Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Особенности клеточного иммунного ответа при мукозальных способах аппликации антигенов условно патогенных микроорганизмов

На правах рукописи

УТКИНА НАТАЛИЯ ПАВЛОВНА

ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ МУКОЗАЛЬНЫХ СПОСОБАХ АППЛИКАЦИИ АНТИГЕНОВ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.03.09-Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005532331

г 9 АВГ 2013

Москва 2013

005532331

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН и Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Ахматова Нэлли Кимовна доктор медицинских наук

Лебединская Ольга Витальевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологических методов исследования ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН

Краснопрошина Людмила Ивановна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунорегуляции ФГБУ «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

Куклина Елена Михайловна

Ведущая организация: Государственный научный центр «Институт иммунологии» при Федеральном медико-биологическом агентстве Российской Федерации

Защита диссертации состоится «26» сентября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан « » августа 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Метод мукозальной иммунизации, предложенный в конце XIX -начале XX веков Д.К. Заболотным, И.Г. Савченко, A.M. Безредка, привлекал внимание исследователей на протяжении всех этапов развития вакцинологии.

Полученные в работах данные касались разных методов введения вакцин через слизистые оболочки и были проанализированы в рамках теоретических представлений, которые преобладали в иммунологии того времени [Першин Б.Б., 1964; Дроздов В.Н., 1965; Александров Н.И., Гефен Н.Е., 1969; Воробьев A.A., 1971; Мешалова А.Н., 1974; Краснопрошина Л.И., 1978 и др.]. В этот период были выявлены основные характеристики мукозальных методов иммунизации, в том числе меньшее сенсибилизирующее действие антигенов по сравнению с парентеральным способом их введения.

Последние десятилетия характеризуются прорывом в исследованиях клеточных и молекулярных механизмов регуляции иммунитета, особенно роли врождённого и его инструктивного значения в развитии адаптивного иммунитета. Данные исследования проведены в основном при использовании парентеральных методов иммунизации и лишь фрагментарно касаются мукозальных способов введения антигенов [Ахматова Н.К., Киселевский М.В., 2008; Kumar Р. et al., 2013; Yan Н., 2013].

В настоящее время возникла необходимость в обобщении данных по молекулярно-клеточным механизмам, задействованным в формировании мукозального иммунитета, так как до 90% патогенов проникают в организм через слизистые оболочки. Важное преимущество мукозальная иммунизация приобретает в условиях расширяющегося Национального календаря прививок. В настоящее время один ребёнок получает до 20—30 прививок в год.

Однако число мукозальных вакцин, разрешённых для применения в практике, невелико, что связано с теоретическими и технологическими сложностями конструирования таких препаратов, а также недостаточностью данных о характеристике иммунитета, создаваемого при их применении [Семёнов Б.Ф., Зверев В.В., 2007, 2010; Barisani-Asenbauer Т. et al., 2013].

Большое значение на первых этапах распознавания микробных антигенов имеет способ их введения, определяющий набор рецепторов, взаимодействующих с лигандами микроорганизмов и, соответствен-

но, сигнальные пути дальнейших этапов развития врождённого, а в последующем - адаптивного иммунитета [Меджитов Р., Джане-вей Ч., 2005; Culter С., 2006; Romange F., 2007; Li Y., Shi X., 2013].

Для изучения особенностей мукозального иммунитета на молеку-лярно-клеточном уровне в качестве антигенной модели в данной работе использована поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий. Этот препарат обладает широким набором патоген-ассоциированных молекулярных структур (ЛПС, пептидогликан, тейхоевые кислоты и др.), являющихся лигандами для клеточных рецепторов, включая семейство То11-подобных рецепторов (TLRs). Установлены основные показатели активации врождённого иммунитета при его подкожном введении [Ахматова Н.К., 2007].

До настоящего времени остались неизученными молекулярно-клеточные механизмы активации врождённого иммунитета на локальном и системном уровнях при мукозальной иммунизации антигенами условно патогенных микроорганизмов.

Цель исследования - изучение особенностей клеточного иммунного ответа при мукозальных способах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

Задачи:

1. Определить особенности экспрессии TLR2, TLR4, TLR9 и им-мунофенотип мононуклеарных лейкоцитов лимфоидных органов и тканей при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

2. Выявить морфогистохимические изменения в лимфоидных органах и эпителио-ассоциированной лимфоидной ткани при непаран-теральных методах иммунизации.

3. Изучить функциональную активность натуральных киллеров и продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками при мукозальных методах введения антигенов.

4. Оценить неспецифическую защитную активность вакцины Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий при мукозальном введении в отношении патогенов, не входящих в состав вакцины.

5. Исследовать специфическую протективную активность Имму-новак-ВП-4 в отношении возбудителей, антигены которых входят в состав вакцины при мукозальных методах введения.

Научная новизна работы

На молекулярно-клеточном уровне выявлены особенности активации лимфоидной ткани разной локализации при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

Впервые установлено, что при мукозальных способах введения антигенов, в отличие от подкожного, не происходит увеличения численности клеток, экспрессирующих TLR2, регулирующего продукцию IgE, что объясняет меньшее сенсибилизирующее действие антигенов при введении через слизистые оболочки. Выявленные различия предполагают существование различных сигнальных путей активации при мукозальном и парентеральном методах иммунизации. Установлено, что численность клеток, экспрессирующих TLR4, TLR9, сопоставима при мукозальном и подкожном методах иммунизации.

Показано, что при всех исследованных методах введения антигенов происходит активация ключевых эффекторов мукозального иммунитета — Ту8 и В] лимфоцитов, но степень их активации и локализация различны. При интраназальном и подкожном методах увеличивается их содержание в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания, и в селезёнке, при пероральном — в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания и желудочно-кишечным трактом.

Выявлено, что при мукозальной аппликации антигенов повышается численность лимфоцитов с экспрессией CD3, CD4, CD8, CD19, CD25 не только в лимфоидных образованиях, ассоциированных с органами дыхания и желудочно-кишечного тракта, но и в селезёнке. Это подтверждается морфогистохимическими исследованиями, указывающими на наличие пролиферативных процессов как в регионарных к месту введения, так и в отдалённых от него лимфоидных органах и тканях, включая селезёнку. Полученные данные свидетельствуют об активации не только местного, но и системного иммунитета.

Впервые установлено, что при мукозальных методах иммунизации увеличивается количество и цитотоксическая активность натуральных киллеров (natural killer — NK) во всех изученных органах и тканях. Наиболее высокой цитотоксичностью характеризовались NK, полученные из лимфоидной ткани кишечника после пероральной иммунизации (75,4± 1,83%), что согласуется с существенным (в 46 раз) нарастанием популяции NK при данном методе введения антигенов. Динамика NK при подкожном введении практически отсутствовала.

Независимо от способа аппликации антигенов выявлено повышение уровня провоспалительных (IL-ip, IL-6) и регуляторных (IL-12, IL-5)

цитокинов в сыворотке крови мышей. При всех исследованных методах практически одинаково усиливался синтез IL-5, регулирующего продукцию IgA.

Продемонстрировано, что антигены условно патогенных бактерий при мукозальном введении стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета и приводят к быстрому формированию неспецифической резистентности, установленной на модели вируса гриппа H5N2. Также подтверждено развитие адаптивного иммунитета в острых опытах защиты от патогенов (Кpneumoniae, P.vulgaris, S.pneumoniae) при пероральном методе аппликации изученных антигенов.

Научно-практическая значимость

Полученные данные расширяют представление о мукозальной системе иммунологической защиты, которая обеспечивается не только иммунными реакциями мукозо-ассоциированной лимфоидной ткани дыхательного и желудочно-кишечного трактов, но и системным иммунитетом.

Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы при разработке неинвазивных методов вакцинации, являющихся оптимальным способом безопасной и массовой профилактики инфекционных заболеваний. Данные о механизмах формирования мукозального и системного иммунитета при непарентеральных способах вакцинации открывают перспективы для конструирования вакцин и иммуномодулирующих препаратов, а также способствуют расширению спектра и методов их применения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антигены условно патогенных бактерий действуют на различные сигнальные пути клеточной активации в зависимости от метода их введения: при интраназальной и пероральной аппликации увеличивается численность клеток с экспрессией TLR4 и TLR9, при подкожном введении - TLR2, 4, 9.

2. Мукозальные методы иммунизации приводят к увеличению количества ключевых эффекторов местного иммунитета (Туб, В] лимфоцитов), а также CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD25+ клеток не только в регионарных лимфоидных органах и эпителио-ассоциированной лимфоидной ткани, но и в селезёнке. Данные факты свидетельствуют о развитии системного иммунитета, что подтверждается морфологическими исследованиями, показавшими формирование локальных иммунных реакций и генерализацию иммунного процесса.

6

3. Непарентеральное введение антигенов условно патогенных бактерий индуцирует увеличение численности и цитотоксической активности NK, причём наибольшей цитотоксичностью характеризуются клетки, полученные после пероральной иммунизации из лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником.

4. При мукозальных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов в сыворотке крови мышей повышается уровень IL-1 р, IL-6, IL-5, IL-12; при подкожном введении, кроме данных цитокинов, увеличивается продукция IFNy.

5. Антигены условно патогенных бактерий при мукозальных методах иммунизации стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета, приводя к быстрому формированию неспецифической резистентности к гетерологичным микроорганизмам и развитию адаптивного иммунитета.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); XIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009), 1st Congress of the confederation of the european otorhinolaryngology head and neck surgery (Barcelona, Spain, 2011), 17-м съезде педиатров России (Москва, 2013), V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2013), конференции молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН 2013 г.; 15th International Congress of Immunology (Milan, Italy, 2013).

Апробация диссертации состоялась 25 апреля 2013 г. на конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН и 11 июня 2013 г. на заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава России.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Препараты. В качестве экспериментальной антигенной модели для иммунизации мышей использовали поликомпонентную вакцину Иммуновак-ВП-4® (ФГУП «НПО «Микроген»), состоящую из антигенов условно патогенных микроорганизмов (.Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus) и предназначенную для иммунотерапии хронических воспалительных и аллергических заболеваний. Вакцина содержит ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных бактерий, пептидо-гликан, тейхоевые кислоты, липопротеины, CpG-мотивы олигонук-леотидов, являющихся лигандами для Толл-подобных рецепторов.

Штаммы микроорганизмов. В работе были использованы штаммы ^pneumoniae К16, P.vulgaris серотипа 016Н6 № 177, S. pneumoniae серотипа 3 (ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН). Штаммы восстанавливали из лиофилизированного состояния, выдерживая в 0,2%-ном сахарном бульоне 4-6 часов при 37°С. После этого пересевали на 16-18 часов на питательный агар. Применяли штамм вируса гриппа птиц H5N2 (A/Mallard/Pensil/1024/84 -H5N2), выделенный от уток и адаптированный к мышам (штамм предоставлен Ю.А. Смирновым - ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» РАМН). Все штаммы использовали для воспроизведения инфекционного процесса у животных.

Экспериментальные животные. Опыты проводили на мышах линий СВА (n=1200), Balb/c (п=300) и беспородных (п=1000) весом 12—14 и 16-18 г, полученных из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка» и содержащихся в условиях вивария ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Иммунизация мышей. Мышей вакцинировали Иммуновак-ВП-4 1-кратно и 3-кратно интраназально в разовой дозе 500 мкг/мышь и перорально в разовой дозе 2 мг/мышь; 1-кратно и 2-кратно подкожно в разовой дозе 200 мкг/мышь.

Защита мышей от бактериальной и вирусной инфекции. Активацию системы врождённого и адаптивного иммунитета у мышей оценивали на моделях клебсиеллёзной (A^pneumoniae К16, в дозах 0,0050,01-0,025-0,05 млрд. м.кл), протейной (P.vulgaris, штамм № 177, в дозах 10-20-40-80 млн м.кл.), пневмококковой (S.pneumoniae, серо-тип 3 в дозах от 10 до 104 м.кл) инфекций (штаммы вводили внутри-брюшинно) и гриппозной инфекции (штаммом H5N2, 50LD50, заража-

ли иитраназально). Заражение мышей проводили через 24 часа после последней иммунизации вакциной. Kpneumoniae Kl6 и Р.vulgaris вводили в 0,4%-ном агаре в соотношении культуры и агара 1:4, S.pneumoniae - в 0,9% растворе натрия хлорида. Протективную активность вакцины определяли через 6-20 дней после заражения.

Выделение мононуклеарпых лейкоцитов (МЛ). Животных выводили из опыта под эфирным наркозом согласно правилам и международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах, извлекали лим-фоидные органы и ткани, гомогенизировали, отмывали средой RPMI-1640 и выделяли MJI с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу A. Boyum (1968).

Определение экспрессии TLRs и поверхностных маркеров проводили при помощи моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре (Beckman Coulter Fc-500, США). На MJI селезёнок, лимфатических узлов, назо-, бронхо- и гастро-ассоциирован-ной лимфоидной ткани мышей исследовали уровни экспрессии TLR 2,4,9, а также маркёры лимфоцитов: CD3, NK 1.1, CD3/NK, CD4, CD25, CD4/CD25, CD8, CD 19, МНС II, CD5.2 (В,), TCR (Ту5).

Цитотоксическую активность МЛ лимфоидных органов и тканей мышей определяли на NK чувствительной линии опухолевых клеток К-562 в МТТ-тесте. Опухолевые клетки (Зх104/мл) инкубировали в течение 18 часов в плоскодонных 96-луночных планшетах (Costar, Франция) в культуральной среде RPMI 1640 (Sigma, США) с МЛ органов и тканей после вакцинации в соотношении 1:5 в С02 инкубаторе при 37°С и 4% С02. В лунки добавляли витальный краситель МТТ (Fluka, Германия) и по оптической плотности (X - 540 нм), измеряемой на мультискане MS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Определение уровня цитокинов. Цитокины в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (США) согласно инструкции производителя.

Морфогистохилшческие исследования. Изучена структура первичных (костный мозг, тимус) и вторичных (селезёнка, регионарные лимфатические узлы, мукозо-ассоциированная лимфоидная ткань) органов иммуногенеза мышей через 24 часа после интраназального, перорального и подкожного однократного введения вакцины Имму-новак-ВП-4 и у интактных животных. Исследования проводили на

серийных парафиновых срезах органов и тканей, окрашенных гистологическими (гематоксилином-эозином и по Ван Гизону) и гистохимическими (по Браше с контролем РНК-азой, по Шабадашу с контролем амилазой и альциановым синим) методами. Фотосъемку и анализ изображения с гистологических препаратов проводили с помощью цифровой системы регистрации и анализа изображения AxioVision 4.2 (Carl Zeiss, Германия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США), интегрированного пакета статистического анализа StatSoft 8.0 с применением параметрических и непараметрических методов сравнения. Выживаемость мышей в течение заданного срока рассчитывали по методу Гланца [Гланц С.А., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспрессия То11-подобных рецепторов на клетках лимфоидных органов мышей

На первом этапе исследований изучено влияние антигенов условно патогенных бактерий, входящих в состав вакцины Иммуновак-ВП-4, на экспрессию TLRs клетками лимфоидных органов (селезёнки, лимфатических узлов) и лимфоидных тканей, ассоциированных с носовой полостью и бронхами (Nasal Associate Lympoid Tissue - NALT, Bronco Associate Lymphoid Tissue - BALT) и с тонким кишечником (Gut Associate Lymphoid Tissue - GALT). Полученные результаты сравнивали с показателями при подкожной иммунизации, оценивая содержание клеток, экспрессирующих TLR2, TLR4 и TLR9.

Уровни экспрессии TLRs у интактных мышей, которые можно принять за контрольные показатели, во всех опытах были небольшими и составляли 0,01-0,5%.

Однократная интраназальная иммунизация в дозе 500 мкг/мышь не оказывала существенного влияния на число клеток, экспрессирующих TLRs во всех исследованных органах и тканях. При пероральном однократном (2000 мкг/мышь) введении вакцины значительно увеличивалась численность клеток, экспрессирующих TLR4, TLR9 в GALT и TLR9 в NALT/BALT. При однократном подкожном введении выявлено увеличение числа TLR2- и TLR4-пoлoжитeльныx клеток в селезёнке, а в NALT/BALT - повышение количества клеток, экспрессирующих все исследованные TLRs, тогда как в лимфоидном аппарате кишечника эти показатели соответствовали уровню у интактных животных.

Изменения численности TLRs-экспрессирующих клеток при многократной аппликации антигенов условно патогенных бактерий (3-кратно при мукозальных и 2-кратно при подкожном) были более выраженными. При интраназальном способе иммунизации у мышей в BALT/NALT увеличивалось число клеток с экспрессией TLR4 до 1,43±0,09%, TLR9 - до 1,27±0,17%, а в GALT - TLR9-3KcnpeccHpyio-щих клеток - до 1,2±0,15% (рис. 1). При пероральном введении антигенов экспрессия TLR4 и TLR9 на клетках выражена в большей степени в GALT - до 13±1,62% и 14,9±1,47% соответственно. В NALT/BALT эти показатели составили 1,9±0,32% и 2,95±0,65%. Обращает на себя внимание, что содержание TLR9-3KcnpeccHpyioiuHX клеток повышалось при данном методе и в селезёнке до 3,47±0,9%. Участие селезёнки в этом процессе позволяет предполагать формирование не только местного, но и системного иммунитета. Однако при мукозальных методах введения антигенов практически не выявлено экспрессии TLR2 на клетках исследованных лимфоидных органов и тканей.

Рис. 1. Содержание клеток (%), экспрессирующих TLRs при разных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов: 1 - селезёнка, 2 - NALT/BALT, 3 - GALT. Интраназально, перорально - 3- кратно, подкожно - 2-кратно. Пунктирной линией обозначены максимальные уровни экспрессии TLRs у интактных животных

Результаты подкожной иммунизации мышей имели несколько существенных отличий от показателей, полученных при непарентеральных методах введения антигенов. Во-первых, при данном методе экспрессия всех трех исследованных TLRs происходила на клетках селезёнки и NALT/BALT, причем на последних даже в большей степени - до 11,3-13,2%. Во-вторых, экспрессия всех этих рецепторов на

клетках GALT была минимальной и лишь немного превышала показатели у интактных мышей. В-третьих, только при подкожном введении определяли значительное количество ТЫ12-позитивных клеток.

Таким образом, один и тот же препарат из антигенов условно патогенных бактерий действовал на различные сигнальные пути клеточной активации при разных методах введения. При подкожном введении увеличивалась экспрессия TLR2,4,9 на клетках исследованных лимфоидных органов и тканей, что приводило к дальнейшей клеточной дифференцировке преимущественно по Thl-пути. При неин-вазивных методах выявлено повышение экспрессии только TLR4 и TLR9. Различия в активации сигнальных путей при парентеральном и непарентеральных методах введения антигенов связаны с отсутствием экспрессии TLR2 при мукозальной аппликации, что является важным фактом, так как этот рецептор участвует в регуляции продукции IgE [Измайлова О.В. и соавт., 2011; Takenaka Н. et al., 2010]. Полученные данные объясняют феномен меньшего сенсибилизирующего действия микробных антигенов при непарентеральных методах вакцинации [Егорова Н.Б. и др., 1968; 1977; Ефремова В.Н. и др., 1985].

Иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов лимфоидных органов и тканей мышей при различных способах аппликации бактериальных антигенов

Важнейшими иммунокомпетентными клетками, обеспечивающими особенности функциональной активности мукозальной иммунной системы, являются Ту8 и Bi лимфоциты, которые заселяют эпителий слизистых оболочек и характеризуются способностью усваивать па-тоген-ассоциированные структуры микроорганизмов без костимули-рующих сигналов и предварительного процессинга другими эффекторами иммунитета [Сидорова Е.В, 2004; Хаитов P.M. и др., 2003; Пинегин Б.В. и др., 2004; Xiong N., Raulet D., 2004].

Отличительными особенностями интраназального 3-кратного введения вакцины было значительное повышение экспрессии исследованных маркёров в NALT/BALT и в селезёнке (табл. 1). В NALT/BALT относительное содержание Ту8 лимфоцитов увеличивалось в 32 раза, Bi (CD5+) - в 8 раз, CD3+ и CD4+ - в 6 и 4 раза соответственно. В селезёнке уровень Ту8 возрастал в 16 раз, Bi - в 10,7 раз. Существенно увеличивался также уровень CD4+ и С08+-клеток.

При пероралыюм введении вакцины во всех исследованных органах и тканях отмечены выраженные изменения клеточного состава.

Таблица 1.

Экспрессия маркёров на эффекторах иммунитета при разных методах введения бактериальных антигенов

Метод иммунизации Содержание клеток, % (кратность увеличения по сравнению с контролем)

Селезёнка Лимфатические узлы МАШВАЬТ Лимфоидная ткань тонкого кишечника (GALT)

маркёр интакт-такт-ные иммунизированные маркёр интакт-такт-ные иммунизированные маркёр интакт-такт-ные иммунизированные

Интраназальный 3-кратно D3 6,3 47,4 (7) CD3 1,2 7,6 (6,4) CD3 0,3 2,7(9,8)

CD3/NK 1,13 3,63 (3) CD3/NK 0,4 1,19(3) CD3/NK 1,16 0,2 (5,8)

CD4 2,1 58,6 (25) CD4 3,5 13,7 (3,9) CD4 0,34 1,9(5,6)

CD4/CD25/Foxp3 0,8 4,48 (5,6) MHCII 1,6 72,0 (45) CD8 0,24 3(12,5)

CD8 4,7 34,2 (7,3) CD19 0,63 25,2 (39) CD5 0,15 0,53 (3,5)

Туб 0,17 2,8(16) Туб 0,05 1,6 (32)

В1 0,08 0,9 (10,7) Bi 0,21 1,7(8)

Пероральный 3-кратно CD3/NK 1,13 5,8 (5,2) CD3 1,2 34 (28) CD3 0,3 4,3(16)

CD4 2,1 13,3 (6) CD4 3,5 40,1 (12) NK 0,7 33,3 (46)

CD25 1,6 12,6(7,8) CD8 1,8 31,9(15) CD4 0,3 7,3 (21)

CD4/CD25/Foxp3 0,8 2,44 (3) CD19 0,6 8,2(13) CD25 0,7 5,4 (7,6)

Туб 0,17 1,43(3,7) Туб 0,05 9,3 (186) CD8 0,24 2,2(10)

В1 0,08 0,5 (9,9) Bi 0,21 2(9,4) CD19 0,4 39,9 (97)

MHCII 1,6 4,8(3) Туб 0,2 9,0 (45)

Bi 0,1 11,7(117)

Подкожный 2-кратно CD3/NK 1,13 0,3 (6) CD3 1,2 10,4 (8,8) CD3 0,3 2,4(8,8)

CD4 2,1 14,3 (7) CD4 3,5 12,6 ¡3,5) CD4 0,3 1,9 ¡5,5)

CD25 1,6 5,6 (3,5) CD8 1,8 12,4 (7) CD8 0,24 1,5(6)

CD4/CD25/Foxp3 0,8 2,8 (3) CD19 0,6 2,3 (3,5) MHCII 5,16 25,9 (5)

Туб 0,17 5,3 (31,2) Туб 0,05 12,0 (240) CD19 0,4 1,75 (4,3)

В1 0,08 4,9(62) В, 0,2 12,1 (58)

В GALT относительное число Туб лимфоцитов увеличилось в 45 раз, В]-клеток - в 117 раз, NK - в 46 раз. В N ALT/B ALT значительно повышалось содержание Ту8 лимфоцитов (в 186 раз), Вглимфоцитов (в 9,4 раза) и клеток, экспрессирующих дифферен-цировочные антигены - CD3, CD4, CD8, CD19 (в 28, 12, 15 и 13 раз соответственно). Пероральный метод введения отличался от интра-назального наименее выраженными изменениями в селезёнке иммунизированных мышей, где процентное содержание CD4, CD25, Туб, В! увеличивалось всего в 3-9 раз.

Подкожный метод вакцинации вызывал увеличение содержания Туб лимфоцитов в NALT/BALT в 240 раз, в селезёнке - в 31,2 раз. Также выявлен высокий уровень числа В ¡-лимфоцитов в этих органах при меньшей степени повышения количества CD25, CD4, CD8, CD 19. Таким образом, при подкожном методе введения бактериальных антигенов происходила существенная активация клеток эффекторов врождённого иммунитета в селезёнке и NALT/BALT. Значительно меньшая динамика этих показателей, как и при интразальном методе введения, выявлена в GALT.

Обращает на себя внимание минимальная активация лимфоидного аппарата кишечника при подкожном и интраназальном введении антигенов и то, что только пероральный метод иммунизации характеризовался значительным повышением численности NK-клеток.

Анализ особенностей иммунофенотипа мононуклеарных лейкоцитов при мукозальной иммунизации антигенами условно патогенных бактерий свидетельствует об интенсивном обмене лимфоцитами между эпителио-ассоциированными лимфоидными образованиями и селезёнкой, что обеспечивает при данном виде вакцинации развитие реакций не только местного, но и системного иммунитета.

Морфогистохимическая характеристика лимфоидных органов и тканей при однократной аппликации антигенов условно патогенных бактерий

При всех способах введения бактериальных антигенов происходила активация иммунокомпетентных клеток как в эпителио-ассо-циированной лимфоидной ткани, так и в структурированных лимфоидных органах. Степень и топография активации зависела от способа введения антигенов. При мукозальных способах аппликации Имму-новак-ВП-4 наиболее выраженную реакцию наблюдали в ближайших

к месту введения лимфоидных образованиях; при интраназальном -в регионарных лимфатических узлах и эпителио-ассоциированной лимфоидной ткани верхних дыхательных путей и бронхиального дерева (рис. 2). Отмечалось также увеличение размеров лимфоидных узелков селезёнки и активация в них клеток лимфоидного ряда.

Рис. 2. Регионарные к месту введения лимфатические узлы мышей при интра-назальной иммунизации Иммуновак-ВП-4: А - окр. по Ван Гизону ув. 200; Б - окр. метиловым зелёным и пиронином по Браше ув. 400.

Обозначения: а, б, в - корковое вещество узла: а - выраженный реактивный центр лимфоидного узелка (В-зона); б - мантийный слой лимфоидного узелка (В-зона); в - межузелковая область с плотно расположенными лимфоцитами; г - промежуточный мозговой синус, заполненный макрофагами и плазмоцитами; д - расширенные мозговые тяжи (Т- и В-зона), содержащие большое количество бластных форм и клеток плазматического ряда

Пероральное введение вакцины приводило к наиболее активной пролиферативной реакции клеток лимфоидного ряда в брыжеечных лимфоузлах и лимфоидной ткани, ассоциированной с тонким кишечником. Причём активация лимфоидных клеток в равной степени касалась Т- и В-зависимых зон лимфоидных образований (рис. 3). Лим-фоидная ткань селезёнки также активно реагировала на пероральное введение вакцины: за счёт пролиферации лимфоидных клеток расширялась площадь белой пульпы, которая занимала большую часть срезов органа (см. рис.4). Лимфоидные узелки разнообразных размеров с преобладанием очень крупных имели достаточно чёткие контуры с выраженными маргинальными зонами и намечающимися светлыми центрами. Красная пульпа была умеренно лимфатизирована.

А Б

Рис. 3. Лимфоидная ткань кишечника мышей при пероральной иммунизации вакциной Иммуновак- ВП-4: А - подвздошная кишка ув. 100; Б - переход тонкой кишки в толстую; окр. гематоксилином и эозином ув. 200. Обозначения: а - ворсинки тонкого кишечника; б - крипты тонкого и толстого кишечника; в - купол с микроскладчатыми клетками; г, д - аггрегированные лимфоидные узелки (пейерова бляшка): г - лимфоидный узелок (В-зона), слившийся с соседними узелками; д - расширенная межфолликулярная Т-зона; е - крупный солитарный лимфоидный узелок

Подкожное введение вакцины Иммуновак-ВП-4 характеризовалось распространённостью активации клеток лимфоидного ряда во всех изученных органах (селезёнке, лимфатических узлах), в лимфо-идной ткани, ассоциированной с носовой полостью и бронхами, и в меньшей степени - в лимфоидной ткани тонкого и толстого кишечника. Особенно заметны пролиферативные процессы лимфоидной ткани в селезёнке, где наблюдалось слияние лимфоидных узелков в единые конгломераты, включающие все Т- и В-зависимые зоны (пе-риартериальную муфту, реактивный центр, мантийную и маргинальную зоны) (см. рис. 4).

Таким образом, интраназальное и пероральное введение вакцины вызывало заметные изменения не только в регионарных лимфоидных органах и тканях, но и в отдалённом от места введения вторичном лимфоидном органе - селезёнке. Это свидетельствуют о том, что наряду с формированием местных иммунных реакций, при му-козальной аппликации бактериальных антигенов происходила характерная для парантеральной иммунизации генерализация иммунного ответа, (рис. 4).

в г

Рис. 4. Селезёнка интактной и иммунизированных Иммуновак-ВП-4 мышей: окр. гематоксилином и эозином ув. 100. А - селезёнка интактной мыши; Б - после интравазального введения; В - после перорального введения; Г - после подкожного введения. Обозначения: а - лимфоидные узелки (белая пульпа); б - красная пульпа; в - центральная артерия с периартериальной муфтой (Т-зона); г - реактивный центр узелка (В-зона); д - мантийная зона (В-зона); е - маргинальная зона (Т- и В-зона)

Цитотоксическая активность 1\Л< клеток лимфоидных органов и тканей мышей при разных способах аппликации бактериальных антигенов

Определение цитотоксичности ТЧК клеток лимфоидных органов и тканей мышей по отношению к линии опухолевых клеток эритро-бластного лейкоза К562 проводили через 24 часа после многократной иммунизации Иммуновак-ВП-4 при разных способах аппликации (табл. 2).

Таблица 2

Цитотоксическая активность мононуклеарных лейкоцитов лимфоидных органов и тканей мышей, иммунизированных Иммуновак-ВП-4, по отношению к ЫК-зависимой линии опухолевых клеток К562*

Метод введения вакцины, дозы, кратность Цитотоксичность МЛ (%), полученных из:

селезёнки лимфатических узлов NALT/BALT лимфоидной ткани GALT

Контроль (интактные мыши) 18,3±1,2 7,7+1,45 2,0+1,15

Интраназальный (0,5 мгх 3-кратно) 12,0+1,0 16,4±0,72* 8,4±0,8*

Пероральный (2 мгх 3-кратно) 33,7±1,01* 20,1+0,8* 75,4±1,83*

Подкожный (0,2 мгх 2-кратно) 33,7±0,93* 27,0+1,01 ** 19,3±2,2*

* - соотношение клетки эффекторы/клетки мишени 1:5

** - достоверность различий по отношению к контролю, Р<0,05;

При иптршшзалыюм введении Иммуновак-ВП-4 усиливалась цитотоксическая активность NK клеток в NALT/BALT и GALT (в 2,1 и 4,2 раза соответственно). При подкожной и пероральной иммунизации отмечалось повышение цитотоксичности NK в селезёнке в 1,8 раза, в NALT/BALT - 3,5 и 2,6 раза и наиболее существенно - в GALT (в 9,6 и 37,7 раз) по сравнению с контролем. Самой высокой цитоток-сичностью характеризовались клетки, полученные из лимфоидной ткани кишечника, после пероральной иммунизации (75,4±1,83%). Это является существенной особенностью перорального метода иммунизации и согласуется с тем, что только в данном случае было выявлено существенное нарастание популяции NK-клеток после иммунизации (см. табл.1).

Уровень цитокинов в сыворотках мышей при мукозальной аппликации бактериальных антигенов

Важным показателем действия иммуномодулирующих препаратов является их влияние на продукцию цитокинов, осуществляющих взаимодействие между эффекторами врождённого и адаптивного иммунитета. Изучено содержание цитокинов 1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-4, 1Ь-10, 1Ь-12, 1Ь-5, ТО Ра и №N7 в сыворотке крови мышей через 24 часа после подкожного и мукозального (интраназального и перорально-го) введения бактериальных антигенов. После аппликации антигенов в сыворотке мышей достоверно повышался уровень 1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-12, 1Ь-5, концентрация которых отличалась в зависимости от метода их введения (табл.3).

При пероралыюм и интраназальном методах аппликации изменения уровней экспрессии данных цитокинов были сопоставимы (р>0,05). Подкожный метод вызывал более выраженную продукцию цитокинов, в том числе 1Ь-12, играющего ключевую роль в активации процессов представления антигенов Т-лимфоцитам и дифференци-ровке их по ТЫ-пути. Об этом же свидетельствовало увеличение в сыворотке мышей в 5 раз по сравнению с контролем концентрации №N-7 (который синтезируется преимущественно ТЫ-клетками и 1ЧК). Значительное повышение содержания в сыворотке ГЬ-5, регулирующего выработку ^А — важного фактора мукозального иммунитета, наблюдалось как при подкожном, так и при мукозальных способах введения вакцины.

Полученные результаты показывают, что введение антигенов условно патогенных микроорганизмов вызывает активацию иммунологических реакций и под воздействием синтезированных цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-12, №N-7) происходит поляризация иммунного ответа преимущественно по ТЫ типу, что особенно выражено при подкожном методе иммунизации.

Таблица 3

Уровень цитокинов в сыворотках мышей при однократном введении антигенов _ условно-патогенных микроорганизмов_

Группа Метод введения антигенов Содержание цитокинов, пкг/мл

И-1Р И-6 И-10 И-12 11.-4 11.-5 Т^а

1 Пероральный 17,8±0,6* 132,0+16,3* 37,5±2,8 12,5±1,5* 5,8±0,8 43,6±1,5* 7,5+1,1 30,5±3,1

2 Интраназальный 18,2±0,7* 115,0+25,6* 39,0±3,3 13,2±1,2* 6,8±0,7 55,5+12,6* 7,3+0,5 33,7±2,1

3 Подкожный 68,3±3,2* 215,0+15,8* 41,2±4,5 38,6±2,7* 5,5+0,4 98,3±9,8* 36,6±2,8* 36,6±2,8

4 Контроль (интактные мыши) 5,2±0,5 46,8±3,3 36,3+3,8 5,2±0,6 5,4±0,6 25,7±2,1 7,2±0,5 28,3±2,1

Достоверность различий между группами РГ2И з <0,05 Р1,з< 0,05 рг,з< 0,05 Р1,2 и з<0,05

* - достоверность различий между контрольной и опытными группами р<0,05.

Таблица 4

Защита мышей от вируса гриппа птиц Н5М2 при мукозальных методах иммунизации вакциной

Группа Метод иммунизации Схема иммунизации Доза, мкг Доза вируса ЦЭбшмышь Выживаемость* Средняя продолжительность жизни, дней

разовая суммарная абс. %±т по С.Гланцу

1 Интраназально 3-кратно через 2 дня 480 1440 50 5/10 50+15,8 0,56±0,15 13,9

2 Перорально -«- 2000 6000 -«- 2/10 20±12,6 0,22+0,13 6,25

3 Интраназально+ перорально -«- 480+ 2000 1440+ 6000 -«- 5/10 50+15,8 0,56+0,16 13,0

4 Контроль (интактные) - не вводили не вводили 0/10 0+8,5 0,10+0,13 5,6

Достоверность различий между группами * - срок наблюдения 14 суток. Р1И 4 < 0,05 Р2И 4 > 0,01 рзи 4 < 0,05 Р1И 4 < 0,05 Р2И 4 > 0,05 рзи 4 < 0,05

Протективная активность антигенов условно-патогенных микроорганизмов при мукозальных методах введения

На следующем этапе исследований проведены эксперименты по изучению протективного эффекта бактериальных антигенов в составе Иммуновак-ВП-4 при разных методах введения. Изучена неспецифическая резистентность на модели вируса гриппа (табл.4), а также специфическая протективная активность в отношении микроорганизмов, антигены которых входят в состав вакцины (табл.5).

Таблица 5

Протективный эффект бактериальной вакцины _при её пероральном введении _^_

№ опыта Кратность иммунизации Доза, мкг Заражение, возбудитель* Число павших/ всего в опыте Ю5о, микробных клеток ИЭ"

1 2 2000 К.рпеитоп1ае Ки 2/26 55,9x106 5,7

3 2000 -II- 7/34 41,6x105 4,3

Контроль (интактные) - -II- 23/32 9,7x106 —

2 3 2 000 К.рпеитотае Ки 13/40 28,8x106 2,3

Контроль (интактные) -II- 25/40 12,5x106 —

3 2 2 000 Р. \zulqaris 177 17/36 30,8x106 2,7

Контроль (интактные) -II- 19/23 11,3x106 —

4 2 2 000 Б.рпеитоп'те, серотип 3 18/37 158,0 12

3 2 000 -II- 19/40 199,5 16

Контроль (интактные) -II- 31/40 12,6 —

*-заражение проводили через 7 суток после последнего введения Иммуновак-ВП-4; **-ИЭ - отношение величины /.Обо в опыте к 1-050 контроля

Защитное действие антигенов условно патогенных бактерий при интраназальном заражении вирусом гриппа выявлено при интра-назальном и комбинированном назально-пероральном введении Им-муновак ВП-4.

В обеих группах выжило по 5 из 10 взятых в опыт мышей (50±15,8)% при 100%-ной гибели мышей в контроле, р<0,05. При пе-

роральном введении вакцины защиты не наблюдалось. Можно предположить, что при интраназальном заражении вирусом гриппа мышей, иммунизированных этим же методом, формировалась выраженная локальная защита в месте входных ворот инфекции.

Для исследования способности бактериальных антигенов стимулировать систему адаптивного иммунитета была проведена серия опытов по защите мышей от K.pneumoniae, Р.vulgaris, S.pneumoniae при пероральном введении вакцины.

Пероральная иммунизация вызывала значительное повышение резистентности к возбудителям, антигены которых входят в состав вакцины — K.pneumoniae, P.vulgaris (см. табл.5). 2- и 3-кратная пероральная иммунизация мышей Иммуновак-ВП-4 обеспечивала защитный эффект от K.pneumoniae при индексе эффективности (ИЭ) от 2,3 до 5,7. Не выявлено статистически значимых отличий в выживаемости мышей при 2-й 3-кратной вакцинации. При заражении иммунизированных мышей P.vulgaris ИЭ составил 2,7. Установлена также значительная степень защиты от S.pneumoniae типа 3 (ИЭ - 12), антигены которого не входят в состав вакцины. Этот возбудитель является важнейшим этиологически значимым фактором хронических воспалительных заболеваний органов дыхания.

Активация клеток эффекторов мукозального иммунитета и генерализация этого процесса в лимфоидные органы, отдаленные от места введения вакцины, является основным моментом, обеспечивающим защиту от пневмококка, однако не исключено наличие общих антигенов у S.pneumoniae и возбудителей, антигены которых входят в состав вакцины.

Полученные данные свидетельствуют о том, что мукозальное введение вакцины, сконструированной на основе антигенов условно патогенных бактерий, обеспечивает не только быстрое формирование неспецифической резистентности, установленной на модели вируса гриппа, но и развитие адаптивного иммунитета, что подтверждено в острых опытах защиты мышей от патогенов (K.pneumoniae, P.vulgaris, S.pneumoniae). Совокупность полученных данных позволяет расширить стратегию использования антигенов условно патогенных микроорганизмов для активации мукозального иммунитета с целью создания защиты от различных инфекций. Разработка неинва-зивных методов вакцинации является важнейшим направлением развития вакцинологии и вакцинопрофилактики.

выводы

1. Антигены условно патогенных бактерий действуют на различные сигнальные пути клеточной активации в зависимости от метода их введения: при интраназальной и пероральной аппликации увеличивается экспрессия ТЬИ4 и ТЫ19 и отсутствует активация ТЬЯ2; при подкожном введении повышается экспрессия всех изученных рецепторов - ТЬЯ2, 4, 9.

2. Активация ключевых эффекторов мукозального иммунитета (Ту8 и В ¡лимфоцитов) наблюдается не только при непарентеральных методах иммунизации, но и при подкожном введении тех же антигенов.

3. При мукозальных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов происходит увеличение количества СЭЗ+, СЭ4 , СБ8 , СБ 19 -лимфоцитов и пролиферация иммунокомпетент-ных клеток как в регионарных к месту введения (в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания и желудочно-кишечного тракта), так и в отдалённых органах иммуногенеза (в селезёнке), что обеспечивает, наряду с местным, развитие системного иммунитета.

4. Отличительной особенностью мукозальных методов аппликации антигенов условно атогенных бактерий является увеличение численности и цитотоксичности №£-клеток. При интраназальном введении усиливается цитотоксическая активность клеток лимфоидной ткани, ассоциированной с дыхательным и желудочно-кишечным трактами. При подкожной и пероральной иммунизации цитотоксиче-ский потенциал 1ЧК-клеток повышается во всех исследуемых лимфо-идных органах, причём наиболее высокой активностью обладают клетки, полученные из лимфоидной ткани кишечника после перо-рального введения вакцины.

5. При мукозальном введении антигенов условно патогенных бактерий увеличивается синтез 1Ь-1р, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-12, 1ГЫ-у, при этом продукция 1Ь-12 и №N-7 менее выражена, чем при подкожном методе иммунизации.

6. Мукозальная иммунизация антигенами условно патогенных микроорганизмов является активным стимулятором эффекторной системы врождённого иммунитета, что обеспечивает быстрое формирование неспецифической резистентности, тестируемой в отношении вируса гриппа.

7. Антигены условно патогенных бактерий при мукозальных методах введения обладают протективным действием, установленным в

отношении K.pneumoniae и P.vulgar is, что свидетельствует о развитии адаптивного иммунитета.

8. Совокупность полученных данных позволяет расширить стратегию использования вакцины Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий с применением непарантеральных методов иммунизации для создания защиты от широкого спектра патогенов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Уткина Н.П., Чертов H.H., Стафеева О.Н., Бродовский М.Б., Лебединская Е.А., Егорова Н.Б. Функциональная активность клеток мукозальной иммунной системы при различных способах введения поликомпонентной бактериальной вакцины // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. -№ 2. - С. 296.

2. Лебединская Е.А., Кузъменко О.М., Ахматов Э.А., Чёртов И.В., Грубер И.М., Бродовский М.Б., Кунягина О.В., Кабановская И.Н., Некрасов A.M., Уткина Н.П., Стафеева О.Н., Лебединская О.В., Ахматова Н.К. Комплекс антигенов бактериального происхождения, несущих лиганды для TLR, корригирует уровень цитокинов при индуцированной иммуносупрессии // Аллергология и иммунология. -2009. - Т. 10. - № 2. - С. 299.

3. Лебединская Е.А., Бродовский М.Б., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Чертов И.В., Егорова Н.Б, Уткина Н.П., Некрасов A.M., Стафеева О.Н. Функциональные и морфологические характеристики иммунокомпетентных клеток, органов лимфопоэза и эпителио-ассо-циированной лимфоидной ткани при различных способах введения бактериальной вакцины // Российский аллергологический журнал. -2009. -№3,- Вып. 1.-С. 9.

4. Кузъменко О.М., Ахматов Э.А., Грубер И.М., Кунягина О.В., Лебединская О.В., Кабановская H.H., Некрасов A.M., Бродовский М.Б., Уткина Н.П. Влияние комплекса антигенов стафилококка на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - № 4-5. - С. 321-322.

5. Лебединская Е.А., Уткина Н.П., Мерзлова Н.Б., Лебединская О.В. Оценка эффективности местной терапии острых фарингитов, ларингитов и катаральной ангины у детей препаратами, содержащими цетилпиридиния хлорид // Вопросы современной педиатрии. - 2013.-№ 1.-С. 177-180.

6. Сорокина Е.В., Ахматова Н.К., Уткина Н.П. Роль сигнальных молекул в распознавании герпесвирусной инфекции, выступающей в роли триггерного фактора у больных хронической крапивницей // V Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. -М„ 2013.-С. 375-376.

7. Егорова Н.Б, Ахматова Н.К., Курбатова Е.А., Уткина Н.П., Семенов Б.Ф., Зверев В. В. Клеточные и молекулярные основы антимикробного мукозального иммунитета - М., 2013. - 119 с.

8. Уткина Н.П., Ильиных Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К. Морфофункциональнная характеристика иммунного ответа при различных методах введения антигенов условно-патогенных бактерий// Пермский медицинский журнал. — 2013. — Т. 30. — № 4. — С. 110-121.

9. Lebedinskaya О. V, Utkina N. P., Akhmatova N.K. The protective activity of the bacterial antigens in mucosal route of immunization in mice // 15th International Congress of Immunology. - Milan. - 2013. - № 1 -P. 32-33.

10.Utkina N.P., Akhmatov E.A, Ilinykh E.A., Sorokina E.V., Lebedinskaya E.A., Marakasova E.C., Lebedinskaya O.V, Kurbatova E.A, Akhmatova N.K. Influence of the PAMPs of opportunistic microorganisms on the TLRs expression 15th International Congress of Immunology. - Milan. -2013.-№ 1-P. 86-87.

На правах рукописи

УТКИНА НАТАЛИЯ ПАВЛОВНА

ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ МУКОЗАЛЬНЫХ СПОСОБАХ АППЛИКАЦИИ АНТИГЕНОВ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 08.08.2013 г. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 542

Отпечатано в издательско-полиграфическом комплексе «ОТ и ДО» 614094, г. Пермь, ул. Овчинникова, 19 тел./факс (342) 224-47-47