Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Особенности микрофлоры желудочно-кишечного тракта при различных клинических формах синдрома раздраженного кишечника

На правах рукописи

Лаврентьева Ольга Алексеевна

Особенности микрофлоры желудочно-кишечного тракта при различных клинических формах синдрома раздраженного кишечника.

14.01.04. - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

12 ДЕК 2013

Москва 2013

005543206

005543206

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор - Лоранская Ирина Дмитриевна Научный консультант:

доктор медицинских наук - Болдырева Маргарита Николаевна Официальные оппоненты:

Ардатская Мария Дмитриевна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента РФ, кафедра гастроэнтерологии, профессор

Автандилов Александр Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, кафедра терапии и подростковой медицины, заведующий

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «26» декабря 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.071.02 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д.19.

Автореферат разослан « ^ ' у^Р 2013г

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Мазанкова Людмила Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Синдром раздраженного кишечника (СРК) - одна из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Согласно Римскому-III Консенсусу по функциональным пищеварительным расстройствам, СРК является функциональным заболеванием кишечника, при котором боль в животе или абдоминальный дискомфорт связаны с дефекацией, изменениями частоты и характера стула (Drossman D.A., 2006). На сегодняшний день СРК страдает около 10-20% населения земного шара, причем преимущественно лица трудоспособного возраста, что определяет клиническую и социальную значимость данного заболевания (Longstreth G.F. et al., 2002). В настоящее время отсутствует единое представление об этиологии и патогенезе СРК, что и определяет трудности в лечении. Среди причин СРК в литературе обсуждают изменения моторики желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), висцеральную гиперчувствительность, генетические факторы, а также стрессы, психические расстройства, вялотекущие воспалительные процессы (Lewis S.J. et al., 1997, Drossman D.A., 2006, Ishihara S. et al., 2009).

Исследования последних лет характеризуют СРК как заболевание, сопровождаемое качественными и количественными изменениями микрофлоры кишечника (Kassinen A. et al., 2007, Spiller R.C., 2008, O'Hara A.M. et al., 2008, Parkes G.C. et al., 2008, Парфенов А.И. и соавт., 2009, Carroll I.M. et al., 2010, Денисов H.JI. и соавт., 2011). В большинстве зарубежных и отечественных работ при СРК исследования резидентной микрофлоры фокусировались на изучении разнообразия полостного микробиотопа, что существенно снижает ценность этих исследований. Для оценки состояния микробиоценоза кишечника более важной является информация о микробной колонизации в стенке кишки, которая обеспечивается адгезивными свойствами бактерий. В отличие от микрофлоры фекалий, именно микроорганизмы пристеночного биотопа наиболее точно отражают состояние микробной экологии человека (Шендеров Б.А., 1998). Микрофлора, обладающая адгезивными свойствами, сосредоточена на апикальной мембране энтеро - и колоноцитов, т.е. в зоне ассимиляции нутриентов. Можно предполагать, что изменения ее качественного и количественного состава оказывают влияние на пищеварительно-транспортные процессы в кишечнике. Способность кишечной микрофлоры вырабатывать нейротрансмиттеры, влияющие на секрецию и моторику кишечника, а также порог висцеральной чувствительности,

свидетельствует о важности дисбиотических изменений в патогенезе СРК (Spiller R.C., 2003, Camilleri М„ 2009).

Методы исследования состояния микробиоценоза ЖКТ постоянно совершенствуются. Наиболее часто применяемые методы диагностики в настоящее время это - бактериологическое исследование кала, хромато-масс-спектрометрия, исследование микробных метаболитов, полимеразная цепная реакция.

В последние годы широкое распространение получил способ определения видов и генетически родственных групп микроорганизмов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основу метода ПЦР положено многократное копирование (амплификация) искомого фрагмента ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы и искусственно синтезированных одноцепочечных фрагментов ДНК, комплементарных участкам генома микроорганизма. По сравнению с традиционными методами диагностики, ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью. ПЦР с регистрацией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволяет проводить количественную оценку микроорганизмов в биопробе.

Несмотря на многочисленные исследования, роль и характер нарушений кишечной микрофлоры в механизме развития СРК до конца не выяснены. До настоящего времени не проводилось достаточно обширных исследований пристеночной микрофлоры ЖКТ при различных клинических формах СРК методом количественной полимеразной цепной реакции. Большинство научных работ базируется на изучении микрофлоры какого-либо одного биотопа -тонкой или толстой кишки, и, как правило, участниками исследования являются пациенты СРК одной клинической формы (Malinen Е. et al., 2005, Kerckhoffs А.Р. et al., 2009, Carroll I.M. et al., 2010, Rajilic-Stojanovic M. et al., 2011). Кроме того, в литературе отсутствуют работы по изучению пристеночной микрофлоры разных отделов ЖКТ здоровых людей, без которых невозможно проводить анализ изменений состава микроорганизмов при различных патологических состояниях. Получение новой информации об одном из звеньев патогенеза СРК, являясь важной основой разработки оптимальных схем обследования и лечения пациентов, делает целесообразным проведение настоящего исследования.

Цель исследования: изучить состав пристеночной микрофлоры разных отделов желудочно-кишечного тракта у здоровых добровольцев и больных синдромом раздраженного кишечника с преобладанием запоров и диареи методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Задачи исследования

1. Изучить состав пристеночной микрофлоры различных отделов ЖКТ (ротовой полости, проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной и прямой кишки) методом ПЦР в режиме реального времени у здоровых добровольцев.

2. Определить особенности изменений пристеночной микрофлоры ротовой полости, проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной и прямой кишки методом ПЦР в режиме реального времени при СРК с преобладанием диареи (СРК-Д).

3. Выявить особенности изменений пристеночной микрофлоры тех же отделов ЖКТ методом ПЦР в режиме реального времени при СРК с преобладанием запоров (СРК-3).

4. Провести сравнительный анализ состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки при СРК с преобладанием диареи и запоров.

Научная новизна

Изучен состав пристеночной микрофлоры разных отделов желудочно-кишечного тракт здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 50 лет методом ПЦР в режиме реального времени. Определены референсные значения концентраций 29 групп микроорганизмов, позволяющих их использование в дальнейших исследованиях.

Проведено исследование состава пристеночной микрофлоры разных биотопов ЖКТ больных СРК двух клинических форм - с преобладанием запоров и диареи, обнаружены достоверные количественные различия в отдельных группах бактерий филотипов Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria по сравнению с группой контроля.

Определены особенности микрофлоры кишечника при СРК с диареей и СРК с запором, позволяющие использовать их в качестве биомаркеров клинических форм заболевания. Показано, что у больных СРК с диареей по сравнению с группой контроля (ГК) в слизистой прямой кишки достоверно ниже содержание Eubacterium spp.; у больных СРК с запором по сравнению с ГК в слизистой проксимальных отделов тонкой кишки достоверно ниже содержание Bifidobacterium spp, в слизистой ободочной кишки достоверно ниже содержание Streptococcus spp.

Проведено сравнение состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки при различных клинических формах СРК. Показано, что при СРК-3 и СРК-Д имеются статистически значимые различия

в композициях фекальной и мукозной микрофлоры в разных группах микроорганизмов: при СРК-Д они обнаружены как среди облигатных анаэробов, так и аэробов; тогда как при СРК-3 различия обнаружены только в группе аэробов.

Практическая значимость

Полученные при исследовании референсные значения концентраций 29 групп микроорганизмов пристеночной микрофлоры разных отделов ЖКТ, выраженные в относительных количественных единицах, позволяют использовать их как показатели нормальных значений для оценки результатов дальнейших исследований.

Выявленные достоверные различия в составе пристеночной микрофлоры у больных СРК и здоровых добровольцев доказывают важную роль нарушений кишечного микробиоценоза в патогенезе синдрома раздраженного кишечника.

Установлено, что метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, целесообразно использовать в диагностике нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у больных СРК.

Результаты изучения состава полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки позволяют оптимизировать диагностику нарушений микробиоценоза при СРК с запорами путем проведения исследования микрофлоры фекалий методом ПЦР-РВ.

С учетом выявленных отклонений в составе микрофлоры при СРК предложено включение в схемы лечения пробиотиков, содержащих Bifidobacterium spp, Streptococcus spp, а также препаратов пребиотического действия.

Результаты проведенной работы позволяют оптимизировать алгоритм диагностических и лечебных мероприятий при СРК с преобладанием запоров и диареи, что будет способствовать улучшению качества жизни пациентов и снизит риск развития рецидивов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Состав пристеночной микрофлоры тонкой и толстой кишки больных синдромом раздраженного кишечника и здоровых добровольцев имеет статистически значимые различия.

2. У больных СРК вне зависимости от клинической формы в слизистой прямой кишки существуют достоверные количественные отличия от группы контроля в группах бактерий филотипов Firmicutes, Proteobacteria,

Actinobacteria: повышено содержание Faecalibacterium praustnizi; понижена концентрация Streptococcus spp, Atopobium claster, Ralstonia spp.+Burkholderia spp.

3. При CPK с запором и CPK с диареей существуют достоверные отличия от группы контроля в разных группах микроорганизмов пристеночной микрофлоры ЖКТ: у больных СРК с запором в слизистой проксимальных отделов тонкой кишки достоверно ниже содержание Bifidobacterium spp., в слизистой ободочной кишки достоверно ниже содержание Streptococcus spp.; у больных СРК с диареей в слизистой прямой кишки достоверно ниже содержание Eubacterium spp.

4. Обнаруженные различия в составе микрофлоры при СРК с запором и диареей предполагают взаимосвязь особенностей микрофлоры с клинической формой СРК и определяют возможность их применения как биомаркеров данной патологии.

5. Патогенетически обосновано включение в программу лечения больных СРК пробиотиков, содержащих Bifidobacterium spp и Streptococcus spp., а также препаратов пребиотического действия.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в научно-практическую работу кафедры гастроэнтерологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Основные положения диссертации используются при чтении лекций, проведении научно-практических конференций, практических занятий и семинаров, включены в программу обучения клинических ординаторов, врачей гастроэнтерологов. Издано учебное пособие, которое используется как методический материал на циклах повышения квалификации и профессиональной переподготовки врачей гастроэнтерологов. Результаты исследования внедрены в практику работы гастроэнтерологического отделения Федерального государственного казенного учреждения главного клинического военного госпиталя федеральной службы безопасности России.

Личный вклад автора

Автором проведено обследование всех субъектов, вошедших в работу (123 пациента СРК и 14 здоровых добровольцев): изучены анамнестические данные и особенности клинических проявлений заболевания,

проведено физикальное обследование, назначены необходимые лабораторные и инструментальные исследования. Автором разработаны

первичные учетные документы — анкеты пациентов и здоровых добровольцев. Отобранным 40 пациентам СРК лично автором проведена ректоскопия, произведен забор образцов слизистой полости рта, фекалий. Автор ассистировала при проведении эндоскопических исследований, участвовала в получении образцов слизистой проксимальных отделов тонкой кишки, левых отделов ободочной кишки, прямой кишки и подготовке биоптатов к проведению исследования методом полимеразной цепной реакции. Анализ, обобщение материалов, статистическая обработка результатов по всем направлениям исследования проведены лично автором.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на X съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010г), на XVII, XIX Российской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, 2011, 2013гг), на Научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», посвященной памяти академика В.Х.Василенко (Москва 2011,2012гг).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников кафедры гастроэнтерологии ГБОУ ДПО РМАПО, кафедры терапии и подростковой медицины ГБОУ ДПО РМАПО, кафедры неотложных состояний в клинике внутренних болезней ФППОВ Первого МГМУ им.И.М.Сеченова, отделения гастроэнтерологии ГБУЗ «ГКБ №14 им.Короленко» Департамента Здравоохранения г. Москвы, ведущих научных сотрудников ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России 4.07.2013г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объекту и методам исследования, двух глав с результатами собственных данных, клинического примера, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включая список литературы, иллюстрирована 12 рисунками, содержит 30 таблиц. В работе использовано 162 литературных источника, из них 48 отечественных и 114 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

На основании диагностических критериев, разработанных Римским-Ш Консенсусом по функциональным пищеварительным расстройствам, 123 пациентам, находившимся на обследовании и лечении в Федеральном государственном казенном учреждении главном клиническом военном госпитале федеральной службы безопасности России с 2009 по 2012г, установлен диагноз синдром раздраженного кишечника. Пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от клинической формы СРК: с преобладанием диареи (п=63) и с преобладанием запора (п=60).

Все пациенты подверглись тщательному обследованию с использованием клинических, лабораторных и инструментальных методов с целью уточнения основной и сопутствующей патологии.

Критериями включения пациентов в группу явились: возраст от 18 до 55лет, наличие рецидивирующей абдоминальной боли или дискомфорта, возникающих с частотой не менее 3 дней в месяц в последние 3 месяца (с началом симптомов не менее чем за 6 месяцев), связанных с 2 или более из следующих симптомов: 1) боль и неприятные ощущения ослабевают после дефекации; 2) появление боли и дискомфорта совпало по времени с изменением частоты стула; 3) появление боли и дискомфорта совпало по времени с изменением формы (внешнего вида) кала. У всех пациентов отсутствовали симптомы «тревоги»: немотивированное уменьшение массы тела, сохранение симптомов в ночные часы, постоянная интенсивная боль в животе, как единственный и основной симптом, лихорадка, кровь в кале, лейкоцитоз, анемия, увеличение СОЭ, изменения в биохимических показателях крови. Критериями исключения из исследования явились пациенты с заболеваниями, способными обусловливать СРК-подобные симптомы.

Группу обследуемых составили пациенты преимущественно в возрасте от 31 до 50 лет (73,2%), с высшим образованием (80,48%), отягощенным психосоциальным анамнезом, средняя длительность заболевания у которых составила 8,46 ±5,5 лет. У всех пациентов СРК ведущими были жалобы на абдоминальные боли, изменения частоты и формы стула, метеоризм. Доминирующая локализация абдоминальных болей различалась при СРК с диареей и СРК с запорами. Больных СРК с диареей наиболее часто беспокоили боли в околопупочной области (57,14%), тогда как у больных СРК с запорами

боли данной локализации встречались в 2 раза реже (25%). Пациентов СРК с запорами чаще беспокоили боли в левом подреберье (30%). Значимых расстройств нутритивного статуса выявлено не было. Преобладающее большинство (95,13%) пациентов имели сопутствующие заболевания. В качестве коморбидных преобладали заболевания опорно-двигательного аппарата (29,26%) и психоневрологические расстройства (29,26%) -соматоформная дисфункция вегетативной нервной системы, астено-невротический синдром, расстройство приспособительных реакций. У 60,97% всех пациентов СРК имелись отклонения от нормы при копрологическом исследовании кала. При СРК с диареей в 3 раза чаще, чем при СРК с запорами встречалась бродильная диспепсия. При бактериологическом исследовании кала обнаружены те или иные количественные отклонения от нормы в составе бактериальной микрофлоры у 75 (60,97%) пациентов СРК: снижено содержание бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки с типичными свойствами, энтерококков; повышено содержание лактозонегативных и гемолитических кишечных палочек, клостридий, стафилококков, других условно-патогенных энтеробактерий. Достоверных качественных различий в содержании каких-либо групп микроорганизмов у больных СРК-Д и СРК-3 не выявлено.

Для решения поставленных задач, методом случайной выборки из 123 обследованных пациентов с синдромом раздраженного кишечника, отобрано 40 -25 мужчин и 15 женщин, в возрасте от 18 до 55лет. Мужчины составили 62,5%, средний возраст пациентов - 39,6±8,0 лет. Пациенты с нормальным питанием составили 70%, остальные 30% - с повышенным питанием и ожирением первой степени, средний ИМТ - 24,9±2,3 кг/м2. В группу не включались больные, которые за 2 месяца до исследования лечились антибиотиками, пробиотиками или были вегетарианцами. Все пациенты осмотрены стоматологом, проведена санация полости рта. Пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от клинической формы СРК: с преобладанием диареи (п=20) и с преобладанием запора (п=20). В группу сравнения вошли 14 здоровых добровольцев (группа контроля - ГК) нормального питания в возрасте от 19 до 50 лет, 11 мужчин и 3 женщины, которым проведено аналогичное комплексное обследование.

Обязательным условием включения в группу исследуемых было письменно оформленное каждым пациентом и здоровым добровольцем информированное согласие.

В ходе реализации цели научной работы участникам исследования стерильным одноразовым зондом проведен соскоб со спинки языка, при

эзофагогастродуоденоскопии произведена биопсия слизистой залуковичного отдела двенадцатиперстной кишки, при фиброколоноскопии - биопсия слизистой левых отделов ободочной и прямой кишки с последующим исследованием микрофлоры методом ПЦР-РВ. Кроме того, у пациентов СРК собраны фекальные образцы, для последующего проведения сравнительного анализа фекальной и мукозной микрофлоры.

ПЦР-диагностика исследуемых образцов производилась с использованием амплификатора ДТ96 (производитель НПО «ДНК-Технология», Россия), обеспечивающего проведение полимеразной цепной реакции с автоматической регистрацией результатов в режиме «реального времени». Набор реагентов включал: смесь для ПЦР-амплификации, специфичную для всех бактерий (общая бактериальная масса), специфичные смеси для определяемых микроорганизмов. Идентифицировано 29 групп микроорганизмов. В одну из пробирок со смесью для амплификации был добавлен внутренний контрольный образец, предназначенный для оценки эффективности протекания полимеразной цепной реакции. Одна из пробирок содержала смесь для амплификации геномной ДНК человека, предназначенную для оценки контроля взятия клинического материала.

В исследуемых образцах методом ПЦР-РВ определяли следующие показатели: контроль взятия материала (КВМ), общая бактериальная масса (ОБМ), абсолютные значения микроорганизмов, с последующим расчетом относительных показателей. Абсолютные значения показателей ОБМ, КВМ и диагностируемых микроорганизмов в результатах ПЦР-РВ представлены в виде десятичного логарифма (lg), который рассчитан по номеру порогового цикла и ориентировочно соответствуют количеству искомой ДНК, выраженной в геном-эквивалентах в образце (ГЭ/обр). Для более объективного анализа рассчитаны относительные количественные показатели микробиоты, отражающие количество конкретных микроорганизмов по отношению к общей бактериальной массе. Относительные показатели представлены в виде разницы десятичных логарифмов соответствующей группы микроорганизмов и общей бактериальной массы.

Статистическая обработка данных производились на персональном компьютере с использованием лицензионных компьютерных программ Microsoft Excel 2007 и «SPSS-Statistics 17». При анализе распределений количественных данных определяли меры центральной тенденции - медиану, и меры дисперсии - интерквартильный размах в виде 25% и 75% процентилей. Описание центральных тенденций и дисперсий количественных данных

представлены в таблицах и графическом виде. Графически данные представлены в виде «коробочных» графиков, которые включают максимальное, минимальное значения, 25% и 75% процентили. Для расчета достоверности различий малых выборок использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Критерием статистической значимости был уровень р < 0,05. Анализ зависимостей осуществлялся непараметрическим методом ранговой корреляции Спирмена.

Полученные результаты и их обсуждение

В образцах слизистой и фекалий 40 пациентов СРК и 14 здоровых субъектов были идентифицированы бактерии основных четырех филотипов (Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria) (табл.1), являющихся ведущими в микроэкологии ЖКТ - сложном сообществе бактерий, архей и эукариотов, а также грибы рода Candida, фузобактерии.

Таблица 1. Филотипы бактерий и их представители, идентифицированные методом ПЦР в исследовании.

Firmicutes Bacteroidetes Proteobacteria Actinobacteria

Класс Clostridia род Ruminococcus род Faecalibacterium род Eubacterium род Peptostreptococcus род Anaerococcus род Veillonella род Clostridium Класс Bacilli poflStreptococcus poAStaphylococcus род Lactobacillus poÄEnterococcus Род Bacteroides Род Prevotella Род Porphyromonas Род Enterobacterium Род Acinetobacter Род Haemophilus Род Ralstonia Род Neisseria Род Helicobacter Род Campylobacter Род Pseudomonas вид Pseud, aeruginosa Род Bifidobacterium Род Mobiluncus Род Atopobium Род Actinomyces

Общая бактериальная масса разных отделов ЖКТ представлена следующим образом: как в ГК, так и у больных СРК наибольшая бактериальная обсемененность выявлена в ротовой полости - 7,45-7,7 ^ ГЭ/обр, наименьшая - в тонкой кишке - 3,9-4,0 ^ ГЭ/обр; в ободочной и прямой кишке - 5,2-6,0 ^ ГЭ/обр (рис.1).

Обод.ки

Прямая кишка

Рисунок 1. Общая бактериальная масса (lg (ГЭ/обр)) мукозной микрофлоры различных отделов ЖКТ.

Проведено исследование микрофлоры слизистой разных отделов ЖКТ в группе контроля для определения количественных и качественных показателей микробиоценоза здоровых людей. Результаты исследования показали, что во всех отделах ЖКТ состав мукозной микрофлоры представлен практически одним и тем же набором микроорганизмов, но соотношение их различно. В ротовой полости преобладают ВРР-группа (Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas), Streptococcus spp, Veillonellaceae (рис.2); в тонкой кишке -ВРР-группа, Streptococcus spp, Ruminococcus spp (рис.3); в ободочной кишке -ВРР-группа, Ruminococcus spp, Enterobacterium spp (рис.4). Доминирующие группы микроорганизмов слизистой оболочки прямой кишки аналогичны ободочной.

014853480202020201010002020001010200020100010201000000020002020248534848020253

00024853000001020100000253480001000200020202000001020001

У

//у/и к/] /

^ 4 Г ^ ^ # ^^ ^ | И1

И |

1

I ____________

Максимзначение

Минимальн значение 3 квартиль (75%)

Рисунок 2. Относительное количество микроорганизмов, нормированное на ОБМ в составе мукозной микрофлоры ротовой полости ГК,

2

-4,5

■ А А £ л» .о л ^ .'У_______

"У- М- ^ г ^ # '( з>* к 4 <Р Г] п

1 11 1 1 1 1 \

1 1 1 Ч

н 1

|

II 1

1 квартиль (25%)

Максим значение

Минимальн значение 3 квартиль (75%)

Рисунок 3. Относительное количество микроорганизмов, нормированное на ОБМ (1§), в составе мукозной микрофлоры проксимальных отделов тонкой кишки ГК.

Ж/ у ^л л ÄJ? > ,/* >

Максим значение

Минимальн значение 3 квартиль (75%)

Рисунок 4. Относительное количество микроорганизмов, нормированное на ОБМ (lg), в составе мукозной микрофлоры ободочной кишки ГК.

Таким образом, в составе мукозной микрофлоры ротовой полости и кишечника у здоровых людей преобладают представители филотипа Bacteroidetes. Вторую позицию занимают представители филотипа Firmicutes: Streptococcus в полости рта и тонкой кишке, Ruminococcus - в толстой кишке. На третьей позиции в полости рта и тонкой кишке также представители филотипа Firmicutes - соответственно Veillonella и Ruminococcus, в толстой кишке представители филотипа Proteobacteria - Enterobacterium spp. Большинство представителей доминирующей микрофлоры исследуемых отделов слизистой ЖКТ - облигатные анаэробы.

Полученные данные микробных композиций здоровых субъектов позволили адекватно судить об отклонениях от нормы при СРК. На основании полученных результатов абсолютных показателей концентраций микроорганизмов, рассчитаны относительные показатели концентраций бактерий, нормированные на общую бактериальную массу. Проведен сравнительный анализ микрофлоры разных отделов ЖКТ у здоровых добровольцев и больных СРК-Д и СРК-3.

Полость рта - наиболее открытый отдел пищеварительной трубки, который, вероятно, во многом определяет формирование микроэкологии нижерасположенных отделов. Но в полости рта в обеих группах СРК по сравнению с ГК статистически значимых различий не выявлено.

В составе мукозной микрофлоры тонкой кишки в обеих группах СРК обнаружено снижение Bifidobacterium по сравнению с ГК. Но статистически значимые различия выявлены при СРК-3: содержание Bifidobacterium оказалось достоверно ниже (р=0,049). Роль бифидобактерий в обеспечении колонизационной резистентности, ферментативной, иммунной функции кишечника, а также регуляции висцеральной чувствительности, хорошо известна, и снижение содержания данных микроорганизмов в мукозной микрофлоре с высокой долей вероятности может играть определенную роль в патогенезе СРК. В остальных группах микроорганизмов значимых различий не выявлено. Обнаружены некоторые особенности: концентрация Helicobacter spp в слизистой тонкой кишки при СРК-3 оказалась выше, чем в ГК и при СРК-Д, но статистическая значимость различий подтверждена при сравнении СРК-3 и СРК-Д (р=0,01) (рис.5).

0 — -1 — ф CP Ii !-Д СРК-3 Г Ii 1 < CP 1 <-Д CP 1 к-з |Г_ 1 Максим значение

.4-- ■ 11 1 11 1 Минимальн значение 3 квартиль (75%)

-7--

Рисунок 5. Относительное количество Bifidobacterium и Helicobacter, нормированное на ОБМ (lg), в составе мукозной микрофлоры проксимальных отделов тонкой кишки в исследуемых группах.

Таким образом, достоверных данных, подтверждающих синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке у пациентов СРК, не получено.

В составе мукозной микрофлоры ободочной кишки при СРК-3 по сравнению с ГК обнаружены значимые различия в концентрации Streptococcus

spp: их содержание оказалось достоверно ниже - р = 0,014. Streptococcus spp, являясь молочнокислыми бактериями, ферментируют углеводы с образованием кислоты, соответственно, снижение их содержания может приводить к повышению pH среды толстой кишки, и, вероятно, как следствие, к моторной дисфункции кишечника.

Наиболее выраженные различия в составе микрофлоры обнаружены в прямой кишке больных СРК по сравнению с ГК. Прежде всего, обращает на себя внимание увеличение общей бактериальной обсемененности слизистой прямой кишки при обеих клинических формах СРК. Статически значимыми оказались различия при СРК-3 - ОБМ - 6,0 (5,6; 6,5) lg ГЭ/обр по сравнению с ГК - ОБМ - 5,2 (4,0; 5,6) lg ГЭ/обр. (р=0,002).

При СРК, вне зависимости от клинической формы, в мукозной микрофлоре прямой кишки по сравнению с ГК обнаружено повышенное содержание Faecalibacterium praustnizi: при СРК-3 - р=0,047, СРК-Д - р=0,05. У больных СРК-Д по сравнению с ГК оказалась ниже концентрация Eubacterium spp (р=0,049) (рис.6)

ГК СРК-Д СР (-3 ГК СРК-Д СРК-3

-1 -1,5 --2 - 1 1 ч ■______Т ........ 1 ........_

■ . ■ ^Н 1 квартиль (25%)

Максим значение

Минимальн значение

3 квартиль (75%)

-4,5 •

Рисунок 6. Относительное количество раесаПЬас1епит рга^тг! и ЕиЬас1епит эрр, нормированное на ОБМ в составе мукозной микрофлоры прямой кишки в исследуемых группах.

Для установления взаимосвязи между максимальной частотой стула в сутки при СРК-Д и концентрацией эубактерий в слизистой прямой кишки был проведен корреляционный анализ этих показателей. Установлено, что максимальное количество дефекаций в день отрицательно коррелирует с концентрацией эубактерий в слизистой прямой кишки (-0,47; р<0,05), то есть

учащение стула сопровождается снижением содержания данных микроорганизмов в слизистой толстой кишки. Снижение Eubacterium spp при СРК-Д можно связать с известным участием этих микроорганизмов в деконъюгации желчных кислот и, соответственно, влиянием их на моторную функцию кишечника. Кроме того, большинство видов Eubacterium являются сахаролитическими, то есть способными ферментировать углеводы с накоплением смеси короткоцепочечных жирных кислот (КЖК). КЖК, являясь важными питательными веществами, необходимыми для поддержания здоровья колоноцитов, участвуют в регуляции апоптоза, пролиферации эпителия слизистой кишечника, стимулируют всасывание воды и электролитов, тем самым предотвращая диарею. Соответственно, одним из звеньев патогенеза СРК-Д, может оказаться уменьшение продукции КЖК вследствие снижения концентрации Eubacterium spp в составе мукозной микрофлоры толстой кишки.

При обеих клинических формах СРК достоверно ниже, чем в ГК оказались концентрации Streptococcus spp (СРК-Д - р=0,003; СРК-3 - р=0,003), Atopobium claster (СРК-Д - р=0,028; СРК-3 - р=0,023), RaLstonia spp,+Burkholderia spp (СРК-Д - p=0,034; СРК-3 - p=0,002) (рис.7).

Г< СРК-Д СРК-3 ГК СРК-Д СРК-3 ГК СРК-Д CPK-3

за

38

1 квартиль (25%) Максим значение Минимальн значение

'"3 квартиль (75%}

Рисунок 7. Относительное количество Streptococcus spp, Atopobium claster, Ralstonia spp., нормированное на ОБМ (lg), в составе мукозной микрофлоры прямой кишки в исследуемых группах.

Только при СРК-3 оказалась ниже концентрация Staphylococcus spp + Aerococcus spp (p=0,039), Acinetobacter (p=0,009).

Таким образом, при обеих формах СРК по сравнению с ГК преобладают различия в составе мукозной микрофлоры прямой кишки — повышение концентрации бактерий семейства Ruminococcaceae, снижение концентрации ряда бактерий 3 ведущих филотипов (Firmicutes - класса Bacilli, Proteobacteria, Actinobacteria). Для наиболее наглядной характеристики выявленных различий мукозной микрофлоры больных СРК от микрофлоры здоровых людей, полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика выявленных отличий мукозной микрофлоры больных СРК от микрофлоры здоровых людей

- концентрация бактерий выше, | - концентрация бактерий ниже, чем в ГК)

Отделы ЖКТ СРК-Д CPK-3

Ротовая полость Нет различий Нет различий

Прокс.отд. тонкой кишки Нет различий ¿Bifidobacterium spp

Лев. отделы толстой кишки Нет различий ¿Streptococcus spp

Прямая кишка fFaecalib.praustn. ¿Eubacterium spp .[Streptococcus spp ¿Ralstonia spp ¿Atopobium claster fFaecalib.praustn. ¿Streptococcus spp ¿Staphylococcus spp ¿Ralstonia spp ¿Acinetobacter ¿Atopobium claster

Тендерных и возрастных различий, влияющих на состав микробиоты слизистой ЖКТ, в обследуемых группах не выявлено.

В процессе набора клинического материала нам показалось интересным провести сравнительную оценку состава микрофлоры пристеночного и полостного микробиотопа прямой кишки пациентов СРК.

В результате сравнительного анализа обнаружены следующие, статистически значимые различия: при СРК-Д в составе микрофлоры фекалий по сравнению с микрофлорой слизистой прямой кишки оказалось достоверно

ниже содержание бактерий ВРР-группы (р < 0,05); Staphylococcus spp + Aerococcus spp (p < 0,01); Ralstonia spp.+ Burkholderia spp (p<0,001); Acinetobacter (p<0,001); Neisseria spp (p<0,01), Heamophilus spp (p=0,05). Кроме бактерий ВРР-группы, являющихся строгими анаэробами, все остальные микроорганизмы относятся к группе аэробов или факультативных анаэробов. Достоверно выше в составе микрофлоры фекалий, по сравнению с микрофлорой слизистой оказалось содержание Eubacterium spp (р<0,05); Bifidobacterium spp (р<0,05); Atopobium claster (p<0,001). Увеличение концентрации Eubacterium spp, Bifidobacterium spp, Atopobium claster в просветной микрофлоре, возможно, отражает избыточное выведение (потерю) данных микроорганизмов вследствие гипермоторной дисфункции кишечника при СРК-Д и характеризует их адгезивные свойства.

При СРК-3 выявлено меньше различий: в фекальной микрофлоре оказалось достоверно ниже содержание Staphylococcus spp+Aerococcus spp (р<0,05); Acinetobacter (р<0,001); Neisseria spp (p<0,001); Heamophilus spp (p<0,05). Наглядно выявленные различия отражены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристика выявленных отличий микрофлоры фекалий от микрофлоры слизистой прямой кишки ( концентрация бактерий выше, | - концентрация бактерий ниже, чем в слизистой)

СРК с диареей СРК с запором

TEubacterium spp

¿Bifidobacterium spp

tAtopobium claster

¿ВРР-группа

¿Staphylococcus spp ¿Staphylococcus spp

¿Ralstonia spp ¿Acinetobacter

¿Acinetobacter ¿Neisseria spp

¿Neisseria spp ¿Heamophilus spp

¿Heamophilus spp

Таким образом, наиболее выраженные различия в составе фекальной и мукозной микрофлоры обнаружены при СРК-Д, как среди облигатных анаэробов (рис.8), так и аэробов (рис.9).

^ фе|

t

t

с.о. фекалии с.о. фемлии с.о. фекалии

' I» .

Максим значение

Минимальн значение

3 квартиль (75%)

Рисунок 8. Относительное количество бактерий ВРР-группы, Eubacterium spp, Bifidobacterium spp, Atopobium claster, нормированное на OEM (lg), в составе мукозной микрофлоры прямой кишки и образцах фекалий пациентов СРК-Д.

О -1 -2 -3 -4 •Б -6 -7 -8 -9

с.о. фекалии

с.о. фекалии

с.о. фекалии с.о. фекалии

II

II

W

if

1 квартиль (25%)

Максим значение

Минимальн значение

3 квартиль (75%)

Рисунок 9. Относительное количество Staphylococcus spp+Aerococcus spp; Ralstonia spp +Burkholderia spp; Acinetobacter; Heamophilus spp, нормированное на ОБМ (lg), в составе мукозной микрофлоры прямой кишки и образцах фекалий пациентов СРК-Д.

При СРК-3 различия в составе фекальной и мукозной микрофлоры прямой кишки обнаружены только в группе аэробов (рис.10)

с.о. фекалии

с.о. фекалии

I

с.о. фекалии с.о. фекалии

t±k

I

г

f

i

1 квартиль (25%)

Максим значение

Минимальн значение

3 квартиль (75%)

Рисунок 10. Относительное количество Staphylococcus spp+Aerococcus spp; Ralstonia spp +Burkholderia spp; Acinetobacter; Heamophilus spp, нормированное на ОБМ (Ig), в составе мукозной микрофлоры прямой кишки и образцах фекалий пациентов СРК-3.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что при СРК-3 композиция фекальной микрофлоры отражает состав микрофлоры слизистой прямой кишки по ведущим группам микроорганизмов, не считая отдельных групп аэробов, содержание которых в кале ничтожно мало. При СРК-Д различия в составе фекальной и мукозной микрофлоры более выражены, в том числе среди облигатных микроорганизмов, поэтому оценка микроэкологии кишечника при данной клинической форме СРК не может производиться на основании композиции микрофлоры фекалий.

Выявленные различия в составе микрофлоры слизистой прямой кишки и фекалий позволяют предположить, что и пристеночный, и полостной микробиотоп выполняют каждый свою роль в поддержании микроэкологии желудочно-кишечного тракта.

Сопоставление данных о композиции микрофлоры при СРК-3 и СРК-Д позволяет предположить возможную взаимосвязь особенностей микрофлоры с клинической формой СРК и определяют возможность их применения как

биомаркеров данной патологии. Вопрос о том, являются ли обнаруженные различия в составе микрофлоры при СРК причиной расстройства или, напротив, результатом воздействия нарушенной моторной функции кишечника на микробиоценоз, требует дальнейшего изучения.

Обнаруженные изменения в составе мукозной микрофлоры ЖКТ при СРК обосновывают необходимость дальнейших углубленных исследований микробиоценоза современными молекулярно-генетическими методами для определения роли конкретных бактерий в патогенезе СРК, а также позволяют продолжить изучение роли про- и пребиотиков в поддержании здоровой микроэкологии человека.

Выводы

1. В разных отделах желудочно-кишечного тракта здоровых субъектов состав мукозной микрофлоры представлен одним и тем же набором микроорганизмов, но соотношение преобладающих популяций варьирует. В ротовой полости доминируют ВРР-группа (Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas), Streptococcus spp, Veillonellaceae; в тонкой кишке - ВРР-группа, Streptococcus spp, Ruminococcus spp; в толстой кишке - ВРР-группа, Ruminococcus spp, Enterobacterium spp.

2. Выявлены различия в составе мукозной микрофлоры при СРК с запором и СРК с диареей, предполагающие взаимосвязь особенностей микрофлоры с клинической формой СРК: у больных СРК-3 по сравнению с ГК в слизистой проксимальных отделов тонкой кишки - достоверно ниже содержание Bifidobacterium spp, в слизистой ободочной кишки - достоверно ниже содержание Streptococcus spp; у больных СРК-Д по сравнению с ГК в слизистой прямой кишки достоверно ниже содержание Eubacterium spp.

3. В результате исследования состава пристеночной микрофлоры синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке у больных синдромом раздраженного кишечника не выявлен.

4. У больных синдромом раздраженного кишечника вне зависимости от клинической формы в слизистой прямой кишки имеются достоверные количественные отличия от группы контроля среди бактерий филотипов Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria: повышено содержание Faecalibacterium praustnizi; понижена концентрация Streptococcus spp, Atopobium claster, Ralstonia spp.+Burkholderia spp.

5. В составе полостного и пристеночного микробиотопа прямой кишки при СРК с запором и СРК с диареей имеются статистически значимые

различия в разных группах микроорганизмов: при СРК с диареей они обнаружены как среди облигатных анаэробов, так и аэробов; тогда как при СРК с запором различия обнаружены только в группе аэробов.

6. Метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени является достоверным и высокоспецифичным методом в оценке микробиоценоза слизистой желудочно-кишечного тракта.

Практические рекомендации

1. Полученные при исследовании референсные значения концентраций 29 групп микроорганизмов слизистой разных отделов желудочно-кишечного тракта здоровых добровольцев, выраженные в относительных количественных единицах, позволяют использовать их как показатели нормальных значений для оценки результатов последующих исследований. Для дальнейшей отработки показателей «нормы» необходимо продолжить набор здоровых добровольцев.

2. Метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени рекомендовано использовать в диагностике нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у больных синдромом раздраженного кишечника. При СРК с запором для изучения микрофлоры прямой кишки достаточно проведение исследования фекалий данным методом.

3. В схемы лечения пациентов с синдромом раздраженного кишечника (особенно с преобладанием запоров) целесообразно включать пробиотики, содержащие Bifidobacterium spp, Streptococcus spp, а также препараты пребиотического действия.

Публикации по материалам диссертации

1. Лоранская И.Д., Болдырева М.Н., Лаврентьева О.А. Метод ПЦР в реальном времени для количественной оценки микробиоты желудочно-кишечного тракта человека // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы Шестнадцатой Российской гастроэнтерологической недели 11-13 октября 2010г, Москва. - 2010. - том XX, №5. — С.157.

2. Лоранская И.Д., Лаврентьева О.А. Состав фекальной микрофлоры при синдроме раздраженного кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы Семнадцатой Российской

гастроэнтерологической недели 10-12 октября 2011г, Москва. - 2011. - том XXI, №5.-С.52.

3. Лоранская И.Д., Лаврентьева O.A. Опыт использования препарата «Закофальк» при синдроме раздраженного кишечника // Сборник материалов Научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Василенковские чтения). - 8 декабря 2011г. - С.121

4. Лоранская И.Д., Болдырева М.Н., Лаврентьева O.A. Состояние микробиоценоза желудочно-кишечного тракта в норме и при синдроме раздраженного кишечника. Обзор литературы // Кремлевская медицина. Клинический вестник. -2011. - №3. - С.136-139.

5. Лоранская И.Д., Лаврентьева O.A. Функциональный анализ микробиоценоза желудочно-кишечного тракта // Русский Медицинский журнал. - 2011.-том 19,№17(411).- С.1057-1060.

6. Лоранская И.Д., Лаврентьева O.A. Системный подход к лечению синдрома раздраженного кишечника // Русский Медицинский журнал. - 2012. - №15. -С.758-760.

7. Лоранская И.Д., Болдырева М.Н., Лаврентьева O.A. Состав мукозной микрофлоры желудочно-кишечного тракта при синдроме раздраженного кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.-2013. -№3. - С. 15-22.

8. Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Лоранская И.Д., Лаврентьева O.A. Особенности состава мукозной и фекальной микрофлоры при различных клинических формах синдрома раздраженного кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы Девятнадцатой Российской гастроэнтерологической недели 30 сентября - 2 октября 2013г, Москва. - 2013. - том XXIII, №5. - С.92

9. Лоранская И.Д., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Лаврентьева O.A. Полостная и пристеночная микробиота прямой кишки при синдроме раздраженного кишечника // Фарматека. -2013. - №18. - С.61-66.

10. Лоранская И.Д., Лаврентьева O.A. Синдром раздраженного кишечника. Учебное пособие (для врачей-гастроэнтерологов и терапевтов поликлиник, стационаров и диагност.центров). - М.: Форте принт, 2011. - 40 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

гк группа контроля

ГЭ/обр геном-эквивалент в образце

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

жкт желудочно-кишечный тракт

имт индекс массы тела

квм контроль взятия материала

кжк короткоцепочечные жирные кислоты

ОБМ общая бактериальная масса

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

СРК синдром раздраженного кишечника

СРК-Д синдром раздраженного кишечника с диареей

СРК-3 синдром раздраженного кишечника с запором

ВРР Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas

Подписано в печать: 15.11.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 294 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru