Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Функциональное состояние легочных и перитонеальных макрофагов после воздействия общей гипертермии (экспериментальное исследование)

На правей рукописи

САМСОНОВ Андрей Викторович

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛЕГ ОЧНЫХ

И ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ

(экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ЯНВ 2012

Томск - 2012

005007461

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессиональною образования «Новосибирские государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцра вития РФ

Защита диссертации состои тся «_»_2012 г. в_на г

седании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Росам ской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (65005 г. Томск, пр-т. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научт исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения Ро сийской академии медицинских наук

Автореферат разослан « » _ .................................... 2011 г.

Ефремов Анатолий Васильевич

Скурихин Евгений Германович Трунов Александр Николаевич

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Е. Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

На современном этапе развития медицины активно разрабатываются новые диагностические и терапевтические технологии, приборы и другая медицинская техника, которые успешно внедряются в практическую деятельность клиник для лечения различных заболеваний. Одним из таких подходов является использование общей управляемой гипертермии, которая активно применяется в клиниках США, стран Европы и Азии (Осин-ский С.П., 2002, Sakaguchi Y. et al., 1994; Bull J.M. et al., 2008; Repasky E.A., Lee J-F., 2008: Peer A.J. et al., 2010).

В настоящее время гипертермия, как локальная, так и общая, находится в центре внимания врачей различного профиля, особенно онкологов (Ше-лыгин Ю.А. с соавт., 2011; Мардынский Ю.С. с соавт., 2011; Карев И.Д. с соавт., 2010; Van der Zee J et al., 2008). Локальная гипертермия в форме терморадио-, термохимио- и терморадиохимиотерапии применяется при лечении онкологических, больных в самостоятельном виде или в плане неоадъювантной и адьювантной терапии. Подавляющее большинство исследований посвящено именно локальной терапии. Что касается общей (системной) и особенно сочетанной или комбинированной гипертермии, то эти методики гипертермического воздействия пока используются в немногочисленных онкологических клиниках. Между тем в применении искусственной управляемой гипертермии в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией скрыты немалые резервы, в частности, при многокомпонентном лечении больных с далеко зашедшими злокачественными новообразованиям! (первичные местнораспространенные, рецидивные и/или метастатические опухоли), а также с локализованными, но крайне неблагоприятными формами заболевания (Бирюков А. В. С соавт., 2010; Репин В .Л. с соавт.. 2010; Ткачев С.И. с соавт., 2007; Курпешев O.K., Павлов В.В., 2007: Терентьев "ИХ, Ильин Н.В., 2006: Pech M.'et al. 2007; Falk M.H., Issels R.D., 2001). В сочетании с другими технологиями различные методы гипертермии могут применяться во многих областях медицины. Сегодня они успешно применяются в урологии - для лечения простатита, в хирургии и, конечно, при лечении инфекционных заболеваний (Антонов А.Р., Морсина Е.В.. 2001; Жаврид Э.А. с соавт., 2010; Чиссов В.И. с соавт., 2010; Кокорина О.В., 2010; Непомнящая Е.М. с соавт., 2010; Снопова Л.Б. с соавт., 2010; Барышников А.Ю. с соавт., 2009; Киприянов Е.А., 2009; Оборотова H.A., Тазина Е.В., 2008; Gong В. et al., 2008; Maluta S. et al., 2007).

В научной литературе идет активная дискуссия о механизмах действия локальной и общей гипертермии на организм человека и ее влиянии на па-

тогенез различных заболеваний (Литвицкий П.Ф.. 2009; Старченко В.В., 2009; Ефремов A.B. с соавт., 2009). Состояние общей гипертермии тела представляет собой один из вариантов тяжелого стресса, адаптация к которому лежит за пределами физиологических возможностей организма. Характер развития стресс-реакции во многом определяется функциональным состоянием лимфоидной ткани, макрофагов и ретикулоэндотелиальной системы в целом. Даже кратковременное пребывание человека и животных в условиях экстремально высокой внешней температуры приводит к метаболическим и функциональным изменениям на всех уровнях многоклеточного организма: молекулярном, клеточном и тканевом (Андреева ЛИ. с соавт. 1999; Баллюзск Ф. В. с соавт., 2001; Сувернев А. В. с соавт., 2002; Алимов Н. И., 2003: Тулсутаев М. Е., 2003; Антонов А. Р. с соавт., 2004; Ефремов А. В. с соавт., 2004; Симакова И. В., 2005; Лушникова Е.Л., Колдышева Е.В.. 2008; Verescliagin Е. I., Souvernev А. V., 2001).

В клинической практике применяются различные варианты активного физического согревания организма, при использовании которых следует учитывать как положительные, так и отрицательные стороны этой интенсивной медицинской технологии. Клинические и экспериментальные работы, посвященные влиянию общей гипертермии на организм человека, проводились в подавляющем большинстве в диапазоне температур 37-42°С. Вместе с тем известно, что гибель опухолевых клеток происходит только при температуре более 43°С (Алимов Н. И., 2003; Тулеутаев М. £,, 2003; Шевченко В. П. с соавт., 2003; Антонов А. Р. с соавт., 2004; Ефремов А. В. и соавт., 2004,2006: Мардынский Ю.С., Лопатин В.Ф., 2007; Сувернев A.B. и соавт., 2009; Chen S.C., Evans S.S., 2005; Repasky E.A., Lee M., 2008).

Клиническому применению ОГ (43°С) должно предшествовать ее экспериментальное моделирование с целью более полного и детального изучения патогенетических аспектов влияния высокой внешней температуры на клетки, ткани, органы и организм в целом.

Поскольку основными областями применения общей гипертермии являются онкология и клиника инфекционных болезней, то наибольший интерес представляют вопросы влияния гипертермии на состояние иммунной системы. Клетки макрофагальной системы играют центральную роль как в обеспечении неспецифической резистентности, так и в реализации специфического иммунного ответа организма (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000). Одним ш методов изменения функциональной активности макрофагов может стать общая гипертермия. Поэтому представлялось интересным изучить роль фагоцитирующих клеток в формировании патогенетических и саногенетических реакций после воздействия общей гипертермии.

Данные обстоятельства определили цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: изучить функциональное состояние легочных, и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

Задачи исследования:

1. Изучить клеточный состав бронхо-альвеолярной лавзжной жидкости и перитонеальной жидкости в различные сроки после воздействия общей гипертермии.

2. Оценить биоцидную активность легочных и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

3. Изучить фагоцитарную активность легочных, печеночных и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

4. Оценить общую антиоксидантную активность бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия общей гипертермии.

5. Оценить общую прооксидантную активность бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия обшей гипертермии.

Научная новизна

Впервые проведена комплексная оценка клеточного состава бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия общей гипертермии. Показано, что динамика клеточного состава бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости носят однонаправленный характер, проявляющийся увеличением общего содержания лейкоцитов за счет моноцитов/макрофагов и клеток нейтрофильного ряда.

Проведена комплексная оценка окислительного метаболизма фагоцитирующих клеток бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости в динамике после воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных. Было выявлено повышение биоцидной активности фагоцитов БАЛ и перитонеальной жидкости на протяжении всего постгипертермического периода, что может служить дополнительным фактором повреждения тканей и привести к активации ПОЛ с развитием окислительного стресса.

Проведена оценка биоцидного потенциала мононуклеарных фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости в динамике после воздействия общей гипертермии. Бьшо отмечено снижение биоцидного потенциала фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости.

Проведена комплексная оценка прооксидантной и общей антпокеидант-ной активности перитонеальной жидкости и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости в различные сроки после воздействия общей гипертермии. Было отмечено, что постгипертермический период сопровождается развитием окислительного стресса, проявляющегося смещением в системе «про-оксиданты - антиокеиданты» в сторону- прооксидантной системы.

Оценена фагоцитарная активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, перитонеальной жидкости, печени и легких после проведения обшей гипертермии. Отмечено стойкое повышение фагоцитарной активности макрофагов.

Практическая значимость результатов работы

Полученные данные расширили представления о развитии патогенетических и саногенетических реакций после проведения обшей гипертермии.

Выявленные соотношения между прооксидантной и антиоксидантной активностью биологических жидкостей в динамике постгипертермическо-го периода позволили выделить наиболее критические периоды с точки зрения развития окислительного стресса.

Повышение фагоцитарной активности моноцитов/макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей может рассматриваться как саногенетический механизм, направленный на повышение как неспецифической так и специфической резистентности организма.

Повышение биоцидной активности моноцитов/макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости с точки зрения биологических последствий носит двоякий характер. С одной стороны, повышается бактерицидный эффект фагоцитирующих клеток. С другой стороны, образование большого количества активных метаболитов кислорода повышает деструктивный потенциал фагоцитирующих клеток и может привести к активации ПОЛ и повреждению собственных тканей организма.

Положения, выносимые па защиту

1. После воздействия общей гипертермии динамика клеточного состава перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости у экспериментальных животных носит однонаправленный характер, проявляющийся увеличением общего содержания лейкоцитов за счет моноцитов/макрофагов и клеток нейтрофильного ряда.

2. Постгипертермический период сопровождается развитием окислительного стресса, проявляющегося смещением в системе «прооксиданты - антиоксиданты» в сторон}' прооксидантной системы.

3. Функциональное состояние фагоцитирующих клеток после проведения общей гипертермии характеризуется повышением биоцидной и фагоцитарной активности.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы исследований включены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры патологической физиологии н клинической патофизиологии, кафедры нормальной физиологии, кафедры биологической химии Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития РФ, Сибирского института гипертермии.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (2009 г., 2010 г.. 2011 г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2009 г., 2010 г., 2011 г.), на заседании проблемной комиссии «Функциональные основы гомеостаза» (2011 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 5 в журналах, рекомендованном ВАК РФ для публикации материалов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Личный вклад автора

Экспериментальное воздействие общей гипертермии на лабораторных животных, забор биологического материала, обработка материала, статистическая обработка полученных результатов, написание диссертации выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 157 отечественных и 117 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 31 таблицой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы обследования

Объект исследования. Исследования проведены на 90 крысах-самцах линии \Vistar (возраст 2,5 мес.), полученных из вивария Центральной научно-исследовательской лаборатории НГМУ массой 200-220 г. Для опыта использовались животные, содержавшиеся в условиях вивария. Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными в соответствии с требованиями приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» от 06.041973 г. К» 1045-73, а также № 1179МЗ СССР от 10.10.1983, №267 МЗ РФ от 19.06. 2003г, «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденных МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Крысы выращивались в условиях вивария НГМУ при 12-часовом периоде освещения, комнатной температуре 20±2°С. влажности 50-70%. Кормление животных осуществлялось согласно установленного рациона с применением комбикорма для лабораторных крыс и мышей «ПроКорм» производства акционерного общества «БиоПро» (заводской артикул Р-22; ГОСТ Р 50258-92) (Россия).

Экспериментальные исследования проводились в зимне-весенний период в одно и то же время - с 9 до 13 часов.

Все животные были разделены на 2 группы:

1 группа - контроль (в количестве 15 особей);

2 группа - животные, подвергшиеся воздействию общей гипертермии, которые были подразделены на 5 подгрупп в зависимости от сроков исследования после воздействия общей гипертермии:

1-е сутки с момента перегревания (15 особей);

3-й сутки с момента перегревания (15 особей);

7-е сутки с момента перегревания (15 особей);

14-е сутки с момента перегревания (15 особей);

21-е сутки с момента перегревания (15 особей).

Экспериментальная модель. Разогревание животных производилось в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» (Ефремов А. В. с соавт, 2001),

Методы исследования. Получение бронхо-альвеолярного лаважа (Мугак С>л\т. е{ а1., 1961). Для получения клеток бронхо-альвеолярного пространства сразу после забоя сердечно-легочный препарат, прндержи-

8

ваемый за трахею, вынимали из грудной клетки и устанавливали интра-трахеальный катетер. После отсасывания воздуха в бронхо-альвеолярное пространство медленно вводили охлажденную среду 199 с гепарином (5 ед/мл) в объеме 5 мл на крысу. Промывную жидкость собирали в полиэтиленовую пробирку, помешенную на лед. Лаваж проводили трижды. Полученную от крыс суспензию клеток центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7 мин при 4°С, затем ресуспендировали их в 1 ш охлажденного раствора Хэнкса с гепарином (5 ед/мл). В камере Горяева подсчитывали общее количество клеток в расчете на грамм легочной ткани.

Получение клеток перитонеальной полости. Для получения перитоне-альных клеток проводили лаваж перитонеальной полости животных. Пробирки с лаважной жидкостью центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость осторожно удаляли, осадок ресуспендиро-вали в 2 мл раствора Хэнкса, еще раз осаждали и ресуспендировали в 1,0 мл р-ра Хэнкса. Подсчитывали количество клеток в камере Горяева.

Получение цитоцентрифужных препаратов. Для определения дифференциального клеточного состава лаважных жидкостей 0, ] мл исследуемой суспензии клеток помещали на предварительно обезжиренное предметное стекло, которое центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут. Окраску препаратов проводили по Романовскому-Гимзе. С помощью светового микроскопа «Ortopl.an» (ФРГ) при увеличении 1000 подсчитывали процентное соотношение клеток.

Метод определения фагоцитарной активности макрофагов. Фагоцитарную активность макрофагов определяли по поглощению метакрилатных гранул (УеПлска V. е£ а!., 1983). Под микроскопом (ув.хЮОО) определял» процент макрофагов, включивших не менее трех гранул (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число гранул, приходящихся на один фагоцитирующий макрофаг (фагоцитарное число - ФЧ).

Метод исследования клиренса крови от частиц коллоидного угля. Исследование скорости выведения из крови частиц коллоидного угля проводили по методу Вю?7у С. с[. а1. (1953) и Вепасегай" В. е1. а1. (1957). Суспензию угля «Оитег-\Уа«псг» (ФРГ) вводили в хвостовую вену крысам в объёме ОД мл. Через 30 сек, 6 и 9 минут из ретроорбитального синуса градуированной пастеровской пипеткой брали 0,1 мл крови и добавляли к 2,9 мл 0,1% раствора Ш 2СО 43 0, содержащего 5 ед/мл гепарина. Пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 650 нм. Скорость очищения крови от частиц коллоидного угля (К-индексы) вычисляли по формуле: 0,301

К = -? где Т1;, -время пояувыведения коллоида из крови.

Получение и фиксация материала. За 1 час до забоя для изучения поглотительной способности Мф на гистологических препаратах животным (крысам) внутривенно вводили 0,5 мл коллоидного угля. Для гистологического исследования печень и легкие перфузировали 0,85% растворю! КтаС1. Кусочки ткани из правой латеральной доли печени и периферических участков средней доли правого легкого фиксировали в 10% нейтральном формалине.

Приготовление и окрашивание гистологических срезов. Фиксированные образцы ткани промывали под проточной водой; на аппарате АТ-4 осуществляли проводку материала, который в дальнейшем заливали в парафин и готовили блоки. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в бальзам.

Морфометрическое исследование (Автандилов Г.Г., 1973; Шварц Я.Ш., 1989). Для оценки поглотительной способности Мф печени и легких на гистологических срезах определяли объем поглощенного коллоидного угля (У\'С). С этой целью под световым микроскопом подсчитывали количество узлов тестовой сетки, приходящихся на фагоцитированный уголь (Р1). Подсчет производили при увеличении х 1000 в 10 полях зрения. Результаты выражали в количестве условных единиц на 1 ммг среза печени.

Для оценки численности фагоцитарно- активных клеток учитывали клетки, нагруженные углем, площадь которого была не менее 25-30 мкм2, и выражали их количество на 1 мм2 среза печени или легких. Интенсивность поглощения (ИПС) утля каждой клеткой рассчитывали по формуле - 2:

(II) ИПС =-X 100 , где

УУ7-объемная плотность поглощенного ККугля, усл. ед.;

Мкк - численность КК на 1 поле зрения.

Результаты выражали в условных единицах.

От каждого животного исследовали не менее 3-х срезов. В каждой группе было не менее 15 животных.

Регистрация хемилюминесцентного (ХЛ) ответа фагоцитирующих клеток. Для оценки способности фагоцитов нарабатывать активные формы кислорода (потенциальной биоцидной активности фагоцитирующих клеток) использовали метод люминол-зависимой хемилюминесценции. Измерения интенсивности хемилюминесценции проводились на биохемилю-минометре «СКИФ-0301» (СКТБ «Наука», Россия).

Определение опсонической активности ц опсонического коэффициента БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости. Оценивали по времени достижения максимума ХЛ свечения (Т...,) при стимуляции клеток зимозаном. Принцип оценки опсонической способности основывается на положении: чем меньше время достижения шиш ХЛ свечения, тем выше опсоннческая активность сыворотки крови. Результат выражали в мин. Для проведения анализа проводили расчет индекса опсонической активности в уел.ед. (Маянский А.Н. и соавт., 3986; Tono-oka Т. е.а., 1983). Опсониче-ский коэффициент рассчитывали по формуле (1'Ттзх) х 100%.

Оценка биоцидного потенциала макрофагов БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости. Для оценки биоцидного потенциала моноцитов / макрофагов БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости в ХЛ исследовании в качестве стимулятора использовали корпускулярный дрожжевой полисахарид Zymosan A (Sigma, USA). Биоцидный потенциал моноцитов /макрофагов БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости оценивали по индексу стимуляции (ИС), который отражает соотношение спонтанного и индуцированного ХЛ ответа нейтрофилов крови. Результаты выражали в уел.ед.

Оценка ирооксидантной активности БАЛ-жидкосги и перитонеальной жидкости. (Маянский Д.Н. с соавт., 1994). Опенку прооксидант-ной активности определяли биохемилюминесцентным методом. ХЛ-ответ регистрировали в течение 1 ч через каждые 2 мин. Результат оценивали по максимуму интенсивности свечения и выражали в ими/мин /НМЛ.

Антшжсидантную активность БАЛ-жидкости и неритонеальной жидкости определяли биохемилюминесцентным методом с перекисью водорода по Журавлеву А.И. с соавт. (1975). Все измерения проводились на биохемилюминометре «Скиф-0301» (СКТБ «Наука», Россия) с термостатированными при ЪТС пробирками, адаптированными с реагентами к темноте.

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью лицензионных пакетов прикладных программ «Statistica 5.0» и «Microsoft Ecxel 7.0». При этом определяли средние арифметические величины (М), стандартную ошибку средней величины (m). Проводили проверку данных по характеру распределения с помощью программы «Statistica 5.0». Достоверность различий двух сравниваемых средних арифметических величин производили по t-критерию Стьюдента. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при р<0,05 (Реброва О.Ю., 2003).

Результаты исследования и их обсуждение

Воздействие на организм чрезвычайного раздражителя характеризуется совокупностью местных и общих патологических и адаптационных процессов, развивающихся в ответ на этиологический фактор. Действие на организм высоких температур инициирует каскад приспособительных реакций организма, которые развиваются на внутри- и межсистемном уровнях.

Тяжесть, длительность и исход патологического процесса определяется первичным взаимодействием причинного фактора и организма. Это зависит от реактивности организма и степени его устойчивости по отношению к повреждающему фактору. Механизмы реактивности лишь относительно целесообразны и обладают потенциальной патогенностью. Поэтому адаптивное реагирование живых систем не всегда ведет к благоприятным последствиям для организма. Рассогласование между реальной ситуацией и той адаптивной программой, которую организм включает в ответ на эту ситуацию, приводит к развитию болезни.

Реактивность и резистентность организма во многом обеспечивается количеством и функциональным состоянием фагоцитирующих клеток - по-лиморфноядерных лейкоцитов и клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Важно отметить, что в патогенезе общей гипертермии роль фагоцитирующих клеток - нейтрофильных гранулоцитов, резидентных макрофагов печени, легких, селезенки и других органов исследованы недостаточно (Шляпников С.А., 1994; Toft P., Andersen S.K., Tœmcscn Е.К., 2003).

В ответ на действие высокой внешней температуры организм пытается защитить себя не только с помощью центральной регуляции температурного шмеостаза, но и на уровне каждой отдельной клетки путем синтеза БТШ (Borrelli M. J. et al., 1996), которые синтезируются в клетке в ответ на действие высокой температуры среды. Однако, несмотря на синтез специфических белков, защищающих внутриклеточные структуры от действия высокой температуры внешней среды, в условиях ОГ в клетках все-таки происходит нарушение обменных процессов, что ведет к возрастанию клеточной деструкции.

Первой линией защиты организма от продуктов деструкции тканей, эн-доаллергенов и токсических веществ являются фагоцитирующие клетки. Поскольку; ответная реакция организма на общую гипертермию рассматривается многими исследователями как полиорганная и полисистемная (Fais! Е. et al.,1983; Wilder R„ 1984; Julien M. et al., 1987), то и изучение количества и функциональной активности фагоцитов представлялось интересным с точки зрения системного подхода. Общее количество лейкоцитов и лейкоцитарный профиль был изучен в БАЛ-жидкости и перитонеаяьной жидкости.

Динамика общего количества клеточных элементов БАЛ-жидкости имела следующие особенности. На 1-е сутки после общей гипертермии общее содержание лейкоцитов в БАЛ-жидкости не отличалось от контрольных значений. С 3-х по 14-е сутки наблюдения отмечался стойкий лейкоцитоз. Поскольку основную часть клеток БАЛ-жидкости составляют альвеолярные макрофаги и макрофаги дыхательных путей, то и изменение общего количества форменных элементов должно быть связано в первую очередь с изменением их количества (Маянский Д.Н., Урсов ИЛ, 1997). Абсолютное количество макрофагов в БАЛ-жидкости повышалось в период с 3-х по 7-е сутки после общей гипертермии, в остальные сроки достоверно не изменялось. При этом отмечалось стойкое повышение абсолютного количества нейтрофилов с максимальными значениями на 3-й и 7-е сутки постгипер-термического периода. Абсолютное количество лимфоцитов, начиная с 3-х суток, резко снижалось вплоть до окончания наблюдения.

Количество клеточных элементов в легких зависит от проницаемости легочных капилляров. Любые агенты, активирующие эндотелий, способствуют миграции лейкоцитов в интерстиций легких, и наоборот. К числу эндогенных активаторов эндотелия относятся компоненты системы копле-мента, цитокины фагоцитов (ШМр, ФНО-а) и лимфоцитов (ИФН-у, ИЛ-2, ФНО-р). Поскольку основная «трагедия», связанная с катаболическими процессами разыгрывается в тканях организма, то лейкоциты устремляются в ткань легкого для реализации своего основного предназначения - санации поврежденных тканей и регуляции взаимодействия клеток в иммунном ответе. Закреплению нейтрофилов и макрофагов в тканях способствуют активированные ими же самими лимфоциты, выделяющие фактор торможения миграции макрофагов из ткани.

Содержание общего количества лейкоцитов в перитонеальной жидкости у животных в 1-е сутки после воздействия общей гипертермии снизилось на 12% по отношению к контрольным значениям. С 3-х суток по 21-е отмечалось выраженное повышение общего содержания лейкоцитов в перитонеальной жидкости. Повышение общего количества лейкоцитов в перитонеальной жидкости происходило за счет повышения абсолютного количества моноцитов и нейтрофилов.

Увеличение количества клеток системы мононуклеарных фагоцитов наблюдалось не только в биологических жидкостях, но и в ткани легких и печени, о чем свидетельствуют данные гистологического исследования. Это связано с увеличением концентраций хемотрактантов и адгезивных белков, определяющих эмиграцию клеток в ткани, активацией миграционной функции лейкоцитов крови и их перехода из сосудов в ткани, что подтверждаются данными литературы. Так, было показано, что в условиях высокой

температуры (41°С) iu vitro усиливается экспресаи адгезивных белков на эндотелиальных клетках, а при воздействии общей гиперемии in vivo повышается проницаемость сосудов, усиливаются адгезивные и миграционные свойства нейтрофилов и лимфоцитов, которые активно начинают рекрутировать в печень, легкие, селезенку, кожу. Кроме того, усиливается продукция ЦИТОК1ШОВ ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6. ИЛ-8, ФИО и ГМ-КСФ (Katschinski D.M. et al,, 1999;. Hasday J.D. et al., 2001; Appenheimer M.M. et al., 2005), стимулирующие эндотелиоциты, клетки крови и костного мозга.

Таким образом, клеточные реакции перитонеальной и БАЛ-жидкости после проведения общей гипертермии носят однонаправленный характер. Полиморфноядерные и мононуклеарные фагоциты, как единая функциональная система, направленная на сохранение антигенной чистоты организма, реагирует на поступление в кровоток токсинов, антигенов, тканевых метаболитов и других биологически активных веществ. Нейтрофилы являются первой, срочной линией защиты. Им на смену приходят монону-клеары, обладающие более широким репертуаром фагоцитоза и способные включать специфические механизмы защиты организма.

Большой интерес представляет не только количественная динамика фагоцитирующих клеток БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости, но и изучение их функциональной активности в ответ на действие такого чрезвычайного фактора как общая гипертермия. В последние годы свободно-радикальное окисление привлекает к себе все большее внимание исследователей и клиницистов. Причиной этого является подтверждение того факта, что нарушения СРО, в первую очередь его активация, являются ключевым событием в развитии целого ряда патологий. Особое место в патогенезе гипертермии занимают процессы ПОЛ (Ефремов А. В. и соавт., 2004, 2006; Сувернев А.В. и соавт., 2009; Repasky Е.А., Lee М., 2008).

Проведенное исследование базировались на оценке потенциальной биоцидной активности фагоцитов, а также при их индукции зимозаном. В целом, исследование окислительного метаболизма моноцитов/макрофагов БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости отражает деструктивный потенциал оцениваемых клеток. Реагируя на различные факторы, посягающие на постоянство гомеостаза перестройкой собственных функций, фагоциты секретируют в окружающую среду флогогенные факторы с мощным деструктивным и биоцидным потенциалом, превращаясь, с одной стороны, в действенный инструмент санации организма, а с другой - в мощное оружие деструкции собственных тканей (Маянский А.Н., Маянский Д.Н.. 1989; Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., 2001).

Одним из методов оценки функционального состояния фагоцитирующих клеток является оценка спонтанной и индуцированной хемнлюминис-

ценции БАЛ-жидкости и иеритонеальной жидкости. Хемияюминисценция связана с АМК нейтрофидов и макрофагов, а также с образуемыми под действием АМК окисленными галогенами. Это главный возбудитель ХЛ. Другой - связан с арахидонатом - полиненасыщенной жирной кислотой, входящей в состав фосфолипидов биомембран клеток. В результате окислительных превращений из нее образуются тромбоксаны, простагландины и лейкотриены, служащие источником ХЛ. В окислении арахидоновой кислоты принимают участие и АМК. Таким образом, оба источника ХЛ взаимосвязаны (Маянский Д.Н., Бородин И.Г., 1996). Поэтому по ХЛ можно судить не только о биошщном потенциале фагоцитов, но и косвенно - об их способности нарабатывать эйкозаноиды.

Определенную роль в образования АМК фагоцитами крови могут играть катехоламины. содержание которых при стресс-реакции на общую гипертермию повышено (Пахомова Ю.В.. 2006). Участие катехоламинов в продукции АКМ опосредуется через интенсификацию гексозомонофос-фатного шунта в фагоцитах и усиление генерации суперошщного анион-радикала (Биленко М.В., 1989), или через их влияние на процессы метаболизма арахидоновой кислоты (Alanko J., Riutta А., Zweier J„ 1978).

Таблица 1

Динамика хемилюминиеценцнн клеток БАЛ-жидкости, оцениваемой но lsuri (спонтанной и индуцированной) после применении обшей гипертермии у экспериментальных животных (х 106 усл. ед.)

Сроки исследования с-ХЛ и-ХЛ

М ± ш % от контроля М ± m % от контроля

Контроль 2,66 ±0,31 3,71 ±0,42

1-е сутки 4,71 ± 0,39* + 77 6,47 ± 0,58* ,-74

3-е суши 3,61 ± 0.27* + 35 5,83 ± 0,49* ±57

7-е сутки 4.92 ±0,41 * -г- 84 10.57 ±0,87* ± 184

14-е сутки 1,21 ± 0.09* -55 1,88 ±0,11* -50

21-е сутки 1,74 ±0,19* -35 2,41 ±0,18* -35

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Клеточный состав БАЛ-жидкости на 90% представлен макрофагами. Несмотря на то, что альвеолярные макрофаги обладают относительно низкой активностью НАДФ-оксидазы, тем не менее, их считают основ-

ным источником образования АМК в легких. В табл. 1 представлены данные о спонтанной и индуцированной хемилюминисценции клеток БАЛ-жидкости, оцениваемой по 1г>ш после воздействия общей гипертермии. В период с 1-х по 7-е сутки постгипертермического периода спонтанный и индуцированный зимозаном ХЛ-ответ клеток БАЛ-жидкости превышал контрольные значения с максимальными показателями на 1-е и 7-е сутки наблюдения. Именно в эти сроки наблюдалось увеличение абсолютного количества макрофагов в БАЛ-жидкости.

Пришедшие макрофаги еще не исчерпали свой резервный потенциал и способны к активной продукции АМК. Кроме того, увеличение данного показателя можно объяснить с позиций межклеточных взаимодействий в легочной ткани. Именно в эти сроки отмечался и рост количества нен-трофилов в БАЛ-жидкости. На 14-е и 21-е сутки отмечалось выраженное снижение изучаемого показателя, что, по-видимому, связано с истощением биоцидного потенциала фагоцитирующих клеток.

Индекс стимуляции клеток БАЛ-жидкости (определяемого по 1^), характеризующий их биоцидный потенциал, был на всем протяжении всего периода после воздействия общей гипертермии значительно ниже контрольных значений. Это свидетельствует о истощении биоцидного потенциала макрофагов БАЛ-жидкости.

Таблица 2

Динамика хемилюминисценции клеток перитонеальной жидкости I ця (спонтанной и индуцированной) после применении обшей гипертермии у экспериментальных животных (уел, ед.)

Сроки исследования с-ХЛ и-ХЛ

М ± ю % от контроля М ± т % от контроля

Контроль 3,47 ± 0.53 6,53 ± 0.58

1-е сутки 2,84 ±0,18* -18 3,21 ±0.23* -51

3-е сутки 4,63 ± 0.39* +33 4,96 ± 0,57* -24

7-е сутки 4.21 ±0,21* +21 6,64 ±0.44 +1Д

14-е сутки 4,97 ± 0,47* +43 7,58 ± 0.52* + 16

21-е сутки 4,72 ±0,31* +36 7,93 ± 0,66* +21

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля (р<0.05)

Клеточный состав перитонеальной жидкости также на 90% представлен моноцитами/макрофагами. Поэтому именно этим клеткам принадлежит основная роль в продукции АМК. Показатель спонтанной хемилюми-

16

нисиенцни у животных контрольной группы был равен 3,47±0,53 усл. ед (табл. 2). Показатель спонтанной хемилюминисценщш у животных после проведения общей гипертермии превышал контрольные значения во все сроки наблюдения.

Данные о индуцированном зимозаном хемияюминисцентном ответе выглядели следующим образом. С 1 -х по 3-й сутки после общей гипертермии изучаемый показатель был достоверно ниже контрольных значений, минимальные значения были зафиксированы на 1-е сутки наблюдения. С 7-х по 21-е сутки наблюдался незначительный рост показателя, пик которого приходится на 21-е сутки. Биоцидный потенциал клеток перитонеальной жидкости, определяемый по индексу стимуляции, был снижен в течение всего постгипертермического периода.

Таким образом, резкое возрастание биоцидного потенциала фагоцитов БАЛ и перитонеальной жидкости на протяжении всего постгипертермического периода может служить дополнительным фактором повреждения тканей и привести к активации ПОЛ с развитием окислительного стресса, развитию таких осложнений как синдром диссеминированного внутрисо-судистого свертывания, острый респираторный дистресс-синдром и полиорганные нарушения.

Истощение биоцидного потенциала фагоцитов БАЛ и перитонеальной жидкости может привести к осложнению вторичными инфекциями, так как фагоцитирующие клетки не смогут ответить адекватной наработкой активных форм кислорода на дополнительные, в том числе и инфекционные стимулы.

Одна из основных функций системы мононуклеарных фагоцитов - удаление из крови микроорганизмов, опухолевых и инфицированных вирусами клеток, токсинов, различных метаболитов, лекарственных веществ и циркулирующих иммунных комплексов. Основную роль в процессе очищения крови играют макрофаги печени и селезенки, причем 85-95% этой функции обеспечивается клетками Купфера. Снижение эффективности фагоцитарного фильтра приводит к ослаблению резистентности организма.

Фагоцитарная активность клеток перитонеальной и БАЛ-жидкости была оценена по фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу. Показатель фагоцитарного индекса макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости был выше аналогичного показателя в контрольной группе в период с 3-х по 21-е сутки после воздействия общей гипертермии (табл. 3). Максимальные значения фагоцитарного индекса отмечались на 3-й сутки наблюдения. В период с седьмых по двадцать первые сутки фагоцитарный индекс макрофагов БАЛ-жидкости постепенно снижался, но при этом оставался выше контрольных значений.

Таблица 3

Динамика фагоцитарного индекса макрофагов перитонеальной и бронхо-алызеолярной жидкости у экспериментальных животных после применения общей гипертермии (%)

Сроки исследования БАЛ-жидкость (М * т) Перитонеаяьная жидкость (М ± т)

Контроль 32,16*0,86 25,83±1Л4

1 -е сутки 36,83*1,44 40.0*1,78*

3-е сутки 77,17*2,10* 46,0*1,90*

7-е сутки 54,3± 1,41* 30,17*098*

14-е сутки 48,0*1,29* 31,30*096*

21-е сутки 41,33*1,12* 26,83*0.83

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Показатель фагоцитарного индекса макрофагов перитонеальной жидкости превышав контрольные значения в период с 1-х по 14-е сутки наблюдения.

Показатель фагоцитарного числа макрофагов бронхо-альвеолярной жидкости у экспериментальных животных контрольной группы составил 6,63±0,33 абс. ед. На первые сутки после общей гипертермии значение данного показателя достоверно не отличалось от контрольных значений. На 3-й сутки рост показателя составил 100%. На протяжении наблюдения с 7-х по 21-е сутки отмечалось постепенное снижение фагоцитарного числа макрофагов бронхо-альвеолярной жидкости, но при этом, значения в эти сроки наблюдения также превышали контрольные значения. Таким образом, низкие показатели фагоцитарной активности макрофагов БАЛ-жидкости в 1-е сутки после проведения общей гипертермии может быть объяснено с позиций развития «стресс-синдрома» в ответ на общую гипертермию, уменьшением синтеза молекул клеточной адгезии, повышенной выработкой глюкокортикоидов и снижением фагоцитарной активности. В последующем, до окончания наблюдения отмечалось достоверное повышение фагоцитарной активности фагоцитов БАЛ-жидкости. Фагоцитарная активность макрофагов перитонеальной жидкости на протяжении всего периода наблюдения также была достоверно выше контрольных показателей.

Также было оценено количество фагоцитарноактивных клеток в легких и печени (табл. 4). Количество макрофагов в легких и печени, нагруженных коллоидным углем, у животных, подвергшихся гипертермическому воздействию, повышалось с 1-х по 14-е сутки наблюдения.

Таблица 4

Численная плотность фагоцитарно-активных макрофагальных элементов в печени и легких после воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных (в абс. Ед.)

Сроки исследования Легкие (М ± т) Печень (М ± т)

Контроль 14,15 ± 1,038 5,10^0,163

1-е су тки 17,60 ±0,696* 7,5±0.105*

3-е сутки 24.80 ± 0,768* 9,3±0,046*

7-е сутки 21,35 + 0,956* 7,3±0,146*

14-е сутки 18,30 ±0,888* 6,8-0.091*

21-е сутки 16,25 ± 1.105 4,83±0,086

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля

В эти же сроки наблюдения повышалась объемная плотность (РОпогло-щенного угля тканью легких и печени (табл. 5).

Таблица 5

Динамика объемной плотности (Р1) поглощенного угля тканью легких и печени после воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных (М ± т)

Сроки исследования Легкие (усл. Ед.) Печень (усл. Ед.)

Контроль 1,6 ±0,074 4,20±0,163

1-е сутки 1,90 ±0.03* 8,5±0.060*

3-е сутки 3,10 ±0,091 7,7±0,046*

7-е сутки 2,72 + 0,041 6,1 ±0,101'"

14-е сутки 1,90 ± 0,047* 6.30=0,039*

21-е сутки 1,88 ±0,083* 5.80±0,1

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля

Опсонофагоцитарные реакции играют одну из важнейших ролей в реализации фагоцитарного механизма защиты, с одной стороны, облегчая фагоцитам процесс дифференцировки и распознавания чужеродных факторов, а с другой стороны, обеспечивая межклеточные взаимодействия в очаге воспаления (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Маянский Д.Н., 1991; Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997).

Опсонизадия - это процесс покрытая микроорганизмов или клеточных компонентов белками плазмы для усиления их прилипания к фагоцитирующим клеткам в процессе подготовки к фагоцитозу. Опсоническую способность БАЛ и перитонеальной жидкости в данной работе оценивали по показателям индекса опсонической активности и коэффициента опсониза-ции. Опсоническая активность БАЛ-жидкости повышалась в период с 1-х по 7-е сутки после проведения общей гипертермии. Опсоническая активность перитонеальной жидкости на 1-е сутки постгипертермического периода снижалась, в период с 3-х по 14-е сутки наблюдения: повышалась в среднем на 40%.

Помимо опсонинов, в очаге патологического процесса сконцентрированы про- и антивоспалительные медиаторы, цитокины и другие БАВ, которые определяют «поведение» фагоцитов. ПОА - это интегральное понятие, включающее в себя те факторы, которые содержатся в сыворотке крови и стимулируют биоцндность лейкоцитов. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость этих реакции, на прооксиданты (усиливают) и антпоксиданты (тормозят). В физиологических условиях в БАЛ-жидкости и перитонеальной жидкости содержится масса факторов, обладающих прооксвдантными свойствами, которые при различных патологических состояниях способствуют росту деструктивного потенциала фагоцитирующих клеток через продукцию ими АМК. К этим факторам можно отнести: - активные фракции комплемента - СЗа, С5а; - кинииы; - PAF; - лейкотриены; - цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ФИО-a!ß и др.) (Giovambattista А., Chisari A.N., Corro L., et ai., 2000).

Таблица 6

Динамика прооксндантной активности перитонеальной и броихо-альвешшрной лаважной жидкости после применения общей гипертермии у экспериментальных животных

Сроки исследования БАЛ-жидкость (М ± т) Перитонеальная жидкость (М ± т)

Контроль 2,61±0.001 0,72+0.001

1-е сутки 5.84+0,33" 5,26*0,25 *

3-е сутки 5.41±0.41* 1,71±0,13 *

7-е сутки 4,07±0,19* 2,62±0,13 *

14-е сутки 3,78±0,13* 3,27±0,17 *

2 i -е сутки 2,38*0.001 3,82*0,18 *

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

На протяжении всего периода наблюдения показатель ПОА БАЛ-жидкости бьш достоверно выше контрольных значений (табл. 6). Максимальные цифры ПОА были зафиксированы на 1-е сутки после проведения общей гипертермии. С 3-х по 14-е сутки после воздействия общей гипертермии происходило постепенное снижение ПОА БАЛ-жидшста, и на 21-е сутки наблюдения прооксидантная активность БАЯ-жндшсти у экспериментальных животных вернулась к контрольным значениям. Прооксидантная активность перитонеальной жидкости во все сроки наблюдения после проведения общей гипертермии была выше аналогичного показателя в контрольной группе животных. Максимальные значения данного показателя были зафиксированы на 1-е сутки наблюдения.

На протяжении всего периода наблюдения показатель ПОА БАЛ-жидкости был достоверно выше контрольных значений (табл. 6). Максимальные цифры ПОА были зафиксированы на 1-е сутки после проведения общей гипертермии. С 3-х по 14-е сутки после воздействия общей гипертермии происходило постепенное снижение ПОА БАЛ-жидкости, и на 21-е сутки наблюдения прооксидантная активность БАЛ-жидкости у экспериментальных животных вернулась к контрольным значениям. Прооксидантная активность перитонеальной жидкости во все сроки наблюдения после проведения общей гипертермии была выше аналогичного показателя в контрольной группе животных. Максимальные значения данного показателя были зафиксированы на 1-е сутки наблюдения.

Таблица 7

Динамика антиоксидантиой активности перитонеальной и БАЛ-жидкости после применения общей гипертермии у экспериментальных животных (усл. ед.).

Сроки исследования БАЛ-жндюэсть (М±!П) Перитопеальиая жидкость (М ± ш)

Контроль 1,22*0.09 0,38+0,021

! -е сутки 0,88+0,001 * 0,52+0,001*

3-е сутки 0,79+0,001* 0,17+0,001*

7-е сутки 1,37*0,11 0,46+0.002*

14-е сутки 1,21*0.001 0.14+0,001*

21-е сутки 2,60±0,25* 0,15+0,001*

Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля (р<0,05)

Функционирование и развитие клеток в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем,

21

к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксиданты.

Основными антиокеидантами БАЛ-жидкости являются аскорбиновая кислота и глутатион. Источником глутатиона являются мигрирующие в альвеолы и бронхи лейкоциты. Важную роль в защите легких от АМК играют и ферментные антиоксиданты (супероксиддисмктаза, каталаза), жирорастворимые фенольные антиоксиданты и SH- содержащие антиоксиданты (White C.R., Brock Т.А., Chang L.Y., 1994; Patterson C.E., Rhoades R.A., 1988), но их активность в БАЛ-жидкости по сравнению с сывороткой крови незначительна. Вероятно, этим объясняется низкая антиоксидантнзя активность БАЛ-жидкости на протяжении практически всего периода после проведения общей гипертермии (исключение составили только 21-е сутки) (табл. 7).

Показатель антиоксидантной активности перитонеальной жидкости носил волнообразный характер. Максимальные показатели были зафиксированы на 3-й и 14-е сутки постшпертермического периода.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что у животных после проведения общей гипертермии развивается окислительный стресс, при котором баланс в системе «оксиданты-антиоксиданты» смещен в сторону прооксидантов (Зенков Н.К. и соавт., 2001). Это подтверждается результатом расчета индекса соотношения показателей прооксидантной и антиоксидантной активности перитонеальной и БАЛ-жидкости, который в период декомпрессии, превышал в 0,5-20 раз контрольные значения.

Таким образом, изменение клеточного состава биологических жидкостей, фагоцитарной активности и биоцидного потенциала клеток носит в постгипертермическом периоде носит однонаправленный характер.

Полученные в настоящем исследовании результаты позволили расширить существующие представления о саногенетических и патогенетических реакциях, развивающихся в ответ на действие обшей гипертермии. Высокий биоцидный потенциал и фагоцитарная активность клеток СМФ может использоваться при лечении хронических онкологических, инфекционных заболеваний, антигенной нагрузке организма. В то же время развитие окислительного стресса является фактором, способствующим развитию системных поражений органов и тканей.

ВЫВОДЫ

1. Динамика клеточного состава перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей после воздействия общей гипертермии носила одно-

напрвленный характер, характеризующийся развитием лейкоцитоза с повышением абсолютного количества нейтрофилов и моноцитов.

2. В динамике постгипертермического периода во все сроки наблюдения отмечалось повышение биоцидной активности моноцитов/макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости.

3. В постгипертермическом периоде отмечалось снижение индекса стимуляции макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости, что отражает истощение биоцидного потенциала фагоцитирующих клеток.

4. После воздействия общей гипертермии на экспериментальных животных отмечалось повышение фагоцитарной активности макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей, а также легочных и печеночных макрофагов.

5. После воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных развивался выраженный окислительный стресс, при котором баланс в системе «оксиданты-антиоксиданты» был смещен в сторону прооксидан-тов. Это подтверждается результатами расчета индекса соотношения показателей прооксидантной и антиоксидантной активности перитонеальной и БАЛ-жидкости, который во все сроки наблюдения превышал в 0,5-20 раз контрольные значения.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Í. Самсонов А. В. Роль гормонов щитовидной железы в формировании адаптивного синдрома в остром периоде после общей управляемой гипертермии /A.B. Самсонов, A.B. Игнатова, B.C. Сазонов/7 Ежегодная конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна-2008»: тез. докл..-Новосибирск, 200S - С.243-244.

2. Сазонов В. С. Роль метаболитов перекисного окисления липидов в остром периоде после общей управляемой гипертермии Роль метаболитов перекисного окисления липидов в остром периоде после общей управляемой гипертермии i В. С. Сазонов, А. В. Самсонов, А. В. Игнатова// Ежегодная конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна-2008»: тез. докл.. - Новосибирск, 2008 -С.245-246.

3. Самсонов А. В. Роль системы антиоксидантной защиты в остром периоде после общей управляемой гипертермии /А. В. Самсонов, А. В. Игнатова, В. С. Сазонов// Ежегодная конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна-2008»: тез. докл.. - Новосибирск, 2008 - С. 246-247.

4. Пахомова 10. В, Изменение концентрации кортикостерона , инсулина и индекса гормональной адаптации в крови и лимфе крыс в остром периоде после общей управляемой гипертермии / Ю. В. Пахомова, А. В. Самсонов, М. Г. Пустоветова, А. В. Игнатова, А. Г. Самохин// Вестник новых медицинских технологий - 2008. - Т. XIV, №3. - С. 48-49.

5. Ефремов А. В. Оценка патогенетического и саногенетнческого эффектов обшей управляемой гипертермии на примере анализа состояния тканевого микрорайона печени крыс линии Wistar /А. В. Ефремов, А. В. Самсонов, М. Г. Пустоветова, Ю. В. Пахомова и др.// Вестник новых медицинских технологий - 2008. - Т. XV, № 4. - С. 25-28.

6. Самсонов А. В. Роль тироксина и трийдтиронина в процессе формирования общего адаптационного синдрома у крыс при общей управляемой гипертермии /А. В. Самсонов, А. В. Игнатова, А. А. Игнатов, В. С. Сазонов// XIV Межгородская конференция молодых учёных: тез. докл. -г. Санкт-Петербург, 2008 - С. 40-41.

7. Самсонов А. В. Изучение роли продуктов перекисного окисления ли-пидов в патогенезе общей управляемой гипертермии /А. В. Самсонов, А. В. Игнатова, А. А. Игнатов, В. С. Сазонов/7 XIV Межгородская конференция молодых учёных: тез. докл.- г. Санкт-Петербург, 2008 - С. 41-42.

8. Сазонов В. С. Оценка роли системы антиоксидантной защиты при общей управляемой гипертермии / В. С. Сазонов, А. В. Самсонов, А. В. Игнатова, А. А. Игнатов/У XIV Межгородская конференция молодых учёных: тез. докл. - г. Санкт-Петербург, 2008 - С. 86-87.

9. Самсонов А. В. Содержание бактериального липоподисахарида Е. coli в сыворотке крови у экспериментальных животных на фоне общей гипертермии / А. В. Самсонов, Н. В. Долотина, В. С. Сазонов// Городское здравоохранение - 2009. - Спец. Выпуск, посвященный XIV Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», г. Казань - с. 175.

10. Самсонов А. В. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови у экспериментальных животных на фоне общей гипертермии/ А. В. Самсонов, И. В. Долотина, В. С. Сазонов// Городское здравоохранение - 2009. - Спец. Выпуск, посвященный XIV Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», г. Казань - с. 175-176.

11. Самсонов А. В. Гемо-лимфатический индекс параметров липидного обмена у крыс при общей гипертермии /А. В. Самсонов, Е. В. Белобородо-ва, О. Н. Логачева, Н. В. Долотина и др.// П1 Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009»: тез. докл. - г. Санкт-Петербург, 2009 - С. 203.

12. Симеонов А. В. Фагоцитарная активность клеток крови у крыс при общей гипертермии /А. В. Самсонов, Е. В. Белобородова, О. Н. Логачева, Н. В. Долотина и др.// III Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения -2009»: тез. докл. - г. Санкт-Петербург, 2009 - С. 211.

13. Самсонов А. В. Лабораторные критерии эндотоксикоза у экспериментальных животных при общей гипертермии /А. В. Самсонов, Е. В. Белобородова, О. Н. Логачева, Н. В. Долотина и др.// III Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009»: тез. докл. - г. Санкт-Петербург, 2009 - С. 212.

14. Ефремов А. В. Изменения эндокринно-метаболических профилей плазмы крови крыс в остром периоде после общей управляемой гипертермии, как проявления синдрома системного воспалительного ответа животного на экстремальное воздействие /А. В. Ефремов, А. В. Самсонов, М. Г. Пустоветова, А. В. Игнатова, Ю. В. Пахомова и др.// Вестник новых медицинских технологий - 2008. - Т. XVI, № 34. - С. 17-19.

15. Самсонов А. В. К вопросу изучения бактериального липополисаха-рида Е. coli крыс в динамике после общей гипертермии/ А. В. Самсонов, Н.

B. Долотина, В. С. Сазонов// Труды I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2009 - С. 331-333.

16. Самсонов А. В. Оценка фагоцитарной и биоцидной активности нейтрофилов периферической крови / А. В. Самсонов, Н. В. Долотина. В.

C. Сазонов// Труды I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2009 - С. 333-335.

17. Самсонов Л. В. Поглотительная способность мононуклеарных фагоцитов печени в динамике после проведения общей гипертермии у экспериментальных животных /А. В. Самсонов, Н. В. Долотина, О. Н. Логачева, В. С. Сазонов// Труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2010 - С. 306-310.

18. Самсонов А. В. Биошсшыи потенциал макрофагов бронхо-альвеолярнои лаважной жидкости после применения общей гипертермии у экспериментальных животных /А. В. Самсонов, Н. В. Долотина, О. Н. Логачева, В. С. Сазонов// Труды П Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2010 - С. 310—314.

19. Самсонов А. В. Биоцидный потенциал перитонеальных макрофагов после воздействия обшей гипертермии у экспериментальных животных

/А. В. Самсонов, Н. В. Долотина, О. Н. Логачева, И. А. Кривошапкин. Г. Г. Волков // Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2011 - С. 287-291.

20. Самсонов А. В. Поглотительная способность мононукдеарных фагоцитов легких в динамике после проведения обшей гипертермии у экспериментальных животных /А. В. Самсонов, Н. В. Долотина, О. Н. Логачева, И. А. Кривошапкин. Г. Г. Волков// Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» - г. Новосибирск, 2011 - С. 292-295.

21. Ефремов А. В. Динамика изменения прооксидантной и антиокси-дантной активности перитонеальной и бронхоальвеолярной лаважной жидкостей у экспериментальных животных после применения общей гипертермии /А. В. Ефремов, А. В. Самсонов, О. Н. Логачева// Бюллетень СО РАМН -2011. - Т. 31, М> 1.-С. 9-14.

22. Самсонов А. В. Функциональное состояние легочных макрофагов у экспериментальных животных после применения общей гипертермии / А. В. Самсонов, Н, В. Долотина// Бюллетень СО РАМН - 2011. - Т. 31, № I,-С. 5-10.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМК - активные метаболиты кисззорода;

АКР - активные кислородные радикалы

АОС - антиоксидангаая система;

БАЛ-жидкость - бронхо-альвеоляриая лаважиая жидкость;

БТШ - белки теплового шока;

ИЛ - интерлешшн;

ИС - индекс стимуляции;

ОАК - опсоинческая активность крови;

ОГ - общая гипертермия;

ОК - опсонический коэффициент;

ОУГ - общая управляемая гипертермия;

ПОА - прооксидантная активность

ПОЛ - перекиеное окисление яшшдов;

СМФ - система мононукдеарных фагоцитов;

СОД - сунероксиддесмутаза;

СРО - свободно радикальное окисление;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ХЛ - хемилюминиецешгая;

и-ХЛ - индуцированная хемияюмшисценция;

с-ХЛ - понтаиная хемнлюмннисцешшя;

II, - интерлейкин;

ТМР - туморнекротизирующий фактор.

Подписано в печать 14.12.2011 г. Формат 60 * 84 / 16 Бумага офсетная. Гарнитура Times. Ризография Усл. печ. л. 1,68. Тираж 100 экз. Изд. Я» 302

Оригииая-макет изготовлен издательством «Сибмедизда т» 11ГМУ г. Новосибирск, ул. Залеескога, 4 Отпечатано в топографии НГМУ г. Новосибирск, yjt. Залесского, 4. Тел/факс: (383) 225-24-29

Актуальность темы. На современном этапе развития медицины активно разрабатываются новые диагностические и терапевтические технологии, приборы и другая медицинская техника, которые успешно внедряются в практическую деятельность клиник для лечения различных заболеваний. Одним из таких подходов является использование общей управляемой гипертермии, которая активно применяется в клиниках США, стран Европы и Азии (Осинский С.П., 2002, Sakaguchi Y. et al., 1994; Bull J.M. et al., 2008; Repasky E.A., Lee J-F., 2008; Peer A.J. et al., 2010).

В настоящее время гипертермия, как локальная, так и общая, находится в центре внимания врачей различного профиля, особенно онкологов (Шелыгин Ю.А. с соавт., 2011; Мардынский Ю.С. с соавт., 2011; Карев И.Д. с соавт., 2010; Van der Zee J et al., 2008). Локальная гипертермия в форме терморадио-, термохимио- и терморадиохимиотерапии применяется при лечении онкологических больных в самостоятельном виде или в плане неоадъювантной и адъювантной терапии. Подавляющее большинство исследований посвящено именно локальной терапии. Что касается общей (системной) и особенно сочетанной или комбинированной гипертермии, то эти методики гипертермического воздействия пока используются в немногочисленных онкологических клиниках. Между тем в применении искусственной управляемой гипертермии в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией скрыты немалые резервы, в частности, при многокомпонентном лечении больных с далеко зашедшими злокачественными новообразованиями (первичные местнораспространенные, рецидивные и/или метастатические опухоли), а также с локализованными, но крайне неблагоприятными формами заболевания (Бирюков А. В. С соавт., 2010; Репин В.Л. с соавт. 2010; Ткачев С.И. с соавт., 2007; Курпешев O.K., Павлов В.В., 2007; Терентьев И.Г., Ильин Н.В., 2006; Pech М. et al. 2007; Falk М.Н., Issels R.D., 2001). В сочетании с другими технологиями различные методы гипертермии могут применяться во многих областях медицины. Сегодня они успешно применяются в урологии - для лечения простатита, в хирургии и, конечно, при лечении инфекционных заболеваний (Антонов А.Р., Морсина Е.В., 2001; Жаврид Э.А. с соавт., 2010; Чиссов В.И. с соавт., 2010; Кокорина О.В., 2010; Непомнящая Е.М. с соавт., 2010; Снопова Л.Б. с соавт., 2010; Барышников А.Ю. с соавт., 2009; Киприянов Е.А., 2009; Оборотова Н.А., Тазина Е.В., 2008; Gong В. et al., 2008; Maluta S. et al., 2007).

В научной литературе идет активная дискуссия о механизмах действия локальной и общей гипертермии на организм человека и ее влиянии на патогенез различных заболеваний (Литвицкий П.Ф. 2009; Старченко В.В., 2009; Ефремов А.В. с соавт., 2009). Состояние общей гипертермии тела представляет собой один из вариантов тяжелого стресса, адаптация к которому лежит за пределами физиологических возможностей организма. Характер развития стресс-реакции во многом определяется функциональным состоянием лимфоидной ткани, макрофагов и ретикулоэндотелиальной системы в целом. Даже кратковременное пребывание человека и животных в условиях экстремально высокой внешней температуры приводит к метаболическим и функциональным изменениям на всех уровнях многоклеточного организма: молекулярном, клеточном и тканевом (Андреева Л.И. с соавт. 1999; Баллюзек Ф. В. с соавт., 2001; Сувернев А. В. с соавт., 2002; Алимов Н. И., 2003; Тулеутаев М. Е., 2003; Антонов А. Р. с соавт., 2004; Ефремов А. В. с соавт., 2004; Симакова И. В., 2005; Лушникова Е.Л., КолдышеваЕ.В. 2008; Vereschagin Е. I., Souvernev А. V., 2001).

В клинической практике применяются различные варианты активного физического согревания организма, при использовании которых следует учитывать как положительные, так и отрицательные стороны этой интенсивной медицинской технологии. Клинические и экспериментальные работы, посвященные влиянию общей гипертермии на организм человека, проводились в подавляющем большинстве в диапазоне температур 37-42°С.

Вместе с тем известно, что гибель опухолевых клеток происходит только при температуре более 43°С (Алимов Н. И., 2003; Тулеутаев М. Е., 2003; Шевченко В. П. с соавт., 2003; Антонов А. Р. с соавт., 2004; Ефремов А. В. и соавт., 2004, 2006; Мардынский Ю.С., Лопатин В.Ф., 2007; Сувернев A.B. и соавт., 2009; Chen S.C., Evans S.S., 2005; Repasky E.A., Lee M., 2008).

Клиническому применению ОГ (43 °С) должно предшествовать ее экспериментальное моделирование с целью более полного и детального изучения патогенетических аспектов влияния высокой внешней температуры на клетки, ткани, органы и организм в целом.

Поскольку основными областями применения общей гипертермии являются онкология и клиника инфекционных болезней, то наибольший интерес представляют вопросы влияния гипертермии на состояние иммунной системы. Клетки макрофагальной системы играют центральную роль как в обеспечении неспецифической резистентности, так и в реализации специфического иммунного ответа организма (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000). Одним из методов изменения функциональной активности макрофагов может стать общая гипертермия. Поэтому представлялось интересным изучить роль фагоцитирующих клеток в формировании патогенетических и саногенетических реакций после воздействия общей гипертермии.

Данные обстоятельства определили цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: изучить функциональное состояние легочных и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

Задачи исследования:

1. Изучить клеточный состав бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости в различные сроки после воздействия общей гипертермии.

2. Оценить биоцидную активность легочных и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

3. Изучить фагоцитарную активность легочных, печеночных и перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных после воздействия общей гипертермии.

4. Оценить общую антиоксидантную активность бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия общей гипертермии.

5. Оценить общую прооксидантную активность бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия общей гипертермии.

Научная новизна

Впервые проведена комплексная оценка клеточного состава бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости у экспериментальных животных в различные сроки после воздействия общей гипертермии. Показано, что динамика клеточного состава бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости носят однонаправленный характер, проявляющийся увеличением общего содержания лейкоцитов за счет моноцитов/макрофагов и клеток нейтрофильного ряда.

Проведена комплексная оценка окислительного метаболизма фагоцитирующих клеток бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости в динамике после воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных. Было выявлено повышение биоцидной активности фагоцитов БАЛ и перитонеальной жидкости на протяжении всего постгипертермического периода, что может служить дополнительным фактором повреждения тканей и привести к активации ПОЛ с развитием окислительного стресса.

Проведена оценка биоцидного потенциала мононуклеарных фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости в динамике после воздействия общей гипертермии. Было отмечено снижение биоцидного потенциала фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости.

Проведена комплексная оценка прооксидантной и общей антиоксидантной активности перитонеальной жидкости и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости в различные сроки после воздействия общей гипертермии. Было отмечено, что постгипертермический период сопровождается развитием окислительного стресса, проявляющегося смещением в системе «прооксиданты - антиоксиданты» в сторону прооксидантной системы.

Оценена фагоцитарная активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, перитонеальной жидкости, печени и легких после проведения общей гипертермии. Отмечено стойкое повышение фагоцитарной активности макрофагов.

Практическая значимость результатов работы

Полученные данные расширили представления о развитии патогенетических и саногенетических реакций после проведения общей гипертермии.

Выявленные соотношения между прооксидантной и антиоксидантной активностью биологических жидкостей в динамике постгипертермического периода позволили выделить наиболее критические периоды с точки зрения развития окислительного стресса.

Повышение фагоцитарной активности моноцитов/макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей может рассматриваться как саногенетический механизм, направленный на повышение как неспецифической так и специфической резистентности организма.

Повышение биоцидной активности моноцитов/макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости с точки зрения биологических последствий носит двоякий характер. С одной стороны, повышается бактерицидный эффект фагоцитирующих клеток. С другой стороны, образование большого количества активных метаболитов кислорода повышает деструктивный потенциал фагоцитирующих клеток и может привести к активации ПОЛ и повреждению собственных тканей организма.

Положения, выносимые на защиту

1. После воздействия общей гипертермии динамика клеточного состава перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости у экспериментальных животных носит однонаправленный характер, проявляющийся увеличением общего содержания лейкоцитов за счет моноцитов/макрофагов и клеток нейтрофильного ряда.

2. Посттипертермический период сопровождается развитием окислительного стресса, проявляющегося смещением в системе «прооксиданты - антиоксиданты» в сторону прооксидантной системы.

3. Функциональное состояние фагоцитирующих клеток после проведения общей гипертермии характеризуется повышением биоцидной и фагоцитарной активности.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы исследований включены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии, кафедры нормальной физиологии, кафедры биологической химии Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития РФ, Сибирского института гипертермии.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (2009 г., 2010 г. 2011 г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (2009 г., 2010 г., 2011 г.), на заседании проблемной комиссии «Функциональные основы гомеостаза» (2011 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 5 в журналах, рекомендованном ВАК РФ для публикации материалов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 157 отечественных и 117 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 31 таблицой.

выводы

1. Динамика клеточного состава перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей после воздействия общей гипертермии носила однонапрвленный характер, характеризующийся развитием лейкоцитоза с повышением абсолютного количества нейтрофилов и моноцитов.

2. В динамике постгипертермического периода во все сроки наблюдения отмечалось повышение биоцидной активности моноцитов/макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости.

3. В постгипертермическом периоде отмечалось снижение индекса стимуляции макрофагов бронхо-альвеолярной лаважной жидкости и перитонеальной жидкости, что отражает истощение биоцидного потенциала фагоцитирующих клеток.

4. После воздействия общей гипертермии на экспериментальных животных отмечалось повышение фагоцитарной активности макрофагов перитонеальной и бронхо-альвеолярной лаважной жидкостей, а также легочных и печеночных макрофагов.

5. После воздействия общей гипертермии у экспериментальных животных развивался выраженный окислительный стресс, при котором баланс в системе «оксиданты-антиоксиданты» был смещен в сторону прооксидантов. Это подтверждается результатами расчета индекса соотношения показателей прооксидантной и антиоксидантной активности перитонеальной и БАЛ-жидкости, который во все сроки наблюдения превышал в 0,5-20 раз контрольные значения.