Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Характеристика внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.01.21
Автореферат диссертации по медицине на тему Характеристика внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях
п
На правах рукописи
КОМАРОВА ЛЮДМИЛА СЕРГЕЕВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ И МЕМБРАНОАССОЦИИРОВАННЫХ МАРКЕРОВ ЭОЗИНОФИЛОВ ПРИ КЛОНАЛЬНЫХ И РЕАКТИВНЫХ ЭОЗИНОФИЛИЯХ
14.01.21 - Гематология и переливание крови 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология
2 7 Я К В 2311
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2010
4843476
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.ПЛавлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор
АФАНАСЬЕВ Борис Владимирович
доктор медицинских наук, профессор ТОТОЛЯН Арег Артемович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
БУБНОВА Людмила Николаевна
доктор биологических наук, профессор СЕСЬ Татьяна Павловна
Ведущая организация: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская
академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится « » января 2011 года в часов на заседании
диссертационного совета Д-208.074.01 ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России» по адресу. 193024, Санкт-Петербург, 2-ая Советская ул., д.1 б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Автореферат разослан "22- " декабря 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук
Т.В. Глазанова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Злокачественные заболевания системы крови - одна из важнейших проблем современной биологии и медицины. Особое место среди них занимают гемобластозы, сопровождающиеся выраженной эозинофилией в периферической крови (Ackerman S.J. et al., 2007). Механизмы развития эозинофилии при различных патологических процессах неоднозначны. При разделении по типу эозинофилия может быть симптоматической, клональной и идиопатической. Эозинофилия может
сопровождать любой вариант злокачественного заболевания крови, быть при этом реактивной или клональной. Наличие эозинофилии оказывает влияние на клинические проявления острых лейкозов, лимфом, хронических
миелопролиферативных заболеваний. Клональные эозинофилии отражают процесс вовлечения эозинофилов в пролиферацию лейкозного клона клеток и являются частью общего процесса (Афанасьев Б.В., 2009). В соответствии с классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2008) клональные эозинофилии включают состояния - хронический эозинофильный лейкоз и опухоли миелоидной и лимфоидной ткани с эозинофилией и наличием мутаций аУ|3 рецептора фактора роста тромбоцитов (platelet-derived growth factor -PDGFR) или 1 рецептора фактора роста фибробластов (Tefferi A et. al, 2009). Гиперэозинофильный синдром является частью идиопатической эозинофилии, при этом эозинофилия может иметь черты моноклональности и трансформироваться в миелопролиферативное заболевание с образованием соединения с тирозинкиназной активностью FIP1L1/ PDGFRA (Klion А. 2009). Реактивная эозинофилия является фактором прогноза при развитии реакции «трансплантат против хозяина» после аллогенной трансплантации гемопоэтических клеток.
Проведение дифференциального диагноза при наличии эозинофилии в ряде случаев затруднено. Принципиально новые подходы к диагностике и лечению заболеваний, протекающие с гиперэозинофшшей, являются актуальными и могут быть оптимизировапы на основе изучения клеточных и молекулярных механизмов их возникновения и развития. В настоящее время отсутствуют данные о комплексном анализе внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофшшях. Исследование цитотоксических белков эозинофилов, химических медиаторов тучных клеток и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях может внести определенный вклад в изучение патогенетических механизмов развития эозинофилий и способствовать определению новых диагностических критериев гиперэозинофильных состояний. Эти положения определили цель и задачи исследования.
Цель работы:
Изучить содержание внутриклеточных маркеров и особенности экспрессии мембраноассоциированных антигенов эозинофилов с целью оптимизации дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий.
з
Задачи работы:
1. Определить содержание растворимых маркеров эозинофилов и тучных клеток (эозинофильный катионный белок, триптаза) в сыворотке крови у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
2. Изучить особенности экспрессии и интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13, CD15, CD33, HLA-DR у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
3. Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий.
Научная новизна работы
1. Впервые проведено комплексное исследование мембраноассоциированных CD 13, CD33, CD15, HLA-DR и внутриклеточных маркеров (ЕСР) эозинофилов у пациентов с клональными (миелопролиферативные заболевания, гиперэозинофильный синдром) и реактивными (БА, РТПХ, солидные опухоли, лимфопролиферативные заболевания) эозинофилиями.
2. Впервые показано, что критериями реактивной эозинофилии являются повышенное содержание ЕСР (<15мг/л), низкая интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD33, CD13 и высокая интенсивность флюоресценции CD15 и HLA-DR.
3. Впервые предложены критерии дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий на основе изучения мембраноассоциированных маркеров CD33, CD13, CD15 и HLA-DR и внутриклеточного маркера эозинофилов (ЕСР).
Практическая значимость работы
Определение уровня растворимых белков эозинофилов и выявление разной интенсивности флюоресценции маркеров эозинофилов при иммунофенотипировании миелопролиферативных и лимфопролиферативных заболеваний, ассоциированных с эозинофилией, может быть использовано для дифференциальной диагностики и мониторинга различных гиперэозинофильных состояний.
Показано, что диагностическими критериями клональной эозинофилии являются нормальное или пониженное содержание ЕСР, уменьшение интенсивности флюоресценции экспрессии CD 15, HLA-DR и увеличение интенсивности флюоресценции экспрессии CD13 и CD33 на мембране эозинофилов. Для реактивной эозинофилии характерно повышенное содержание ЕСР в сыворотке крови, увеличение интенсивности флюоресценции экспрессии CD15, HLA-DR и снижение интенсивность флюоресценции экспрессии CD 13 и CD33 на эозинофилах.
Основные положения, выносимые на защиту
1. У пациентов с реактивными эозинофилиями определяется повышенная концентрация эозинофильного катионного белка (>15мг/л) в сыворотке крови по сравнению с пациентами с клональными эозинофилиями (<15мг/л), что отражает разную способность эозинофилов к дегрануляции.
2. У пациентов с реактивными эозинофилиями отмечается более высокая интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов (CD 15 и HLA-DR) по сравнению с пациентами с клональными эозинофилиями, что может свидетельствовать о разной степени дифференцировки и стадии созревания эозинофилов при данных состояниях.
3. Интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13 и CD33 у пациентов с клональными эозинофилиями выше, чем у пациентов с реактивными эозинофилиями, что может свидетельствовать о более ранней стадии дифференцировки клеток при клональных эозинофилиях.
4. Исследование антигенной характеристики и измерение интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13, CD33, CD15 и HLA-DR, определение уровня ЕСР позволяют предложить диагностические критерии шперэозинофильных состояний.
Апробация
Основные положения диссертационного исследования были доложены на Российско-Норвежской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2003), научной конференции «Болезнь Ходжкина», (Петрозаводск, 2004), «Актуальные вопросы в гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург,2004), межвузовской конференции Общества молодых ученых СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения» - 2004 и 2005, IV международной научной конференции (Санкт-Петербург, 2004,2005), Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004,2005,2008), Российском Форуме "Актуальные проблемы в педиатрии» (Санкт-Петербург, 2005), на 5-ой международной Парнасовской конференции «Молекулярные механизмы клеточного сигналинга» (Киев,Украина, 2005), I международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток», посвященном памяти P.M. Горбачевой (Санкт-Петербург, 2007), Европейском конгрессе ЕВМТ (Hamburg, Germany, 2006; Gothenburg, Sweden, 2009).
По теме диссертационного исследования были получены гранты Правительства Санкт-Петербурга Фундаментального Естествознания в 2004г., Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов и молодых ученых в 2004, 2005 гг.
Личное участие автора в получении результатов
Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором использованы методы иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии для оценки мембраноассоциированных маркеров эозинофилов и иммунофлюоресцентный метод для выявления внутриклеточного катионного белка эозинофилов и фермента тучных клеток. Оценены фенотип эозинофилов при реактивных и клональных эозинофилиях и содержание концентрации эозинофильного катионного белка и триптазы в сыворотке крови. Предложены критерии для дифференциальной диагностики гиперэозинофшгьных состояний. Выполнена статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований.
Публикации
По теме диссертационного исследования опубликовано 8 работ, в том числе 3 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура н объем диссертации
Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных данных, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 14 таблицами. Список литературы включает 143 источника, из них 35 отечественных и 108 зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 63 пациента с верифицированными онкогематологическими заболеваниями (основная группа), и 26 пациентов с негематологическими заболеваниями: 18 пациентов с бронхиальной астмой и 8 пациентов с солидными опухолями, находившихся на лечении в клиниках СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, НИИ Онкологии им. H.H. Петрова, Ленинградской областной клинической больнице, городских клинических больницах №31 и №17 и Российском НИИ гематологии и трансфузиологии г. Санкт-Петербурга за период с 2004 по 2010 гг (табл. 1).
Таблица 1
Группы обследованных пациентов
Нозологическая форма гемобластозов Количество пациентов, п
Миелопролиферативные заболевания - 20
Хронический эозинофильный лейкоз 1
Острый миелобластный лейкоз 4
Хронический миелоидный лейкоз 6
Гиперэозинофильный синдром 9
Хронические лимфопролиферативные заболевания - 23
Лимфома Ходжкина 13
Неходжкинская лимфома 10
Хроническая РТПХ - 20
Острый лимфобластный лейкоз 12
Острый миелобластный лейкоз 6
Лимфома Ходжкина 2
Бронхиальная астма -18
Аллергическая 12
Смешанная 4
Неаллергическая, инфекционная 2
Солидные опухоли - 8
рак молочной железы 4
карцинома ротоносоглотки 1
карцинома яичников 1
эстеогенная саркома 1
нефробластома 1
б
У пациентов всех групп была установлена эозинофилия периферической крови, с абсолютным содержанием эозинофилов не менее 0,4х109/л, что составляло более 5% от общего числа лейкоцитов.
У всех пациентов была получена периферическая кровь, выделена и забанкирована сыворотка. Сыворотка хранилась при -20С до проведения иммунофлюореецентного анализа.
Иммунофенотипироваиие выполняли методом трехцветной проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, следующих специфичностей: CD45, CD14, HLA-DR, CD15, CD117, CD13, CD33, CD34, CD25, CD23, CD16 (Becton Dickinson, США), коньюгированных с флюорохромами FITC, РЕ, PerCP, АРС. Анализ экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов и учет результатов проведен на проточном цитофлюориметре Partee PAS с помощью программного обеспечения FlowMax, FlowJo. Минимальное количество анализируемых лейкоцитоз составляло не менее 50 тысяч событий.
Метод определения концентрации ЕСР, триптазы. Использован иммунофлюоресцентный метод на анализаторе UniCap 100 (Pharmacia, Швеция). В соответствии с инструкцией производителя аналитическая чувствительность теста для триптазы составила < 1,0 мкг/л, а специфичность (при оценке кросс-реактивности с гепарином) - < 0,01 %. Аналитическая чувствительность теста для ЕСР составила < 2 мкг/л, а специфичность (при оценке перекрестной реакции с эозинофильной пероксидазой) < 0,1 %. В норме в сыворотке крови концентрация триптазы находится в пределах 2—14 мкг/л, а концентрация ЕСР 0-15 мкг/л.
Статистический анализ.
Для хранения и обработки информации о пациентах и проведенных исследованиях была разработана база данных в системе управления базами данных MS Access. Обработка полученных данных была проведена при помощи статистической программы STATIST1CA 6.0 с использованием непараметрических критериев, поскольку выборки не подчинялись нормальному распределению. Для сравнения интенсивности флюоресценции различных маркеров на эозинофилах использован критерий Уилкоксона. Для сравнения относительного содержания клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры CD45, CD 14, HLA-DR, CD 16, CD15, CD117, CD13, CD33, CD34, CD25, CD23 в исследуемых группах использовали такие непараметрические критерии, как двухвыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, U-тест Манна-Уитни, критерия Вальда-Вольфовица. Для описания среднего значения результатов во всех случаях использовали медиану (М), 25 и 75 процентили (Р25-Р75). Для вычисления диагностических коэффициентов клональных и реактивных эозинофилий использовался кластерный анализ. Минимальная информативность признака для включения его в диагностическую таблицу составила 0,5.
Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение абсолютного содержания эозинофилов, концентрации ЕСР и триптазы у больных с клепальными и реактивными эозинофилиями.
Проведено сопоставление абсолютного содержания эозииофилов группы клональных эозинофилий с группой реактивных эозинофилий. При сравнении абсолютного содержания эозинофилов в двух группах - клональной эозинофилии (М=3,1) и в группе реактивной эозинофилии {М=1,2), включающей пациентов с БА, солидными опухолями, хронической РТПХ и лимфопролиферативными заболеваниями, были выявлены достоверные различия (р=0,001). В группе клональной эозинофилии содержание эозинофилов в 3 раза превышало содержание эозинофилов в группе реактивных эозинофилий (рис. 1).
Абсолотнов содержание эозинофилов в гр^чла* (стона/гной и реаетивной эозинофилий
о МеЛап
0 25%-Г5%
1 М1г>Мах
Рис. 1. Сравнение абсолютного содержания эозинофилов групп клональной и реактивной эозинофилии (р=0,001).
Далее проведено сравнение концентраций ЕСР и триптазы в группе с клональными и с реактивными эозинофилиями, а затем в группе реактивных эозинофилий, разделенных по нозологиям: лимфопролиферативные заболевания, группа РТПХ, группа солидных опухолей и группа больных с бронхиальной астмой.
При сравнении концентрации ЕСР в двух основных группах также были выявлены достоверные различия (р=0,01). Содержание эозинофильного катионного белка в группе реактивных эозинофилий (М==26,3) в 2 раза превышало содержание ЕСР в группе клональных эозинофилий (М=11,3) (рис. 2).
Содержание ЕСР в группах при клональной и реактивной
реактивная эоэмнофилия клональная эозинофилия
Рис. 2. Сравнение концентрации ЕСР в группе клональных эозинофилий и в группе реактивных эозинофилий (р=0,03).
При дальнейшей статистической обработке данных группа с реактивными эозинофилиями была разделена на подгруппы по нозологиям -лимфопролиферативные заболевания, бронхиальная астма, солидные опухоли и хроническая РТПХ, Также проведен сравнительный анализ содержания эозинофильного катионного белка подгрупп реактивной эозинофилии с группой клональных эозинофилий.
При сравнении концентрации ЕСР в группах лимфопролиферативных заболеваний (реактивная эозинофилия) и миелопролиферативных заболеваний (клональная эозинофилия) были выявлены достоверные различия (р=0,01). Содержание эозинофильного катионного белка в группе лимфопролиферативных заболеваний (М=33,5) в 3 раза превышало содержание ЕСР в группе миелопролиферативных заболеваний (М=11,3), несмотря на то, что абсолютное содержание эозинофилов в группе с клональными эозинофилиями выше, чем в группе реактивных эозинофилий (рис. 3).
Содержание ЕСР в группе лимфопролифорапивных и миелопролиферативных заболеваний
120 ---.—;-
100
40
Лимфолролиферативные
Миелолролиферэтганые
0 МесЫал □ 25%-75%
1 МггьМах
Рис. 3. Сравнение концентрации ЕСР в группе лимфопролиферативных заболеваний и группе миелопролиферативных заболеваний (р=0,01).
При сравнении концентрации ЕСР в группах бронхиальной астмы (реактивная эозинофилия) и миелопролиферативных заболеваний (клональная эозинофилия) также были выявлены достоверные различия (р=0,02). Содержание эозинофильного катионного белка в группе бронхиальной астмы (М=25,5) превышало содержание ЕСР в группе миелопролиферативных заболеваний (М=11,3) (рис. 4).
При сравнении концентрации ЕСР в группах хронической РТПХ (реактивная эозинофилия) и миелопролиферативных заболеваний (клональная эозинофилия) были также выявлены достоверные различия (р=0,03). Содержание эозинофильного катионного белка в группе хронической РТПХ (М=30,5) превышало содержание ЕСР в группе миелопролиферативных заболеваний (М=11,3) (рис. 5).
Содержат« ЕСР а группе бронхиальная астма и миелолролифератаных заболеваний
Миепопро/иферагивные
□ М«Гип
□ 23%-Г5% -11 МИ-Мах
Рис. 4. Сравнение концентрации ЕСР в группе бронхиальной астмы и в группе миелопролиферативных заболеваний (р=0,01).
Сравнения концентрации ЕСР группы хронической РТПХ и ми*лолролиф»ратмвмьп заболеваний
200 i-.---
180 ieo
140
120
lm и
ВО 60 40
20 О
Рис. 5. Сравнение концентрации ЕСР в группе хронической РТПХ и в группе миелопролиферативных заболеваний (р=0,03).
При сравнении концентрации триптазы в исследуемых группах не было выявлено достоверных различий, несмотря на то, что максимальная концентрация триптазы наблюдалась в группе хр. РТПХ и составила 24 мкг/л, что в два раза превышает норму.
При сравнении концентрации триптазы в двух основных группах (клональные и реактивные эозинофилии) ие были выявлены достоверные различия. Содержание триптазы в группе реактивных эозинофилий и в группе клональных эозинофилий составило 6 мкг/л (М=6).
Таким образом, суммируя представленные выше результаты о содержании внутриклеточного белка эозинофилов, можно сделать вывод о различии в способности к дегрануляции эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях. В группе реактивных эозинофилий концентрация ЕСР в несколько раз выше, чем в группе клональных эозинофилий, что может свидетельствовать о сохранности и активации зрелых эозинофилов, способных к дегрануляции.
Следующим этапом исследования стало изучение интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях.
Исследования интенсивности флюоресценции
мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных
и реактивных эозинофилиях.
Интенсивности флюоресценции изучаемых маркеров определялась во всех пробах с отрицательным изотопическим контролем в условных единицах по осям FL-1 (меченных FITC), FL-2 (соответствующих флюоресценции моноклональных антител, меченных РЕ и по оси FL-3, FL-4 (соответствующих флюоресценции моноклональных антител, меченных РегСР и АРС).
Был проведен сравнительный анализ интенсивности флюоресценции миелоидных антигенов CD14, CD15; панмиелоидных антигенов CD 13 и CD33,
Median □ 25%-75%
Т Utn.Uav
линейно неограниченных антигенов HLA-DR, антигена стволовых клеток CD34 на популяциях эозинофилов и нейтрофилов и панлейкоцитарного антигена CD45.
Выделение популяции эозинофилов и нейтрофилов осуществляли с помощью наложения логического ограничения CD45/SSC, CD16/SSC.
При сопоставлении значений средней интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров эозинофилов у пациентов с клональными эозинофилиями и реактивными эозинофилиями была выявлена достоверная разница в интенсивности флюоресценции экспрессии следующих маркеров (табл. 2, рис. 6).
В таблице приведены значения средней интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров на популяциях эозинофилов в группах клональных и реактивных эозинофилий. Достоверно более высокая интенсивность флюоресценции экспрессии CD45 была выявлена на эозинофилах в группе реактивных эозинофилий по сравнению с эозинофилами клональной группы (р<0,001). Более высокая интенсивность флюоресценции экспрессии CD33 была выявлена на эозинофилах группы клональных эозинофилий по сравнению с эозинофилами реактивных эозинофилий (р<0,01). Достоверно более высокая интенсивность флюоресценции экспрессии CD15, CD13, HLA-DR была выявлена на эозинофилах группы реактивных эозинофилий по сравнению с эозинофилами клональной группы (р<0,02).
При сравнении ИФ CD45 в группах реактивной эозинофилии и клональной эозинофилии были выявлены достоверные различия (р<0,001). ИФ CD45 в группе реактивной эозинофлии (М=330,2) превышало ИФ CD45 в группе клональных эозинофилий (М=190,9) (рис.6).
Эти данные могут свидетельствовать о том, что эозинофилы являются частью опухолевого клона, который характеризуется сниженной экспрессией панлейкоцитарного антигена CD45. Снижение интенсивности флюоресценции CD45 на бластных клетках также регистрировалось при острых лейкозах.
Таблица 2
Уровень интенсивности флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров на эозинофилах (усл.ед.) при клональных и реактивных эозинофилиях
CD антиген Клональпая Реактивная
CD45 190,9(130-310)* 330,2 (290-480)
CD13 160,7(120-240)* 260,1 (201-285)
CD15 121 (85-138)* 158(120-182)
CD33 81 (41-122)* 24(16-59)
HLA-DR 92 (56-120)* 121 (103-177)
Примечание: *- достоверность различий при р<0,05 по критерию Уилкоксона.
Данные представлены в виде медианы, Р25-Р75.
При сравнении ИФ СО 13 в группах реактивной эозинофилии и клональной эозинофилии были выявлены достоверные различия (р=0,02). ИФ С013 в группе
12
реактивных эозинофлий (М=260,1) превышало ИФ CD 13 в группе клональных эозинофилий (М=160,7) (рис.7).
Интенсивность флюоресценции С СИ 5 при клональньх и реактивных эозимофмлиях
| 350
I
§ 300 £
\ 250
Е 200
□ Mflcflan
□ 25V7S% X Min-Ma*
Рис. 6. Сравнение ИФ CD45 в группе реактивной эозинофлии (М=330) с группой клональных эозинофилий (М=191). (р<0,001).
Интенсивность флюоресценции CD13 при кл опальных и реа»тивных эоэинофилиях
п Median О 25%-75% X MirvMax
Рис. 7. Сравнение ИФ CD13 в труппе реактивных эозинофлий (М=260) с группой клональных эозинофилий (М=161). (р=0,02).
При сравнении ИФ CD 15 в группах реактивных эозинофилий и клональных эозинофилий были выявлены достоверные различия (р=0,02). ИФ CD 15 в группе реактивных эозинофлий (М=158) превышало ИФ CD15 в группе клональных эозинофилий (М=121) (рис. 8).
5
1 160
о МеШап О 25%-75%
Рис. 8. Сравнение ИФ СП 15 эозинофилий (М=121). (р—0,02).
группе реактивных эозинофлий (М=158) с группой клональных
При сравнении ИФ С1333 в группах реактивных эозинофилий и клональных эозинофилий были выявлены достоверные различия (р=0,01). ИФ СОЗЗ в группе реактивных эозинофлий (М=24) в 3 раза ниже ИФ СЭЗЗ в группе клональных эозинофилий (М=81) (рис. 9).
Интенсивность флюоресценции СОЗЗ пр* клональных и реактивных эозинофитмях
Рис. 9. Сравнение ИФ СРЗЗ в группе реактивных эозинофлий (М=24) с группой клональных эозинофилий (М=81). (р=0,01).
При сравнении ИФ ПЬД-БЯ в группах реактивных эозинофилий и клональных эозинофилий были выявлены достоверные различия (р=0,01). ИФ НЬА-ПЯ в группе клональных эозинофлий (М=121) ниже ИФ НЬА-БЯ в группе реактивных эозинофилий (М=25) (рис. 10).
й 120 &
с МжИэп О 25%-75% IX М|о^ах
Рис, 10. Сравнение ИФ ПЬЛ-ЕЖ в группе реактивных эозкнофлий (М=121) с труппой клональных эозинофилий (М=92). (р-0,05).
Таким образом, нами было показано, что у пациентов с реактивными заболеваниями отмечалась более высокая интенсивность флюоресценции эспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов (СВ15 и НЬА-ОЯ) по сравнению с пациентами с клепальными эозинофилиями, что свидетельствует о разной степени дифференцировки и стадии созревания эозинофилов. Интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов СО 13 и СОЗЗ у пациентов с клональными эозинофилиями выше, чем у пациентов с реактивными эозинофилиями, что свидетельствует о более ранней стадии дифференцировки клеток при клональных эозинофилиях.
Критерии дифференциальной диагностики реактивных и клональных
эозинофилий.
Основываясь на наших экспериментальных данных о взаимоотношениях между внутриклеточными маркерами тучных клеток и эозинофилов и мембраноассоциированными маркерами эозинофилов, мы попытались создать критерии для дифференциальной диагностики реактивных и клональных эозинофилий.
Кластерный математический анализ выявил следующие иммунофенотипические признаки и пороги их значений, позволяющие отнести каждый конкретный случай эозинофилии либо к реактивной либо к клональной (табл. 3):
Таблица 3
Итоговая информативность лабораторных показателей для диагностики _кяональных и реактивных эозинофилий_
Признак Информативность
Эозинофилы 1
ЕСР 0.6
HLA-DR 0,65
CD15 1,29
CD33 3,02
CD13 0.7
Были получены диагностические индексы (по Е. В. Гублеру), использовалась формула Бейса для объединенных диагностических коэффициентов (ДК). Проведен подсчет диагностического коэффициента и информативности для диагностически значимых (по результатам кластерного анализа) показателей: концентрация эозинофильного катионного белка, абсолютного содержания эозинофилов и относительному содержанию эозинофилов, экспрессирующих
мембраноассоциированные маркеры CD13, CD33, CD15, HLA-DR. По результатам была построена диагностическая таблица (табл. 3).
Оказалось, что наибольшим диагностическим значением обладают: экспрессия CD33, и CD15. Относительное содержание эозинофилов, экспрессирующих этот маркер, составило более 20% для клональных эозинофилиях, менее 20% для реактивных эозинофилий, ДК=(+8), информативность равна 1,3. Относительное содержание эозинофилов; экспрессирующих CD15, составило до 80% для клональных эозинофилий, более 80% для реактивных эозинофилий, ДК= (+4), информативность равна 3.
Также высокой диагностической ценностью обладают экспрессия CD 13 и HLA-DR. Относительное содержание эозинофилов, экспрессирующих CD 13 составило менее 90% для клональных эозинофилий, более 90% для реактивных эозинофилий, ДК=(+4), информативность равна 0,7. Относительное содержание эозинофилов, экспрессирующих HLA-DR составило более 30% для клональных эозинофилий, менее 30% для реактивных эозинофилий, ДК=(+4), информативность равна 0,65. Равновысокой диагностической ценностью обладали и внутриклеточный белок эозинофилов и абсолютное содержание эозинофилов. Содержание ЕСР составило менее 14мг/л для клональных эозинофилий, более 15мг/л для реактивных эозинофилий, ДК=(+3), информативность 0,6. Абсолютное содержание эозинофилов составило более 5х109/л для клональных эозинофилий, менее 5х109/л для реактивных эозинофилий, ДК=(+3), информативность 1. Наибольшей диагностической значимостью обладает комбинация этих признаков, ДК=(+8), информативность 3. Порог точности метода составил 96,2%.
Таким образом, нам удалось выявить устойчивые сочетания отдельных показателей иммунофенотипяческой характеристики эозинофилов и их внутриклеточного белка, находящихся в тесной взаимосвязи и отражающих, вероятно, морфофункциональные характеристики клеток при различных гиперэозинофильных состояниях.
Анализ полученных данных позволил предложить диагностические критерии эозинофилии и дать им подробную математическую характеристику. Выявленные диагностические критерии могут быть использованы для оптимизации возможностей дифференциальной диагностики эозинофильных состояний.
Проведение дифференциально-диагностического анализа становится более глубоким, если учитывать не только процент клеток, экспрессирующих тот или иной антиген, но и интенсивность экспрессии мембраноассоциированных антигенов. В настоящее время клиническое значение интенсивности флюоресценции экспрессии диагностических лейкозных маркеров интенсивно изучается с точки зрения возможности их потенциального использования либо для повышения точности диагностики лейкозов, либо для получения более глубокой информации о биологической сущности бластных клеток, что могло бы оказаться полезным для прогнозирования исхода заболевания. Диагностические возможности показателя ИФ отдельных маркеров, экспрессирующихся на клетках, позволят существенно повысить эффективность иммунофенотипического анализа гемобластозов в сложных для диагностики случаях.
Вывод об универсальности предложенных критериев базируется на том, чго их информативность не зависит от других признаков. Полученные нами данные о иммунофенотипическом профиле эозинофилов и о содержании внутриклеточного белка эозинофилов в сыворотке крови позволили подойти к созданию дополнительных диагностических критериев эозинофильных состояний.
ВЫВОДЫ
1. Комплексный анализ внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов показал достоверное различие изучаемых параметров при клональных и реактивных эозинофилиях, что может отражать различные морфофункциональные характеристики клеток при разных шперэозинофильных состояниях.
2. У пациентов с реактивными эозинофилиями содержание ЕСР в сыворотке крови выше(>15мг/л), чем у пациентов с клональными эозинофилиями. Содержание триптазы в сыворотке крови достоверно не отличалось у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
3. У пациентов с клональными эозинофилиями определялось: достоверное снижение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих CD15 антиген (<80%), его интенсивности флюоресценции (< 121 усл.ед); достоверное снижение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих CD 13 антиген (<90%), его интенсивности флюоресценции (<160,7усл.ед); достоверное увеличение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих HLA-DR антиген (>30%), его интенсивности флюоресценции (>92усл.ед); достоверное увеличение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих CD33 (>20%), его интенсивности флюоресценции (>81 усл.ед).
4. Диагностическими критериями клональных эозинофилии является комбинация признаков: увеличение абсолютного содержания эозинофилов периферической крови (>5х109/л), снижение концентрации ЕСР в сыворотке крови (<15 мг/л),
17
уменьшение количества эозинофилов, экспрессирующих CD 15 (< 80%), CD 13 (< 90%), повышение процента эозинофилов, экспрессирующих CD33 (> 20%) и HLA-DR (>30%). ДК=(+8), информативность более 3,0 при пороге точности метода 96,2%.
5.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Комплексная оценка эозинофилов, экспрессирующих
мембраноассоциированные антигены CD33, CD13, CD15, HLA-DR методом проточной цитометрии в сочетании с измерением концентрации внутриклеточного белка эозинофилов в сыворотке крови и значения абсолютного содержания эозинофилов периферической крови может быть использована для оптимизации дифференциальной диагностики клональных эозинофилий у больных с гемобластозами.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Комарова, Л.С. Опыт определения триптазы и эозинофильного катионного белка у пациентов с эозинофилией различного происхождения / Л.С. Комарова, Е.Б. Зуева, Н.Б.Михайлова, Н.А.Буравцова, И.И.Нестерович, А.А.Тотолян, Б.В.Афанасьев // Медицинская иммунология. - 2004. - Т.6, №3-5. - С.353.
2. Комарова, Л.С. Опыт определения эозинофильного катионного белка у пациентов с эозинофилией при болезни Ходжкина и других лимфопролиферативных заболеваниях / Л.С.Комарова, Е.Е.Зуева, А.В.Куртова, Н.Б.Михайлова, Н.А.Буравцова, И.И.Нестерович, А.А.Тотолян, Б.В. Афанасьев // Материалы 111 научно-практической конференции с международным участием "Болезнь Ходжкина". - Петрозаводск. - 2004. - С.32-33.
3. Комарова, Л.С. Определение триптазы и эозинофильного катионного белка у пациентов с эозинофилией различного происхождения / Л.С.Комарова // Санкт-Петербургские научные чтения - б-я международная научно-практическая конференция. - Санкт-Петербург. - 2004. - С.46.
4. Komarova, L. Determination of eosinophil cationic protein and tryptase in patients with eosinophilia with lymphoproliferative and myeloproliferative disorders / L.Komarova, Ye.Zueva, I.Nesterovich, A.Kurtova, N.Buravzova, N.Mikhaylova, A.Totolian, B.Afanasyev // Украшьский CioxiMiHHHlf журнал. - 2005. - Vol.77, №2.-P.192.
5. Комарова, Л.С. Роль внутриклеточных белков эозинофилов и тучных клеток при различных заболеваниях с эозинофилией / Л.С.Комарова, Е.Е.Зуева, И.И.Нестерович, Н.Б.Михайлова, А.А.Тотолян, Б.В. Афанасьев // Российский иммунологический журнал. - 2007. - Т.10, №1. - С.27-33.
6. Комарова, Л.С. Роль эозинофильного катионного белка и триптазы при миелопролиферативных и лимфопролиферативных заболеваниях / Л.С.Комарова, Н.Б.Михайяова, И.И.Нестерович, Е.Е.Зуева, Б.В.Афанасьев, A.A. Тотолян // Мед Иммунол. - 2008. - Т.10, №4-5. - С.26-30.
7. Комарова, Л.С. Определение эозинофильного катионного белка и триптазы при реакции трансплантат против хозяина и гематологических опухолях с эозинофилией / Л.С. Комарова, Н.Б.Михайлова, A.A.Тотолян, Б.В.Афанасьев // Онкогематология. - 2008. - №4. - С.361-370.
8. Komarova, L. Intracellular markers of eosinophils and mast cells in patients with chronic graft-versus-host disease associated with high-grade eosinophilia / L.Komarova, N.Mikhaylova, B.Afanasyev // Bone Marrow Transplantation. - 2009. - Vol.43:l.- P. S138.
Подписано в печать « 22 » декабря 2010 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Уст. печ.л. 1,3. Тираж 100 экз.
Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.
Оглавление диссертации Комарова, Людмила Сергеевна :: 2010 :: Санкт-Петербург
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Иммунопатогенез миелопролиферативных и лимфопролиферативных заболеваний, протекающих с эозинофилией.
1.2. Морфология и функции эозинофилов.
1.3. Эозинофилия. Типы эозинофилий.
1.41 Заболевания, ассоциированные с эозинофилией.21;
1.5. Вторичная или реактивная эозинофилия*.
1.6. Первичная или югональная эозинофилия.
1.7. Антигенная, экспрессия при миелоидной и лимфоидной дифференцировке.
Гранулоцитарная дифференцировка.
1.8. Информативность метода иммунофенотипирования.1.
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. Г. Пациенты.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Проточная цитометрия. Анализ изображения. Получение и представление данных.
2.2.2. Пробоподготовка.
2.2.3. Оценка результатов.
2.2.4. Представление данных.
2.2.5. Исследования интенсивности флюоресценции.
2.2.6. Анализ антигенной экспрессии.
2.2.7. Метод определения ЕСР, триптазы.
2.2.8. Принцип метода.
2.3. Статистический анализ.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1 Определение абсолютного содержания эозинофилов, концентрации ЕСР и триптазы у больных с клональными и реактивными эозинофилиями
3.2 Исследование интенсивности флюоресценции эозинофилов.
3.3 Иммунологическиие критерии дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий.
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Комарова, Людмила Сергеевна, автореферат
Актуальность темы
Злокачественные заболевания крови —. одна из важнейших проблем современной биологии и медицины. Особое место среди них занимают гемобластозы, . сопровождающиеся выраженной эозинофилией в периферической крови [37]. Увеличение числа эозинофилов может влиять на клинические проявления, течение и прогноз гемобластозов. Механизмы развития эозинофилии при различных патологических процессах весьма неоднозначны при этом подходы к дифференциальной диагностике и лечению гиперзозинофильных состояний остаются недостаточно изученными [115]. Клональные эозинофилии включают гиперэозинофильный' синдром, идиопатическую эозинофилию, миелопролиферативные заболевания, протекающие с гиперэозинофилией. В то же время большие диагностические трудности могут представлять реактивные эозинофилии, возникающие при цитокиновой активации эозинофилов и их предшественников при различных аутоиммунных, инфекционных и опухолевых заболеваниях [133].
Принципиально новые подходы к диагностике и лечению заболеваний, протекающих с гиперэозинофилией, могут быть оптимизированы на основе изучения клеточных и молекулярных механизмов их возникновения и развития. В литературе нет данных о комплексном анализе.внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях.
Исследование цитотоксических белков эозинофилов, химических медиаторов тучных клеток и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональной и реактивных эозинофилиях может внести определенный вклад в изучение патогенетических механизмов развития эозинофилий и способствовать определению новых диагностических 6 критериев гиперэозинофильных состояний. Эти положения определили цель и задачи-исследования.
Цель исследования:
Изучить содержание внутриклеточных маркеров и особенности экспрессии мембраноассоциированных антигенов эозинофилов с целью оптимизации- дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий.
Задачиисследования:
1. Определить содержание растворимых маркеров эозинофилов и тучных клеток (эозинофильный катионный белок, триптаза) в сыворотке крови у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
2. Изучить особенности экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD 13, CD15, CD33, HLA-DRy пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
3. Провести исследование интенсивности флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13, CD15, CD33, HLA-DR у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
4. Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики клональных и реактивных эозинофилий-.
Научная новизна:
1. Впервые проведено, комплексное исследование мембраноассоциированных CD13, CD33, CD15, HLA-DR и внутриклеточных маркеров эозинофилов (ЕСР) у пациентов с клональными (миелопролиферативные заболевания, гиперэозинофильный синдром) и реактивными эозинофилиями (БА, РТПХ, солидные опухоли, лимфопролиферативные заболевания).
2. Впервые показано, что критериями реактивной эозинофилии являются повышенное содержание EGP (<15мг/л), низкая^ интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD33, CD 13 и высокая интенсивность флюоресценции CD 15 и HEA-JDR1
3. Впервые предложены критерии дифференциальной диагностики; клональных и реактивных эозинофилий на основе изучения мембраноассоциированных маркеров GD33, CD13, CD15 и bILA-DR и внутриклеточного маркераэозинофилов ЕСР.
Практическая ценность проведенного исследования:
Определение уровня- растворимых белков, эозинофилов и выявление разной интенсивности флюоресценции маркеров эозинофилов при иммунофенотипировании миелопролиферативных и лимфопролиферативных заболеваний, ассоциированных с эозинофилией, может быть использовано для дифференциальной диагностики и мониторинга различных гиперэозинофильных состояний.
Показано, что диагностическими'критериями клональной эозинофилии являются нормальное или пониженное содержание ЕСР в сыворотке крови, уменьшение интенсивности флюоресценции экспрессии, CD15, HLA-DR и увеличение интенсивности флюоресценции экспрессии CD13: и CD33 на мембране эозинофилов. Для? реактивной эозинофилии характерно повышенное содержание ЕСР в сыворотке крови, увеличение интенсивности флюоресценции экспрессии CD15, HLA-DR и снижение интенсивности флюоресценции экспрессии CD 13 и CD33 на эозинофилах.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. У пациентов с реактивными эозинофилиями определяется повышенная концентрация эозинофильного катионного белка (>15мг/л) в сыворотке крови по сравнению с пациентами с кпональными эозинофилиями 8
15мг/л), что отражает разную способность эозинофилов к дегрануляции.
2. У пациентов с реактивными эозинофилиями отмечается более высокая интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов (CD 15 и HLA-DR) по сравнению с пациентами с клонапьными эозинофилиями, что может свидетельствовать о разной степени дифференцировки и стадии созревания эозинофилов при данных состояниях.
3. Интенсивность флюоресценции экспрессии мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13 и CD33 у пациентов с клональными эозинофилиями выше, чем у пациентов с реактивными эозинофилиями, что может свидетельствовать о более ранней стадии дифференцировки клеток при клональных эозинофшшях.
4. Исследование антигенной характеристики и измерение интенсивности флюоресценции мембраноассоциированных маркеров эозинофилов CD13, CD33> CD15 и HLA-DR, определение уровня ECF позволяют предложить диагностические критерии пшерэозинофильных состояний.
Заключение диссертационного исследования на тему "Характеристика внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов при клональных и реактивных эозинофилиях"
Выводы
1. Комплексный анализ внутриклеточных и мембраноассоциированных маркеров эозинофилов показал достоверное различие изучаемых параметров при клональных и реактивных эозинофилиях, что может отражать различные морфофункциональные характеристики клеток при разных гиперэозинофильных состояниях.
2. У пациентов с реактивными эозинофилиями содержание ЕСР в сыворотке крови выше (>15мг/л), чем у пациентов с клональными эозинофилиями. Содержание триптазы в сыворотке крови достоверно не отличалось у пациентов с клональными и реактивными эозинофилиями.
3. У пациентов с клональными эозинофилиями определялось: достоверное снижение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих CD15 антиген (<80%), его интенсивности флюоресценции (<121 усл.ед); достоверное снижение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих CD13 антиген (< 90%), его интенсивности флюоресценции (<160,7 усл.ед); достоверное увеличение относительного количества эозинофилов, экспрессирующих HLA-DR антиген (>30%), его интенсивности флюоресценции (> 92 усл.ед); достоверное увеличение относительного количества эозинофилов, эксирессирующих CD33 (>20%), его интенсивности флюоресценции (> 81 усл.ед).
4. Диагностическими, критериями; клоналышх эозинофилий является комбинация: признаков: увеличение абсолютного содержания эозинофилов периферической крови (>5х109/л), снижение концентрации EGP в сыворотке: крови (<15мг/л), уменьшение количества эозинофилов,. экспрессирующих CD 15 (<80%), CD 13 (< 90%), повышение процента эозинофилов, экспрессирующих CD33 (> 20%) и 1-1LA-DR (>30%). ДК=(+8), информативность 3, порог точности . метода составил-;96,2%.
Благодарности:
Автор выражает благодарность за сотрудничество с заведующей' химиотерапевтическим отделением НИИ Онкологии им. Н.Н. Петрова — Вере Ивановне Антипенковой,, заведующей; гематологическим отделением городской клинической больницы № 17 - Альфие Сахабовнс Незамутдимовой, заведующей гематологическим отделением городской^ клинической больницы № 31 — Климович Анне Владимировне; врачам-гематологам первого терапевтического отделения СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, отделения онкогематологии Ленинградской областной клинической больницы, врачам; Института детской гематологии и трансплантологии имени P.M. Горбачёвой, врачам клинико-диагностической лаборатории МАЛО, лаборатории клинической иммунологии и молекулярной диагностики ЦЛД СПбГМУ им.акад.Ш1Павлова.
Практические рекомендации
Комплексная оценка эозинофилов, экспрессирующих мембраноассоциированные антигены CD33, CD13, CD15, HLA-DR методом проточной цитометрии в сочетании с измерением концентрации внутриклеточного белка эозинофилов в сыворотке крови и значения абсолютного содержания эозинофилов периферической крови может быть использована для оптимизации дифференциальной диагностики клональных эозинофилий у больных с гемобластозами.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Комарова, Людмила Сергеевна
1. АнаевЭ.Х. Эозинофилы и эозинофилии // Пульмонология и аллергология. 2002. № 3. С. 15—18.
2. Бережная Н.М., ЧехунВ.Ф., Сепиашвили Р.И. Эозинофилы, базофилы и иммуноглобулин Е в противоопухолевой защите // Аллергология и иммунология. 2005. Т. 6. № 1. С. 38—49.
3. Боровиков В. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере: Для профессионалов. 2-е изд. — СПб.: Питер, 2003. 688с.: ил.
4. Вильчевская Е.В., Тютюнник В.В. Оценка экспрессии CD45 при анализе популяции бластных клеток у детей с острыми лейкозами. Онкология. 2008. Т. 10. №4. С.389-392.
5. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. Т. 1. М:, 2002. 280 с.
6. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. — М.: Практика, 1998.-459с.
7. Гриншпун Г.Д., Виноградова Ю.Е. Эозинофилы и эозинофилии // Терапевт, арх. 1983. № 10. С. 87—90.
8. Гублер Е.В., Генкин A.A. Применение непараментрических методов статистики в медико-биолошческих исследованиях. — JL: Медицина, 1973. -70с.
9. Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М. Эозинофилы и их роль в патогенезе аллергических заболеваний // Рос. вест, пренатологии и педиатрии. 1999. № 5. С. 42—45.
10. Зуева Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов. Medline.ru Т. 4. С. 471-478.1.. Клиническая онкогематология: Руководство для врачей / Под ред. М.А. Волковой. М.: Медицина, 2001. - 576 е.: ил.
11. Лабораторная диагностика России 2004/2005: ежегодный справочник. -СПб.:Человек, 2004. 87с.
12. Методы проточной цнтометрии в медицинских и биологических исследованиях. Сборник научных трудов под редакцией М.П.Потапнева. Минск ГУРНМБ.2003. Мн.; ГУРИМБ, 2003.-136с.:ил.
13. Михайлова Н.Б, Панкратова О., Вавилов В.Н. Успешная аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у больного гиперэозинофильным синдромом. Вопр.гематол., онкол.,иммунопатол. -2003. — Т.2. — С.12-8.
14. Михайлова Н.Б., Афанасьев Б.В. Клональные эозинофилии. Клиническая онкогематология. Т.2.№1.С.1-10.
15. Мокеева P.A., Цветаева Н.В., Семенова Е.А. и др. Патология сердца при идиопатическом пшерэозинофильном синдроме // Терапевт, арх. № 12. 2000. С. 59—62.
16. Озерецковская H.H. Эозинофилия крови и иммуноглобулинемия Е: особенности регуляции при гельминтозах и аллергический болезнях // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 1997. № 2. С. 3—7.
17. Основы иммунологии / Под ред. А. Ройта. М.: Мир, 1991. С. 328.
18. Основы иммунологии / Под ред. A.A. Ярилина. М.: Медицина, 1999. 608 с.
19. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. M.: МедиаСфера, 2003.-312с.
20. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с анг. M.: М.,-2000. - 592с.: ил.
21. Руководство по гематологии: в 3 т. Т.1. Под ред. А.И. Воробьева. 3-е изд., перераб. Идопол. М.: Ньюдиамед: 2002. 280 е.: ил.
22. Румянцев С.А., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. —2003. — Т.2, №4. — С.5-9.
23. Семенкова E.H., Моисеев C.B., Наместникова О.Г. Клинические аспекты гиперэозинофилии // Клинич. медицина. № 2. 2004. С. 28—31.
24. Тотолян АА. Роль хемокинов и их рецепторов в иммуноретуляции // Иммунология. 2001. № 5. С. 7—10.
25. Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Иммунопатологические механизмы воспаления бронхов и легких. // Механизмы воспаления бронхов и легких и противовоспалительная терапия. — СПб:, 1998. —194-298 с.
26. Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Роль изменения иммунной системы в формировании бронхиальной астмы. // Бронхиальная астма: / Под ред. Г.Б. Федосеева. СПб., 1996. - с.54-69.
27. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000.431 с.
28. Хорошко Н.Д., Мокеева P.A., ТуркинаАТ. и др. Гиперэозинофильный вариант РН-положительного хронического миелолейкоза // Терапевт, арх. 1998. № 7. С. 30—36.
29. Чучалип А.Г. Гиперэозинофилия при заболеваниях органов дыхания // Терапевт, арх. 2003. № 3. С. 5—15.
30. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. — М.: Медицина, 1999. — 608 е.: ил. 4714-6.
31. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при:иммунном;ответе // Вестн. РАМН. 1999. № 4. С. 25—29.
32. A first course in statistical methods. Ott Eongnecker Thomson. Duxbury Press; 4th editíom2004. 726 pages.
33. Ackerman S. J., Bochner B. S. Mechanisms of eosinophilia in the pathogenesis of hypereosinophilic: disorders // Immunol Allergy Clin N Am. 2007. — Vol.27. — PI357—375;.
34. Ackerman S. J., Butterfield J. H. Eosinophilia, eosinophil-associated disease,. chronic eosinophil leukemia, and the hypereosinophilic syndromes.// Host
35. Defense and lts Disorders. Chapter 45. 2007. P.763-786.
36. Amini R.-M-, Aaltonèn K., Nevanlinna H:, Carvalho R., Salonen L., Heikkilâ P., Blomqvist C. Mast cells and eosinophils in invasive breast carcinoma //BMC Cancer. 2007. - Vol.7(165). - P.l-5.
37. Andreas R., Grimwade D., Cross N.C.P. Diagnostic and therapeutic management of eosinophilia-associated chronic myeloproliferative disorders // The hematology journal.-2007. -Vol. 92(09).-P.l 153 -1158.
38. Ault P., Cortes J:, Koller C., Kaled E.S., Kantarjian H. Response of idiopathic hypereosinophilic syndrome to treatment with imatinib mesylate. // Leuk. Res.-2002.-Vol. 26(9).-P.881-884. ;•
39. Bandeira-Melo C., Herbst A., Weller P.F. Eotaxins, contributing to the diversity of eosinophil-recruitment and activation // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001: - Vol. 24. - P.653-657.
40. Barnes E.J., Abdel-Rehim M.JVL, Goulis Y. Applications and limitations of blood' eosinophilia for the diagnosis of acute cellular rejection in liver transplantation // Am ^Transplant: 2003. - Vol.3. - P.432.
41. Barnes P J. Differential regulation of human eosinophil* IL3, IL5, and GM-CSF receptor alpha-chain expression by cytokines // J. Immunol. 2003. V. 1. № 5. P. 175.
42. Bochner B.S., Schleimer R.P. Mast cells, basophils, and eosinophils: distinct but overlapping pathways for recruitment. // Immunol. Rev. — 2001. — Vol. 179. -P.5-15.
43. Bochner B.S. Systemic activation of basophils and eosinophils: markers and consequences // J: Allergy Clin. Immunol; 2000. V. 5. № 2. P. 292—302.
44. Boyce J.A. The pathobiology of eosinophilic inflammation. // Allergy Asthma Proc. 1997. - Vol.l8(5). -P.293-300.
45. Brito-Babapulle F. The eosinophilias, including the idiopathic hypereosinophilic syndrome. Review // British Journal of Haematology. 2003. -Vol.121. -P.203-223. •
46. Burgess L.E. Mast cell tiyptase as a target for drug design // Drug News Perspect. — 2000. Vol.l3(3).-P.147-157.
47. Butterfield J.H. Treatment of hypereosinophilic syndromes with prednisolone, hydroxyurea, and interferon // Immunol Allergy Clin N Am. -2007. Vol. 27. - P. 493-518.
48. Butterfield JJH., Weiler D.A., Hunt L.W., Wynn S.R., Roche P.C. Purification of tryptase from a human mast cell line // J. Leukoc. Biol. 1990. — Vol.47(5). — P.409-419.
49. Chang H., Leong K., Koh D., Lee S. Clonality of isolated eosinophils in characteristics of myelodysplastic syndrome with bone marrow eosinophilia or basophilia // Blood. 2003. - Vol.101. - P.3386-90.
50. Cools J., DeAngelo D. J., Gotlib J. et al. A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic target of imatinib in idiopathic hypereosinophilic syndrome // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol.348. P. 1201-14.
51. Douglas I. S., Leff A. R., Sperling A.I. CD41 T-cell and eosinophil adhesion is mediated by specific ICAM-3 ligation and'results in eosinophil activation // The Journal of Immunology. 2000. - Vol. 164. - P.3385-3391.
52. EllyardJ. I., Simson L., Parish C. R. Th2-mediated anti-tumour immunity: friend or foe? // Blackwell Munksgaard. 2007. - Vol.70. - P. 1-11.
53. Elsas X., Elsas M.I. G. Eosinophilopoiesis at the cross-roads of research on development, immunity and' drug discovery // Current Medicinal Chemistry. -2007. -Vol.14.-P.1925-1939.
54. Pauci A. S., Harley J. B., Roberts W. C. et al. The idiopathic hypereosinophilic syndrome. Clinical, pathophysiological, and therapeutic considerations // Ann. Intern. Med. 1982; 97: 78-92.
55. Fletchera S., Bain B. Diagnosis and treatment of hypereosinophilic syndromes. // Current Opinion in Hematology.-2006.-P.l-6.
56. Fletchera S., Bain B. Eosinophilic leukaemia // British Medical Bulletin.-2007.-P.1-13.
57. Flow cytometry in clinical diagnosis. 4th edition. John L. Carey, J. Philip McCoy, David F. Keren. ASCP Press, Chicago, IL, 2007. 739 pages.
58. Flow Cytometry in Hematopathology. Visual Approach to-data analysis and interpretation. Second edition. Doyen. Nquyen, Lawrence Diamond, Raul C. Braylan. Humana press, Totowa, New Jersey, 2007. 344pages.
59. Flow cytometry in neoplastic hematology morphologic-immunophenotypic correlation. Wojciech Gorczyca. Informa healthcare. 2006. 280 pages.
60. Genereau T. Hypereosinophilic reactions in cancer // Rev. Prat. — 2000. — Vol.50.-P.612-5.
61. Giembycz MA., Lindsay M.A. Pharmacology of the Eosinophil // Pharmacological reviews. 1999. - Vol.51, No. 2.-P. 78-85.
62. Glech G. J., Leiferman K. M., Pardanini A. et al. Treatment of hypereosinophilic syndrome with imatinib mesilate // Lancet. — 2002. — Vol.359. -P. 1577-8.
63. Gotlib J. Eosinophilic disorders: Molecular pathogenesis, new classification, and modern therapy I I Best Practice & Research Clinical Haematology. 2006. -Vol. 19(3). — P.535—569.
64. Gotlib J., Cools J:, Malone J.M., Schrier S.L., Gilliland D.G., Coutr S.E. FIP1L1-PDGFRA in hypereosinophilic syndrome. I I Blood. 2003. - Vol.06. -P.l-71.
65. Gurish M.F., Austen K.F. The-Diverse roles of mast cells. // J. Exp. Med. -2001. Vol.l94,No. 1.-P.1-5.
66. Hallgren J., Pejler G. Biology of mast cell tzyptase: an inflammatory mediator//FEBS J. 2006. - Vol.25. -P.234-41.
67. Hara M., Ono K., Hwang M-W., Iwasaki A., Okada M., Nakatani K., Sasayama S., Matsumori A. Evidence for arole of mast cells in the evolution to congestive heart failure // J. Exp. Med. 2002. - Vol.l95.(3). - P.375-381.
68. Hartman M-L., Piliponsky A.M., Temkin V., Levi-Schaffer F. Human peripheral blood eosinophils express stem cell factor//Blood. 2001*. — Vol.97. -P. 1086-1091.
69. Hung K., Hayashi R., Lowenstein C., Pardoll D., Lafond-Walker R., Levitsky H. The central role of CD4 cells in the antitumor immune response // J. Exp. Med. 1998. - Vol. 188(12). -P.2357-2368.
70. Immunophenotyping. Steward C.C., Nicholson J.K.A. Wiley-Liss. A John Wiley and sons, Inc, publication. 2000.429 pages.
71. Ishibashi S., Ohashî Y., Suzuki T. Tumor-associated tissue eosinophilia in human esophageal squamous cell carcinoma // Anticancer Res. 2006. - Vol.26. — P.1419-24
72. Jacobsohn D.A., Schechter T., Seshadri R., Thormann K., Duerst R., Kletzel M. Eosinophillia correlates with the presence or development of chronic graft-versus-host disease in children // Transplantation. 2004. - Vol.77(7). - P.1096-100.
73. Kay A. B. The role of eosinophils in the pathogenesis of asthma // TRENDS in Molecular Medicine. 2005. - Vol. 11(4). - P. 148-52.
74. Keresztes K., Szollosi Z., Simon Z., Tarkanyi I., Nemens Z., Illes A. Retrospective analysis of the prognostic role of tissue eosinophil and mast cells in Hodgkin's Lymphoma // Pathology oncology research. — 2007. Vol.13 (3). -P.237-242.
75. Kita H., Gleich G.J. Eosinophils and IgE receptors: a continuing controversy // Blood. 1997. - Vol.89. - P.3497-3501.
76. Klco J.M., Vij R., Kreisel F.H., Hassan A., Frater J.L. Molecular pathology of myeloproliferative neoplasms // Am J Clin Pathol. 2010. - Vol.133. - P.602-615.
77. Klion A.D., Law M.A., Noel P., Haverty T.P., Nutman T.B., Anti-IL5 treatment of hypereosinophilic syndrome // Blood. — 2003. — Vol.10. — P.3620.
78. Klion A.D., Nutman T.B1 Hypereosinophilic syndrome with elevated serum tryptase is a- syndrome that differs from systemic mast cell disease with eosinophilia // Blood. 2003. - Vol.102, No. 8. - P.3073-3074.
79. Lalani T., Simmons R.K., Ahmed A.R. Biology of IL-5 in health and disease. // Ann. Allergy Asthma*Immunol. 1999. - Vol:82(4). - P.317-332.
80. Ma H.L., Whitters M.J., Jacobson B.A., Donaldson D.D., Collins M., Dunussi-Joannopoulos K. Tumor- cells secreting IL-13 but not IL-13Ralpha2 fusion protein have reduced tumorigenicity in vivo // Int Immunol. 2004. -Vol.16.-P.1009-17.
81. Maurer M., Echtenacher B., Haltner L., Kollias G., Mannel D.N., Langley K.I., Galli SJ. The c-kit ligand, stem cell factor, can enhance innate immunity through effects on mast cells // J. Exp. Med. 1998. - Vol.188, No.12. - P.2343-2348.
82. McNeel D., Rubio M.T., Damaj G. Hypereosinophilia as a presenting sign of acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation // Transplantation. 2002. - Vol.74. - P. 1797.
83. Mierke C.T., Ballmaier M., Werner IX, Manns M.P., Welte K., Bischoff S.C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells // J. Exp. Med. 2000. - Vol.192, No. 6. - P.801-811.
84. Mingomataj E.C. Eosinophil-induced prognosis improvement of solid, tumors could be enabled by their vesicle-mediated barrier permeability induction // Med Hypotheses. -2007. Vol.3. - P.l-3.
85. Nishimura T., Iwakabe K., Sekimoto M. Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (Thl) and Th2 cells in tumor eradication in vivo // J. Exp. Med. -1999. Vol.190. -P.617-27.
86. Ogbodu P., Rosing D., Home M. Cardiovascular manifestations of hypereosinophilic syndrome // Immunol. Allergy Clin. North Am. — 2007. — Vol. 27. P.457—75.
87. Pardanani A., Reeder T., Li C-Y., Tefferi A. Eosinophils are derived from the neoplastic clone in patients with systemic mastocytosis and eosinophilia. // Leukemia Research.-2003.-Vol.23 .-P.883-885.
88. Pulsoni A., Iacobelli S., Bernardi M. M4 acute myeloid leukemia: the role of eosinophilia and cytogenetics in treatment response and survival. The GIMEMA experience // Tlaematologica. 2008. - Vol.93(7). - P.1025-32.
89. Reiter A., Grimwade D:, Cros N.C.P. Diagnostic and therapeutic management of eosinophilia-associated chronic myeloproliferative, disorders //. Haematologica / the hematology journal; 2007. - Vol;92(09). - P. 1153 - 58
90. Ringden O. Immunotherapy by allogeneic stem cell transplantation // Adv Cancer Res. 2007. - Vol.97. - P.25-60.115: Robinson D.S., Kay A.B., Wardlaw A.J. Eosinophils // Clin. Allergy Immunol. 2002. - Vol. 16. - P.43-75.
91. Rosenberg H. P., Phipps S., Foster P.S. Eosinophil trafficking in allergy and asthma // J Allergy Clin Immunol. 2007. - Vol. 119. - P.1303-10.
92. Rosenberg H.E, Ackerman S.J., Tenent D.G. Human eosinophil cationic protein // J1 Exp. Med: 1989. - Vol.170. - P.163-176.
93. Rothenberg M. E. Mechanisms of disease: eosinophilic// N. Engl. J. Med. -1998. Vol.338.-—P.1592-1600.
94. Samoszuk M. Eosinophils and human cancer // Histol. Histopathol. — 1997. — Vol.l2(3). — P.807-812.
95. Sato T., Kobayashiî R., Nakajima M., Iguchi, A., Ariga T. Significance of eosinophilia after stem cell* transplantation as a possible prognostic marker for favorable outcome // Bone Marrow Transplant. 2005. — Vol:36. — P.985.
96. Schwartz R. S. The hypereosinophilic syndrome and the biology of cancer //■ N.Engl. J. Med. 2003: - Vol.348(13). - P:1199-1201.
97. Sclerodermatous chronic graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: incidence, predictors and outcome. Stem Cell Transplantation • Brief Report // Haematologica. 2006. - Vol.91. - P.258-261.
98. Shakoory B., Fitzgerald S.M., Lee S.A., Chi D.S., Krishnaswamy G. The role of human mast cell derived cytokines in eosinophil biology // J Interferon and Cytokine Res. 2004. - Vol. 24. - P.271-281.
99. Sheikh J., Weller P.F. Advances in diagnosis and treatment of eosinophilia // Current Opinion in Hematology. 2009. - Vol. 16 P.3-8.
100. Simon D., Simon H-U. Eosinophilic disorders // J Allergy Clin Immunol.-2007.-P. 1291-1300.
101. Sperr W.R., Hauswirtin A.W., Valent P. Tryptase a novel biochemical marker of acute myeloid leukemia // Leuk. Lymphoma. — 2002. Vol.43(12). -P.2257-2261.
102. Sperr W.R., Jordan J.H., Baghestanian M., Kiener H.P., Samorapoompichit
103. P., Semper H., Hauswirth A., Schernthaner G.H., Chott A., Natter S., Kraft D.,i
104. Valenta R., Schwartz L.B., Geissler K., Lechner K., Valent P. Expression of mast cell tryptase by myeloblasts in a group of patients with acute myeloid leukemia // Blood. 2001. - Vol.98(7). - P.2200-2209.
105. TefFeri A. The history of myeloproliferative disorders: before and after Dameshek // Leukemia. — 2007. — P. 1—11.
106. Tefferi A., Patnaik M.M., Pardanani A. Eosinophilia: secondary, clonal and idiopathic // Blackwell Publishing Ltd, British Journal of Haematology. 2006. -Vol, 133. — P.468—492.
107. Tefferi A., Vardiman J. W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algotryhms // Leukemia. — 2008. — Vol.22. P. 14-22.
108. The Eosinophilias, including the idiopathic hypereosinophilic syndrome.
109. Review// British Journal of Haematology. 2003.-Vol.121.-P. 203-223101
110. Valent P., Samorapoompichit P., Speir W.R., Horny H.P., Lechner K. Myelomastocytic leukemia: myeloid neoplasm characterized by partial differentiation of mast cell-lineage cells // Hematol. J. 2002. - Vol.3(2). - P.90-94.
111. Vandenberghe P., Wlodarska I., Michaux L. et al. Clinical and molecular features of P1P1L1-PDFGRA (+) chronic eosinophilic leukemias // Leukemia. -2004. Vol.18. — P.734-42.
112. Voehringer D., Rooijen N., Locksley R.M. Eosinophils develop in distinct stages and are recruited to peripheral sites by alternatively activated macrophages. // J. Leukoc. Biol. 2007. - Vol. 81. - P.1434—1444.
113. Walz T.M., Nishikawa B.K., Malm C., Wasteson A. Production of transforming growth factor alpha by normal human, blood i eosinophils // Leukemia. 1993. - Vol.7(10). - P. 1531-1537.
114. Wardlaw A J., Moqbel R., Kay A.B. Eosinophils: biology and role in disease // Adv. Immunol. 1995. - Vol.60. -P. 151-266:
115. Wechsler M. E. Pulmonary Eosinophilic Syndromes // Immunol Allergy Clin N Am. 2007. - Vol. 27. - P. 477-^92.
116. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 4th edition Lyon. 2008. 441 pages.