаев обусловлен приемом пациентами НПВП, о чем свидетельствует выявление специфичных для НПВП-гастропатии морфологических признаков поражения СОЖ.

Впервые выявлено, что апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне, в частности РаэЬ и ТОТ-а, значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ. Вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный нарушениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53.

Впервые установлено, что в патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора эпидермального фактора роста (ЕОИ?.) и МБкВ-сигнального пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ - не только гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза, но и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-р СГОР-р).

Впервые выявлено, что роль. ТМ^-а в патогенезе геликобактерного и негеликобактерного ХГ неоднозначна: при негеликобактерном ХГ ТЪШ-а ответственен за индукцию апоптоза, обусловленного воспалительными и дегенеративными изменениями в СОЖ; при геликобактерном ХГ ЮТ-а опосредует активацию М7кВ-сигнального пути, следствием чего является выживание поврежденных клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований, свидетельствующие о роли р53, ТГ^-а и РаэЬ в инициации апоптоза, БОР и ТОГ-|33 - в регуляции клеточного цикла эпителиальных клеток СОЖ при различных формах хронического гастрита, позволяют расширить представление о патогенезе хронического гастрита.

Установленные в исследованиях иммуногистохимические признаки геликобактерного и негеликобактерного ХГ дают возможность применения полученных закономерностей на практике - в качестве дополнительных диагностических критериев при исследовании гастробиоптатов пациентов с хроническим гастритом.

Выявленные изменения сывороточных уровней ТОР-р1 и гастрина-17 у пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным ХГ (тип С) определяют, целесообразность включения в комплексную программу : обследования больных с хроническим, гастритом исследование ТОР-(31 и гастрина-17 в сьнюротке крови.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствие с планом НИР ГБОУ ВПО «111 МЛ им. академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития России. Регистрационный номер 01.2.00709666. ''

Апробация диссертационного материала и публикации. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ГН'СХА им. акад. Д.Н. Прянишникова, Пермь, 18 ноября 2010; Научной сесии ПГМА, посвященной 95-летию медицинского образования на Урале и 80-летию ПГМА им. академика Е.А. Вагнера, Пермь, 2011; Всероссийской научно- практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодежная наука 2011: технологии, инновации», Пермь, 16-17 марта 2011; VI Межрегиональной научно-практической конференции гастроэнтерологов Приволжского федерального} округа «Современная- гастроэнтерология: что нужно знать практическому врачу?», Н.-Новгород, 4-5 апреля: 2012; Научной сессии ПГМА им. академика Е.А. Вагнера, Пермь, 2012; Международной научно-практической конференции «Инновации: аграрной? науки -предприятиям АПК», Пермь, 24-25 апреля 2012 г.

По теме диссертации' опубликовано: 10 печатных работ, из них 3 работы, опубликованы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Внедрение в практику. Полученные результаты используются в. учебном процессе на кафедре патологической- физиологии, кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии; кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии, оперативной хирургии; внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ ГБОУ ВПО «ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 171 печатной странице, содержат 29 таблиц, 30 рисунков, включают 183 литературных источника, из которых 67 -отечественных и 116 - иностранных авторов.

ВЫВОДЫ:

1. При сравнении характера патологических изменений в СОЖ пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным (тип С) гастритом в соответствии с рекомендациями модифицированной Сиднейской классификации ХГ выявлены статистически значимые различия: у пациентов с геликобактерным гастритом преимущественно отмечается II степень тяжести ХГ, II и III степень активности воспалительного процесса в СОЖ и наличие II и III типов кишечной метаплазии; у пациентов с негеликобактерным ХГ -1 степень тяжести ХГ и I степень активности воспалительного процесса в СОЖ.

2. При хроническом гастрите, обусловленным инфицированием Helicobacter pylori, наблюдается не только перераспределение нейтральных муцинов в СОЖ, но и выявление в значительном проценте случаев кислых и сульфатированных ГАГ в эпителиальных клетках.

3. У пациентов с геликобактерным гастритом отмечается повышение уровня TGF-ßl в сыворотке крови, что обусловлено выраженной воспалительной реакцией в СОЖ, активным участием лимфоцитов в воспалении при инфицировании Helicobacter pylori; у пациентов с негеликобактерным гастритом - повышение уровня гастрина-17, что объясняется пролиферацией G-клеток ДЭС, подтвержденной иммуногистохимическими методами исследований.

4. Апоптоз, инициируемый факторами, действующими на клетку извне -провоспалительными цитокинами семейства TNF (FasL и TNF-a), значим для пациентов с геликобактерным и негеликобактерным ХГ; вместе с тем, при хроническом негеликобактерном гастрите в патогенезе повреждения СОЖ существенную роль играет апоптоз, обусловленный нарушениями конформации ДНК и опосредованный активацией р53.

5. В патогенезе геликобактерного ХГ имеет значение выживание поврежденных клеток СОЖ вследствие активации рецептора эпидермального фактора роста (БОРЯ) и ОТкВ-сигнального пути, в патогенезе негеликобактерного ХГ — гибель клеток СОЖ вследствие апоптоза и подавление пролиферативных процессов под действием трансформирующего фактора роста-Р СГОР-Р).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Установленные в исследованиях иммуногистохимические признаки геликобактерного и негеликобактерного ХГ дают возможность применения полученных закономерностей на практике - в качестве дополнительных диагностических критериев при исследовании гастробиоптатов пациентов с хроническим гастритом.

2. Выявленные изменения сывороточных уровней ТОР-(31 и гастрина-17 у пациентов с геликобактерным (тип В) и негеликобактерным ХГ (тип С) определяют целесообразность включения в комплексную программу обследования больных с хроническим гастритом исследование ТОР-р1 и гастрина-17 в сыворотке крови.