Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности макрофагального звена в динамике ВИЧ-инфекции у детей

Кубанская государственная медицинская академия

На правах рукописи

РГб од

?. 2 СЕ!! 1357

ШЕМШУРА Андрей Борисович

ОСОБЕННОСТИ МАКРОФАГАЛЬНОГО ЗВЕНА В ДИНАМИКЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ.

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар 1997

Работа выполнена в Ростовском государственном медицинском университете Минздрава Российской Федерации.

Научный руководитель:

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Сизякина Л.П.

доктор биологических наук, профессор Гараев М.М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ханферян Р.А.

доктор биологических наук, Зверев В.В.

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет

Защита состоится "_" 1997 г. в _час. на заседании

диссертационного совета К 084.06.03. в Кубанской государственной медицинской академии (350063, г.Краснодар, ул. им.Седина, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Соболева Н.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В мире продолжается пандемия СПИДа (Bentley M., 1996). Эта проблема самым серьезным образом обострилась сегодня в России, что связано с экономическими и социальными изменениями в стране (Наркевич М.И., 1997). На фоне уже имеющейся на Юге Российской Федерации большой группы детей, инфицированных парентеральным путем во время вспышки 1988-1989г.г., в последние годы в этом регионе и в сопредельных странах СНГ отмечается быстрый рост числа новых случаев заражения среди взрослых, что неизбежно приведет к увеличению количества детей, инфицированных ВИЧ трансплацентарно. Однако, несмотря на значительные усилия, до сих пор до конца не расшифрованы интимные механизмы патогенеза ВИЧ-инфекщш, особенности формирования различных вариантов течения заболевания (Rozenberg Z.F., Fauci A.S.,1990, Gougeon M.L.,1995, Cozzi Lepri A., 1995, Just J.J., 1995). Вышеприведенные обстоятельства обусловливают возрастающую актуальность исследований в этой области.

Известно, что при ВИЧ-инфекщш прежде всего поражаются иммунокомпетентные клетки, а основным проявлением возникающего иммунодефицита является редукция клеток, обладающих хелперно-индукторными свойствами (Rosenberg Z., Fauci А., 1989, 1991; Montagnier L., 1992, Ameisen J.C.,1995). Однако, в последние годы, большинство исследователей придают приоритетное значение в нарушении функциошгрования иммунной системы и формировагаш тяжелой иммуносупресаш при этой инфекции изменениям в макрофагальном звене (Хаитов P.M. с соавт.,1995, Сгоякина Л.П. с соавт., 1995, Meitzer M. et al.,1990; Falk S., 1991; Mabondzo A. et al., 1991; Poli G., 1992; Rozenberg Z., 1994).

Макрофага, одними id первых вступающие в контакт с чужеродными антигенами и несущие на своей поверхности, как и Т-хелперы-индукторы, С04-рецепторы, играют ключевую роль в патогенезе ВИЧ-инфекции (HoW. et al., 1994, Mosier D. et al., 1994, Schuitemaker H., 1994). Показано, что они являются клетками-мишенями и, одновременно, резервуаром вируса (O'Brien et al., 1990, Schnizlein et al., 1990, Colman et al., 1992). Воздействие ВИЧ при его активной репродукции в макрофагах, приводит к изменению их фагоцитирующих и ашигенпрезентирующих функций и нарушению секреции важнейших монокинов с последующей дискоординацией работы всей иммунной системы и формированием тяжелого иммунодефицита. Именно с особенностями макрофагальной системы связано формирование

"спящей" инфекции без выраженного размножения вируса (Innocenti Р. et al., 1991., Ratner et al., 1991, Foucliier R. et al.,1994), a начало прогрессировать ВИЧ-1шфскцш1 сопровождается сменой преобладающего числа моноцитотропных штаммов на лимфотропные (Schuitemaker Н. et al., 1992).

Однако, сведения о динамике функциональной активности макрофагов, их участии в межклеточной кооперации крайне разнообразны и противоречивы. Так, Molina J. et al.,(1990), Longo N. et al., (1991), Aspa J. et al., (1992) указывают на снижение секреции ИЛ-1Р и ФНОа моноцитами в результате прямого цитопатического эффекта ВИЧ. Однако, Aukrust P. et al.,(1995), Llobet P. et al.,(1995), Халдеева H.A.,(1996) сообщают о повышенном содержании ИЛ-1Р и ФНОа у лнц, инфицированных ВИЧ с последующим снижением на момент выраженных клинических проявлений. В то же время, Калинина Н.М. с соавт.,(1992) выявили, что увеличение содержания ИЛ-1Р и ФНОа в сыворотке детей, инфицированных ВИЧ прямо коррелировало со степенью иммуносупрессии. По мнению Fauci А.,(1992) птерпродукция моноцитами ФНОа является основным механизмом активации ВИЧ-инфекции. Kent S., (1994) свидетельствует о снижении экспрессии Fe,- и СзЬ-рецепторов макрофагов в процессе инфицирования вирусом, a Laurence, (1990), Capsoni, (1992) считают, что обнаруженное ими повышение экспрессии FCyR у больных ВИЧ-инфекцией, благодаря феномену антителозависимой вирусной экспансии, может привести к дальнейшему прогрессированию заболевания.

Не решен вопрос о закономерностях возникновения различных вариантов течения ВИЧ-инфекции. Хотя недавно выявлено, что прогрессированне заболевания обусловлено переходом от преимущественно макрофаготропных штаммов ВИЧ к лимфотропным (Schuitemaker Н. et al., 1994), роль макрофагалыюго звена в формировании того или иного варианта 1шфекциошюго процесса до конца неясна. Еще более малоизученными являются представления о функциональном состояшш макрофагов при ВИЧ-инфекции у детей. Лишь в последнее время появились отдельные сообщения, характеризующие возрастные особенности некоторых параметров мононуклеарных фагоцитов при ВИЧ-инфекции (Халдеева Н.А., 1996).

В доступной литературе практически отсутствуют данные, позволяющие подробно изучить динамику изменений макрофагального звена в течение заболевания в зависимости от биологических свойств поражающего их вируса.

Таким образом, проблема комплексной всесторонней оценки функционального состояния макрофагалыюго звена у ВИЧ-инфицированных детей в динамике заболевания является весьма актуальной.

Цель исследования: изучить роль макрофагального звена в патогенезе формирования различных вариантов течения ВИЧ-инфекции у детей.

Задачи исследования:

1. Изучить экспрессию Ис,- и СзЬ-рецепторов на мембранах моноцитов и фагоцитарную активность макрофагов в динамике ВИЧ-инфекции у детей различных возрастных групп;

2. Исследовать содержание ИЛ-1р и ФНОа в сыворотках и супернатантах клеточных культур в стадиях первичных проявлений и вторичных заболеваний у детей младшего и старшего возраста;

3. Изучить особенности функционального состояния макрофагов при благоприятном и неблагоприятном вариантах течения ВИЧ-инфекции в различных возрастных группах;

4. Охарактеризовать первичную последовательность нуклеоти-дов и исследовать изменчивость области УЗ гена епу §р120 вируса иммунодефицита в динамике развитая ВИЧ-инфекции;

5. Провести корреляционный анализ особенностей макрофагального звена, параметров иммунного статуса и характеристик в1грусного генома.

Научная новизна работы: Впервые выявлены возрастные особенности изменений макрофагального звена в динамике ВИЧ-инфекции у детей.

Впервые дана комплексная оценка роли макрофагального звена в патогенезе формирования различных вариантов ВИЧ-инфекции у детей.

Впервые выявлена взаимосвязь между нарушениями функциональной активности макрофагов и молекулярно-генетическими характеристиками ВИЧ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Установлено, что изменения экспрессии мембранных рецепторов, поглотительной активности и уровня кислородзависимого метаболизма моноцитов периферической крови у ВИЧ-инфицированных детей различных возрастных групп носят разнонаправленный характер. При этом у больных всех возрастов удельная фагоцитарная активность и функциональные биохимические резервы с развитием ВИЧ-инфекции неуклонно снижаются.

2. Обосновывается положение о наличии взаимосвязи между повышением содержания ИЛ-1Р, ФНОа в сыворотке крови, а также увеличением их спонтанной продукции мононуклеарамн периферической крови (МНПК) in vitro и снижением количества С04+лимфоцитов и их функциональной активности при прогрессировашш заболевания.

3. Значительное увеличение экспрессии мембранных рецепторов моноцитов, их окислительно-восстановительного метаболизма на фоне снижения удельной фагоцитарной активности, биохимических резервов и уменьшения способности отвечать на стимулы к продукции ИЛ-1Р in vitro, являются неблагоприятными прогностическими факторами и свидетельствуют о прогрессирующем течении ВИЧ-инфекции.

4. Изменения функциональной активности макрофагов при ВИЧ-инфекции связаны с усилением размножения в них ВИЧ, что манифестируется увеличением коэффициента вариабельности вирусного генома, как при утяжелении клинической картины, так и при более быстром течении заболевания.

Практическое значение работы: Полученные результаты позволяют рекомендовать определение показателей макрофагального звена для оценки тяжести течения и стадии ВИЧ-инфекции. Данные по изучению вирусного генома могут быть использованы при прогнозировашш развития инфекционного процесса и назначении специфической противовирусной терапии.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в практику работы Северо-Кавказского регионального центра по профилактике и борьбе со СПИД, используются в диагностике, диспансерном наблюдении, прогнозировании и стационарном лечении больных ВИЧ-инфекцией в первом детском отделении больницы скорой медицинской помощи №1 им. H.A. Семашко г.Ростова-на-Дону. Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия курса "Клиническая иммунология" ФУВ РГМУ.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Результаты исследований доложены и обсуждены на первом Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), конференции молодых ученых и специалистов РГМУ (Ростов-н/Д, 1992), VII-om Национальном кошрессс болгарских педиатров (Плевен 1993), 1-ой Национальной украинской научно-практической конффенции по проблемам ВИЧ/ СПИД (Киев, 1994), на Х-ой международной конференции по СПИД (Иокогама, 1994), 1-ой научной сессии

РГМУ (Ростов-н/Д, 1996), VIII-ом международном конгрессе по иммунологии слизистых (Сан-Диего, 1995), XI-он международной конференции по ВИЧ/СПИД (Ванкувер, 1996), первой конференции РААКИ (Москва, 1997), IX-ом международном конгрессе по иммунологии слизистых (Сидней, 1997).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введеши, обзора литературы, главы "Материалы и методы", двух глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 322 источника, в том числе 290 зарубежных. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и иллюстрирована 19 таблицами и 31 рисунками.

Материалы и методы исследования. Для решения поставленных задач в настоящей работе были использованы данные клишпсо-иммунологическнх наблюдений 108 детей в возрасте от 3 до 14 лет, зараженных во время вспышки 1988-1989 годов. В результате неё на Юге России сформировалась уникальная ситуация, когда появившиеся практически одномоментно обширные нозокомиальные очага ВИЧ-инфекщш имели по данным эпидемиологического расследования и анализа нуклеотидаых последовательностей вирусов, получивших распространение в этой популящш, единственный общий источник заражения, трансмиссия вируса осуществлялась при парентеральных манипуляциях в детских стационарах г.Ростова-па-Дону и области (Покровский В.В. и др., 1990, Chengsong-Popov et al., 1992). Таким образом, в исследуемой популящш цпркултгровал единственный вариант ВИЧ-1, передающийся парентеральным путём, а размер популяции (108 пациентов) и объём иммунологического мошггоринга обеспечили возможность формирования статистически достоверной выборки.

Клиническая диагностика, определешю стадга! ВИЧ-инфекщш проводились по классификации В.И.Покровского (1989), в соответствии с которой все обследуемые дети были разделены на четыре группы. Первую группу составили 44 человека (29%), находящихся в стадии Нв, вторую — 47 человек (31%) в стадии Illa, третью — 31 ребенок (21%) в стадии Шб и четвертую — 28 (19%) детей в И1в-4 стадии.

В работу также были включены результаты, полученные в процессе непрерывного динамического наблюдения детей, переходящих из одной стадии в другую (22 человека).

Поскольку изучаемый контингент больных характеризовался большим возрастным разбросом (от 3 до 14 лет), а имеющиеся данные (А.Н.Чередеев, Л.В.Ковальчук, 1984) свидетельствуют о вариабельности иммунологических показателей в

зависимости от возраста, внутри каждой группы были выделены соответствующие подгруппы. В стадии 11в - 24 человека в возрасте от 3 до 5 лет и - 20 человек в возрасте от 6 до 14 лет, в стадии Ша - 31 и 16, в стадии III6 - 16 и 15, в стадии IIIb-4 - 15 и 13 человек соответственно.

Кроме того, были выделены группы детей с быстро и медленно прогрессирующим течением заболевания. В качестве критерия скорости прогрессии использовалась продолжительность перехода из второй стадии в третью (до и более года, Just J. et al., 1995; Денисенко В.Б.,1997). Контрольную группу, в которой проводился иммунологический мониторинг, составили 15 детей в возрасте от 3 до 5 лет и столько же детей в возрасте от 6 до 14 лет, все они относились к первой группе здоровья. Объектом исследования была кровь, взятая из локтевой вены у обследуемых.

В работе использованы следующие методы:

1. иммунологические — для всех иммунологических тестов использовали мононуклеарные клетки, выделенные на градиенте плотности фиколл-веро1рафина по методу Recalde H.R.,1984. Изучение функционального состояния макрофагального звена проводили согласно Методическим рекомендациям МЗ СССР "Комплекс методов изучения иммунорегуляторной функции мононуклеарных фагоцитов при оценке иммунного статуса человека", (1991). Для получения моноцитов периферической крови использовали метод адгезии прилипающих клеток к стеклу (Ковальчук J1.B., Чередеев А.Н., 1986).

Определение экспрессии FcyR и СзЬЯ на мембране моноцитов/макрофагов (Мц/Мф) проводили методом ЕА- и ЕАС-розеткообразования. Фагоцитарную активность Мц/Мф исследовали методом ЕА-фагоцитоза. Спонтанная и стимулированная НСТ-активность Мц/Мф оценивалась по методу Т.В.Михеенко с соавт., (1991). Определение содержания ИЛ-1Р и ФНОа в сыворотке крови и супернатантах клеточных культур проводили методом ИФА с применением тест-систем производства ТОО "Протеиновый контур" (ВНИИОЧБП, Санкт-Петербург); Исследование пролиферативной активности лимфоцитов и продукции ИЛ-1р моноцитами осуществляли в стандартной постановке РБТЛ с радиометрическим способом учета. Определение CD4+ и CD8+ субпопуляций лимфоцитов провод или с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (Филатов А.В. с соавт., 1990) с использованием мышиных моиоклональных антител (МКАТ) ЛТ4, ЛТ8 и козьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ (АО"Сорбент", Москва) с учетом на проточном лазерном цитофлюориметре EPIX-XL (Coulter).

Изучение содержания ЦИК проводили методом селективной преципитации ПЭГ 6000 (Гриневич Ю.А. с соавт., 1981).

2. молекулярно-генетические — определение вариабельности области Уз гена env ВИЧ-1 в лимфоцитах и моноцитах/макрофагах проводили с помощью nested-ПЦР с последующим секвенированием по методу Сенгера и дальнейшим анализом нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей.

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятым методом с расчетом средней арифметической (М), ошибки средней (т). Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Мака-Утни-Внлкоксона. Определяли также коэффициент корреляции (Гх.у). Расчеты проводили на компьютере AMD586DX-133 с помощью программы Exel 7.0.

Результаты исследований и их обсуждение.

При ВИЧ-инфекции макрофаги не только являются резервуаром вируса и, следовательно, постоянным источником его репродукции, но и выделяют различные количества провоспалительных и ипгибирующих цигокинов, вследствие влияния разнообразных вторичных факторов. Тем самым они определяют ход инфекционного процесса (Weiss L. et al., 1989, Agostini С. et al., 1991, Vuacamam A. et al., 1991, Montaner L.J., 1995). Таим образом, оценка функционального состояния макрофагального звена играет ведущую роль в диагностике степени иммуносупрессни, оценке эффективности проводимой терапии и прогнозировании течения заболевания при ВИЧ-инфекции. Между тем, среди различных авторов до сих пор нет единства в освещешш этой проблемы. Практически отсутствуют (за исключением продукции ФНОа) литературные данные о возрастных особенностях макрофагального звена при ВИЧ-инфекции.

Учитывая это обстоятельство, а также эпидемиологические особенности изучаемого детского контингента (заражение всех пациентов из одного общего источника с формированием нозокомиальных очагов (С.Р.Саухат с соавт., 1990, М.М.Гараев с соавт., 1992), предполагающие, что дальнейшее развитие инфекционного процесса в большей степаш будет зависеть от иммунной системы больного, нами был проведен анализ изменений макрофагального звена детей различных возрастных групп в динамике развития ВИЧ-инфекции.

Изучение полученных данных показало, что экспрессия Fc,-и СзЬ-рецепторов на мембране моноцитов у детей младшей возрастной группы, находясь в стадии первичных проявлений на уровне, достоверно более шиком, чем у доноров, постепенно увеличивалась от стадии 11в к стадии Шб, где значительно превышала нормальные показатели, снижаясь лишь в стадии IIIb.IV (FCyR доноры - 27±2.7%, 11в - 22.6±1.8%, Illa - 24.1±1.3%, Шб - 31.2±1.5%, IIIb.IV - 23.1 ±1.9%; СзЬ R доноры - 35±3.9%, 11в -28.6+1.9%, Illa - 32.0±2.1%, Шб - 39.1 ±2.7%, IIIb.IV - 29.8±2.5%).

Таким же образом, как и экспрессия мембранных рецепторов, в данной группе изменялась поглотительная способность моноцитов при фагоцитозе опсонизированных эритроцитов барана, возрастая от достоверно более низкой, чем у доноров в стадии 11в к достоверно более высокой в стадии III6, а затем резко снижаясь в стадии IIIb,IV (доноры - 25±2.8%, Ив -20±2.5%, Illa - 21±1.8%, III6 - 30.1±1.1%, IIIb.IV - 20.3±1.5%).

Удельная фагоцитарная активность моноцитов в группе пациентов младшего возраста с утяжелением клинической картины прогрессивно уменьшалась (доноры - 1.35±0.4у.е., Ив -1.30±.03у.е., Illa - 1.26±.09у.е., III6 - 1.20±.06у.е., IIIb.IV -1.15±.06у.е.).

Споиташ1ая активность окислительно-восстановительных процессов в моноцитах у детей младшей возрастной группы, определенная с помощью НСТ-теста, также сниженная в начальных стадиях, с развитием заболевания значительно возрастала, превышая нормальные значения в стадии Шб, а затем вновь снижалась (доноры - 1.15 ±0.09у.е., Ив - 0.84±0.03у.е., Illa -0.91±.06у.е., III6 - 1.04±.03у.е., IIIb.IV - 0.61±.06у.е.). Выявленные закономерности свидетельствуют об активации макрофагального звена при присоединении вторичных инфекций в процессе прогрессирования заболевания в младшей возрастной группе и дискутируют с утверждениями Ercdi L. et al.,(1990), Lardich Т. et al.,(1992), Kent S. et al.,(1994) о раннем угнетении функциональной активности макрофагов при ВИЧ-инфекции.

Изучение индуцированной кислородзависимой метаболической активности моноцитов позволило выявить снижение коэффициента стимуляции НСТ-теста у детей этой группы усиливающееся с течением !шфекции (доноры - 1.44 ±0.1у.е., Ив -1.39 ±0.046у.е., Illa - 1.27±0.06у.е„ III6 - 1.17±0.05у.е., IIIb.IV -1.11±0.08у.е.).

Исследование продукции моноцитами ИЛ-1р у детей младшей возрастной группы в непрямом индометащшовом тесте в

РБТЛ при добавлении индометацина в среду культивирования, а также изучение содержания ИЛ-1Р и ФНОа в супернатантах спонтанных культур мононуклеаров показало, что на фоне некоторого снижения в стадии 11в, с прогрессированием заболевания отмечается резкое увеличение продукщш изучаемых монокинов в стадии Illa, сопровождающееся усилением пролифератпвного ответа лимфоцитов, при нарастающем в дальнейшем выраженном падении всех четырех показателей (Рис.1).

Доноры РБТЛ ИЛ-lp Доноры ИЛ-lp ФНОа с ФГА инд.тесг супернат. супернаг.

Рис.1. Пролиферативная активность лимфоцитов в РБТЛ с ФГА, продукция ИЛ-ip в индометацпновом тесте РБТЛ и содержаш1е ИЛ-ip и ФНОа в супернатантах спонтанных культур мононуклеаров у доноров и больных ВИЧ-инфекцией детей младшей возрастной группы.

Определение содержания ИЛ-]р и ФНОа в сыворотке крови у пациентов младшей возрастной группы позволило установить неуклонное и значительное повышение уровней обоих монокинов по мере развития заболевания (ИЛ-1Р - доноры - 29±13.0пкг/мл., 11в - 26±12.0пкг/мл., Illa - 61±14.7пкг/мл., Шб - 240±13.2пкг/мл„ IIIb,IV - 457±53.4пкг/мл.; ФНОа - доноры - 20±2.7пкг/мл., 11в -65±15.0пкг/мл., Illa - 83±16.1пкг/мл., Шб - 427±49.2пкг/мл., IIIb.IV - 854±126.0пкг/мл.). Выявленные закономерности продукции цитокпнов, отражают нарастающую активацию макрофагаль-ного звена с последующей его анергией. Вероятно, в процессе

развития ВИЧ-инфекции происходит праймирование и сенсибилизация моноцитарных клеток к выработке монокинов, особенно ФНОа, при последующей антигенной стимуляции (D'Addario et al.,1990, Gan H. et al.,1990, Tobin E. et al.,1990, Gougeon M.L.,1995).

Выявленные нарушения в макрофагальном звене в младшей возрастной группе сопровождались весьма типичными для ВИЧ-инфекции изменениями субпопуляционного состава лимфоцитов, которые пошшо неуклонного достоверного уменьшения процентного содержания СВ4+лимфоцнтов (доноры - 48.4±13%, Ив - 24±4.3%, Illa - 16.4±1.8%, Шб - 11.8±2.1%, IIIb.IV - 8.9±2.6%), характеризовались вначале небольшим, а затем, в стадии Illa, резко выраженным увеличением С08+лимфоцитов с их последующим постепенным уменьшением (доноры - 17.8±3.6%, 11в - 28±5.2%, Illa - 35.3±3.7%, Шб - 33.3±4.2%, IIIb.IV - 31.4±2.1%), что верифицировало прогрессирующее падение ИРИ с развитием заболевания и являлось проявлением усугубляющейся иммуносупрессии.

Количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), напротив, непрерывно статистически достоверно возрастало с прогрессированием инфекции (доноры - 45±12у.е., 11в - 165±15у.е., Illa - 250±15у.е., Шб - 337±14у.е., IIIb,IV - 344±18у.е.).

Суммируя приведенные данные можно заключить, что прогрессирование ВИЧ-инфекции у детей младшей возрастной группы (3-5 лет) характеризуется присоединением различных оппортунистических инфекций и, постепенно нарастающей, вследствие этого, активацией макрофагалыюго звена (увеличение экспрессии FCyR и СзЬЯ, поглотительной фагоцитарной способности, кислородзависимого метаболизма моноцитов, синтеза провоспалительных цитокинов ФНОа и ИЛ-1Р), что на фоне уменьшающейся удельной активности фагоцитоза и падающих резервных метаболических возможностей моноцитов, приводит на конечных стадиях развили инфекциошюго процесса к тотальному угнетению всех показателей функциональной активности макрофагов. Повышенные количества ЦИК, отражая поликлональную активацию В-клеток, с одной стороны стимулируют экспрессию мембранных рецепторов, а с другой — блокируют их, делая малодоступными для определения (Ellaurie М.,1990). Нарушение процессов рециклизации мембранных структур, отмечаемое при ВИЧ-инфекции (Molina et al., 1995), особенно при их интенсивной экспрессии, способствует уменьшению количества полноценных рецепторов и ухудшению фагоцитарной активности моноцитов.

При анализе показателей макрофагального звена у пациентов старшей возрастной группы (6-14 лет) выявлено, что при переходе в более тяжелую стадию ВИЧ-инфекции отмечается постепенное снижение экспрессии мембранных Fey и СзЬ-рецепторов моноцитов, с выраженным увеличением уровня этой экспрессии в конечной стадии IIIb,IV (Fc^R доноры - 28.2±2.7%, 11в

- 25.1±1.7%, Illa - 23.2±1.6%, Шб - 20.2+1.8%, IIIb.IV - 36.9±1.9%; C3bR доноры - 37+2.8%, 11в - 32±2.1%, Illa - 30.9±1.7%, Шб -28.9±2.5%, IIIb.IV - 46.9±2.9%). Аналогичньгм образом изменялась и фагоцитарная поглотительная способность моноцитов (доноры

- 27±2.4%, Пв - 24.7±1.6%, Illa - 24.3±1.5%, Шб - 20.4±1.6%, IIIb.IV

- 32.6+1.8%).

Удельная активность фагоцитоза моноцитов с утяжелением инфекционного процесса в этой группе пациентов прогрессивно уменьшалась (доноры - 1.43±0.6у.е., Пв - 1.3±0.2у.е., Illa -1.25+0.08у.е., III6 - 1.19±0.04у.е., IIIb.IV - 1.06±0.10у.е.). Спонтагшая НСТ-активность, постепешю снижаясь к стадии III6, возрастала в последней стадии IIIb.IV, оставаясь все же ниже нормального уровня (доноры - 1.2±0.1у.е., Пв - 0.92±0.06у.е., Illa -0.86±0.07у.е., Шб - 0.79±0.1 Iy.e., IIIb.IV - 1.11±0.09у.е.). Резервные способности моноцитов, верифицируемые по коэффициенту стимуляции (Кст.) НСТ-теста, в старшей группе пациентов в течение инфекции статистически достоверно снижались (доноры -1.4±0.1у.е„ IIb - 1.36±0.07у.е., Illa - 1.23±0.06у.е., III6 - 1.16±0.05у.е., IIIb.IV - 1.09±0.09у.е.).

Выявленные в старшей возрастной группе закономерности подавления практически всех показателей функциональной активности макрофагов при начинающемся прогресснровашш ВИЧ-инфекции возможно обусловлены прямыми нммуно-супрессивными эффектами цитомегало- и герпесвирусов, акпшно размножающихся в оргашгзме, вследствие присоединешгя уже на ранних стадиях заболевания оппортунистических инфекций преимущественно вирусной этнологии (Денисенко В.Б.,1997). Несомненно, определенное значение при этом имеет непосредственный цитопатический эффект самого ВИЧ на клетки макрофагального ряда (Kent S. et al., 1994).

Одновременно с отмеченными нарушениями у пациентов старшей группы выявлялось достоверное снижение продукции ИЛ-1 р моноцитами крови по данным индометацинового теста РБТЛ (доноры - 187±14инд.стим., Пв - 87±17.2инд.стим., Illa -68±10.5ннд.стим., III6 - 59±19.3инд.стим., IIIb.IV - 29±11.1 шгд.спгм.).

В отличие от этого, спонтанная продукция макрофагами ФНОа возрастая к стадии Шб, резко снижалась в терминальных стадиях (доноры - 8±3.7пкг/мл., IIb - 15±3.5пкг/мл., Illa -113±27.9пкг/мл., Шб - 470±75.0пкг/мл., IIIb.IV - 72±27.2пкг/мл.). Подобное усиление синтеза ФНОа макрофагами, вследствие пшерпродукщш метаболитов арахидоновой кислота, в частности, ПГЕга. может обусловливать снижение их способности к стимулированной секреции ИЛ-1р (Nokta М. et al., 1995).

, Содержание ИЛ-1Р и ФНОа в сыворотке крови у детей старшей возрастной группы непрерывно возрастало вплоть до терминальных стадий заболевашш (ИЛ-1р - доноры 37±2.3пкг/мл., IIb - 28±1.2тсг/мл., Ша - 40±14.9пкг/мл., Шб -165±19.1пкг/мл., IIIb.IV - 258±23.8пкг/мл.; ФНОа - доноры -26±2.7пкг/мл., IIb - 40±6.5пкг/мл., Illa - 60±21.1пкг/мл., III6 -371±51.7пкг/мл., IIIb.IV - 730±48.3пкг/мл.).

Иммунный статус детей старшей группы при ВИЧ-инфекщш характеризовался изменениями, сходными с таковыми в младшей группе. С утяжелением стадии инфекционного процесса наблюдалось выраженное снижение процентного содержания С04+лимфоцнтов на фоне вначале достоверно увеличивающегося, а затем несколько уменьшающегося количества С08+лимфоцитов (CD4+ - доноры - 46±1.7%, IIb - 23±5.3%, Illa -15,05±3,5%, Шб - 11,10+2,3%, IIIb,IV - 9,32±4,63%; CD8+ - доноры

- 18±0.7%, IIb - 30±5.8%, Illa - 35,86±6,85%, III6 - 37,75±9,7%, IIIb.IV - 35,37±7,03%), что сопровождалось несклонным падением иммунорегуляторного индекса (доноры - 2,6±0.18у.е., IIb -0,76±0.25у.е„ Illa - 0,42+0.16у.е., III6 - 0,29+0.9у.е., IIIb,IV -0,26±0.5у.е.) и сшшашсм пролиферативной активности (доноры -120+27инд.стим., IIb - 89+17.9инд.стим., Illa - 68±15инд.сшм., III6

- 59±181шд.стим., IIIb.IV - 23±13инд.стим.). С прогрессироваш!ем заболевания значительно повышалось содержание ЦИК в сыворотке крови (доноры - 35±12у.е., IIb - 196±38.2у.е., Illa -212±15у.е., III6 - 257±14у.е., IIIb.IV - 315±18у.е.).

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что уже в ранних стадиях ВИЧ-инфекции у пациентов старшей возрастной группы наблюдается, усиливающийся в дальнейшем, дефицит макрофагального звена, который проявляется в снижении практически всех показателей функциональной активности макрофагов на фоне патологической пшерпродукщш ФНОа. А отмечающийся в терминальных стадиях аномальный всплеск экспрессии поверхностных Fcy и СзЬ-рецепторов,

увеличение захватывающей способности и интенсивности окислительно-восстановительных процессов в моноцитах, на фоне продолжающих снижаться удельной фагоцитарной активности и резервных метаболических возможностей, не может обеспечить сколько-нибудь значимого улучшения макрофагальных функций и приводит, в конечном итоге, лишь к еще более выраженным нарушениям, что верифицируется изменениями показателей иммунного статуса больных в этой группе.

Таким образом, при сравнении показателей макрофагаль-ного звена в динамике ВИЧ-инфекщш у детей различных возрастных групп, обнаруживаются разнонаправленные изменения экспрессии мембранных рецепторов Рсг11, СзЫ1, поглотительной способности и окислительно-восстановительной активности моноцитов (Рис.2). В то время, как при прогрессироватш инфекции у детей младшей группы наблюдается увеличение вышеуказанных параметров с последующим падением в терминальных стадиях, в старшей группе происходит обратный процесс — постепенное снижение этих показателей в ранних периодах ВИЧ-инфекции с резким подъёмом в конечной фазе заболевания.

I | — младшая группа

л— —I—"-1—I—""—I I ™—I—™—I— —1^1'

РсД СШ Ф.А НСТсп.рсД СзЪВ. ФА НСТсп.

Рис.2 Экспрессия мембранных рецепторов (РсуЯ, СЗЬЯ), поглотительная фагоцитарная (Ф.А.) и НСТ-активность моноцитов у детей, больных ВИЧ-инфекцией в динамике заболевания.

Возможно, подобные изменения связаны с большей реактивностью относительно незрелой иммунной системы детей младшего возраста (Чередеев А.Н.,1994), а также с блокадой рецепторного аппарата моноцитов большим количеством ЦИК (ЕМаипе М.,1990), уровень которых у детей старшего возраста гораздо выше, чем у младшего.

С другой стороны, в обеих возрастных группах отмечаются совершенно аналогичные тенденции выраженного снижения удельной фагоцитарной активности и резервных метаболических возможностей моноцитов с утяжелением клинической картины заболевания (Рис.3). Подобные отмеченным закономерности прослеживаются и в отношении показателей иммунного статуса. Однонаправленное снижение содержания С04+популяции Т-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса, с одновременным вначале повышением, а затем уменьшением содержания С08+лимфоцитов (Рис.4), и неуклонное повышение ЦИК на протяжении всего заболевания в обеих группах сопровождаются на ранних стадиях в младшей возрастной группе увеличением пролиферативного ответа лимфоцитов на ФГА и синтеза ИЛ-1р моноцитами с последующим резким падением, тогда как в старшей группе отмечается постоянное выраженное снижение, и

I | — младшая группа

— старшая группа

Кстим.

■ I-г

Ша 1116 Шв,IV

Рис.3 Удельная фагоцитарная активность (Ф.Ч.) и резервные метаболические возможности (К стим.) моноцитов у детей, больных ВИЧ-инфекцией в динамике заболевания.

пролпфератпвпой активности лимфоцитов, и синтеза моноцитами ИЛ-1Р. Все эти изменения происходят на фоне пшерсежреции ФНОа (Рис.4), причем показатели в младшей возрастной группе заметно превышают таковые в старшей.

младшая группа

3 — старшая группа

IIIb.IV

пкг/мл

С04+ С08+ ФИО СЫ+ С08+ ФНО

Рис.4 Содержатте С04+, СБ8+ лимфоцитов и концентрация ФНОа в сыворотке крови у детей различных возрастных групп, больпых ВИЧ-инфекцией в динамике заболевания.

у. е., пкг/мл

2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00

Рис.5 Удельная фагоцптарпая акпшность (Ф.Ч.), резфвные метаболические возможности (К стим.) монощггов и содфжание ФНОа в сыворотке крови у детей, больных ВИЧ-инфекцией младшей возрастной группы в стадии первичных проявлений с различной скопостыо протекания инфекционного процесса.

стим.

Нами были проанализированы также особенности функционирования макрофагального звена и формирования иммунного ответа при ВИЧ-инфекции у детей как младшей, так и старшей возрастных групп с быстро прогрессирующим и замедленным типом течения ВИЧ-инфекции, которые определялись по существующим критериям быстрого и медленного течения (до и более года, Just J. et al.,1995; Денисенко В.Б.,1996).

В стадии первичных проявлений в младшей возрастной группе в подгруппе с медленным течением ВИЧ-инфекции отмечалась более высокая экспрессия поверхностных рецепторов, более высокие показатели фагоцитоза и метаболических резервов. На этом фоне макрофаги больных с медленной прогрессией продуцировали гораздо меньше ФНОа (Рис.5) при сохраненной способности к продукции ИЛ-1р (медл. - 78±14инд.стим.; быстр. - 40±10инд.стим.). При этом, в подгруппе с медленным течением было выше, как количество С04+лимфоцигов и ИРИ, так и пролиферативная активность лимфоцитов (медл. -78±14инд.спт.; быстр. - 70±10инд.стим.). У детей с медленнопротекающей инфекцией обнаруживалось меньшее количество ЦИК в сыворотке крови (медл. - 152±16у.е.; быстр. -187±0.8у.е.).

При сравнении изучаемых показателей в подгруппах с медленной и быстрой прогрессией заболевания в старшей возрастной группе обнаруживались те же закономерности, что и в младшей.

В стадии вторичных заболеваний сопоставление показателей функциональной активности макрофагов в быстро- и медленнопрогрессирующих подгруппах возрастных различий также не выявило. И в старшей, и в младшей возрастных группах медлешюе течение характеризовалось более высоким уровнем всех изучаемых показателей, кроме количества ЦИК, ИЛ-1р и ФНОа в сыворотке крови, содержание которых было ниже, чем в подгруппе с быстрым типом течения заболевания.

Таким образом, медлешюе течение ВИЧ-инфекщш в обеих возрастных группах сопровождается большей сохранностью макрофагального звена, что позволяет макрофагам более эффективно осуществлять свои разнообразные защитные и иммунорегуляторные функции.

Сравнение динамики изменения отдельных показателей функционирования макрофагов с другими параметрами

иммунного статуса позволило выявить наличие четкой взаимосвязи между снижением числа С04+лимфоцитов и увеличением содержания в сыворотке крови ИЛ-1р и ФНОа в обеих возрастных группах (младшая г=-0,97; старшая г=-0,78). Кроме того установлена корреляционная взаимозависимость между снижением числа С04+лимфоцитов и уменьшением удельной фагоцитарной активности в младшей возрастной группе (г=0,73); между уменьшеш1ем пролиферативной активности лимфоцитов и способности моноцитов к продукции ИЛ-1р в индометациновом тесте (младшая г=0,67; старшая г=0,58); между сш1жешгем числа С04+лимфоцитов и ИРИ и уменьшением резервных метаболических возможностей моноцитов (младшая г=0,87; старшая (г=0,76). Увеличение содержания ЦИК в начальных стадиях заболевания коррелирует с увеличением экспрессии мембранных рецепторов в младшей возрастной группе (г=0,86) и с уменьшением их экспрессии в старшей (г=-0,91). Исходя из проведенного корреляционного анализа, можно заключить, что нарушения макрофагального звена и изменения иммунного статуса при ВИЧ-инфекции не возникают изолированно, а характеризуются тесной взаимосвязью и взаимозависимостью (Халдеева Н.А.,1996, Аикгш1 Р. й а1.,1995).

Изменения функционального состояния макрофагов несомнешю зависят от характеристик В1фуса, циркулирующего в организме. В последнее время в литературе появились многочисленные указания на существование в крови ВИЧ-инфицированных особой субпопуляцин ВИЧ-1 обладающего специфическим тропизмом по отношению к макрофагам (БсИпег 1 й а1.,1993; Рие^епЬе^ Б. й а!, 1993). Основные отличия макрофаготропного и лимфотропного вируса локализовались в области участка, кодирующего пшервариабельный домен УЗ ^ 120 (УатаБЬйа А. й а1., 1994,). В связи с тем, что основная масса работ, посвященных анализу специфичности последовательностей УЗ была проведена на вариантах ВИЧ-1, принадлежащих В-субтипу, а популяция ВИЧ-инфицированных, явившаяся предметом настоящего исследования, инфицирована С-субтипом (Гараев М.М.,1994, ВоЬскоу й а1., 1994), наш! была предпринята попытка проведения анализа специфичности последовательностей области УЗ gpl20 ВИЧ-1 от пациентов из нозокомиальных очагов ВИЧ-инфекции Юга России.

Как следует из полученных данпых, индивидуальные консенсусы пациентов практически не отличаются от группового, что является подтверждением данных эпидрасследования об общем источнике заражения для этих пациентов. В позиции 32

конеенсусных последовательностей в лимфоцитарных вариантах присутствует остаток глютамина, а в макрофагальных — аргишша. Кроме того, прослеживается явная тенденция к консерватизму замен в макрофагальных вариантах в поз.14, где нами были обнаружены замены лейцина только на фенилаланин. Эти различия, по-видимому, обусловлены адаптированностыо вируса к определенным типам клеток, которые имеют различные свойства мембран.

В частности, отражением этого обстоятельства является различный суммарный заряд УЗ петли и ее гидропатичность. Действительно, при анализе суммарного заряда отдельных фрагментов области УЗ в условиях нейтрального рН наш! установлено, что участок 17-35 ак у макрофаготропных вирусов имеет больший относительный заряд и гидрофобностъ по сравнению с лимфоцитарными вирусами (Таблица 1).

Таблица 1.

Заряд области УЗ в условиях нейтрального рН.

Клетки Восходящая цепь Нисходящая цепь Вся цепь

ЗарчД Ивд алифашчиосш Зарвд Ивд ашг(етичносш Зерщ Ивд ашфшнизеш

Макрофаги +3,77 38,9 -0,82 80,3 +2,91 59,6

Лимфоциты +3,28 34,5 -0,27 86,4 +3,01 61,2

Одной из основных функций макрофагов является презентация вирусного антигена. В зависимости от варианта (вариантов) вируса, которым инфицирован макрофаг будет активироваться клон лимфоцитов, специфичный к тем или иным вариантам вируса, тем самым обуславливая специфичность общего ответа организма на инфекцию. В связи с этим, сопоставление уровней вариабельности вируса в лимфоцитах и в макрофагах дает представление об общем соотношении характера иммунного ответа и варианта вируса циркулирующего в организме.

Таблица 2.

Внутрипациентная вариабельность области Уз йр120 ВИЧ-1.

Стадии Вариабельность области Уз ер120

внутрипациентная лимфоциты макрофаги

2в(К.) 2,4 - 2,4

2в(А.) 3,2 2,8 3,9

За (Б.) 3,3 3,2 3,4

36 (П.) 3,9 - 3,9

Для количественной оценки уровней вариабельности было проведено попарное сравнение всех полученных последовательностей. Соответствующие выборки из массива значений чисел несовпадающих нуклеотпдов (выраженные в процентах) были использованы в статистическом тесте Колмогорова-Смирнова для определения степени различий. Результаты обработки данных представлены в таблице 2.

Так как абсолютный уровень изменчивости области генома оценить чрезвычайно сложно, то обычно используют различные методы, основанные на измерении вариабельности в ограниченных выборках и в дальнейшем экстраполируют эти данные на всю популяцию молекул с той или иной степенью вероятности. Используя этот подход мы попытались оценить уровень изменчивости области УЗ в макрофагальной п лпмфощггарной популяциях вируса у изучаемых нами пациентов.

Нами установлено, что уровень внутрнпацпентной вариабельности области УЗ gpl20 зависит в первую очередь от стадии заболевания: у пациентов находящихся в стадии первичных проявлений уровень изменчивости ниже, чем у пациентов в стадии вторичных заболеваний. Это наблюдение справедливо для всего пула вируса присутствующего в организме независимо от его тропизма (Таблица 2). Полученные данные доказывают правильность тезиса БЛийтейсег Н., (1994) об усилении вариабельности генома ВИЧ в процессе развития заболевания.

Также необходимо отметить, что у пациентов с медленной прогрессией инфекционного процесса вариабельность УЗ gpl20 несколько ниже, чем у пациентов находящихся на той же стадии инфекции, но с быстрым типом течения. По-видимому, эти

различия обусловлены разным уровнем подавлеши репликации вируса факторами иммушггета, что хорошо согласуется с современными представлениями о связи концентрации вируса в организме и скоростью прогрессии заболевания (Но D., 1995).

Согласно полученным нами данным уровень вариабельности вируса в макрофагах выше, чем в лимфоцитах у пациентов находящихся на разных стадиях заболевания (Таблица 2). Такая разница в уровнях изменчивости вирусов по-видимому обусловлена разными репликативными потенциями макрофагальных и лнмфотропных вирусов. Согласно данным Poli G., (1994), лимфотроиная популяция вируса представлена в основном rapid/high вариантами в то время как макрофагальная - slow/low вариантами. При этом основная масса активно реплицирующегося rapid/high вируса характеризуется ограшгчеиным числом вариантов, в то время slow/low штаммы в силу ограниченной способности к репликации позволяют накапливать большее число генетически измененных форм (Schuitmeiker Н., 1991).

Выводы:

1. Экспрессия FCy- и СзЬ-рецепторов на мембране макрофагов, поглотительная активность и уровень окислительно-восстановительного метаболизма, в младшем возрасте (3-5 лет), будучи сниженными в начальных стадиях, повышаются в дальнейшем с прнсоединешюм оппортунистических инфекций и вновь значительно уменьшаются в тяжелых конечных стадиях; в старшей возрастной группе (6-13 лет) при прогрессировашш ВИЧ-инфекщш обнаруживается угнетение экспресаш мембранных рецепторов, поглоштельной активности и НСТ-активно-сти, сменяющееся резким увеличением этих показателей в терминальных стадиях. Удельная фагоцитарная активность и функциональные биохимические резервы моноцитов снижаются по мере развития заболевания в обеих возрастных группах.

2. Продукция мононуклеарами при спонтанном культивировании in vitro ИЛ-1р и ФНО„ у детей, больных ВИЧ-инфекцией во всех возрастных периодах вначале увеличивается с развитием инфекционного процесса, а затем снижается в тяжелых стадиях заболевания, при этом уровень продукции ИЛ-1Р и ФНОа в младшей возрастной группе во всех стадиях превышает таковой у детей старшего возраста. Содержание ИЛ-1Р и ФНОа в сыворотке крови у пациентов всех возрастов увеличивается при прогрессировашш заболевания, достигая максимальных значешш в терминальных стадиях. При этом концентрации

ИЛ-1р и ФНОа в младшей возрастной группе практически во всех стадиях выше, чем у детей старшей возрастной группы.

3. Быетропрогресспрующее течение ВИЧ-инфекции у детей обеих возрастных групп характеризуется угнетением экспрессии мембранных рецепторов, фагоцитарной активности, спонтанного и стимулированного кислородзависимого метаболизма на фоне птерпродукции ИЛ-1Р и ФНОа.

4. Первичные последовательности области УЗ др120 ВИЧ в макрофагах, в отличие от лимфоцитов, имеют в большинстве случаев в позиции 32 аргинин, а в позиции 14 — фенилалагаш, что обуславливает больший суммарный заряд и большую гидрофобность петли, кодируемой изучаемой областью вируспого генома. Вариабельность области УЗ яр120 ВИЧ в макрофагах увеличивается при утяжелешш клшшческой карлшы и находится на более высоком уровне при быстром течении заболевания.

5. Снижение удельной фагоцитарной активности и резервпых метаболических возможностей макрофагов в обеих возрастных группах при прогрессировании ВИЧ-инфекции имеют выраженную корреляцию с пшерпродукцней ИЛ-1Р и ФНОа и увеличением содержания ЦИК. При этом повышение концентрации ИЛ-1Р и ФНОа обратно коррелирует с уменьшением числа С04+лимфощггов, ИРИ и пролифератнвной активности лимфоцитов.

Список работ, опубликованных по теме дисссрташш

1. Патогенетическая значимость иммунологических сдвигов при ВИЧ-ннфскщш у детей и их динамика в процессе иммуно-реабилитации (Л.П.Сизякина, В.Н.Черньппов). — //Тез. докл. 7-го Национального конгресса болгарских педиатров. — Плевен.—1993. — С.157.

2. Особенности макрофагального звена в динамике ВИЧ-инфекщш у детей. — //Тез. докл. 1-й региональной конференщш "Актуальные проблемы ВИЧ-шгфекции". — Ростов-н/Д.—1993. — С.57.

3. Иммуногенетические ассоциации вариабельности генома ВИЧ-1, скорости прогрессии ВИЧ-инфекции и эффективности противовирусной терапии (Л.П.Сизякина, И.В.Шестакова, Г.И.Иноземцева, В.М.Орлова). — //Тез.докл. 1-й Национальной украинской научно-практической конференщш по проблемам ВИЧ/ СПИД — Киев. —1994. — С.91.

4. Функции макрофагов при лечении ретровиром ВИЧ-инфицированных детей (Л.П.Сизякина, Э.Н.Симованян, В.Н.Черньппов, В.Б. Денисенко). — //Тез. докл. 10-й Международной конференщш по СПИД. — Иокогама. —1994.

— С.260.

5. Особешюст макрофагального звена у детей, больных ВИЧ-инфекцией, при лечении ретровиром (Л.П.Сизякина,

B.Н.Черньппов, Э.Н.Симованян, З.Н.Савкова). — Иммунология. —1995. —№.5. С.19.

6. Взаимодействие показателей макрофагов у ВИЧ-инфицированных. детей и вариабельности вирусного генома (Л.П.Сизякина, М.М.Гараев, В.М.Орлова). — //Clinical Immunology and Immunopathology. — 1995. —V.76. — №.1. p.S.106. Part 2.

7. Сравнительная характеристика результатов определения ИЛ-lp иммуноферментньш методом и в реакции бласт-трансформащш с индометащшом (В.В.Плаван, Л.П.Сизякина).

— //Клшшческая и лабораторная диагностика. — 1996. — №2.

C.42.

8. Иммуногенетические и иммунологические особенности быстрого и медленного течения ВИЧ-инфекции (Л.П.Сизякина, В.М.Орлова). — //Тез. докл. 10-й Международной конференщш по СПИД. — Ванкувер. — 1996. — С.267.

9. Ассоциация вариабельности генома ВИЧ и характера клинического течения ВИЧ—инфекщш (Л.П.Сизякина,

М.М.Гараев, И.В.Шестакова). — //Иммунология. — 1996. — №3. С.21.

10. Зависимость характеристики макрофагов детей, больных ВИЧ-инфекцией от степени вариабельности вирусного генома. — //Тез. докл. 1-ой научной сессии РГМУ. — Росгов-н/Д. — 1996.— С.79.

11. К механизму апоптоза при ВИЧ-инфекции (Л.П.Сизякина, И.Н.Колесшпсова). — //Immunology and cell biology. — 1997.— V.75. — S.l. p.A.94.