Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Особенности созревания лимфоцитов крови и экспрессии цитокиновых рецепторов у новорожденных детей

На правах рукописи

ÜU3447u4b

ЗИНОВЬЕВА ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ СОЗРЕВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ И ЭКСПРЕССИИ ЦИТОКИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

14 00 09-Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 о СЕН 2009

Москва-2008

003447046

Работа выполнена в НИИ Педиатрии ГУ Научный Центр Здоровья Детей Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук

Яцык Галина Викторовна Семикина Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Антонов Альберт Григорьевич доктор медицинских наук, профессор Ботвиньева Виктория Владимировна

Ведущая организация - ФГУ Научный Институт Педиатрии и детской хирургии Росздрава

Защита диссертации состоится « 14 » октября 2008г в « 13 » часов на заседании диссертационного совета при ГУ Научный Центр Здоровья Детей РАМН по адресу 119991, Москва, Ломоносовский проспект, 2/62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный Центр Здоровья Детей РАМН

Автореферат разослан « 12 » сентября 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Тимофеева А.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Анализ состояния здоровья новорожденных свидетельствует о неуклонном росте заболеваемости детей этой возрастной группы [Г В Яцык, 2002, ЛП Суханова, 2007] Заболеваемость недоношенных детей в 4,5 раза выше неонатальной заболеваемости доношенных и составляет около 780 на 1000 недоношенных, родившихся живыми [Н П Шабалов, 2006]

В России, на фоне снижения в течение последних пяти лет заболеваемости новорожденных в отношении внутриутробной гипоксии и асфиксии при рождении (на 7,0%), гемолитической болезни новорожденных (на 6,7%) и инфекций, специфичных для перинатального периода (на 5,9 %), а также снижения в 2,7 раза частоты сепсиса новорожденных (с 0,59 на 1000 родившихся в 1999 году до 0,22 в 2004 г), чрезвычайно тревожным является продолжающийся прогрессивный рост замедления увеличения длины тела и недостаточности питания новорожденных [JIП Суханова, 2007, А Н Стрнжаков, 2002] В период 1991 - 2004 гг отмечено увеличение распространенности врожденной пневмонии в 3,7 раза - с 2,13 0/ооВ 1991 г до 7,86 °/00 в 2004 г [Л П Суханова, 2007] В последние годы продолжается значительный рост частоты неонатальной желтухи — с 47,3 °/оо в 1991 г до 75,3 °/оо в 2004 г, или в 1,6 раза, что характеризует нарастание морфофункционалыюй незрелости у новорожденных детей, в том числе из-за увеличения частоты индуцированных родов и абдоминального родоразрешения до начала родовой деятельности [Л П Суханова, 2007]

Наблюдаемое в последние годы значительное ухудшение здоровья новорожденных (увеличение числа больных детей до 40% в 2003 - 2004 гг и детей высокого риска развития перинатальной патологии) обусловлено целым спектром причин [А А Баранов и соавт, 2003, В И Стародубов и соавт, 2003] Увеличение числа первородящих женщин в возрасте старше 30 лет, у которых частота экстрагенитальных заболеваний и акушерской патологии существенно выше, рост числа родившихся вне брака, увеличение доли «первенцев» среди родившихся детей (соответственно снижению суммарного коэффициента рождаемости в России до 1,32), наконец, успешная терапия различных форм бесплодия и невынашивания беременности с применением вспомогательных репродуктивных технологий приводит к снижению индекса здоровья родившихся детей [Г В Яцык, 1999, А А Баранов и соавт, 2003, В И Стародубов и соавт, 2003]

Характер течения периода внутриутробного развития плода и периода новорожденное™ в значительной степени определяет будущее состояние здоровья и качество жизни человека Иммунная система является интегрирующей и, наряду с центральной нервной системой и эндокринной системой, участвует в поддержании гомеостаза организма ребенка и установлении оптимального баланса во взаимоотношениях с окружающей средой Иммунологические механизмы участвуют в патогенезе основных заболеваний перинатального периода и во многом обуславливают возможность полноценной реабилитации заболевшего ребенка [Яцык Г В и соавт, 2004, Останин А А , 2001, Таболин В А , 1997]

Цель работы: Установить особенности экспрессии цитокиновых рецепторов и созревания различных популяций Т- и В-лимфоцитов у новорожденных детей с перинатальной патологией на разных сроках гестации

Задачи исследования:

1 Исследовать комплекс рецепторов лимфоцитов крови для оценки созревания системы клеточного иммунитета у новорожденных детей,

2 Определить состав основных субпопуляций Т-лимфоцитов крови у новорожденных детей различного гестационного возраста в первые 10 суток жизни и в конце неонатального периода,

3 Изучить особенности состава В-лимфоцитов крови у новорожденных детей в те же возрастные периоды,

4 Выявить особенности экспрессии цитокиновых рецепторов к основным провоспалительным цитокинам (интерлейкин 2, 5, 8, интерферон-у, фактор некроза опухоли-а) у новорожденных детей различного гестационного возраста в первые 10 суток жизни и в конце неонатального периода,

5 Определить особенности экспрессии цитокиновых рецепторов к основным противовоспалительным цитокинам (интерлейкин 4, 10) у новорожденных детей различного гестационного возраста в те же возрастные периоды

Научная новизна работы. Впервые у доношенных и недоношенных новорожденных детей исследован комплекс дифференцировочных антигенов иммунокомпетентных клеток с помощью метода проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток Впервые изучена

динамика состава В1-лимфоцитов в начале и конце периода новорожденносш и в пуповшшой крови

Впервые определена экспрессия мембранных рецепторов к провоспалительным цнтокинам интерлейкинам 2, 5, 8, интерферону-у, фактору некроза опухоли-сс, а также к основным противовоспалительным цитокинам интерлейкинам 4 и 10 на лимфоцитах пуповиной крови и у новорожденных детей в первые 10 суток жизни и в конце неонатального периода Показан процесс активации клеточных иммунных реакций в ранний период внеутробпой жизни, отражающий особенности функционирования иммунной системы в этом возрасте Впервые изучена динамика состава субпопуляций лимфоцитов крови и экспрессии цитокиновых рецепторов в начале и в конце неонатального периода в зависимости от гестационного возраста и наличия инфекционных заболеваний Доказано негативное влияние развития инфекционно-воспалительных заболеваний периода новорожденное™ на развитие рецепторного аппарата лимфоцитов крови Показано, что адекватная реакция иммунной системы недоношенных детей при инфекционных заболеваниях формируется только к концу 1-го месяца жизни

Практическая значимость работы. Доказана диагностическая ценность изучения иммунофенотипа лимфоцитов крови с определением уровней экспрессии мембранных рецепторов цитокинов у новорожденных детей различного гестационного возраста

Методика исследования субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток адаптирована для работы с микродозами крови, что позволило использовать ее у новорожденных, в том числе недоношенных, детей Применение данной методики дает возможность изучить этапы созревания иммунокомпе1ентны\ клеток и особенностей экспрессии рецепторов к основным про- и противовоспалительным цитокинам

На основании изучения иммунофенотипа лимфоцитов крови новорожденных с разным гестационным возрастом на протяжении первого месяца жизни выявлена определяющая роль таких факторов, как недоношенность и наличие внутриутробного инфицирования, в замедлении созревания иммунной системы в этой возрастной группе

Предложен протокол иммунофенотипирования лимфоцитов крови с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов, помогающий

дифференцированно проводить профилактические и терапевтические мероприятия, что позволяет снизить риск возможных осложнений и дальнейшей инвалидизации у доношенных и особенно недоношенных детей первого месяца жизни

Внедрение результатов работы в практику и публикации. На основании результатов настоящего исследования, разработан протокол иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов у новорожденных детей, который был внедрен и используется в отделении для недоношенных детей НИИ педиатрии ГУ НЦЗД РАМН с 2007 года

Результаты исследования используются в практической работе отделения для недоношенных детей и отделении диагностики и восстановительного лечения детей с перинатальной патологией Научного Центра Здоровья Детей Российской Академии Медицинских Наук

Метод иммунофлюоресценции путем проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток используется в клинико-диагностической лаборатории ГУ НЦЗД РАМН для диагностики функционального состояния системы иммунитета у детей раннего возраста

Результаты настоящей работы были доложены на научно-практической конференции ГУ НЦЗД РАМН «Проточная цитометрия в диагностике заболеваний» (Москва, 2006), конференции молодых ученых ГУ НЦЗД РАМН (Москва, 2006), научно-практической конференции «Фармакотерапия и фармакокинетика в педиатрии»» (Москва, 2006), заседании проблемной комиссии сотрудников отделения неонатологии и клинико-гематологической лаборатории ГУ НЦЗД РАМН (Москва, 2006), 2й конференции «Клуба профессиональных иммунологов» (Турция, Анталия, 2007)

Предложенные методы исследования функционального состояния системы иммунитета у детей рекомендуется использовать для диагностических целей в работе отделений II этапа выхаживания новорожденных, отделений патологии детей раннего возраста Материалы диссертации целесообразно включать в учебные курсы для студентов медицинских факультетов ВУЗов, ординаторов, аспирантов, слушателей факультетов усовершенствования врачей

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 40 таблицами, 23 рисунками Список литературы включает 148 источников, в том числе 57 отечественных и 91 зарубежных

ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для решения задач данной работы были проведены комплексные клинико-инструментальные и лабораторные исследования в отделении для недоношенных детей (зав - д м н, проф Г В Яцык), а также стандартные и специализированные гематологические исследования на базе клинико-гематологической лаборатории (зав - д м н , Е Л Семикина), ГУ Научного центра здоровья детей РАМН (директор - академик РАМН, профессор А А Баранов)

Комплексно было обследовано 88 детей в возрасте от 3 дней до 1 месяца Гестационный возраст детей колебался от 28 до 41 недель Недоношенные дети составили 45,5% (40 из 88) от общего числа наблюдавшихся детей

Все пациенты, включенные в исследование, были распределены на 4 группы в зависимости от гестационного возраста и возраста на момент обследования (Таблица 1)

1-ю группу составили 28 доношенных детей в возрасте от 3 до 10 суток жизни Во 2-ю группу включили 21 недоношенного новорожденного в возрасте от 3 до 10 суток жизни 3-ю и 4-ю группы составили 20 и 19 доношенных и недоношенных новорожденных соответственно, обследование которых проводилось в конце неонатального периода Референтную группу (группа 5) составили 16 условно здоровых доношенных новорожденных ребенка с благоприятным течением перинатального периода, родившихся у здоровых матерей 19-33 лет Состояние при рождении по шкале Апгар у этих детей было оценено на 8-10 баллов, период ранней адаптации протекал нормально

Перед проведением указанных исследований и терапевтических мероприятий у родителей всех наблюдавшихся детей было получено добровольное информированное согласие и гарантировано лечение с доказанной эффективностью

Таблица 1

Общие клинические показатели в группах обследованных детей

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

Изученные параметры N=28 N=21 N=20 N=19

ДН НН ДН НН

Масса тела при рождении « <=1000 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (11%)

1001-2000 0 (0%) 7 (33%) 0 (0%) 9 (47%)

2001-3000 3001-4000 12 (43%) 11(52%) 4 (20%) 8 (42%)

14 (50%) 3 (15%) 12 (60%) 0 (0%)

>4000 2 (7%) 0 (0%) 4 (20%) 0 (0%)

Оценка по шк Апгар (баллы) 8-10 9 (32%) 1 (5%) 8 (40%) 0 (0%)

6-7 16(57%) 19 (90%) 10 (50%) 16(84%)

0-5 3(11%) 1 (5%) 2 (10%) 3 (16%)

Состояние после рождения Удовлетворит 13 (46%) 0 (0%) 9 (45%) 0 (0%)

Сред тяж 8 (29%) 16 (76%) 6 (30%) 10 (53%)

Тяжелое 7 (25%) 5 (24%) 5 (25%) 9 (47%)

Девочки 10(36%) 5 (24%) 1 (5%) 8 (42%)

Мальчики 18(64%) 16 (76%) 19 (95%) 11(58%)

Наряду с полным клиническим обследованием новорожденных детей, нами учитывались особенности соматического и акушерско-гинекологического анамнеза матерей, а также динамика течения настоящей беременности и родов

Анализ анамнестических данных показал, что большинство матерей относились к возрастной категории 20-30 лет, во 2-й и 4-й группах был выше процент женщин старше 30 лет (18%, 43%, 15%, 58% в 1-й - 4-й группах соответственно) Следует отметить, что доля женщин в возрасте старше 30 лет была больше в группах недоношенных новорожденных детей

Частота соматической и акушерско-гинекологической патологии также была выше у женщин, родивших недоношенных детей (группы 2 и 4) Так, в 1-й и 3-й группах, соматически здоровыми были 68% и 60% женщин соответственно, во 2-й группе - 48% и в 4-й - только 32% Среди наиболее частых заболеваний, у матерей отмечались вегето-сосудистая дистония, хроническая патология пищеварительного тракта (гастродуодениты, язвенная болезнь 12-перстной кишки, панкреатит), воспалительные заболевания мочевого пузыря и почек, ЛОР-заболевания (тонзиллиты), аллергические болезни (в том числе бронхиальная астма) Реже встречались гипертоническая болезнь, эндокринная патология (сахарный диабет, ожирение, заболевания щитовидной железы), анемия, варикозная болезнь,

миастения, дисклазия тазобедренных суставов, миопия, ангионатия сетчатки, носнтельство антигенов вируса гепатита

Акушерско-гинекологический анамнез был отягощен у большинства женщин, наиболее часто отмечались инфекционно-воспалительные заболевания гениталий (хронический аднексит, сальпингоофорит, бактериальный вагинит), эрозия шейки матки и медицинские аборты Реже встречались миома матки и эндометриоз, киста яичника

В 4-й группе, куда вошли глубоконедоношенные дети, наблюдался самый высокий процент бесплодия (32%), внематочных и неразвивающихся беременностей (21%) Частота самопроизвольных выкидышей была одинаково высокой во 2-й, 3-й и 4-й группах и составила 14% -16%

В той или иной степени патологическое течение настоящей беременности и/или родов отмечалось у всех женщин Частота патологии беременности была высокой во всех группах и составила от 89% до 95%

В 15% - 29% случаев наблюдался ранний гестоз Практически у половины (от 42% до 50%) женщин во всех группах были проявления позднего гесюза разной степени тяжести В высоком проценте случаев встречалась угроза прерывания беременности, частота которой во 2-й группе составила 91%, а в 4-й группе достигала 84%

Таким образом, отяг ощенность соматического и акушерско-гинекологического анамнеза была наиболее высокой у матерей детей 2-й и 4-й групп, что и явилось причиной невынашивания беременности и рождения недоношенного ребенка

Оперативным путем родились 36% детей 1-й группы, 48% детей 2-й группы, 25% детей 3-й группы и более половины (53%) детей 4-й группы Длительный безводный промежуток (более 6 часов) отмечался во всех группах в 29 - 36% случаев, а частота отслойки плаценты - была выше во 2-й и 4-й группах (10% и 11% соответственно)

Доля детей с очень низкой массой тела при рождении составила 33% и 47% во 2-й и 4-й группах соответственно В 4-ю группу были включены 2 ребенка (11%) с экстремально низкой массой тела при рождении В то же время, в 1-й и 3-й группах все дети при рождении имели массу более 2000 г

В 1-й и 3-й группах 32% и 40% новорожденных детей соответственно имели оценку по шкале Апгар 8-9 баллов на 1-й минуте жизни У 57% и 50% соответственно отмечалась асфиксия легкой степени (6-7 баллов по шкале Апгар), оценка по шкале Апгар ниже 6 баллов наблюдалась у 10%-

11% детей 1-й и 3-й групп соответственно Во 2-й и 4-й группах большинство детей родились в асфиксии легкой степени (90% и 84% соответственно), во 2-й группе 1 ребенок (5%) имел оценку по шкале Апгар 8-9 баллов, в 4-й группе таких детей не оказалось В 4-й группе был выше процент детей, рожденных с оценкой по шкале Апгар ниже 6 баллов (16%), в 3-й группе тяжелая асфиксия была отмечена у 1 ребенка (5%)

Таблица 2

Распределение детей в зависимости от видов церебральной патологии

Церебральная патология 1 группа N=28 ДН 2 группа N=21 НН 3 группа N=20 ДН 4 группа N=19 НН

Церебральная ишемия 1 степени 2 (7%) 3 (14%) 4 (20%) 2(11%)

Церебральная ишемия 2 степени 24 (86%) 16 (76%) И (55%) 15 (79%)

Церебральная ишемия 3 степени 2 (7%) 2 (10%) 4 (20%) 2(11%)

Синдром угнетения 17(61%) 12 (57%) 8 (40%) 3 (16%)

Синдром возбуждения 8 (29%) 6 (29%) 9 (45%) 11 (58%)

Синдром вегето-висцеральной дисфункции 6 (21%) 2(10%) 2 (10%) 4(21%)

Судорожный синдром 2 (7%) 2 (10%) 1 (5%) 0 (0%)

Синдром мышечной дистонии 13 (46%) 7 (33%) 9 (45%) 8 (42%)

Гипертензионно-гидроцефальный синдром 1 (4%) 1 (5%) 1 (5%) 1 (5%)

В неонатальном периоде у всех детей отмечалась перинатальная

церебральная патология во всех группах чаще отмечалась церебральная ишемия 2 степени (55% - 86%) (см Таблицу 2) Синдром угнетения отмечался у новорожденных первых десяти суток жизни у 61% и 59% доношенных и недоношенных детей соответственно В то же время, синдром возбуждения как у доношенных, так и у недоношенных новорожденных отмечался в конце неонатального периода у 45% и 58% соответственно

Среди сопутствующей патологии наиболее часто отмечались дыхательные нарушения, в том числе синдром дыхательных расстройств, ателектазы легких, пневмония, аспирационный синдром Также с достаточно большой частотой встречались неонатальные желтухи, наличие очагов локальной инфекции (омфалиты, конъюнктивиты, везикопустулез), анемии Высока была частота внутриутробной гипотрофии, морфо-функциональной незрелости

Все дети были обследованы на наличие инфекционных возбудителей микробиологическими методами, а также с использованием ДНК-диагностики, методом Г1ЦР

Наиболее тяжелый период ранней и поздней постнаталыюй адаптации отмечался у новорожденных, родившихся у матерей с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, имеющих сочетанную соматическую патологию, перенесших обострение хронических воспалительных заболеваний во время настоящей беременности и патологическое течение настоящих родов, а также у недоношенных новорожденных, родившихся у матерей, страдающих бесплодием более 5-7 лет, с настоящей беременностью путем ЭКО (метод подсадки эмбриона), угрозой невынашивания на протяжении всей беременности, гормональной терапией с периодической госпитализацией, неблагоприятным течением настоящих родов

В данном исследовании проводился анализ распределения видов проводимой терапии, а также характера вскармливания детей сравниваемых групп На грудном вскармливании находилось не менее половины детей 1-й и 3-й групп (50% и 60% соответственно), в то время как в 4-й группе частота грудного вскармливания была наименьшей - 21% На искусственном вскармливании находилось по 1 ребенку 1-й и 3-й групп (4% и 3% соответственно), 10% и 26% новорожденных 2-й и 4-й групп соответственно Приложены к груди в течение первых 10 дней жизни были от 40% до 50% новорожденных 1-й - 3-й групп и только 21% детей 4-й группы

Антибактериальное лечение на первом этапе выхаживания проводилось 50% - 55% детей 1-й и 3-й групп, то время как недоношенным новорожденным (дети 2-й, 4-й групп) антибактериальная терапия с рождения проводилась в 81% и 79% случаев соответственно Частота антибактериальной терапии на втором этапе выхаживания составила у доношенных новорожденных 75% - 85%, у недоношенных - 91% во 2-й группе и 100% у пациентов 4-й группы Более чем половине недоношенных детей проводилась терапия внутривенными иммуноглобулинами (57% и 58% детей 2-й и 4-й групп соответственно)

Таким образом, недоношенные дети чаще получали антибактериальную терапию, в том числе с рождения, а также терапию внутривенными иммуноглобулинами, что связано с более тяжелым течением

периодов ранней и поздней постнатальной адаптации и инфекционной патологией

В работе использовались следующие методы

• Анализ соматического и акушереко-гинекологического анамнеза матерей

• Клинический осмотр детей с оценкой соматического и неврологического статуса

• Лабораторные методы общий анализ мочи, биохимический анализ, исследование крови и мочи на маркеры внутриутробных инфекций (методом полимеразной цепной реакции для выявления генома, методом иммуноферментного анализа для выявления антител IgG, IgM, а также с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции), определение уровней иммуноглобулинов классов А, М, G, Е, бактериологические исследования (кала, мочи, крови, мазков из носа, ротоглотки, с конъюнктивы)

• Инструментальные методы ультразвуковые исследования головного мозга, сердца, органов брюшной полости, почек, электрокардиография, электроэнцефалография, исследование вызванных зрительных и слуховых потенциалов По показаниям - рентгенография легких, компьютерная томография легких, холтеровское мониторирование ЭКГ, магнитно-резонансная томография головного мозга

• Мониторирование частоты сердечных сокращений (ЧСС), ЭКГ, частоты дыхания и насыщения артериальной крови 02 с помощью прикроватных мониторов "Dash-2000" (Германия) и "Nihon Cohden" (Япония) у детей, находящихся в тяжелом состоянии

• По показаниям дети консультировались специалистами невропатологом, офтальмологом, пульмонологом, кардиологом, диетологом, урологом, генетиком, врачом ЛФК, ортопедом, эндокринологом

• Специальные гематологические методы

- общий клинический анализ крови (на автоматическом счетчике Beckman Coulter НМХ),

- исследование иммунофенотипа лимфоцитов венозной крови с определением субпопуляций лимфоцитов крови и экспрессии рецепторов к цитокинам их мембране проводили методом проточной цитофлюорометрии в реакции прямой иммунофлюоресценции в клинико-гематологической лаборатории ГУ НЦЗД РАМН Определялись следующие кластеры дифференцировки зрелые Т-лимфоциты CD3+, Т-хелперы CD3+CD4+, Т-

супрессоры CD3+CD8+, B-лимфоциты CD19+, субпопуляция молодых и активированных B-лимфоцитов CD19+CD10+, популяция В1-лимфоцитов CD19H3D5+, а также рецепторы CD 25 - низкоаффинная субъединица рецептора к ИЛ-2, CD 122 - высокоаффинная субъединица рецептора к ИЛ-2, CD 124 - рецептор к ИЛ-4, CD 125 - рецептор к ИЛ-5, CD 128 - рецептор к ИЛ-8, CD 210 - рецептор к ИЛ-10, CD 119 - рецептор к интерферону-у, CD 120 - рецептор к ФНО-а

Все клинико-инструментальные исследования в основных группах проводили на 3-10 дни жизни и в конце неонатального периода У детей референтной группы исследование гематологических показателей пуповинной крови проводилось сразу после рождения

Методика исследования нммунофенотипа клеток цельной крови с помощью лизирования.

Для проведения исследования образец венозной крови в количестве не более 0,5 мл помещался в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТЛ) Клетки крови исследовали без применения градиента плотности, с проведением лизирования эритроцитов Использована технология и реактивы BD Biosciences, США Для проведения флюоресцентного окрашивания клеток цельной крови в полистиреновые пробирки вносили моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентным красителем, в количестве 1015 мкл на тест Затем добавляли 50 мкл крови, разведенной рабочим буферным раствором Cell Wash в соотношении 1 • 1, тщательно перемешивали встряхиванием и инкубировали 15 минут при t 4°С в темноте Далее проводилось лизирование эритроцитов с использованием реагента Simulset Lysing Solution в объеме 3 мл на пробирку, пробу тщательно перемешивали и инкубировали 5-7 минут Затем клетки отмывали от лизирующего раствора и готовили рабочую взвесь с 0,5 мл буфера Cell Wash, после чего взвесь была готова к подсчету на проточном цитофлюориметре Метод проточной цитофлюорометрии.

Исследования проводились на приборе FACCalibur фирмы Becton Dickinson (США) Принцип метода проточной цитометрии заключается в измерении оптических свойств клетки, проходящей через сфокусированный лазерный луч В результате реакции мембранного рецептора клетки с моноклональным антителом на поверхности лимфоцита фиксируется молекула флюоресцентного красителя, которая поглощает энергию лазерного луча и испускает собственное свечение Проточный цитометр регистрирует

параметры рассеяния лазерного луча и индуцированной флюоресценции Анализ сотен клеток в секунду и 10 ООО клеток в каждой пробе обеспечивает статистическую достоверность исследования Стабильность работы цитофлюориметра обеспечивается регулярным проведением процедуры автоматической настройки с применением калибровочных частиц CaliBnte Beads и программы Autocomp Анализ данных проводился с использованием программ CellQuest (Becton Dickinson) и некоммерческой исследовательской программы Win MDI2 8

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов «STATISTICA 6 0» и «Microsoft Excel 2 0» Применялся расчет средних величин, среднеквадратичного отклонения, стандартной ошибки среднего, минимума, максимума

Различия показателей определялись по критериям Вальда-Вольфовица, Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни Анализ причинно-следственных связей базировался на определении коэффициента ранговой корреляции Спирмана и коэффициента гамма корреляции За уровень значимости принимали значения р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и выявления возможных особенностей их созревания проведено исследование комплекса антигенов Т-линейной дифференцировки основного антигена всех стадий созревания CD3+, субпопуляции Т-хелперов CD3+CD4+, Т-супрессоров CD3+CD8+, их соотношения CD3+CD4+ CD3+CD8+, а также субпопуляции молодых Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+CD4+CD8+

Проведенные исследования позволили сравнить комплекс показателей Т-лимфоцитов у доношенных и недоношенных детей, обследованных на 310 день жизни и в конце периода новорожденное™, а также сравнить их с аналогичными показателями пуповинной крови При исследовании пуповинной крови отмечен относительно низкий процентный уровень зрелых Т-лимфоцитов (44,8+9,2%), пропорционально Т-хелперов и Т-супрессоров (33,3+9,7%) и (12,8+3,4%) соответственно

Показатели детей, обследованных на 3-10 день жизни (доношенных и недоношенных) были достоверно выше и соответствовали нормальным показателям для этого возраста

Средние показатели состава субпопуляций Т-лимфоцитов приведены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная таблица показателей иммунофенотипа Г клеток М(+т)

Группа детей _ Масса Гест. при возр. рожд. Х1Л0% ЛсЬ х10 /л СБЗ+ СОЗ+4+ СОЗ+8+ % I % % гп. . СБЗ+ ГП8+ !С04+ ' | %

1ДН10 <п=28) 39,4 ' 3168,2 (+0,2) (+109,0) 12,4 ; 44.8 (±0,6) : (+2,4) 5.5 (+0,4) 67,2* 48,5* 18,1* (±2,3) (±2,5) (+1,3) 2,9 (+0,2) 3,5* (+0,4)

2НН10 (п=21) 34,7* : 2343,3* (+0,3) (±125,0) 11,4 ! 43,5 (±1,0) (+3,4) 4,5 (+0,4) 64,6* (±2,1) 47,3* 18,1* (±1,8) (+1,0) 2,7 (+0,2) 3,9* (±0,4)

зднзо (п=20) 39,6 3482,6 (+0,2) | (+116,3) 10,2 : 50,2 (+0,7) I (+3,5) 5,1 (+0,5) 66,6* (±2,1) 66,7* (+2,0) 48,2* 20,5* (±3,0) (+1,3) 2,4 (±0,2) 2,8 (±0,7)

4НН30 (п=19) 32,6* 1790,2* (+2,6) (±123,7) 11,2 51,8 (±0,7) (±2,8) 5,8 (+0,5) 47,1* | 20,2* (±2,4) I (+1,6) 2,6 (±0,2) 3,1 (+0,5)

5Пуп (п=16) 40,0 3475,3 (+0,2) I (+93,2) 13,8 47,2 (+1,4) (+4,7) 5,9 (+0,6) 44,8 ! 33,3 12,8 2,6 (±2,3) | (±2,5) ; (+0.9) ; (+0,2) 2,0 (±0,3)

М - среднее значение, т - ошибка средней * -различия с референтной группой статистически значимы

В конце неонатального периода значительных изменений содержания субпопуляций зрелых Т-клеток СЭЗ+, Т-хелперов СЭЗ+С04+, Т-супрессоров СЭЗ+С08+ не отмечено как у доношенных, так и у недоношенных детей. Удалось лишь выделить тенденцию к возрастанию уровня Т-супрессоров к концу неонатального периода по сравнению с возрастом 3-10 суток жизни - как для доношенных, так и для недоношенных детей.

Статистически значимых различий соотношений Т-хелперы: Т-супрессоры (СОЗ+С04:СБЗ+С08+) не отмечено. Отмечена тенденция к некоторому снижению этого показателя в группе доношенных новорожденных, обследованных в конце неонатального периода по сравнению с детьми 3-10 дней жизни.

Проведенный корреляционный анализ позволил зарегистрировать умеренную отрицательную статистически значимую корреляцию между уровнем СОЗ+лимфоцитов и возрастом у доношенных и недоношенных новорожденных в конце неонатального периода (см. рисунок 1).

R (Spearman) =-49 04 R (Spearman) = 55p=0 01

Рисунок 1 Корреляционная зависимость уропин СБЗ+лимфоцитов и возраста у доношенных (слева) и недоношенных (справа) новорожденных в конце неонатального периода

Проведение многоцветного окрашивания позволило проанализировать содержание молодых Т-клеток, фенотип которых соответствует тимической стадии созревания СВЗ+С04+СБ8+ В пуповинной крови содержится 2,0+1,4% клеток этой «малой» популяции В крови новорожденных детей всех групп уровень таких Т-лимфоцитов значительно выше уровня пуповинной крови и уровня детей старшего возраста (по данным литературы не более 1%) Процент С03+С04+С08+ лимфоцитов повышался в периферической крови у доношенных и недоношенных новорожденных в первые 10 суток жизни (3,5+2,2% и 3,9+1,6% соответственно) Повышение уровня молодых Т-клеток в циркуляции было наиболее выражено у недоношенных детей, имеющих клинические проявления инфекционных заболеваний (4,5+0,78%) Выявлена тенденция к снижению уровня этих молодых лимфоцитов у доношенных и у недоношенных новорожденных к концу неонатального периода (2,8+1,7% и 3,1+1,8% соответственно)

Для оценки субпопуляционного состава В-лимфоцитов и выявления возможных особенностей их созревания проведено исследование комплекса антигенов В-линейной дифференцировки основного антигена всех стадий созревания СБ19+, субпопуляции молодых/активированных В-лимфоцитов с фенотипом С019+С010+, и популяции В1-лимфоцитов С019+СБ5+

Средние показатели состава субпопуляций В-лимфоцитов приведены в таблице 4

Общий уровень В-лимфоцитов по метке СБ19+ у детей всех групп соответствовал возрастному диапазону и не имел различий между группами

Выявлено, что В-клетки с фенотипом С019+С0Ш+ присутствуют в крови детей всех групп, достоверных отличий их содержания не выявлено.

Таблица 4

Сравнительная таблица показателей иммунофенотипа В-клеток М(+т)

Группа Гест, возр. Масса при рожд. Ле х10% Лф% ЛсЬ хЮ /л С019+ % СОЮ+19+ % С05+19+ % СО5+10+ 19+ % 5,4 (+0,8)

1ДН10 ! (п=28) 39,4 (±1.1) 3168,2 (+576,5) 12,4 (±3,4) 44,8 (±12,7) 5,5 (+1,9) 13,3 (±1,3) 5,9 (+0,9) 9,0 (±1,1)

2 НН10 (п=21) 34,7* (±1,2) 2343,3* 11,4 (+572,9) | (+4,4) 43,5 (±15,4) 4,5 (±1,7) 12,0* (±1,3) 5,5 (+0,6) 7,9 (±1.0) 5,4* (±0,6)

ЗДНЗО (п=20) 39,6 (+0,9) 3482,6 (±507,0) 10,2 (±3,1) 50,2 (+14,7) 5,1 (+2,0) 15,9 (±1.5) 8,3 (±1,1) 10,8* (±1,5) 6,7* (±1,0)

4НН30 (п=19) 32,6* (±2,6) 1790,2* ! 11,2 (+539,0) ; (+3,2) 51,8 (±11,7) 5.8 (+2,0) 5.9 (+2,5) 17,8 (+2,2) 10,2 (±2,1) 13,4* (+2,0) 8,2* (±1,9)

5Пуп (п=16) 40,0 (±0,7) 3475,3 (+384,3) 13,8 (+5,8) 47,2 (±18,7) 17,5 (±1,9) 6,4 (+0,9) 6,6 (±0,9) 3,1 (±0,7)

М - среднее значение, т - ошибка средней

* -различия с референтной группой статистически значимы

В последние годы внимание исследователей привлекает субпопуляция В1-лимфоцитов с мембранным иммунофенотипом СЭ19+С05+. Их основное функциональное свойство - низкая специфичность антиген распознающих иммуноглобулиновых рецепторов и способность продуцировать иммуноглобулины класса М и А. У взрослых В1 популяция составляет около 30% всех циркулирующих В-лимфоцитов.

Нами выявлено, что уровень В1-лимфоцитов в крови новорожденных детей всех групп значительно превышает уровень данной субпопуляции в пуповинной крови и у взрослых и составляет около 65%.

Уровень В1 лимфоцитов в крови взрослых

□ С019+С05* ■ СШ9«С05-

Рисунок 2. Уровень В1-лимфоцитов в составе В-клеток у новорожденных детей (А) и взрослых (Б)

У всех групп детей присутствовала популяция С05+СВ19+С0Ю+ -молодые активированные В1-клетки, эта группа составляла более половины всех В1-лимфоцитов Анализ указанных показателей у доношенных детей, имевших и не имевших инфекционные заболевания, резкой реакции В-клеток не выявил У недоношенных детей без инфекционных заболеваний к концу неонатального периода выявляется тенденция к увеличению уровня молодых активированных В-лимфоцитов Однако статистически достоверных различий не выявлено, ввиду значительного разброса индивидуальных показателей У недоношенных детей, обследованных в конце неонатального периода, с наличием инфекционного процесса -выявлено существенное снижение уровня молодых активированных В-лимфоцитов (СШ0+СБ19+) и активированной части В1-лимфоцитов (СВ19+СБЮ+С05+) Этот факт может быть как признаком миграции молодых активированных В-клеток в очаг воспаления или в другие органы лимфоидной системы, так и свидетельством срыва компенсаторных процессов недостаточно зрелой иммунной системы недоношенных детей, при развитии инфекционного заболевания

Следующая часть работы была посвящена анализу экспрессии мембранных рецепторов к комплексу цитокинов, характеризующих различные звенья клеточного иммунного ответа Определялся процент клеток лимфоидного региона, на мембране которых присутствовали рецепторы

- к фактору роста Т-лимфоцитов интерлейкину 2 (ИЛ-2) -низкоаффинная субъединица рецептора С025, определяющая а-цепь рецептора, высокоаффинная субъединица СО 122, определяющая р-цепь,

- к фактору роста Т- и В-лимфоцитов интерлейкину 4 (Ш1-4), который также является фактором роста тучных клеток и индуктором синтеза иммуноглобулина Е - а-цепь рецептора СБ 124,

- к фактору роста В-лимфоцитов и эозинофилов интерлейкину 5 (ИЛ-5) - а-цепь рецептора СВ125,

- к фактору хемотаксиса нейтрофилов интерлейкину 8 (ИЛ-8) - а-цепь рецептора СО\у128,

- к основному противовоспалительному цитокину, подавляющему иммунные и воспалительные реакции и ингибирующему синтез гамма-интерферона и других провоспалительных цитокинов интерлейкину 10 (ИЛ-10) - а-цепь рецептора СБ\\'210,

- к основному провоспалительному цитокину гамма-интерферону (интерферон-у), который является активатором роста и функций цитотоксических лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, обладает противовирусной и противоопухолевой активностью - а-цепь рецептора СО! 19;

к важнейшему медиатору воспаления и цитотоксических реакций фактору некроза опухолей (ФНО- а) - а-цепь рецептора СО 120 .

Показатели новорожденных детей сравнивались с показателями пуповинной крови и с уровнем экспрессии этих рецепторов у детей подросткового возраста (группа сравнения клинико-гематологической лаборатории).

Интерлейкин 2 - основной фактор роста дифференцировки и активации Т-лимфоцитов. К концу неонатального периода, у доношенных детей выявлена значительная активация лимфоцитов, выразившаяся в повышении экспрессии СО 122 (с 9,1+1,3 до 15,4+2,3%). Недоношенные дети этого возраста такую активацию не показывали (8,3+1,4 - 9,0+1,2%), у них выявлено замедление активации клеточных иммунных реакций. Повышение экспрессии высокоаффинной субъединицы рецептора ИЛ-2 С0122 одинаково выражено у доношенных детей в конце неонатального периода независимо от наличия инфекционных заболеваний (15,1+0,5% — с инфекциями, 17,1+3,7% - без). Недоношенные дети, не имеющие инфекционных заболеваний, в конце неонатального периода имели тенденцию к повышению уровня СО 122 (10,2+1,6%). При развитии инфекционного процесса у недоношенных детей такая реакция активации полностью отсутствовала (7,2+1,5%). Динамика уровней С025+ и С0122+ субъединиц рецептора ИЛ-2 по группам представлена на рисунке 3.

1 гр 2 гр 3 гр 4 гр 5 гр

Рисунок 3. Уровни экспрессии субъединиц рецептора ИЛ-2 (СГ>25 и СВ122) на мембранах лимфоцитов крови детей анализируемых групп

Интерлейкин 4 - фактор роста В-клеток, индуктор синтеза 1с Е, цитокин, определяющий Т2 - дифференцировку клеток и продуцируемый Т-хелперами 2 типа

Минимальный уровень экспрессии этого рецептора выявлен на клетках пуповинной крови - рецептор присутствовал в среднем на 1,8+0,4% лимфоцитов В течение первой недели жизни у доношенных детей отмечено достоверное увеличение уровня лимфоцитов с экспрессией этого рецептора, у недоношенных повышение отсутствует (4,4+0,9% и 2,9+0,5% соответственно) К концу неонатального периода достоверного различия уровня лимфоцитов с рецептором ИЛ-4 у доношенных и недоношенных детей не выявлено, их показатели не отличаются от уровня детей старшего возраста (5,6+1,3% у доношенных и 4,1+0,9% у недоношенных) Изменения экспрессии рецептора к ИЛ-4 в зависимости от наличия инфекционного процесса ни в одной группе детей не выявлено

Интерлейкин 5 - фактор роста В-клеток, колониестимулирующий фактор роста эозинофилов Средний процент лимфоцитов с этим рецептором в пуповинной крови составил (3,1+0,4%), у детей 1 группы (2,6+0,3%), 2 группы - (3,1+0,3%) К концу периода новорожденное™ средние показатели составили 3,6+0,4% для доношенных и 4,4+0,6% для недоношенных детей Изменения экспрессии этого рецептора в зависимости от возраста, срока гестации и наличия инфекционного процесса не выявлены

Анализ экспрессии рецепторов к интерферону-у показал отсутствие различий у детей всех исследуемых групп, независимо от наличия инфекционных процессов Показатели детей первой недели жизни составили 68,5+7,1% у доношенных и 64,8+6,1% у недоношенных детей, к концу первого месяца жизни - 73,3+5,2% и 61,0+8,5% соответственно В целом экспрессия рецептора к ИФН-у соответствовала уровню детей старшего возраста Полученные результаты говорят о том, что чувствительность лимфоидных клеток к ИФН-у в периоде новорожденности достаточно хорошо сформирована

Нами изучена экспрессия рецепторов к цитокину, ответственному за течение воспалительных реакций - ФНО-а, который служит пусковым механизмом для продукции каскада провоспалительных цитокинов Исследовать экспрессию этого рецептора нам удалось у небольшого числа

детей в связи с чем, дети (доношенные и недоношенные) были разделены только по возрасту — 3-10 день жизни (дети 1 и 3 группы) и конец неонатального периода (дети 2 и 4 группы). У всех новорожденных к концу первого месяца жизни уровень экспрессии данного рецептора значительно возрос, что является одним из свидетельств активации системы клеточного иммунитета.

Рисунок 4. Уровни экспрессии рецептора ФНО-а на мембране лимфоцитов крови детей анализируемых групп

Интерлейкин 8 - фактор миграции нейтрофилов, рецептор к нему есть и на лимфоцитах, что свидетельствует об их активном участии в воспалительном процессе и клеточных иммунных реакциях. Уровень экспрессии рецепторов к ИЛ-8 в пуповинной крови низкий (3,6+0,7%). У новорожденных детей отмечается существенный рост данного показателя с первой недели жизни - рецептор экспрессировали (9,5+1,7%) лимфоцитов крови доношенных и (10,5+2,8%) недоношенных детей. Достигнутый уровень сохраняется в течение всего первого месяца, без колебаний — у детей 3 группы их число было (10,0+2,4%), 4 группы - (10,9+2,0%). Это свидетельствует о том, что произошедшая активация характерна для доношенных и недоношенных детей.

Отмечено, что у доношенных и недоношенных новорожденных детей 1 -ой недели жизни развитие инфекционных заболеваний сопровождается значительным увеличением уровня рецепторов к хемотаксическому фактору ИЛ-8. В течение первого месяца жизни у доношенных детей эта реакция выравнивается, а у недоношенных сохраняется достоверно значимое повышение экспрессии этого рецептора, что может свидетельствовать о

более распространенных воспалительных реакциях со стороны системы клеточного иммунитета у недоношенных детей.

Рисунок 5. Изменения экспрессии рецептора Ш1-8 на мембране лимфоцитов крови при инфекционных заболеваниях у новорожденных детей

Интерлейкин 10 - основной противовоспалительный цитокин. 8 пуповинной крови процент экспрессирующих его лимфоцитов низкий (2,2+0,5%). Увеличение экспрессии этого рецептора в течение 1 месяца жизни происходит синхронно с увеличением экспрессии рецепторов к некоторым провоспалительным цитокинам (ИЛ-2 - СБ 122, ИЛ-8, ФНО). Средние показатели у детей 1 недели жизни составили (6,4+1,6%) у доношенных и (6,6+1,1%) у недоношенных детей. К концу периода новорожденное™ число лимфоцитов с рецептором ИЛ-10 достигло (12,9+2,2%) у доношенных детей и (11,0+1,5%) у недоношенных. Повышение экспрессии этого рецептора очень важно как один из механизмов, ограничивающих развитие воспалительных реакций.

Анализируемые группы

Средние значения ±т +Б (ст) Выпадающие значения Рисунок 6. Уровни экспрессии рецепторов к ИЛ-10

Экстремальные точки

У доношенных детей, обследованных на 3-10 день жизни, развитие инфекционных заболеваний сопровождается значительным увеличением уровня экспрессии рецепторов к ИЛ-10. У недоношенных детей этого же возраста выявляется только тенденция к повышению.

Рисунок 7. Изменения экспрессии рецепторов к ИЛ-10 на мембране лимфоцитов крови новорожденных детей при инфекционных заболеваниях

К концу первого месяца жизни данный показатель у доношенных детей выравнивается и не зависит от наличия инфекционных заболеваний. У недоношенных детей адекватная реакция увеличения экспрессии рецепторов к ИЛ-10 при инфекционных заболеваниях выявляется только к концу 1-ого месяца жизни, что обуславливает недостаточность противовоспалительного иммунного ответа у этой группы детей.

Таким образом, проведенные исследования позволили отметить ряд особенностей экспрессии дифференцировочных антигенов, определяющих субпопуляционный состав лимфоцитов крови детей периода новорожденное™. Выявленные изменения экспрессии цитокиновых рецепторов отражают активацию клеточных иммунных реакций в первые недели внеутробной жизни. Развитие инфекционных заболеваний в периоде новорожденное™ серьезно нарушает нормальное развитие системы клеточного иммунитета в неонатальном периоде.

1. Адаптация новорожденного ребенка к условиям внеутробной жизни определяет особенности функционирования системы клеточного иммунитета в этом возрастном периоде. У недоношенных детей отмечается задержка созревания иммунной системы, которая приводит к недостаточности ряда клеточных реакций и способствует развитию инфекционных заболеваний.

Изменения экспрессии рецептора ИЛ 10 при инфеционных заболеваниях новорожденных детей

ВЫВОДЫ

2 Уровень зрелых Т-клеток, Т-хелперов и Т-супрессоров у доношенных и недоношенных новорожденных детей с перинатальной гипоксией является стабильным и не зависит от развития сопутствующих инфекционных заболеваний Уровень Т-лимфоцитов с тимическим фенотипом СБЗ+С04+С08+ у детей первой недели жизни превышает 3%, что достоверно выше уровня взрослых Повышение уровня молодых Т-клеток в циркуляции наиболее выражено у недоношенных детей с клиническими проявлениями инфекционных заболеваний

3 Общий уровень В-лимфоцитов у детей всех обследованных групп соответствует возрастному диапазону и не имеет различий между группами В крови новорожденных детей всех групп уровень В1-лимфоцитов значительно превышает уровень данной субпопуляции в пуповинной крови и у детей старшего возраста и составляет 62-67%

4 В крови новорожденных детей всех групп определяются значительные популяции молодых активированных лимфоцитов с фенотипом С019+С010+ и В1-лимфоцитов С019+С0Ю+С05+ У недоношенных детей, обследованных в конце неонаталыюго периода, с наличием инфекционного процесса выявлено существенное снижение уровня молодых активированных В-лимфоцитов и активированной части В1-лимфоцитов, что является свидетельством срыва компенсаторных процессов недостаточно зрелой иммунной системы недоношенных детей при развитии инфекционного заболевания

5 У доношенных новорожденных к концу первого месяца жизни выявлено повышение уровня активированных лимфоцитов с высокоаффинным рецептором ИЛ-2 СО 122 У недоношенных детей подобная реакция отсутствует При анализе экспрессии рецепторов к интерлейкинам 4 и 5 у детей обследованных групп существенной динамики в течение первого месяца жизни не отмечено

6 Экспрессия рецептора к гамма-интерферону на лимфоцитах крови у новорожденных всех групп однородна, и к концу первого месяца существенной динамики не отмечается Экспрессия рецептора к ФНО-а у детей первой недели жизни соответствует уровню пуповинной крови, в дальнейшем достоверно повышается к месячному возрасту, что является свидетельством активации иммунного ответа

7 С первых дней жизни на лимфоцитах крови детей всех групп увеличивается экспрессия рецептора к фактору хемотаксиса ИЛ-8, что

является свидетельством активации клеточных иммунных реакций Это повышение наиболее выражено у детей 3-10 дней жизни с инфекционными заболеваниями

8 В течение первого месяца жизни на лимфоцитах крови достоверно увеличивается мембранная экспрессия рецептора к основному противовоспалительному цитокину ИЛ-10 Выявлено повышение числа лимфоцитов с рецептором к ИЛ-10 при развитии инфекционных заболеваний, особенно выраженное у доношенных детей первой недели жизни Адекватная реакция увеличения экспрессии рецептора к ИЛ-10 при инфекционных заболеваниях у недоношенных детей выявляется только к концу 1-ого месяца жизни

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Использование протокола иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов, у новорожденных детей рекомендуется в отделениях I и II этапов выхаживания новорожденных, а также в центрах реабилитации детей раннего возраста с различными видами перинатальной патологии и ее последствий для определения степени зрелости иммунной системы, а также для контроля за эффективностью проводимого лечения (в дополнение к традиционному определению факторов гуморального иммунитета в сыворотке крови)

2 Особенности становления иммунокомпетентности у доношенных и недоношенных новорожденных необходимо учитывать при назначении терапии детям с различным гестационным возрастом Особенно важно учитывать задержку становления иммунитета у недоношенных новорожденных

3 Рекомендовано применение протокола иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов, у новорожденных детей из группы риска внутриутробного инфицирования в качестве дополнительного критерия оценки тяжести и прогнозирования течения инфекционно воспалительных заболеваний

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Семикина ЕЛ, Намазова ЛС, Мигачи АВ, Турш ТВ, Зиновьева ТЕ,

Вознесенская Н И , Копыльцова Е А , Громов И А Особенности экспрессии цитокиновых рецепторов на мембране лимфоцитов у новорожденных детей// Материалы X Конгресса Педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» М, 2006 -С 523

2 Семикина ЕЛ, Намазова ЛС, Мигали АВ, 1 урти ТВ, Зиновьева ТЕ, Вознесенская НИ, Копыльцова ЕА, Громов И А Особенности экспрессии рецептора к IgE на лимфоцитах крови детей// Материалы X Конгресса Педиатров России ((Актуальные проблемы педиатрии» М, 2006 - С 523-524

3. Семикина Е Л , Яцык Г В , Мигали А В , Турти Т В , Зиновьева Т Е, Копыльцова Е А К вопросу о присутствии малодифференцированных популяции лимфоцитов у новорожденных детейII Материалы X Конгресса Педиатров России ((Актуальные проблемы педиатрии» М, 2006 - С 524

4 Зиновьева Т Е Особенности дифференцировки В-лимфоцигов у новорожденных детей// Вопросы современной педиатрии 2006 - Т 5 - Jé 4 -С 108-109

5 Зиновьева Т F , Семикина L Л Особенности дифференцировки В-лимфоцитов у новорожденных детей// Матсриачы V Симпозиума с международным участием «Физиология иммунной системы Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний» М,2006 - С 35-36

6 Копыльцова Е А, Семикина Е Л, Зиновьева Т Е Возмолаюсти оценки активации лимфоцитов крови по экспрессии шпошновых рецепторов// Матери&чы XII Конгресса Педиатров России ((Актуальные проблемы педиатрии» М,2008 - С 161 7. Семикина Е Л , Копыльцова Е А, Зиновьева Т Е Субпопуляции клеток памяти CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ в пуповинной крови// Труды Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммуножния - междисциплинарные проблемы» Российский аллергологический журнал - 2008 - № 1 - прил 1 - С 261-262

8. Семикина Е Л, Копыльцова Е А, Зиновьева Т Е, Ходунова Т В Особенности дифференцировки Т-лимфоцитов у новорожденных детей// Материалы Объединенного Иммунологического Форума 2008

9. Семикина Е Л, Зиновьева Т Е, Копыльцова Е А, Давыдова И В , Симонова О И , Мигали А В , Яцык Г В Возрастная динамика уровня В1-лимфоцнтов крови у детей// Российский педиатрический журнал - 2008 -М>4 - С 23-25

Подписано в печать 11 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 724 Тираж 120 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы:

Становление иммунитета происходит постепенно и зависит от целого ряда факторов: гестационного возраста новорожденного, наличия локальных или генерализованных воспалительных процессов, перенесения острой- и - / или хронической гипоксии и т.д.

Несмотря на' многочисленные исследования, иммунной системы новорожденного ребенка, многие аспекты этой проблемы остаются недостаточно изученными. Известно, что у недоношенных новорожденных есть незрелые лимфоциты, но оценка их производилась только по Л антигену и процесс дальнейшей дифференцировки мало изучен:. В частности, недостаточно исследований, посвященных процессам^ дифференцировки иммунных клеток в периферической крови у новорожденных детей разного гестационного возраста и с учетом всех факторов, определяющих иммунокомпетентность. Благодаря новым методикам определения клеточных популяций путем проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток, появилась возможность объективно детально охарактеризовать мембранный фенотип иммунокомпетентных клеток, проследить этапы их созревания, особенности экспрессии рецепторов к основным про - (интерлейкины 8, 5, интерферон) и противовоспалительным^ (интерлейкины 4,10) цитокинам.

Все вышеизложенное обусловило цель настоящей работы.

Цель работы:

Установить особенности экспрессии цитоюшовых рецепторов и созревания различных популяций5 Т- и В-лимфоцитов. у новорожденных детей с перинатальной патологией.

Задачи исследования:

Г. Исследовать комплекс рецепторов лимфоцитов крови для оценки созревания системы, клеточного иммунитета у новорожденных детей;

2. Определить состав основных субпопуляций. Т-лимфоцитов крови у новорожденных детей различного гестационного возраста, в первые 10 суток жизни и в конце неонатального периода;

3. Изучить особенности состава В-лимфоцитов крови, у новорожденных детей' в те же возрастные периоды;

4. Выявить особенности экспрессии цитокиновых рецепторов к основным провоспалительным цитокинам (интерлейкин 2, 5; 8, интерферон-у, фактор некроза опухоли-а) у новорожденных детей различного гестационного возраста, в первые 10 суток жизни и в конце неонатального-периода;

5. Определить особенности экспрессии цитокиновых рецепторов к основным противовоспалительным цитокинам (интерлейкин 4, 10) у новорожденных детей различного гестационного возраста, в те же возрастные периоды.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые у доношенных и недоношенных новорожденных детей исследован- комплекс дифференцировочных антигенов иммунокомпетентных клеток с помощью метода проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток. Впервые изучена динамика состава В1-лимфоцитов в начале и конце периода новорожденности и в пуповинной крови.

Впервые определена экспрессия мембранных рецепторов к провоспалительным цитокинам интерлейкинам 2, 5, 8, интерферону-у, фактору некроза опухоли-а, а также к основным противовоспалительным цитокинам интерлейкинам 4 и 10 на лимфоцитах пуповиной крови и у новорожденных детей в первые 10 суток жизни и в конце неонатального периода. Показан процесс активации клеточных иммунных реакций в ранний период внеутробной жизни, отражающий особенности функционирования иммунной-системы в этом возрасте. Впервые изучена динамика состава субпопуляций лимфоцитов крови и экспрессии, цитокиновых рецепторов в начале и в конце неонатального периода в зависимости от гестационного возраста и наличия инфекционных заболеваний. Доказано негативное влияние развития инфекционно-воспалительных заболеваний периода новорожденное™ на развитие рецепторного аппарата лимфоцитов крови. Показано, что. адекватная реакция иммунной системы недоношенных детей при инфекционных заболеваниях формируется только к концу 1-го месяца жизни.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Доказана диагностическая ^ ценность изучения иммунофенотипа-лимфоцитов крови с определением уровней экспрессии мембранных рецепторов цитокинов, у новорожденных детей различного гестационного возраста.

Методика исследования субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток адаптирована для работы с микродозами крови, что позволило использовать ее у новорожденных, в том числе недоношенных, детей. Применение данной методики-дает возможность изучить этапы созревания иммунокомпетентных клеток и особенностей экспрессии рецепторов к основным про- и противовоспалительным цитокинам.

На основании* изучения иммунофенотипа лимфоцитов крови новорожденных с разным гестационным возрастом на протяжении первого месяца жизни выявлена определяющая роль таких факторов, как. недоношенность и наличие внутриутробного инфицирования, в замедлении созревания иммунной.системы в этой возрастной группе.

Предложен протокол иммунофенотипирования лимфоцитов крови с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов, помогающий дифференцированно проводить профилактические и терапевтические мероприятия, что позволяет снизить риск возможных осложнений и дальнейшей инвалидизации у доношенных и особенно недоношенных детей первого месяца жизни.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ

И ПУБЛИКАЦИИ

На основании результатов настоящего исследования, разработан протокол иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов у новорожденных детей, который был внедрен и используется, в отделении, для недоношенных детей НИИ педиатрии ГУ НЦЗД РАМН с 2007 года.

Результаты, исследования' используются в практической работе отделения для недоношенных детей и отделении диагностики и восстановительного лечения детей с перинатальной патологией Научного Центра Здоровья Детей Российской Академии Медицинских Наук.

Метод иммунофлюоресценции путем проточной цитометрии с применением двойной и тройной флюоресцентных меток используется в клинико-диагностической лаборатории ГУ НЦЗД РАМН для диагностики функционального состояния системы иммунитета у детей раннего возраста.

Результаты настоящей работы были доложены на научно-практической конференции ГУ НЦЗД РАМН «Проточная- цитометрия в диагностике заболеваний» (Москва, 2006), конференции молодых ученых ГУ НЦЗД РАМН (Москва, 2006), научно-практической конференции «Фармакотерапия и фармакокинетика в педиатрии»» (Москва, 2006), заседании проблемной комиссии сотрудников отделения неонатологии и клинико-гематологической лаборатории -ГУ НЦЗД РАМН (Москва, 2006), 2й конференции «Клуба профессиональных иммунологов» (Турция, Анталия, 2007).

Предложенные методы исследования, функционального состояния системы- иммунитета у детей рекомендуется использовать для диагностических целей в работе отделений II этапа выхаживания новорожденных, отделений, патологии детей, раннего возраста. Материалы диссертации, целесообразно включать в учебные курсы для, студентов медицинских факультетов ВУЗов, ординаторов, аспирантов, слушателей факультетов усовершенствования врачей.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

ВЫВОДЫ

1. Адаптация новорожденного ребенка к условиям внеутробной жизни определяет особенности функционирования системы клеточного иммунитета в этом возрастном периоде. У недоношенных детей отмечается задержка созревания иммунной системы, которая приводит к недостаточности ряда клеточных реакций и способствует развитию инфекционных заболеваний.

2. Уровень зрелых Т-клеток, Т-хелперов и Т-супрессоров у доношенных и недоношенных новорожденных детей с перинатальной гипоксией является стабильным и не зависит от развития сопутствующих инфекционных заболеваний. Уровень Т-лимфоцитов с тимическим фенотипом CD3+CD4+CD8+ у детей первой недели жизни превышает 3%, что достоверно выше уровня взрослых. Повышение уровня молодых Т-клеток в циркуляции наиболее выражено у недоношенных детей с клиническими проявлениями инфекционных заболеваний.

3. Общий уровень В-лимфоцитов у детей всех обследованных групп соответствует возрастному диапазону и не имеет различий между группами. В крови новорожденных детей всех групп уровень В1-лимфоцитов значительно превышает уровень данной субпопуляции в пуповинной крови и у детей старшего возраста и составляет 62-67%.

4. В крови новорожденных детей всех групп определяются- значительные популяции молодых активированных лимфоцитов с фенотипом CD19+CD10+ и В1 -лимфоцитов.CD 19+CD10+CD5+. У недоношенных детей, обследованных в конце неонатального периода, с наличием инфекционного процесса выявлено существенное снижение уровня молодых активированных В-лимфоцитов и активированной части В1-лимфоцитов, что- является свидетельством срыва компенсаторных процессов недостаточно зрелой иммунной системы недоношенных детей * при развитии инфекционного заболевания.

5. У доношенных новорожденных к концу первого месяца жизни, выявлено повышение уровня^ активированных лимфоцитов с высокоаффинным рецептором ИЛ-2 CD 122. У недоношенных детей подобная реакция» отсутствует. При анализе экспрессии рецепторов к интерлейкинам 4 и 5 у детей обследованных групп существенной динамики в течение первого месяца жизни не отмечено.

6. Экспрессия рецептора к гамма-интерферону на лимфоцитах крови у новорожденных всех групп однородна, и к концу первого месяца существенной динамики не отмечается. Экспрессия рецептора к ФНО-а у детей первой недели жизни соответствует уровню пуповинной крови, в дальнейшем достоверно« повышается* к месячному возрасту, что является свидетельством активации иммунного ответа.

7. С первых дней жизни на лимфоцитах крови детей всех групп увеличивается» экспрессия рецептора к фактору хемотаксиса ИЛ-8, что является свидетельством активации клеточных иммунных реакций. Это повышение наиболее выражено у детей 3-10*дней жизни с инфекционными заболеваниями.

8. В течение первого месяца жизни на лимфоцитах крови достоверно увеличивается мембранная экспрессия рецептора к основному противовоспалительному цитокину ИЛ-10. Выявлено повышение числа лимфоцитов с рецептором к ИЛ-10 при развитии инфекционных заболеваний, особенно выраженное у доношенных детей первой недели жизни. Адекватная реакция увеличения экспрессии рецептора к ИЛ-10 при инфекционных заболеваниях у недоношенных детей выявляется только к концу 1-ого месяца жизни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использование протокола иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов; у новорожденных детей рекомендуется в отделениях I и II этапов выхаживания новорожденных, а также в центрах реабилитации детей раннего возраста с различными* видами перинатальной патологии и ее последствий для* определения степени, зрелости- иммунной системы, а также для контроля, за эффективностью проводимого лечения (в дополнение к традиционному определению факторов гуморального иммунитета в сыворотке крови).

2. Особенности становления иммунокомпетентности у доношенных и» недоношенных новорожденных необходимо учитывать при назначении терапии детям с различным гестационным возрастом. Особенно важно учитывать задержку становления иммунитета у недоношенных новорожденных.

3. Рекомендовано применение протокола иммунофенотипирования лимфоцитов крови, с учетом экспрессии цитокиновых рецепторов, у новорожденных детей из группы риска внутриутробного инфицирования в качестве дополнительного критерия оценки тяжести и прогнозирования течения инфекционно воспалительных заболеваний.