Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Особенности морфогенеза гранулематоза в печени мышей при силикотуберкулезе



На правах рукописи

Карпов Михаил Александрович

ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА ГРАНУЛЕМАТОЗА В ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПРИ СИЛИКОТУБЕРКУЛЁЗЕ

14.03.02 - патологическая анатомия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

3 О СЕН 2010

Новосибирск - 2010

004609993

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Учреждении Российской академии медицинских наук «Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН» (Новосибирск).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, академик РАМН Шкурупий Вячеслав Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Надеев Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Зайдман Алла Михайловна Обухова Лидия Александровна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится «»/92010 г. в (дч.. на заседании диссертационного совета Д 208.062.05 при Новосибирском государственном медицинском университете (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (8-383)229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52)

Автореферат разослан « ;_2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А. В. Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что морфологическими проявлениями туберкулеза и силикоза являются гранулемы, состоящие, в основном, из фагоцитирующих клеток и нх производных (Струков В. В., Кауфман О. Я., 1989; Шкурупий В. А., 2001, 2007; Boros D. L., 2003). При попадании в организм животных оба гранулемогенных фактора, вне зависимости от очередности введения, персистируют в вакуолярном аппарате макрофагов и поэтому, можно полагать, способны взаимно отягощать патологический процесс на всех этапах его развития (Новикова М. С. и соавт., 2008; Anderson J A. et al., 2008), что, собственно и подтверждается клинической практикой (Mulenga Е., 2005; Rees D., Murray J., 2007). Вместе с тем, клинические исследования не предоставляют возможностей изучения процессов, происходящих в основных компартментах системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) и особенностей патогенеза, обусловливающих тяжесть этих заболеваний и их осложнений.

Одним из наиболее распространенных осложнений гранулематозов, в частности туберкулеза и силикоза, является фиброз. Лучше изучены эти осложнения в гранулемах, как таковых, а из органов - в легких (Byrne J. D., Baugh J. A. 2008; Cassel S. L., et. al., 2008). Известно, что оба эти заболевания нередко проявляются системно (Шкурупий В. А., 2007; Уланова Е. В. и соавт., 2009; Hamilton R. F. Jr. et al., 2008). Однако патологические проявления в иных органах (кроме легких) при этих заболеваниях, особенно при силикотуберкулезе, остаются недостаточно изученными. Наибольшее внимание, в этой связи, привлекает печень как основной компартмент СМФ.

Фагоциты обладают большим деструктивным потенциалом, сосредоточенным в их лнзосомах (Шкурупий В. А и соавт., 1999. Шкурупий В. А., 2007), который при гранулематозах увеличивается в связи с продукцией макрофагами гранулем активированных кислородных метаболитов (АКМ) (Меньшикова Е. Б. и соавт., 2006), а в случае туберкулеза - деструкция печени увеличивается в связи с агрессивной его полихимиотерапией

3

(Кононенко В. Г., Шкурупий В. А., 2002; Шкурупий В. А., 2007). Это предполагает возможность масштабных повреждений в паренхиме печени при силикотуберкулезе, развития постдеструктивных осложнений, способных значительно изменить структуру и функцию этого центрального органа гомеостазирования у млекопитающих.

Цель исследования: изучить особенности патоморфогенеза гранулематозного воспаления в печени мышей линии СВА и реагирования системы мононуклеарных фагоцитов (её центрального и периферического звеньев) при силикотуберкулезе.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности образования, топологию гранулём при силикотуберкулезе в печени мышей.

2. Изучить динамику изменений клеточного состава гранулём при силикотуберкулезе в печени мышей.

3. Изучить особенности реагирования центрального и периферического звеньев системы мононуклеарных фагоцитов при силикотуберкулёзе.

4. Исследовать особенности деструктивных и репаративных процессов в паренхиме печени мышей при силикотуберкулёзе.

5. Изучить особенности фиброзирования гранулём и печени мышей при силикотуберкулёзе.

Положения, выносимые на защиту:

1. При генерализованном силикотуберкулёзе доминирующими являются биологические эффекты частиц оксида кремния, проявляющиеся более ранним (с 3-х суток) и динамичным формированием и «развитием» гранулём, эпителиоидно-клеточного «ядра», ранним и массивным фиброзом гранулём и печени в целом, чем при гранулематозах только микобактериалыюй или силикотической этиологии.

2. Для генерализованного силикотуберкулёза характерны более ранние и масштабные повреждения паренхимы печени, подавление процессов клеточной

и внутриклеточной реиаративной регенерации, чем при БЦЖ-гранулематозе или силикозе.

3. На ранних сроках генерализованного силикотуберкулёза усилена миграция моноцитов из костного мозга в гранулёмы и периферическую кровь, а на поздних сроках - их элиминация из гранулём и задержка моноцитов в костном мозге.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что для БЦЖ-

гранулематоза, и гранулематозов, индуцированных двуокисью кремния или ее сочетанным введением с БЦЖ, характерны повышенная элиминация моноцитов из костного мозга, включение их в гранулемы в ранние периоды после введения гранулемогенных факторов и последующая задержка их в костном мозге с 56 по 180 сутки.

Показано, что при силикотуберкулёзе наибольшее влияние на развитие процесса оказывают частицы оксида кремния: при силикозе и силикотуберкулёзе не характерен процесс «диссоциации» гранулём, но свойственно увеличение количества и размеров гранулём, по сравнению с БЦЖ-гранулематозом.

Показано, что при силикотуберкулёзе рано (с 3-х суток) формируются эпителиоидно-клеточные гранулёмы в печени, в сравнении с гранулематозным воспалением при силикозе или только при туберкулёзе.

Впервые показано, что как для силикоза, так и для силикотуберкулёза свойственен прогрессирующий фиброз гранулём: к б месяцу эксперимента коллагеновые и аргирофильные волокна занимают более 90 % объёма гранулём. Однако, только для силикотуберкулёза характерна более выраженная пролиферация фибробластов, чем при силикозе и БЦЖ-гранулематозе. Фиброз в гранулёмах при силикотуберкулёзе достигается увеличением количества фибробластов, тогда как при силикозе фиброзирование гранулём обусловлено увеличением коллаген-синтетической активности фибробластов.

Впервые показано более выраженное угнетение процессов клеточной и внутриклеточной регенерации при силикозе и силикотуберкулёзе, чем при

туберкулёзе, что, видимо, связано с более выраженным токсическим действием на гепатоциты частиц Б Юг-

Фибротические осложнения хронических гранулематозов смешанной (силикотической и туберкулёзной) и силикотической этиологии в печени мышей носят не заместительный характер, а прогрессирующий, в отличие от такового при БЦЖ-гранулематозе.

Практическая значимость работы. Полученные данные дополняют и обобщают известные сведения об особенностях патоморфогенеза хронического генерализованного гранулематозного воспаления при силикотуберкулёзе, и должны учитываться при подборе средств лечения больных силикотуберкулёзом, обладающих возможной гепатотоксичностью.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были представлены на Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы морфологической диагностики заболеваний» (Витебск, 2008), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова «Актуальные вопросы современной патологии» (Красноярск, 2008), на четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), на III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009), на Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова «Современные проблемы общей и частной патологической анатомии» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций основных результатов исследования.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы,

описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 46 рисунками и содержит 12 таблиц. Библиографический указатель включает 267 источников (71 отечественных и 196 зарубежных авторов).

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на 210 мышах-самцах линии СВА, массой 20-22 г. Животные получены из питомника НИИ цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Эксперимент проводили в соответствии с приказом министерства здравоохранения СССР № 755 от 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом дислокацией шейных позвонков с последующей декапитацией с целью забора крови. Для исследования забирали печень, периферическую кровь, костный мозг.

Животных разделили на 4 группы, в 3-х группах - по 60 животных, в 4-й группе - 30 животных, в каждой, по 10 мышей в каждой точке эксперимента. Мышам 1-й группы первоначально внутривенно вводили раствор Si02 марки S-563 (1-5 мкм), («Sigma», США) в дозе 100 мкг/кг в 0,5 мл стерильного 0,85 % водного раствора NaCl. Через 10 суток подопытным животным 1-й группы внутрибрюшинно вводили 0,5 мг вакцины БЦЖ (ГП «Аллерген», г. Ставрополь) в 0,2 мл стерильного 0,85 % водного раствора NaCl. У мышей 2-й группы индуцировали силикотическое гранулематозное воспаление однократным введением в хвостовую вену взвеси частиц Si02 в той же дозе, что и мышам 1-й группы. У мышей 3-й группы индуцировали гранулематозное воспаление туберкулезной этиологии путем внутрибрюшинного введения 0,5 мг вакцины БЦЖ в той же дозе, что и мышам 1-й группы. Образцы тканей

забирали на 3, 10, 28, 56, 120, 180 сутки после введения вакцины БЦЖ (для 1-й и 3-й групп мышей) и взвеси частиц Si02 (для 2-й группы животных). Мышам 4-й группы внутривенно вводили 0,85 % водный раствор NaCl.

Объектом для исследования служила печень. Из каждого образца печени на микротоме готовили по 4-6 срезов толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по Ван-Гизону, азотнокислым серебром по Свиту и Гордону (Саркисов Д. С., ПеровЮ. Л., 1996). Гистологические срезы исследовали в световом микроскопе «Axiostar».

Морфометрическое исследование печени проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в работах, посвященным методам теоретического обоснования и их применения в практике (Христолюбова Н. Б., 1974; Автандилов Г. Г., 1990, 1994; Weibel Е. R., 1979).

При помощи окуляр-микрометра измеряли диаметры гранулем. При помощи морфометрической сетки из 25 точек (16 квадратов), вставленной в окуляр, подсчитывали численную плотность гранулем (Nai), объемную плотность (Vv): очагов некрозов и зон с дистрофическими изменениями гепатоцитов, фуксинофильных и аргирофильных волокон в соотношении с площадью гранулем (Филимонов П. Н., 1996; Надеев А. П.,1998; Козяев М. А., 1999; Шкурупий В. А., 2007). Исследовали клеточный состав гранулем: подсчитывали количество макрофагов, эпителиоидных клеток, лимфоцитов, нейтрофилов и фибробластов в гранулёмах (за 100 % принимали общее количество клеток в гранулёме) (Шкурупий В. А., 2007).

Для оценки коллаген-синтетической функции фибробластов в гранулёмах показатели объемной плотности коллагеновых волокон в гранулемах Vv (%) соотносили с относительным количеством фибробластов в гранулемах (%) (Филимонов П. Н., 1996). Для оценки активности созревания ретикулиновых волокон в коллагеновые соотносили объемные плотности (Vv) фуксинофильных и аргирофильных волокон.

Исследование клеточного состава красного костного мозга и периферической крови проводили совместно с научным сотрудником

10. С. Бугримовой (Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск), директор - академик, профессор, д.м.н. Шкурупий В. А.). Мазки крови окрашивали по методу Романовского-Гимза (Саркисов Д. С., Перов Ю. Л., 1996). Костный мозг для исследования получали из бедренной кости и грудины животного (Горизонтов П. Д. с соавт., 1983). Анализ миелоцитограмм проводили в мазках, окрашенных по Папенгейму.

Статистическую обработку данных проводили в соответствии с принципами вариационной статистики (Лакина Г. Ф., 1980). Достоверность различий сравниваемых величин определяли при помощи критерия Стьюдента при условии нормального распределения величин исследуемых параметров. Различия между сравниваемыми средними величинами считали достоверными при р < 0,05.

Статистическую обработку полученных в ходе морфометрического исследования данных проводили с использованием лицензированного пакета программ Microsoft Word и Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

При гистологическом исследовании печени мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ) на 3, 10, 28 сутки после заражения вакциной БЦЖ, обнаруживали преимущественно эпителиоидно-клеточные гранулёмы, а также макрофагальные гранулёмы. На 56, 120 и 180 сутки наблюдали крупные, нередко сливающиеся между собой, эпителиоидно-клеточные и фиброзирующиеся гранулёмы, в центрах которых обнаруживали апоптотические тельца. Вокруг гранулём и вне связи с ними выявляли некротизированные гепатоциты. На периферии печёночных долек обнаруживали гепатоциты в состоянии вакуольной, вплоть до баллонной, дистрофии и микро очаги из гепатоцитов в состоянии некроза.

При гистологическом исследовании печени мышей 2-й группы (силикоз) на 3 и 10 сутки после введения частиц оксида кремния обнаруживали преимущественно макрофагальные гранулёмы, с единичными эпителиоидными

клетками. Через 28 суток после введения частиц оксида кремния в печени мышей 2-й группы преобладали эпителиоидно-клеточные гранулёмы, однако макрофагальные гранулёмы продолжали персистировать. С 56 суток в гранулемах обнаруживали апоптотические тельца. На 180 сутки в гистологических срезах печени мышей 2-й группы (силикоз) гранулёмы достигали больших размеров, состояли из эпителиоидных клеток, а также коллагеновых и аргирофильных волокон, нередко сливались. Обнаруживали гиперплазию синусоидальных клеток.

При исследовании гистологических срезов печени мышей 3-й группы (БЦЖ), с 3 по 10 сутки после заражения вакциной БЦЖ наблюдали преимущественно макрофагальные гранулёмы, в которых выявляли эпителиоидные клетки. На 28 сутки в печени мышей 3-й группы (БЦЖ) преобладали эпителиоидно-клеточные гранулёмы. В паренхиме печени во все периоды после заражения вакциной БЦЖ обнаруживали признаки вакуольной дистрофии, вплоть до баллонной, на 28 и 56 сутки, обнаруживали микро очаги гепатоцитов в состоянии некроза.

Nai мкм

3 I

2,5 -

2 •

1,5 -

1 -

i

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки)

3 10 28 56 120 180

□ БЦЖ О Силикоз 0 Смликоз+БЦЖ

Периоды наблюдения (сутки) □ БЦЖ О Силикоз ИСиликоз+БЦЖ

Рис. 1. Численная плотность (№Г) рис. 2. Диаметры гранулём

гранулём в печени мышей различной этиологии в печени

У животных в 1-й группе (силикоз+БЦЖ) с 3 по 180 сутки количество (рис. 1) и размеры (рис. 2) гранулём увеличивались, с наиболее выраженным

ростом величин этих показателей на 120 сутки. У мышей 2-й группы (силикоз) с 3 по 180 сутки размеры и количество гранулём также увеличивались, а наибольший рост этих показателей наблюдали на 180 сутки. У мышей 3-й (БЦЖ) группы количество (рис. 1) и размеры (рис. 2) гранулём увеличивались с 3 по 56 сутки эксперимента, однако величины данных показателей уменьшились на 120 сутки и оставались неизменными до 180 суток. Таким образом, в гранулёмогенезе смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии более выражены биологические эффекты частиц оксида кремния, чем микобактерий туберкулёза. У животных в 1-й группе (силикоз+БЦЖ) с 28 по 56 сутки было меньшее количество гранулём, что, возможно, обусловлено повторным захватом патологических агентов макрофагами, находящимися в гранулёмах.

Динамика изменения содержания макрофагов (рис. 3) в гранулёмах у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группы была в большей степени сходна с таковой у мышей 2-й (силикоз) группы, чем у мышей в 3-й (БЦЖ) группе, что свидетельствует о более выраженном гранулёмогенном эффекте частиц SiOj. Содержание макрофагов в гранулёмах печени у мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ) с 3 по 56 сутки было меньшим, в сравнении с величиной аналогичных показателей у животных 2-й (силикоз) и 3-й (БЦЖ) групп, во всех периодах наблюдения, что, по-видимому, обусловлено не только токсическим действием частиц оксида кремния на макрофаги с последующей их гибелью в гранулёме (Hamilton R. F. Jr., 2008), но и токсическим действием метаболитов микобактерий туберкулёза. Это подтверждается наличием в гранулёмах апоптотических телец и элиминацией клеток из центров гранулём к концу эксперимента.

На 3 сутки силикотуберкулёза формировалось эпителиоидноклеточпое «ядро» гранулём, что подтверждалось преобладанием в гранулёмах силикотуберкулёзной этиологии эпителиоидных клеток (ЭК) и меньшим количеством макрофагов. В составе гранулём двух других экспериментальных

групп животных преобладали макрофаги, количество которых уменьшалось к концу эксперимента, а количество ЭК к 180 суткам, напротив, увеличивалось.

%

60 -) 50 т 40 - ,-Ц 30 -20 - :: ю - ; о -Щ-

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки) □ БЦЖ □ Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 3. Содержание макрофагов в гранулёмах различной этиологии в печени мышей

Периоды наблюдения (сутки) □ БЦЖ □ Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 4. Содержание эпителиоидных клеток в гранулёмах различной этиологии в печени мышей

Содержание нейтрофилов (рис. 5) в гранулёмах печени у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группы с 3 на 180 сутки после введения гранулёмогенных факторов уменьшилось в 2 раза. При этом у мышей во 2-й (силикоз) группе количество нейтрофилов на 3 сутки было больше величин аналогичных показателей у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) и 3-й (БЦЖ) групп, и к 180 суткам уменьшилось в 21 раз в сравнении с величиной аналогичного показателя на 3 сутки эксперимента. В гранулёмах печени у мышей в 3-й (БЦЖ) группе во всех периодах исследования количество нейтрофилов было меньшим, в сравнении с таковым у животных 1-й (силикоз+БЦЖ) и 2-й (силикоз) групп. Вероятно, усиление миграции нейтрофилов в гранулёмы связано со стимулирующим действием частиц оксида кремния у мышей в 1-й (силикоз+БЦЖ) и 2-й (силикоз) группах в отношении секреторной активности макрофагов, приводя к увеличению ГМ-КСФ и увеличению количества нейтрофилов в периферической крови (Цыбенов Ю. Ю., 2005).

%

5 4 3 2 1 О

А /

Ii ь * a ña -Г

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки) □ БЦЖ □ Силикоз О Силикоз+БЦЖ

Рис. 5. Содержание нейтрофилов в гранулёмах различной этиологии в печени мышей линии СВА.

%

25 20 15 10 5 0

,-вч П-Й

Ml

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки) □ БЦЖ □ Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 6. Содержание фибробластов в гранулёмах различной этиологии в печени.

С 3 по 180 сутки после введения гранулёмогенных факторов количество фибробластов (рис. 6) в гранулёмах печени мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ) увеличивалось, и к 180 суткам было больше величины аналогичного показателя у животных 2-й (силикоз) и 3-й (БЦЖ) групп. С 3 по 180 сутки увеличивался объём аргирофильных (рис. 7), а также коллагеновых волокон (рис. 8) в гранулёмах печени мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ), однако к 180-м суткам его величина не отличалась от величины аналогичного показателя 2-й группы (силикоз). Таким образом, фибропластическая активность фибробластов (табл. 1) у животных в 1-й (силикоз+БЦЖ) группе была больше таковой у живтных 2-й (силикоз) и 3-й (БЦЖ) групп. Это свидетельствует о выраженном профиброгенном действии частиц оксида кремния (Fijimura N., 2000; Chong S. et al., 2006; Byrne J. В., Baugh J. А., 2008; Hamilton R. F. Jr. et al., 2008), очевидно, преобладающем в гранулёмах смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии в печени мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группы. Однако увеличение содержания коллагеновых и аргирофильных волокон в гранулёмах у мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ) было связано с увеличением количества фибробластов, а у животных во 2-й группе (силикоз) - с увеличением активности синтеза этих волокон фибробластами. Кроме того, прогрессирующий, характерный для силикотического гранулематоза, «луковичный» склероз гранулём в печени мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группы

13

наблюдали на 120 сутки, тогда как у животных 2-й (силикоз) группы - на 180 сутки эксперимента.

Таблица 1

Отношение объёмной плотности (Vv) коллагеновых волокон и количества фибробластов в составе гранулём различной этиологии как показатель «фибропластической активности» фибробластов в печени мышей линии

СВА (М±ш).

Период с момента Условия эксперимента

заражения 1-я группа 2-я группа 3-я группа

(сутки) (Si02+ БЦЖ- (БЮг-гранулематоз) (БЦЖ-гранулематоз)

гранулематоз)

3 3,61 ±0,67 с 6,50 ±2,43 * 3,41 ± 1,22

10 2,35 ±0,27 вс 19,33 ± 7,86 я 1,53 ± 0,43

28 11,16 ± 1,30 8С 20,63 ± 3,40 а 7,22 ± 0,97

56 11,90 ±1,03 с 9,49 ±1,13 а 11,41 ±0,70

120 4,89 ±0,14 ЕС 10,81 ±0,61 а 7,54 ±0,58

180 4,37 ±0,12 с 10,54 ±0,52 а 4,72 ± 0,23

Примечание: 1. «а» - достоверные отличия показателей 2-й группы (силикоз) в сравнении с 3-й группой (БЦЖ); 2. «в» - достоверные отличия показателей 1-й группы (Х^О;!- БЦЖ) в сравнении с 3-й группой (БЦЖ); 3. «с» - достоверные отличия показателей 1-й группы (ЯЮ2+ БЦЖ) в сравнении с 2-й группой (силикоз), р<0,05.

На ранних сроках силикотуберкулёзного гранулематоза наблюдали уменьшение абсолютного количества моноцитов в крови (рис. 9) и костном мозге (рис. 10) мышей по отношению к величине аналогичного показателя в группе контроля, в связи с рекрутированием моноцитов из костного мозга и периферической крови в гранулёмы, размеры и количество которых увеличивались.

%

50 40 30 20 10 0

ЖГЗЖ».

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки)

-БЦЖ □ Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 7. Объемная плотность (Уу)

аргирофильных волокон в гранулемах различной этиологии

%

80 70 60 50 40 30 20 10 0

скСкй...

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки) И БЦЖ □ Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 8. Объемная плотность (\'у) коллагеновых волокон в гранулемах различной этиологии

7 6 5 4 3 2 1 0

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки)

□ Контрольная группа

□ БЦЖ

О Силикоз 0 Силикоз+БЦЖ

Рис. 9. Абсолютное количество моноцитов в костном мозге

1,2 1

0,8 -0,6 0,4 0,2 0

_М

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки)

□ Контрольная группа

□ БЦЖ

О Силикоз О Силикоз+БЦЖ

Рис. 10. Абсолютное количество моноцитов в периферической крови

На поздних сроках эксперимента при силикотуберкулёзе обнаруживали задержку моноцитов в костном мозге (рис. 9), при этом в периферической крови (рис. 10) их количество не отличалось от величины аналогичного показателя группы контроля. Эти изменения, возможно, обусловлены не только частичной элиминацией микобактерии туберкулёза из гранулём у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группы, что сопровождается уменьшением численной

плотности гранулём к 56 суткам эксперимента на 37,5 %, в сравнении с аналогичным показателем на 28 сутки (рис. 1), но и «запиранием» костного мозга, возможно, в связи с увеличением содержания глюкокортикоидных гормонов в надпочечниках мышей (Palchikova N. A. et al., 2008), обусловленном стимулирующим действием частиц Si02 на продукцию ИЛ-1 (Hamilton R. F. Jr. et al., 2008).

Таблица 2

Объемная плотность (Vv) дистрофически и некротически измененных геиатоцитов в печени мышей линии СВА при гранулематозах различной

этиологии (М±ш).

Исследован Период с Условия эксперимента

ные момента 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа

параметры заражения (Si02+ БЦЖ- (Si02- (БЦЖ- (контроль)

(сутки) гранулематоз) гранулематоз) гранулематоз)

Дистрофия 3 66,44 ± 0,6 8вс 64,31 ±0,72 а 75,06 ± 0,74 11,71 ±0,98

(Vv) 10 65,20 ±0,69 с 59,68 ± 0,73 а 64,80 ± 0,69 -

28 57,82 ± 0,87вс 54,57 ± 0,68 а 62,26 ± 0,66 -

56 59,28 ± 0,79 с 54,62 ± 0,97 а 57,91 ±0,86 -

120 60,57 ± 0,74 с 55,95 ± 0,73 а 60,80 ±0,77 -

180 59,15 ± 0,77вс 51,20 ±0,90 а 66,26 ± 0,69 -

Некроз (Vv) 3 25,64 ± 0,60вс 31,20 ±0,70 а 20,26 ± 0,74 0,75 ± 0,28

10 25,28 ± 0,72 с 33,28 ± 0,72 а 25,64 ±0,83 -

28 35,20 ± 0,77вс 38,44 ±0,65 а 30,40 ± 0,72 -

56 36,26 ±0,81вс 38,40 ±0,97 а 33,73 ± 0,84 -

120 35,91 ±0,81 в 35,95 ±0,82 а 33,73 ± 0,78 -

180 36,13 ±0,83 в 38,84 ±0,88 а 26,66 ± 0,77 -

Некроз гепатоцитов, возможно, обусловлен токсическим действием частиц оксида кремния, синтезом активных метаболитов кислорода (АКМ) (Меныцикова Е. Б. и др., 2006; Fubini В., Hubbard А., 2003), продукцией свободных радикалов кислорода, оксида азота и кремния (Valko М. et al., 2007). Возможно, увеличение активности фагоцитов сопровождается дегрануляцией

16

нейтрофилов и макрофагов, выбросом лизосомальных ферментов в синусоиды паренхимы печени, обусловливая лизис гепатодитов.

Таблица 3

Соотношения объёмных плотностей (V,.) гепатоцитов в состоянии некроза и вакуольной дистрофии в начале (3 сутки) и в конце (180 сутки)

эксперимента при гранулематозах различной этиологии (М±т).

Период с момента заражения (сутки) Условия эксперимента

1-я группа (Si02+ БЦЖ-гранулематоз) 2-я группа (вЮг-гранулематоз) 3-я группа (БЦЖ-гранулематоз)

3 0,38 ± 0,01 0,48 ± 0,01 а 0,26 ±0,01

180 0,61 ±0,01 в 0,75 ± 0,02 а 0,40 ±0,01

Объёмные плотности дистрофически измененных гепатоцитов (табл. 2) в паренхиме печени у мышей во всех экспериментальных группах уменьшалась к концу эксперимента. С 3 по 180 сутки увеличивались объёмные плотности некрозов (табл. 3) гепатоцитов у мышей во всех экспериментальных группах. Величина коэффициента, полученного при соотношении объёмных плотностей некротически и дистрофически измененных гепатоцитов (табл. 3), увеличивалась к концу эксперимента во всех группах, но в большей степени у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) группе. Это свидетельствует о некрозе дистрофически измененных гепатоцитов вследствие подавления механизмов внутриклеточной регенерации.

При гранулематозах различной этиологии, особенно в печени мышей 1-й группы (силикоз+БЦЖ), с 3 по 180 сутки уменьшалось количество двуядерных гепатоцитов (табл. 4), видимо, в связи с их деструкцией, следовательно, репаративный процесс был подавлен и на клеточном уровне, особенно у мышей с силикотуберкулёзом.

Таблица 4

Объемная плотность (Vv) двуяденых гепатоцитов в печени мышей линии СВА при хронических гранулематозах различной этиологии (М±т).

Исследован Период с Условия эксперимента

ные момента 1 -я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа

параметры заражения (Si02+ БЦЖ- (SiOr (БЦЖ- (контроль)

(сутки) гранулематоз) гранулематоз) гранулематоз)

Двуядерные 3 18,75 ±0.77 в 18,53 ±0,83 а 24,44 ± 0,83 17,85 ± 1,16

гепатоциты 10 17,68 ±0,78 в 18,26 ±0,82 а 25.64 ± 0,83 -

(Vv) 28 12.53 ± 0,63 вс 16.04 ±0,64 16.26 ±0.86 -

56 13,77 ±0,70 с 15,33 ± 0.71 а 12,31 ±0.66 -

120 15,06 ±0,78 с 12,57 ± 0,74 а 14.53 ±0.79 -

180 12,53 ± 070 в 11,24 ± 0,60 а 16,48 ±0,79 -

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки) В БЦЖ □ Силикоз а Силикоз+БЦЖ

Рис. 11. Объёмная плотность (Уу) аргирофильных влокон в портальных трактах печени

20

16 12 8 4 0

.ЛеСЙ,

3 10 28 56 120 180 Периоды наблюдения (сутки)

□ БЦЖ О Силикоз И Силикоз+БЦЖ

Рис. 11. Объёмная плотность (Уу) аргирофильных влокон в портальных трактах печени

К концу эксперимента (120 и 180 сутки) расширялись и склерозировались перипортальные пространства. В перипортальных пространствах у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) и 2-й (силикоз) групп наблюдали увеличение объёмных плотностей аргирофильных (рис. 11) и коллагеновых волокон (рис. 12) с 3 по 180 сутки. При этом продукция аргирофильных волокон не прекращалась в печени у мышей в этих группах. В перипортальных зонах печени мышей 3-й

18

(БЦЖ) группы рост объёма ретикулиновых и коллагеновых волокон был заметен с 3 по 56 сутки, однако количество волокнистых структур убывало на 120 и 180 сутки.

ВЫВОДЫ

1. У мышей с генерализованным силикотуберкулёзом в печени существенно раньше (на месяц), чем при силикозе и туберкулёзе и в большем количестве формируются гранулёмы, размеры которых продолжают увеличиваться и через 6 месяцев наблюдений, что свидетельствует о высоком гранулёмоиндуцирующем потенциале одновременно воздействующих на организм М. tuberculosis и окисида кремния:

а) каждый из использованных гранулёмогенных факторов обладает различной способностью к индукции и развитию эпителиоидноклеточного «ядра» гранулём. При силикотуберкулёзе оно формируется наиболее рано и остаётся на постоянном уровне в процессе развития гранулематоза, тогда как при его индукции М. tuberculosis и SÍO2 - постоянно увеличивается.

б) при силикотуберкулёзе в гранулёмах во все периоды их образования доля макрофагов/моноцитов значительно меньше, чем при при силикозе и БЦЖ-гранулематозе.

в) двуокись кремния как гранулёмогенный фактор, детерминирует нейгрофилёз гранулём при силикозе и силикотуберкулёзе, индуцирует апоптоз макрофагов в гранулёмах.

2. При формировании и развитии гранулём, индуцированных микобактериями БЦЖ, двуокисью кремния, их совместным введением наблюдали различную динамику транслокаций клеток системы мононуклеарных фагоцитов в гранулёмы и из них, а также из костного мозга и в крови:

а) мобилизация моноцитов из костного мозга при силикотуберкулёзе происходит раньше (с 3-х суток), чем при силикозе и БЦЖ-гранулематозе.

б) в костном мозге у мышей трех различных форм гранулематозов формируется эффект, так называемой, блокады костного мозга, наиболее выраженный при БЦЖ-гранулематозе.

в) при силикотуберкулёзе концентрация моноцитов в периферической крови уменьшалась по мере увеличения интенсивности гранулёмообразования. В большей степени «резервы» моноцитов крови к 6-ти месяцам эксперимента истощались у мышей с силикозом и силикотуберкулёзом, чем с БЦЖ-гранулематозом при очевидной недостаточности поступления моноцитов из костного мозга. Процесс «диссоциации» гранулём при БЦЖ-гранулематозе обусловил поддержание физиологического уровня моноцитов в периферической крови при наличии феномена, так называемой блокады костного мозга.

3. При силикотуберкулёзе высокий уровень пролиферации фибробластов в гранулёмах печени, особенно через 6 месяцев, после введения гранулёмогенных факторов обусловливает больший уровень фиброза гранулём при меньшей «фибропластической активности» фибробластов, чем при БЦЖ-гранулематозе и силикозе, где фиброзирование гранулём обусловлено большей «фибропластической активностью» фибробластов, нежели процессом их пролиферации.

4. При всех исследованных гранулематозах процесс фиброзирования гранулём начинался с первых дней образования гранулём и не имел тенденций к завершению, о чём свидетельствует увеличение соотношения аргирофильных и коллагеновых волокон в гранулёмах, и в большей степени при силикозе.

5. Оба гранулёмогенных фактора, использованных порознь и вместе обладают высоким продеструктивным потенциалом в отношении гепатоцитов:

а) процессы вакуольной дистрофии и некроза гепатоцитов охватывают более 90 % гепатоцитов. В наибольшей степени они были выражены у мышей с силикозом и силикотуберкулёзом, чем с БЦЖ-гранулематозом.

6. При изолированном силикозе и силикотуберкулёзе развивается депрессия репарагивных процессов в паренхиме печени:

а) клеточная репаративная регенерация в печени мышей о которой судили по концентрации двуядерных гепатоцитов, при силикозе и силикотуберкулёзе была снижена в начале эксперимента и продолжала уменьшаться к б-му месяцу от его начала, тогда как у мышей с БЦЖ-гранулематозом уровень клеточной регенерации был повышен в начале эксперимента, и достигал физиологического уровня в его конце.

б) процессы внутриклеточной регенерации гепатоцитов, о которой судили по динамике соотношения количества гепатоцитов в состоянии вакуольной дистрофии и некроза, имели место только у мышей с БЦЖ-гранулематозом.

7. В зонах повреждения паренхимы печени фибропластические процессы не носили заместительного характера, поскольку развивались преимущественно в портальных трактах, тогда как зоны деструкции располагались диффузно.

а) двуокись кремния обладает высокой профиброгенной активностью, а в сочетании с инфицированием микобактериями туберкулёза она усиливается.

б) при генерализованных силикозе, БЦЖ-гранулематозе и силикотуберкулёзе процесс фиброзирования печени начинается на ранних этапах гранулёмообразования, но чрезвычайно усиливается (в 5 -6 раз) к 4-6 месяцам после его индуцирования при силикозе и силикотуберкулёзе, очевидно, в связи с существенным изменением в этих случаях соотношения в органе и гранулёмах клеток СМФ (уменьшение) и фибробластов (увеличение).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные позволяют предполагать у больных силикотуберкулёзом более выраженное прогрессирование деструктивных процессов, подавление механизмов регенерации печени на различных структурных уровнях, возможность фибротических осложнений не только в лёгких, но и в печени.

Новые результаты исследования структурной организации печени при хроническом гранулематозном воспалении и особенностей развития силикотуберкулёза могут быть использованы для преподавания общей и

частной патологической анатомии в разделах: «Дистрофия», «Некроз», «Склероз», «Продуктивное воспаление», «Компенсаторные и приспособительные процессы», «Туберкулёз», «Силикоз».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ШкурупийВ. А., НадеевА.П., Карпов М. А., Бугримова Ю. С. Цитоморфологические исследования реакции системы мононуклеарных фагоцитов при гранулематозе смешанной (силикотической и туберкулезной) этиологии в эксперименте II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2010.-Т. 149.-№4.-С.448-452, автора-0,15 п.л.

2. Карпов М. А., Шкурупий В. А., Надеев А. П. Исследование фибротических осложнений в гранулемах при хроническом силикотуберкулезе у мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2010. — Т. 149. - № 5. - С.594 - 598, автора - 0,2 п.л.

3. Карпов М. А., ШкурупийВ. А., НадеевА.П. Исследование деструктивных и репаративных процессов в печени при хроническом гранулематозе смешанной (силикотической и туберкулезной) этиологии в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2010. - Т. 149. -№ 6. - С.622 - 626, автора -0,16 п.л.

4. Карпов М. А., Надеев А. П., Шкурупий В. А. Особенности гранулематоза микст-этиологии в печени мышей линии СВА // Актуальные вопросы морфологической диагностики заболеваний : материалы Республиканской научно-практической конференции - Витебск, 2008. - С. 185187, автора - 0,12 п.л.

5. Карпов М. А., НадеевА.П., ШкурупийВ. А. Особенности фиброзирования гранулём при хроническом гранулематозном воспалении смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии в печени // Современные проблемы общей и частной патологической анатомии: материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры

патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова. -СПб, 2009. - С. 60-62, автора - 0,12 п.л.

6. Карпов М. А., Надеев А. П., Шкурупий В. А. Особенности деструктивных и компенсаторных изменений в печени мышей при хроническом гранулематозном воспалении смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов : материалы Четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2009.

- С. 90-91, автора - 0,08 п.л.

7. Карпов М. А., Надеев А. П., Шкурупий В. А. Морфологические аспекты гранулёмогенеза силикотической и туберкулёзной этиологии в печени у мышей // Актуальные вопросы современной патологии : материалы Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова. - Красноярск, 2008. -194-197, автора - 0Д6 п.л.

8. Карпов М. А., Надеев А, П., Шкурупий В. А. Особенности динамики клеточного состава гранулём смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии в печени мышей // Актуальные вопросы патологической анатомии : материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. - Самара, 2009.

- С. 218-220, автора - 0,12 п.л.

9. Карпов М. А. Особенности гранулемагозного воспаления смешанной этиологии в печени .// «Авиценна-2006» : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых учёных. - Новосибирск, 2006. - С. 74 - 75, автора - 0,25 пл.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного Технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, тел./факс: (383) 346-08-57 формат 60x84 1\16, объем 1,5 пл., тираж 100 экз. заказ № 281 подписано в печать 09.09.2010 г.

В последние годы эпидемиологическая обстановка по заболеваемости туберкулезом стабилизировалась, но она по-прежнему остается на высоком уровне. Так по данным ВОЗ, несмотря на спад заболеваемости в 2005 году, ежегодно регистрируют 8,8 миллионов новых случаев заболевания туберкулезом, а умерших от этого заболевания 1,6 миллионов человек. На территории Российской Федерации на 2007 год заболеваемость также оставалась на высоком уровне. Среди факторов, способствующих повышению заболеваемости туберкулёзом и развитию его осложнений, можно выделить пылевые, или профессиональные заболевания, среди которых особого внимания заслуживает силикоз (Calvert G.M., et. al., 2003). В период с 1985 года по 2007 год возрос уровень заболеваемости силикозом, и в 12-15% случаев наблюдаются сочетания силикоза с туберкулезом, особенно, в регионах с высокой заболеваемостью туберкулезом (WHO Report., 2009).

Интерес к силикозу всё больше возрастает, поскольку известно, что он приводит к необратимым изменениям во внутренних органах, преимущественно склеротического характера (Струков В.В., Кауфман О .Я., 1989; Маянский Д.Н., 2008; teWaterNaude J.M., et. al., 2006; Cassel S. L., et. al., 2008). Развитие воспаления индуцирует корпускулярный материал, персистирующий при силикозе в макрофагах — Si02- В отличие от других пылевых факторов частицы кремния способны оказывать повреждающее действие не только на фагоциты, но и на окружающие ткани, приводя к глубоким функциональным расстройствам органов (Kulonen Е., et. al., 1983).

Известно, что ключевую роль в развитии гранулематозного воспаления, как при силикозе, так и при туберкулезе, играют клетки системы мононуклеарных фагоцитов — макрофаги (Струков В.В., Кауфман О.Я., 1989; Шкурупий В.А., 2001; Надеев А. П. и соавт., 2005; Шкурупий В.А., 2007; Brink G. С., et. al., 1960; Warraki S. E., et. al., 1965). При этих заболеваниях воспаление сопровождается образованием гранулем с последующей хронизацией процесса (Шкурупий В.А., 2007).

Известно, что развитие силикотуберкулеза также сопровождается продуктивным воспалением с образованием гранулем, состоящих из моноцитов, макрофагов, эпителиоидных клеток (Струков В.В., Кауфман О.Я., 1989), но процесс сопровождается более выраженным фиброзом и связанными с ним осложнениями в виде эмфиземы легких и хронической сердечной недостаточности (Brink G.C., et. al., 1960). Особый интерес представляет изучение реакции клеток-участников гранулематозного воспаления при сочетании силикоза и туберкулеза, поскольку известно, что как частицы кремниевой пыли, так и микобактерия туберкулеза пресистируют в макрофагах (Шкурупий В.А., 2007). Исследования показывают, что при силикозе туберкулез протекает в более тяжелой форме, по сравнению с изолированным туберкулёзом (Rees D., Murray J., 2007). В связи с этим Hamilton R.F.Jr., et. al. (2008) предполагают блокаду мельчайшими частицами SiC>2 эндоцитозной ёмкости вакуолярного аппарата клеток системы мононуклеарных фагоцитов, препятствующего, тем самым, фагоцитозу микобактерии туберкулеза. Однако, существует и другая теория, предполагающая наличие на поверхности кристаллов кварца свободных ионов кремния, что ведёт, возможно, к образованию свободных радикалов вследствие освобождения кислородных связей. Такая теория воздействия Si02 получила название кристаллической (Guzik TJ, et al., 2003; Valko M, et al., 2007). Согласно этой теории свободные радикалы оказывают токсическое действие на макрофаги, окружающие клетки и ткани внутренних органов (Valko М., et. al., 2007), а также активируют процесс апоптоза, в связи с чем затрудняется элиминация микобактерий (Iyer R, Hamilton R.F., et al., 1996; Gordon S., 2002; Liu H., et al., 2007). Существует и другая точка зрения на патологическое воздействие частиц кремния в отношении фагоцитов. Согласно этой теории S1O2 нарушает нормальные процессы метаболизма внутри фагоцитов (Vallyathan V., et al., 1992; Blackford J.A., et al., 1994;

Shapiro R.M., et al., 1995), вследствие чего они становятся неспособны фагоцитировать микобактерии.

Общеизвестно, что при силикозе и туберкулезе первично поражаются лёгкие, но встречаются и генерализованные формы указанных заболеваний (Brink G.C. et al., 1960; Warraki S.E. et al., 1965). При этом распространение патогенных факторов осуществляется гематогенно и лимфогенно, благодаря чему поражаются органы, топографически находящиеся в отдалении от лёгких. В своих исследованиях, Brink G.C., et. al. (1960) показал, что кроме легочных осложнений у больных с 8Ю2-пневмокониозом встречается и цирроз печени, что обусловлено функциональной ролью печени как центрального органа гомеостазирования, в частности, по осуществлению клиринговых функций, поскольку в ней сосредоточена большая часть клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Роль печени в развитии силикотического и туберкулезного воспаления показана в многочисленных экспериментах, где независимо от пути введения гранулёмогенных факторов (ингаляционно, внутрибрюшинно, внутривенно), обнаруживали признаки воспаления различной степени выраженности (Цырендоржиев Д.Д., 1991; Филимонов П.Н., 1996; Chiappino G., Vigliani Е.С., 1982; Geissman F., et. al., 2005). Вместе с тем, есть много сведений о более частом и тяжёлом течении туберкулёза при инфицировании микобактериями туберкулёза и поражении пылевыми частицами S1O2. Однако, механизмы и особенности реакции клеток системы мононуклеарных фагоцитов на микобактерию туберкулёза и частиц Si02 — основных акцепторов этих гранулёмогенных факторов, недостаточно изучены.

Наибольшее количество исследований в области силикотуберкулеза направлено на изучение процесса фиброза, проблемы дифференциальной диагностики и клинических проявлений силикоза и силикотуберкулеза. Но склеротические процессы всегда считались исходом патологических процессов, таких как гипоксия, воспаление, прямое повреждение клеток паренхимы органов, стромы.

Цель исследования: изучить особенности патоморфогенеза гранулематозного воспаления в печени мышей линии СВА и реагирования системы мононуклеарных фагоцитов (её центрального и периферического звеньев) при силикотуберкулёзе. Задачи исследования:

1. Изучить особенности образования, топологию гранулём при силикотуберкулёзе в печени мышей.

2. Изучить динамику изменений клеточного состава гранулём при силикотуберкулёзе в печени мышей.

3. Изучить особенности реагирования центрального и периферического звеньев системы мононуклеарных фагоцитов при силикотуберкулёзе.

4. Исследовать особенности деструктивных и репаративных процессов в паренхиме печени мышей при силикотуберкулёзе.

5. Изучить особенности фиброзирования гранулём и печени мышей при силикотуберкулёзе.

Научная новизна исследования.

Впервые исследованы особенности морфогенеза хронического гранулематозного воспаления при силикотуберкулёзе в печени мышей линии СВА. Показано, что для БЦЖ-гранулематоза, и гранулематозов, индуцированных двуокисью кремния или их сочетанным введением, характерны повышенная миграция моноцитов из костного мозга и включение их в гранулемы в ранние периоды после введения гранулемогенных факторов и последующая задержка их в костном мозге с 28 по 180 сутки.

Показано, что для силикотуберкулёза не характерен процесс «диссоциации» гранулём, но свойственно увеличение количества и размеров гранулём. При этом, в развитии процесса гранулёмообразования доминируют эффекты оксида кремния, по сравнению с БЦЖ-гранулематозом.

Показано, что при силикотуберкулёзе рано (с 3 суток) формируются эпителиоидно-клеточные гранулёмы в печени, в сравнении с гранулематозным воспалением при силикозе или при туберкулёзе. 8

Как для силикоза, так и для силикотуберкулёза свойственен прогрессирующий фиброз гранулём: к 6-му месяцу эксперимента коллагеновые и аргирофильные волокна занимают более 90% объёма гранулём. Для силикотуберкулёза характерна более выраженная пролиферация фибробластов, чем при силикозе и БЦЖ-гранулематозе. Фиброз в гранулёмах при силикотуберкулёзе достигается преимущественно увеличением количества фибробластов, тогда как при гранулематозе, индуцированном только частицами оксида кремния оно обусловлено преимущественно увеличением их коллаген-синтетической «активности».

Показано более выраженное угнетение процессов клеточной и внутриклеточной регенерации в паренхиме печени при силикотуберкулёзе, чем при БЦЖ-гранулематозе.

Фибротические осложнения хронических гранулематозов при силикотуберкулёзе и силикозе в печени мышей носят не заместительный, а прогрессирующий характер.

Практическая значимость работы.

Полученные данные дополняют и обобщают известные сведения об особенностях патогенеза и морфогенеза силикотуберкулёза, а также позволяют врачам-клиницистам предполагать и учитывать существенные нарушения обменных процессов в печени.

Результаты исследования структурной организации печени при силикотуберкулёзе могут быть использованы в процессе преподавания общей и частной патологической анатомии в разделах: «Дистрофия», «Некроз», «Продуктивное воспаление», «Компенсаторные и приспособительные процессы», «Туберкулёз», «Профессиональные заболевания», «заболевания печени».

Положения, выносимые на защиту:

1. При генерализованном силикотуберкулёзе доминирующими являются биологические эффекты частиц оксида кремния, проявляющиеся более ранним (с 3-х суток) и динамичным форимированием и «развитием» гранулём, эпителиоидно-клеточного «ядра», ранним и массивным фиброзом гранулём и печени в целом, чем при гранулематозах только микобактериальной или силикотической этиологии.

2. Для генерализованного силикотуберкулёза характерны более ранние и масштабные повреждения паренхимы печени, подавление процессов клеточной и внутриклеточной репаративной регенерации, чем при БЦЖ-гранулематозе или силикозе.

3. На ранних сроках генерализованного силикотуберкулёза усилена миграция моноцитов из костного мозга в гранулёмы и периферическую кровь, а на поздних сроках — их элиминация из гранулём и задержка моноцитов в костном мозге.

выводы

1. . У мышей с генерализованным силикотуберкулёзом в печени существенно раньше (на месяц), чем при силикозе и туберкулёзе и в большем количестве формируются гранулёмы, размеры которых продолжают увеличиваться и через 6 месяцев наблюдений, что свидетельствует о высоком гранулёмоиндуцирующем потенциале одновременно воздействующих на организм М. tuberculosis и окисида кремния: а). Каждый из использованных гранулёмогенных факторов обладает различной способностью к индукции и развитию эпителиоидноклеточного «ядра» гранулём. При силикотуберкулёзе оно формируется наиболее рано и остаётся на постоянном уровне в процессе развития гранулематоза, тогда как при его индукции М. tuberculosis и Si02 — постоянно увеличивается. б). При силикотуберкулёзе в гранулёмах во все периоды их образования доля макрофагов/моноцитов значительно меньше, чем при при силикозе и БЦЖ-гранулематозе. в). Двуокись кремния как гранулёмогенный фактор, детерминирует нейтрофилёз гранулём при силикозе и силикотуберкулёзе, индуцирует апоптоз макрофагов в гранулёмах.

2. При формировании и развитии гранулём, индуцированных микобактериями БЦЖ, двуокисью кремния, их совместным введением наблюдали различную динамику транслокаций клеток системы мононуклеарных фагоцитов в гранулёмы и из них, а также из костного мозга и в крови: а). Мобилизация моноцитов из костного мозга при силикотуберкулёзе происходит раньше (с 3-х суток), чем при силикозе и БЦЖ-гранулематозе. б). В костном мозге у мышей трех различных форм, гранулематозов формируется эффект, так называемой, блокады костного мозга, наиболее выраженный при БЦЖ-гранулематозе. в). При силикотуберкулёзе концентрация моноцитов в периферической крови уменьшалась по мере увеличения интенсивности гранулёмообразования. В большей степени «резервы» моноцитов крови к 6113 ти месяцам эксперимента истощались у мышей с силикозом и силикотуберкулёзом, чем с БЦЖ-гранулематозом при очевидной недостаточности поступления моноцитов из костного мозга. Процесс «диссоциации» гранулём при БЦЖ-гранулематозе обусловил поддержание физиологического уровня моноцитов в периферической крови при наличии феномена, так называемой блокады костного мозга .

3. При силикотуберкулёзе высокий уровень пролиферации фибробластов в гранулёмах печени, особенно через 6 месяцев, после введения гранулёмогенных факторов, обусловливает больший уровень фиброза гранулём при меньшей «фибропластической активности» фибробластов, чем при БЦЖ-гранулематозе и силикозе, где фиброзирование гранулём обусловлено большей «фибропластической активностью» фибробластов, нежели процессом их пролиферации.

4. При всех исследованных гранулематозах процесс фиброзирования гранулём начинался с первых дней образования гранулём и не имел тенденций к завершению, о чём свидетельствует увеличение соотношения аргирофильных и коллагеновых волокон в гранулёмах, и в большей степени при силикозе.

5. Оба гранулёмогенных фактора, использованных порознь и вместе обладают высоким продеструктивным потенциалом в отношении гепатоцитов: а). Процессы вакуольной дистрофии и некроза гепатоцитов охватывают более 90% гепатоцитов. В наибольшей степени они были выражены у мышей с силикозом и силикотуберкулёзом, чем с БЦЖ-гранулематозом.

6. При изолированном силикозе и силикотуберкулёзе развивается депрессия репаративных процессов в паренхиме печени: а). Клеточная репаративная регенерация в печени мышей о которой судили по концентрации двуядерных гепатоцитов, при силикозе и силикотуберкулёзе была снижена в начале эксперимента и продолжала уменьшаться к 6 месяцу от его начала, тогда как у мышей с БЦЖгранулематозом уровень клеточной регенерации был повышен в начале эксперимента, и достигал физиологического уровня в его конце. б). Процессы внутриклеточной регенерации гепатоцитов, о которой судили по динамике соотношения количества гепатоцитов в состоянии вакуольной дистрофии и некроза, имели место только у мышей с БЦЖ-гранулематозом.

7. В зонах повреждения паренхимы печени фибропластические процессы не носили заместительного характера, поскольку развивались преимущественно в портальных трактах, тогда как зоны деструкции располагались диффузно. а). Двуокись кремния обладает высокой профиброгенной активностью, а в сочетании с инфицированием микобактериями туберкулёза она усиливается. б). При генерализованных силикозе, БЦЖ-гранулематозе и силикотуберкулёзе процесс фиброзирования печени начинается на ранних этапах гранулёмообразования, но чрезвычайно усиливается (в 5-6 раз) к 4-6 месяцам после его индуцирования при силикозе и силикотуберкулёзе, очевидно, в связи с существенным изменением в этих случаях соотношения в органе и гранулёмах клеток СМФ (уменьшение) и фибробластов (увеличение).

Заключение.

Во всех исследуемых группах с 3 по 180 сутки обнаруживали гранулёмы, увеличение численной плотности и размеров которых сопровождалось миграцией в очаг воспаления макрофагов из костного мозга. При раздражении резидентных макрофагов небиодеградабельным и длительно персистирующим агентом происходит мобилизация центрального звена СМФ. В костном мозге и периферической крови у мышей во всех исследуемых группах уменьшалось количество моноцитов, лимфоцитов. Кроме того, в гранулёмы мигрировали фибробласты, которые активно синтезировали аргирофильные, а также коллагеновые волокна.

Однако, после предварительного введения мышам частиц оксида кремния, макрофаги в печени насыщаются частицами Si02 и, последующее введение мышам вакцины БЦЖ сопряжено с генерализацией гранулематоза смешанной (силикоз+БЦЖ) этиологии, что приводило к более выраженной миграции моноцитов из костного мозга мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) и 2-й силикоз) групп. Частицы оксида кремния, персистирующие в гранулёмах, стимулируют фагоцитозную и секреторную активность макрофагов, однако фагоцитоз не завершается, и с 3 по 180 сутки в печени мышей 1-й силикоз+БЦЖ) и 2-й (силикоз) групп увеличивается количество гранулём и их размеры. У мышей 3-й (БЦЖ) группы, по-видимому, в связи с частичной элиминацией возбудителя количество и размеры гранулём уменьшались на

120 и 180 сутки после введения вакцины БЦЖ. В условиях сенсибилизации лимфоцитов микобактериями туберкулёза и увеличении активности фагоцитов в гранулёмах, видимо, происходит ускорение трансформации макрофагов в эпителиоидные клетки. На 3 сутки гранулематоза смешанной силикотической и туберкулёзной) этиологии в печени мышей линии СВА образуются эпителиоидноклеточные гранулёмы. Однако, при изолированном силикотическом воспалении (мыши 2-й группы), видимо, нет стимулирующего к сенсибилизации лимфоцитов влияния микобактерий туберкулёза, на 3 и 10 сутки преобладают макрофагальные гранулёмы.

Персистенция в очаге воспаления цитотоксичных частиц оксида кремния и

109 микобактерии туберкул^, выброс агрессивных „изосомальных ферменхо^ Г пр1д Т к ранним (на 3 сутки гранулематозного воспален™* Ф£' „„1 дисГф— и некробиотическим изменениям гепатоци^ m ^Zl™ и » (силикоз) При зтом з о^ ollel J^ фибробласты, и и— а— син.з молодо Ч ГАуксинофильных) коллагеновых волокон. — —; -J• • —— наряду с п р образом, при гранулематоз^

II" ~—-—-— различной деструктивных изменений, проявляющихся

Т — — 3 —°персистенцией й

Г!™ действием микобактерий тубероза, части» оксида креМНЙ,. пр м уменьшалось количество двуядерных ген—, в которЬ1х т!е обн ружив^и признаки дистрофии и некроза. Деструктиву изменения — репаративных процессов. При гранулематозах изменения ]ь[х в0 всех „следуемых группах выявляли различной зтиоло« , ж фиброзом паре™Мы угнетение клеточной Реге„, увеличиВаЛоеь прчени' перисинусоидально и в порки печени. Р аогирофильных волокон. При гранулематозном zr;—г<г—. —воспалении сутки, сопровождавшегося

1е1 с аналогичными показателями на 56 сутки. Тогда как при сравнени количество и размеры гранулем увеличилась -*'»г.гвцж«— с.»5 ■—<■»-* уменьшились. Это свидетельствовало о продолжении персистенции гранулёмогенного фактора у животных 2-й группы, и его элиминации у мышей 3-й группы (БЦЖ).

Прогрессирование роста количества, размеров гранулём, а также склероза гранулём сопровождалось, склерозом перипортальных и перисинусоидальных пространств, дисциркуляторными нарушениями в виде полнокровия сосудов, что, по-видимому, приводило к развитию гипоксии в паренхиме печени у мышей 1-й (силикоз+БЦЖ) и 2-й (силикоз) групп, и сопровождалось увеличением объёма деструктивных изменений в паренхиме печени с 56 по 180 сутки. Их развитие, очевидно, было обусловлено не только цитотоксическим эффектом частиц оксида кремния, но и цитолизом при воздействии лизосомальных ферментов активированных макрофагов и нейтрофилов, а также дисциркуляторными и склеротическими изменениями в портальных трактах и перисинусоидальных пространствах, приводя к развитию гипоксии. Дистрофическим и некробиотическим изменениям была подвержена и часть двуядерных гепатоцитов, количество которых уменьшалось как при гранулематозе смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии, так и при силикозе, при гистологическом исследовании обнаруживали некроз и баллонную дистрофию двуядерных гепатоцитов, сливные очаги некроза гепатоцитов, что указывает на подавление регенераторной способности в печени. При БЦЖ-гранулематозе с 56 по 180 сутки наблюдали уменьшение количества и размеров гранулём, уменьшение количества коллагеновых волокон в гранулёмах, объёмной плотности некрозов гепатоцитов, увеличивалось и количество двуядерных гепатоцитов, что свидетельствует о преобладающем действии частиц оксида кремния в гранулёмогенезе смешанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии.

Однако, при сочетанном заражении частицами оксида кремния и микобактерией туберкулёза в печени количество и размеры гранулём на 120 и 180 сутки были больше, чем у мышей 2-й (силикоз) группы. Стимуляция активности макрофагов частицами Si02, одновременно со стимулирующим

111 эффектом вакцины БЦЖ в отношении активности лимфоцитов, приводит к ускоренной трансформации макрофагов в эпителиоидные клетки (на 3 сутки), миграции фибробластов в гранулёмы, и усилению их коллагенсинтетической активности (120 и 180). При гранулематозе сочетанной (силикотической и туберкулёзной) этиологии суммарный объём деструктивных изменений был более выраженным, чем при изолированном силикотическом или туберкулёзном гранулематозе, что обусловлено угнетением клеточной регенерации. Таким образом, увеличение количества и размеров гранулём, деструкции паренхимы печени, а также прогрессирование фибротических осложнений в гранулёмах и портальных трактах, обусловлены одновременным воздействием частиц SiC>2 и микобактерии туберкулёза, которые, возможно, продолжают персистировать, в связи с модуляцией макрофагов и разрушением их вакуолярного аппарата.

Все эти данные свидетельствуют о том, что при силикотуберкулёзе в большей степени, чем при туберкулёзе или силикозе выражены процессы деструкции паренхимы печени, подавление репаративной регенерации и масштаба фибротических осложнений как в гранулёмах, так и собственно в печени.

Все эти процессы проявляются на ранних этапах развития силикотуберкулёза и сопряжены, видимо, со значительными нарушениями функционального состояния печени.