Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Особенности гепаринобусловленных кислородзависимых реакций моноцитов при бактериальном и аутоиммунном воспалении

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НЕДИЦИНСКИИ ЙНСТИГУТ ИМ.С.В.КУРАНЮВА МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОСОИСКОЙ ФЕДЕРАЦШ

На правах рукописи

АРЛЕЕВСКЛЯ МАРИНА ИГОРЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ГЕПАРИНОБУСЛОВЛЕННЫХ КИСЛОРОДЗАВИСИМЫХ РЕАКЦЮ МОНОЦИТОВ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНОМ И АУТОИММУННОМ ВОСПАЛЕНЖ

140016 - патологическая физиология 140003 - внутренние болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань - 1993

Работа »ьагоияека в Казанском государственном институте усовврщенствованйя врачей МЭ РФ.

Научные руководители - доктор медицинских наук,

профессор А.П. Цибулькин, доктор медицинских наук, профессор Я. А. Щербатенко Официальные оппоненты - доктор медицинских наух,

профессор И. Г.Салихов, доктор медицинских наук, профессор Ф. И. Мухутдиноьа

Ведущее учреждение - Российский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится -/А ОЗ 1994 г. в час на заседании специализированного Совета £084.29.03 Казанского государственного медицинского института (420012, г.Казань, ул. Бутлерова, д.493.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института Сул.Бутлерова, д.496).

Автореферат разослан " 1994 г.

Ученый секретарь Совета

дондцдат медицинских наук Р. X. Ахмедзянов

' об!^ая характерисп-зсл 'работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Моноциты - макрофага является вах-геЯипми- участниками любих воспалительных процессов» в т<_'ц гасло бактериальных и аутоиммунных СМаянский А. Н., Маянский I.Н.. 1989). Б зависимости от'природы процесса и особенностей организма эти клетки "широких и разносторонних возыойо-:тей" СМаянский Д. Н. , 19913 выступает преимущественно в ка-:ой-то из своих многочисленных ролей, во- многом определяя управление развития воспалительной реакции.

Существование различий а функционировали',! :клёток "моноцк-'о - «акрофагальной системы '(ММС) при бс'трои бактёрИальйЬи ОБВ) и аутоиммунном воспалении представляется 'законоыерньЙ!. toicuio предраспологенносгл клеток к тому Я ли иному'ответу атолсгичссгсий фактор, эти различия могут быть 'обусловлены арахтером ыодулируьэда воздействий, специфичных "для ъйспЬ.-ителькых процессов различной природы.

В начале ОБВ это прехде всего бактерии и продукты iix гйа-едеятельности, ыодулируюзде активность клеток ММС в оча^е оспаленпя и в крови вследствие возникающей в таких случаях актериеыии (Бело'цккЯ С.М.-. ¿нйетина Т. Й. , 1988, Рочев В: П. соавт.«, Rot A. eL al, 1986). Согласно общепринятый пред-гавлениям, микробные агенты ййляЬтся наиболее мокдиа сти-улятораыи цитотоксической функции фагоцитов (Ofek I., 1989, suth J. et al, 1990, Tarsi-Tsuk D., Levy R., 1990). Актива-ля этой функции настолько характерна для ОБВ, что ее тести-ззанке с помоги^ КСТ-теста предлагалось многими исследова-злями для дифференциальной диагностики бактериального и не-

бактериального воспалительных процессов (Parle В.Н., et al 1368, Segal A.W. ot al. 1S73).

Однако, при сопоставлении результатов, полученных разный авторам!?, можно заметить ряд особенностей. Так, нормализаци КСТ-реакцни фагоцитов в крови происходит значительно позне исчезновения бактерий из сосудистого русла (Горшков М. П. соавт., 1990, Яковлев В. А. и соавт., 1S92). Причем, это за ыаздыаание, благоприятно сказывается на течении процесс (Балтийская Н.В. и соавт., 1991). Представляется интересны и тот факт, что более поздняя нормализация НСТ-реакции фаго цитов обнаруживается преимущественно при постановке теста : присутствии гепарина.

Важнейшими модуляторами активности клеток ММС при аутоии ыунном восцалении, в отличие от ОБВ, являются лимфокины, ¡ также циркулирующие иммунные комплексы С Шилов Е. М. и соавт. 1987, Goronzy J.J. , Veyand C.K, '1990, JClngsley G. et al 1990). Для первых характерно отсроченное действие на клетки вторые не способны адекватно стимулировать клеточные функции, в том числе цитотоксическую (Маянский Д.Н., 1S91).

Возможно, именно характер модулирующих воздействий явля' ется причиной особого состояния клеток ММС при аутоиммунны: процессах, результаты исследования которого нередко заводя1 в тупик. Так, при сопоставлении данных разных авторов обнаруживается явное противоречие: исследователи» изучавшие моноциты крови, приходят к выводу о неполноценности практически всех их функций, в том числе цитотоксической, тогда Kai результаты исследования макрофагов очага воспаления свиде-

тельствуст об избыточности тех асе функций - главного условия поддержания воспалительного процесса (Абрамова Т. Я. и соавт. , 1991, Fuji! Let al, 1990, Goronzy J, J., Yfeyand C.M.. 1990, Muryoi Tai, Sasaki Takeshi, 1989).

Сведения о продукции оксидантов моноцлтаии крози при аутоиммунных ревматических заболеваниях также противоречивы. Однако» мы обратили внимание на некуп закономерность: избыточная секреция радикалов кислорода обнаружена авторами, использовавшими при постановке тестов гепарин в физиологических концентрациях ССалихбаева У.С. и соавт., 1990, Baechner R. L. „ 1974» Carapos И. Е. et al„ 1974). В остальных случаях эта функция клеток оказывалась подавленной л ли сравнимой -с нормальной (Демин А. А. , Дробышева В. П., 1984. Михеенко Т. В. и соавт, 1988, Fujii I et al., 1990).

Таким образом, анализ литературы позволил предпслогать, что, во-первых, существувт различия в секреции оксидантов клетками ММС при ОБЗ и аутоиммунном воспалении, а такзсе на разных стадиях ОБВ; во-вторых, секреция оксидантов фагоцитами зависит от присутствия некоторых факторов, в частности гепарина, и эта зависимость ыогет быть причиной противоречивых выводов разных авторов, исследовавших эту функцмо клеток при аутоиммунном воспалении. о

Проверка этих предположений представляет практический интерес. Известно, что одинаковые для аутоиммунных и бактериальных процессов клинические и лабораторные признаки воспалена» обуславливают необходимость дифференциальной диагностики этих заболеваний. Учитывая ключевую роль клеток KMC з

развитии воспаления и их относительную доступность для ис следования, возможные различия в состоянии этих клеток при воспалительных процессах разной природы могли бп стать основой для дифференциально - диагностических тестов.

Изучение наметившихся закономерностей позволяет выяснить некоторые механизмы развития аутоиммунного воспаления и ОБВ.

ЦЕПЬ РАБОТЫ - изучение особенностей функционирования клеток ММС в условиях острого бактериального и аутоиммунного воспалительных процессов с целью выявления возможных различий в функциональной активности этих клеток и выработки на этой основе тестов для дифференциальной диагностики указанных типов воспаления.

Основные задачи исследования: . - исследовать состояние кислородного метаболизма клеток ММС у больных с аутоиммунными ревматическими, заболеваниями -ревматоидным артритом CPA), системной красной волчанкой (СКВ), системной склеродермией (ССД);

- оценить ведущие механизмы активации кисяородзаьисимой цитотоксической функции клеток ММС и интенсивность секреции им оксидантов в зависимости от степени активности аутоиммун-нрго процесса;

- исследовать состояние кислородного метаболизма клето> ММС в динамике у больных с ОБВ;

- провести сравнительный анализ полученных результатов пс обоим типам воспаления с целью создания методов дифференциальной диагностики ОБВ и аутоиммунного процесса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Научной новизной обладает обнару-

жение качественных различий в состоянии кислородного метаболизма активированных циркулирующих клеток ММС при ОБВ к пре-активированных циркулирующих моноцитов при аутоиммунном воспалении.

Продемонстрирована роль лимфокинов в преактивации кислородного метаболизма моноцитов циркуляторного русла при аутоиммунном воспалении.

Обнаружена причина противоречивости данных разных авторов, исследовавших кислородзависимув цитотохсичность фагоцитов при аутоиммунном воспалении, и уточнен смысл полученных ими результатов.

Впервые исследовались механизмы воздействия гепарина на кяслородэависиыую цитотокскческую функцию клеток ММС. Обнаружено качественное различие в воздействии гепарина на кислородный метаболизм активированных микробами и примированных лимфокинаыи моноцитов. Полученные результаты позволяют предположить существование еще одного механизма регуляции гомео-стаза этим протеогликаном.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Предложен метод выявления примированных яимфокинами моноцитов, основанный на специфическом воздействии гепарина на изменившийся в результате примирова-ния кислородный метаболизм этих клеток. о

На основании полученных результатов разработаны лабораторные тесты для дифференциальной диагностики ОБВ и аутоиммунного воспаления, а также для диагностики активности РА.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОаИЫЕ НА ЗАЩИТУ - Разная чувствительность клеток ММС к гепарину при ауто-

иммунном воспалении и ОБВ отражает качественные различия состоянии их кислородного метаболизма при двух типах воспа лительного процесса. -

- Соотношение показателей секреции оксидантов моноцитам в присутствии гепарина и в его отсутствие отражает соотноше ние уровней примирувдих и разрешающих стимулов в микроокру хении клеток.

- Избыточная гепаринзависимая НСТ-реакция моноцитов ; больных РА связана с повышением содержания в крови примирую щих факторов, в частности, лимфокинов.

- Исследование гепаринзависимой НСТ-реакции моноцитов мо жет служить для диагностики активности РА. Определение соот ношения показателей гепаринзависиыого и безгепаринового НОТ-теста моноцитов капиллярной крови может применяться для дифференциальной диагностики СКВ и РА, с одной стороны, и ОБ] на ранних его сроках, с другой.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Предложенные лабораторные тесты для дифференциальной диагностики аутоиммунного (СКВ, РА) и бактериального воспалительных процессов и для диагностики активности РА использу-цтся в практической работе в терапевтической клинике V 1 ШУВа, а также в малой предприятии по внедрение медицински: технологий "Полимед" для обследования больных по направлениям кз поликлиник и стационаров г. Казани.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс нг циклах тематического усовершенствования "Лабораторные метод* клинической иммунологии" в Казанском ГИДУВе.

По материалам работы опубликовано 8 печатных работ. Получено авторское свидетельство № 1788468 на "Тест для дифференциальной диагностики системной красной волчанки и острого бактериального воспаления".

Основные положения диссертации доложены на Республиканских конференциях молодых ученых (1987, 1989 гг.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, изложения клинической характеристики больных, методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 171 странице, призедеио 6 рисунков, 16 таблиц.

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ Клиническая характеристика больных

В работе проанализирован клинический материал и оценено состояние клеток ММС у 198 больных, в том числе у 102 пациентов с РА, 31-е СКВ, 10-е ССД, 45-е ОБВ, 10-е ДОА, а такхе у 34 здоровых людей.

Состояния моноцитов, характерные для аутоиммунного воспаления и ОБВ, воспроизводились на клетках доноров путем воздействия на них стимулов, специфичных для изучавшихся типов воспалительных процессов.

Методы исследования

Материалом служила цельная капиллярная или венозная кровь.

1 из которой в зависимости от„1Щлей исследования получали взвеси лейкоцитов или моноцитов.

Взвесь лейкоцитов получали 'лз стабилизированной венозной крови, 'из которой после отстаивания в термостате при 37°С в

течение 40 мин и центрифугирования при 1500 оборотах/им в течение 10 мин удаляли плазму и собирали лейкоциты. Клетки отмывали в 0,1 М фосфатном буфере на физиологическом растворе от гуморальных факторов крови (Меньшиков В. В. < 1987).

В других сериях исследования проводились на взвесях моноцитов. которые выделяли в градиенте плотности фикслла-веро-графина (Фримель Г.. 1987J с последующим удалением прилипавших клеток после часовой инкубации взвеси мононуклеаров в термостате при 37°С.

Синовиальная жидкость у больных РА забиралась по обычной методике (Астапенко М. Г., Павлов В.П.. 1S73).

В ряде экспериментов моноциты премировали, инкубируя их с рекомбинантным ИЛ-2 в течение 3 часов при 37°С, после чего ставился HCT-тест и определялись остальные показатели.

Для стимуляции клеток использовалась также взвесь Staph, aureus, убитых прогреванием на водяной бане и опсонизирован-кых аутосывороткаыи. Инкубация клеток с микробами происходи-, ла в процессе постановки НСТ-теста или перед измерением люминесценции пиридиннуклеотидов и флавопротеинов.

Ккслородзависимая цитотоксическая функция моноцитов и не! трофилов крови и макрофагов синовиальной жидкости исследовалась с помощью НСТ-теста. Тест ставился по методу Park В.Н. и соавт. в кодификации Виксмана Ы.Е. и Маянского А.Н. (Маян ский А. Н.. Виксман М. Е., 1979) в двух вариантах: (а) на ста билизированной 3,8%-ным раствором цитрата натрия цельной кр ви, на взвеси отмытых от гуморальных факторов клетках крови или на .цельной синовиальной жидкости без добавления антикоа

гуяянтов; Cd) с инкубацией клеток с раствором гепарина в конечной концентрации 10 ед/мл з процесс® постановки тоста.

Доли мокоцитоз с преобладающим красным свечением вследствие? повышенного содержания РНК опрзделаям по распространенной методике с помощью микроскопа "Лсмам-Ю" при просмотре препаратов, предварительно проинкубированных з растворе акридинового оранжевого в цитратно-фосфатном буфере £1:300003 в течение 10 мин при 18е- 20°С (Карнаухова H.A.„ 19913.

Исследовали также люминесценцию фяавспротеинов и пиридин-нуклеотидос в моноцитах крови по методу Славинского ' А. А. (Сяавинский А.А., 1989) после предварительной 30-минутной инкубации во влажной камере при 37°С предметных стекол со вззесьс клеток и опссиизированиыш микробами али 0,1 М фосфата™ буфером на физиологичсскс^ рзстворе э присутствии гепарина или без него.

Визуальные наблюдения и фотометрия клеток проводились с помощью шпсроскопа - цнтофлвориыетра "Люмаы-ИЗ" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1.

Некоторыэ показатели иммунограммы определялись следующими методами СМеньшиков В.В.„ 19873:

титр РФ в крови - реакцией агглютинации сенсибилизированных кроличьим иммуноглобулином эритроцитов барана (ДРф); содержание ЦИК в крови - осаждением полиэтиленгликолем; урезень хокплемента - по 50%-ному гемолизу нагруженных антителами эритроцитов барана.

Статистическая обработка донных проводилась следующими методами. Свечение пиридиннуклеотидов и флавопротеинов в 20

моноцитах каждой взвеси. Далее сравнивались попарно препараты клеток контрольной и опытной групп, полученные в процессс одного эксперимента. Сравнение пар препаратов проводилось пс критерию Вилкоксона. Для определения различий между группам в целом полученные таким образом результаты обрабатывали п< критерию знаков.

В остальных случаях для статистической обработки данньс применялись двухвыборочный и одковыборочный критерии Стъю дента, критерий Вилкоксона, а также критерий знаков, прово дился корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТ« ИССЛЕДОВАНИИ При исследовании секреции оксидантов клетками ММС сосуди стого русла в присутствии ч в отсутствие гепарина при ОБВ аутоиммунном воспалении обнаружились следующие закономерное ти Срис.1). При ОБВ секреция оксидантов мононуклеарныш фа гоцитами была избыточной по сравнение с нормой как в гепа ринзависимом, так и в безгепариновом варианте НСТ-теста. Пр аутоиммунных заболеваниях в безгепариновок тесте количеств НСТ-положительных моноцитов было близко к таковому у доне ров; избыточная же по сравнению с нормой активность этих кт, ток выявлялась только после контакта с протеогликаноы.

Сопоставление часто взаимоисклвчающих результатов иссле дований разных авторов, посвященных данной проблеме, подтвг дило наше предположение о том, что обнаруженная при аутои» куннои воспалении зависимость результатов исследования кис дородзависимоЯ цнтотоксической функции моноцитов от гепарш ре случайна. Исследователи, работавшие с отмытыми от гепар!

- и -

Рисунок 3.. Рга.чичЕЛ глхглатолеЯ НСТ-реахвдк lio.'vO'i'-'TCS цз.чыгоз ярозя НСТ_2Мяозз!Т8П>к!яг хягток) при г.утсюогуЕ™/: реакатяческкя заболеваниях к СБВ

доноры (1) ЛОА (2) ЭБВ СЗ) PA C4I СКВ (5) ССЯ (6)

Услоенш с-5сс;:а':с:г.!л: Я " показатели беэгепариноаого варианта 1ЮТ-теста; gä - показателя гепаринзавкскмого тестг. Отмечены лншь достоверна раэлзчзя ые*ду показателями (по двухвмборочному хрвтергэ Стгп-дента): « - р ( 0„05-0,01;. я» - р < 0,002.

на фагоцитами или стабилизировавшие кровь другими актикоагу-лянтами, кгх правило, приходили к выводу, что секреция огсси-дантов клетками при данной патологии близка к таховоЯ а норме (Демин A.A. . Дрсбыяева В. П., 1984, Мяхеенко Т. В.- к соавт, 1988, Fuji! I et al.. 1990). Если хе тесты ставились з присутствии гепарина в концентрациях, близких к физиологическим (10 ед/мл), количество фагоцитов, продуцировавших оксиданты0 в крози больных РА и СКВ. было избыточным (Салихбаева У. С. и Ъоавт., 1990, Baechner R. L., 1974, Caapos М. Е. et al, 1974).

- 12 -

В отличие от авторов указанных работ, игнорировавших зависимость результатов НСТ-теста от гепарина или считавших ее сугубо лабораторным феноменом, мы предположили, что в основе обнаруженных закономерностей лежит взаимодействие гепарина либо с гуморальные факторами крови, специфичными для аутоиммунного воспалекия, либо с моноцитами, состояние которых в конечном итоге обусловлено модулирующим эффектом этих факторов.

На следующем этапе моноциты доноров обрабатывали аутосы-воротками, либо сыворотками больных РА, моноциты этих боль-, ных - также аутосыворотками. либо сыворотками доноров. Результаты НСТ-теста показали, что увеличение секреции оксидан-тов в присутствии гепарина происходит вследствие его взаимо- -действия с клетками, но не с гуморальными факторами крови. Эти выводы подтверждены данными, полученными при постановке гепаринзависимой НСТ-реакции в бессывороточной среде (рис.2).

Кроме того мы предположили, что различная чувствительность клеток ММС при остром бактериальном и аутоиммунном воспалительных процессах может явиться следствием существования исходных различий в их функциональной активности. Это предположение было подтверждено в ходе дальнейших исследований. Действительно, моноциты больных РА по некоторым параметрам отличались от мононуклеарных фагоцитов больных с 05В и клеток доноров Срис.З).

Эти клетки отличались высоким уровнем РНК и увеличенной активностью флавопротеинсодержаших ферментов. В то же время в них не происходило значительной активации ферментов, содер-

жащих пиридиннуклеотиды. Моноциты больных РА не секретирова-ли радикалы кислорода» яо были способны в большей степени, чек клетки доноров» начать их секрецию при дополнительном воздействии гепарином. Причем, стимулируя синтез оксидантов» протеогликан одновременно оказывал другие эффекты на моноциты больных РА - в его присутствии ингибировалась активность флавопротеинсодержащих и стимулировалась работа пиридиннук-леотидсодержащих ферментов.

Рисунок 2. Гепаринзависимая спонтанная НСТ-реакция моноцитов (% НСТ-положительных клеток} больных РА и доноров при перекрестной обработке сыворотками и а бессывороточном варианте

моноциты донора бессызороточная среда моноциты донора + сыворотка донора моноциты донора сыворотка больного

п - 14 14,93 1Р'> С +0,64 —|р"< 0,001!-—-п = 15 '. ' 27,33 1Р'> £ ±2,64 п = 37 ),05| 16>5? |р-> ±0,67 ■—¡Р"< 0,0011-- п = 36 ).05| 2д>56 |р> ±1,23 п = 31 °'051 16,42 ±0,84 — |р"< 0,001}— п = 34 °'05' 25,38 ±1,45

ионоциты больного + бессывороточная среда моноциты больного сыворотка больного моноциты больного + сыворотка Д&нора

Условные обозначения: р'- достоверность различий при обработке данных по одновыборочному критерию Стыздента; р"- достоверность различий при обработке данных по двухвыборочному критерии Стъвдента.

Рисунок 3. Показатели кислородного метаболизма и содержание РНК в моноцитах Зольных РА, ОБВ и доноров

""Пока-" эатели

группы

ДОНОРЫ

О Б В

(все случаи)

I

неделя О

Б-

В II

неделя

НСТ-полохительнке моноциты С/Л

безгепа-ривовый тест

п = 11 12,34 +1.15 р<0,

—р>0.05-п = 13 14,31 +0,41 р<0,

-р<0,010-п = 12 29,08 +4,68 р<0,

гепарин-ЗаВИСИМЫЙ тест

п = 16

36,40

+2,38

001

-р<0,С01-п = 11 24,00 +2,44

01

-*><0,001-п = 12 43,57 +3.23

025

п~="7 36,71 +6,43 Р>0, рд<0,002

-р<0,010-п = 5 18,40 +3,39

р<0,005

П = 7 50,43 +0,81

05 рд<0,002

-р>0,050-П = 5 34,20 +1,74

рд<0,006

1£

,<0.001

¿оля С/О клеток, богатых рнк

п = 16

56,37

+4,68

-р<0,001-г. = 14 29,78 +2.85

-р>0,050-п = 12 41,33 ±5,46

п = 7 34,14 +6,59

-р>0,050— п = 5 49,80 +8,50

рд<0,001

Окисленные пиридиннуклеотиды

исходный эффект уровень гепарина

п = 35

п = 24

р<0,05

-р>0,41-

п = 30

р<0,001 п

-р<0,001 п = 31

= 15

р>0,07

п = 24 да

' р>0 р_<0,002

п = 15

•V

20

п = 7

п = 5 „в

рл<о.8г

>0,20

Окисленные флавопротеины

исходный уровень

п = 35

эффект гепарина

п «= 24

р<0,003 -р<0.001'

р<о,оог

п = 30

I

-р<0,03-П = 31

Г! = 15

^р<0,005 ^

п = 24

Iе

рд<0д

<0

п = 15

Г

п = 7

04

р<0 05 Рп>0.50 I

п = 5

Г

По сравнение с показателями доноров.

Условные обозначения:^ ^ - повышение или понижение содержания окисленных форм пиридиннуклеотидов и флавопротеинов в клетках; « отсутствие изменений этих показателей, =з их исходный уровень; р - достоверность различив с показателями группы доноров.

Рисунок 4. Показзтеяи кислородного ыетабо/газма и содержание РНК в интактных, приыирозанных ИЛ-2 и активированных михрсхЗаии моноцитах доноров и большое РА

Показатели

Ноно- \ циты доноров

Премированные ИЛ-2

Интахтные

Активированные шжробама

ин-такт-ные

б

H о О к H ь

О к_

Ц ы акти-И s виро-Т вал.

и р

i Ю1КРО

А бши

НСТ-положительные моноциты С/О

йезгепариновый тест

гепарин-зависимый тест

я = 13 16,00 ±1.11 р<0,

-р>0,10-п = 13 14,31 ±0,41 р<0,

-p<o,oos'

п = 6 41,50 ±5,69 р<0.

-I.

п = 13 35,46 ±2,23 001

-р<0,001-П = 13 22,23 ±0,75 0С1

-р<0,001-п = 8 60,50 ±2,82 005

п = 149 7,79Т ±0,27

р<0,001

p<0,00l' п = 26 23.5ST ±2,23

р<0,001

п = 181

25,24т

±0,58

-р<0.001-п = 26 46.27Г ±2,16

ДоляС'/О клеток, богатых РНК

р<0,001 п - 14 29,78 ±2,85

Окисленные пкридиннуклеотиды

Окисленные флавопротеинь!

исходный уровень

п = 12

56,17

±5,57

п = 19

зффект гепарина

исходный уровень

п = 19

р<0.001 -р>0,40-'

эффект гепарина

п = 30

п = 19 t

р<0,00 -р<0,023

<0,007

-р<0,05-п = 17

t Результаты НСТ-теста мояоцитоз доноров ж больних РА, представленные в даякоЯ таблице не сопоставимы, так как условия постановка теста были различными.

Условные о&оначения: ^ | - повышение или понижение содержания окисленных фор« пиридиннухлеотидов я флавопротоинов в клеткахо % отсутствие изменений зтих показателей, == их исходный уровень; Я - отсутствие данных.

В отличие от моноцитов больных РА (рис.3), мононухлеарные фагоциты сосудистого русла больных ОБВ секретировали оксидан-ты без дополнителы:ого воздействий гепарином. В них была повышена, вероятно, максимально, активность пиридиннуклеотидсо-держащих ферментов, что подтверждалось отсутствием добавочного влияния гепарина на этот показатель. Активность флавопро-теинсодерхааих ферментов была снижена, а содержание РНК оказалось близким к таковому у доноров.

Таким образом, исследования активности внутриклеточных ферментов, имевших отношение к кислородному метаболизму, т.е. к синтезу оксидантов и митохондриальному дыхание, а также определение доли моноцитов, богатых РНК. - косвенного свидетельства активации синтеза белков и митохондриального дыхания (Лениндхер А.. 1985) - выявили различия в исходном состо-, янии клеток ММС при двух типах воспалительных процессов. Кроме того, оказалось, что стимулируя синтез оксидантов, гепарш одновременно модулирует активность указанных ферментов, причем, его эффект на клетки различен при аутоиммунном воспалении и ОБВ.

Углубленное исследование НСТ-реакции клеток ММС при ОБВ и аутоиммунных ревматических заболеваниях показало, что связи показателей безгепаринового и гепаринэависимого вариантов теста с другими параметрами процесса, в том числе с некоторыми гуморальными факторами крови, при каждом типе воспаления различны. Можно было предположить, что особенности влияния гепарина на клетки обусловлены особенностями модуляции их состояния стимулами, содержащимися в клеточном микроокру-

гении.

В то же время, оказалось, что характерные черты НСТ-реак-ции клеток МУС крови прк ОБВ к. РА Сссютко-леняя показателей гепарикзависимого и безгепаринового тестов> не являются абсолютно специфичными для бактериального и аутоиммунного воспалительных процессов. В очаге резматоиднога воспаления секреция оксидантов макрофагами была избыточной независимо от их контакта с гепарином. В гепариновом тесте доля НСГГ-полохи-тельных клеток составила 33,25+2,06%, в отсутствие гепарина -24,75+1,85%, что в 3,96 раза превышало аналогичный показатель для моноцитов крови у больных РА. Таким образом, соотношение показателей НСТ-теста соответствовало таковому для клеток ЖС крови при ОБВ. Тот же тип реакции мы получили, стимулируя моноциты сосудистого русла больных РА микробной ззвесью (рис.4). В последнем случае соответствующим образом изменилась и активность пиридиннукеотид- и флавопротеинсодер-жащих ферментов - состояние клеток стало напоминать состояние мононуклеарных фагоцитов больных ОБВ (рис.4).

Эти факты, а также закономерности изменения НСТ-реакции моноцитов крози при положительной динамике ОБВ (снижение показателей безгепаринового теста при неизменно повышенных результатах гепаринзависимой реакции) позволили сделать«вывод, что обнаруженные нами различия в состоянии клеток ММС и особенности влияния на них гепарина обусловлены соотношением гримирующих и активирующих стимулов в клеточном микроокружении. Этот вывод вполне согласуется с общепринятыми представлениями; согласно которым соотношения указанных стимулов при

аутоиммунных ревматических заболеваниях и ОБВ различны. В первом случае важнейшими факторами, модулирующими активность клеток сосудистого русла, является лимбокины, в то время, как наиболее вероятные разрешающие стимулы - циркулирующие иммунные комплексы - не способны адекватно стимулировать клеточные функции, в тем числе цитотоксическую (Маянский Д.Н., 1991, Полтырев A.C., 1S90, Салохин К.В.и соавт, 1993, Кгое-mer G., Wick G., 1989). При ОБВ основными модуляторами состояния фагоцитов в сосудистом русле являются мощные разрешающие факторы - бактерии, быстро и эффективно активирующие их кислородзависимую цитотоксическую функцию СВоеводина Т. В. и соавт., 1990, Горшков М.П. и соавт. , 1990).

Таким образом, выявленные нами особенности в Состоянии клеток ММС при остром бактериальном и аутоиммунном воспалительных процессах могли быть обусловлены модуляцией их активности указанными стимулами. Мы проверили это предположение, исследовав динамику всех изучавшихся нами показателей при стимуляции моноцитов доноров ИЛ-2 и микробной взвесью. Состояние клеток, примированных Ш1-2, полностью соответствовало таковому у больных РА Срис.4). В том числе воспроизвелись характерные эффекты гепарина. Состояние моноцитов доноров при стимуляции их микробами также в основном соответствовало таковому яри ОБВ (рис.4).

Следовательно, можно сделать вывод, что в крови больных ОБВ содержится избыточное количество кононузелеарных фагоцитов, активированных микробами или продуктами их жизнедеятельности. Эти клетки, интенсивно секретирующие оксиданты в со-

- 19' -

судистом русле без дополнительных воздействий» иохно обнаружить как в безгепариновом, так и а гепаринзависимом варианте НСТ-теста,

В крови больных РА повышено, количество моноцитов, прими-рованкых лкмфокинами. Спонтанная секреция ими цитотоксичес-ких факторов соответствует1 таковой: у доноров, но при дополнительном воздействии гепарином клетки: начинает секретиро-зать оксиданты в избыточных по сравнению с нормой количествах. Для обнаружения их возросшего в, результате примирования цитотоксического потенциала требуется: постановка гепарянза-висимого' НСТ-теста-.

Результаты, исследований' имеют определенное практическое значение-. Выявленные нами особенности НСТ-реакцки клеток ММ? крови- при аутоиммунном воспалении и ОБВ стали основанием для разработки: теста для дифференциальной диагностики указанных процессов^. Предложенный: тест оказался, высокоинформатизным и конкурирует по специфичности- с- наиболее ценными методами, применяемыми: для диагностики-, этих групп заболеваний. Так, его. специфичность для аутоиммунного воспаления равна 96%, ДЛЯ: 0БВ; - 977..1Х.

Исследование гепаринзавиекмой' НСТ-реахции моноцитов цельной крови: оказал осн. высокоинформативным в. диагностик© активности- РА'. Чувствительность метода: вз выявлении активности про' цесса составила. 84.7%,. что- превышает соответствующие показатели, рассчитанные для общепринятых-: лабораторных методов.

Дополнительное воздействие гепарином;в процессе исследования кислородзавискмой цитотохсической: функции моноцитов

также можно использовать в практике для выявления примир< ванных клеток.

выводы

1. Особенности действия гепарина на клетки ММС кр< (5ольных с аутоиммунным и острым бактериальным воспалителы ми процессами обусловлены исходными различиями в состоя] их кислородного метаболизма.

' 2. Для моноцитов крови больных с аутоиммунным воспален!

, CPA) характерны:

1 - повьшеная по сравнению с кормой активность флавопро' кнсодержащих ферментов;

- отсутствие значительного изменения активности ферм* тов, содержащих пиридиннуклеотиды; ■

- отсутствие, спонтанной секреции избыточного количес оксидантов в сосудистом русле;

- реализация избыточного по сравнении с нормой кислор зависимого цитотоксического потенциала при дополните, ном воздействии гепарином.

3. Состояние кислородного метаболизма, характерное , моноцитов больных РА, полностью воспроизводится примирова

; ем моноцитов доноров ИЯ-2, что указывает на избыточное со, хате примированных лимфокинами клеток ММС в сосудистом р; ле при этой патологии.

4. Для мононуклеарных фагоцитов сосудистого русла боль с острым бактериальным воспалением характерны:

- 21 -

- спиленная по сравнению с нормой активность флавопроте инсодержащих ферментов;

»

- избыточная активность ферментов, содержащих пиридиннук-леотиды;

- избыточная спонтанная секреция окскдантоз в сосудистом русле, выявление которой in vitro не требует дополнительного воздействия на клетки гепарина.

5. Состояние кислородного метаболизма, характерное для мононуклеарных фагоцитоз сосудистого русла больных с острым бактериальным воспалением, в основном воспроизводится при стимуляции моноцитов доноров взвесью опсониэированных микробов, что свидетельствует о ведущей их роли в качестве разрешающего стимула при данной патологии.

6. Стимулирующее влияние гепарина на продукцию оксидантов моноцитами больных РА может, быть связано с его эффекта;«, приводящими в конечном итоге к активации пиридиннуклеотидсо-деркаоих ферментов, а также с ингибированием активности ферментов, содержащих флавопротеины.

7. Стимулирующее влияние гепарина на мононухлеарные фагоциты больных с острым бактериальным воспалением преимущественно обусловлено ингибированием активности флавопротеинсо-дерхащих ферментов. 0

8. Характер модулирующего воздействия гепарина на активность флавопротеин- и -пиридиннуклеотидсодержащих ферментов в клетках ММС, в той или иней степени приводящего к активации их кислородзависимой цитотоксической функции, зависит от соотношения уровней иримирующих и разрешающих стимулов в кле-

точном микроокружении и не является специфичным для аутоим ыунного или бактериального воспаления.

9. Определение соотношения показателей гепаринзависимог и безгепаринового НСТ-теста моноцитов капиллярной крови мо жет применяться для дифференциальной диагностики аутоиммун ного и острого бактериального воспалительных процессов.

10. Включение гепаринзависимой НСТ-реакции моноцитов кро ви в общепринятый комплехс методов определения степени акти ности РА значительно повышает степень соответствия указанн го комплекса выраженности артрита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации!

1. Авторское свидетельство № 1788468 "Тест для дифференци альной диагностики системной красной волчанки и острого бак териального воспаления". /Арлеевская И. И., Тихонов 0.Е., Ци булькин А. П. Заявлено 25.09.90, решение 15.09.92.

2. Арлеевская М. И., Эиккевич 0. Д., Воронина И. Е. Функциональ ное состояние нейтрофилов и моноцитов при ревматоидном арт рите /'/Казанский мед. ж. - 1987. ~ № 5. - С. 362-364.

3. Арлеевская М. И. Тест восстановления нитроскнего тетразо лия СНСТ) в дифференциальной диагностике заболеваний соеди нительной ткани. //Тезисы докл. Республиканской конференцн молодых ученых. - Казань, 1987. - С. 54.

4. Арлеевская М. И. К вопросу о механизме гепаринзавлсимс НСТ-реакции моноцитов при ревматоидном артрите //Тезисы док ладов конференции молодых ученых. - Казань, 1989. - С. 76-77 3. Цибулькин -А. П., Арлеевская М. И. , Еербатенко Л. А. Опреде

-взлете гепаринзависнмой активности моноцитов в лабораторной диагностике активности ревматоидного артрита. //Ла6. дело. -1991. - № 8. - С. 57-59.

6» Цибуяькин А. П. , Арлеевская М. И. Положительная гепаринза-висимая НСТ-реакция моноцитов при аутоиммунных процессах: что она отражает? //Нижегородский мед. ж. - 1992. - № 1. - С. 56-58.

7. Цибуяькин А.П.» Арлеевская М. И. Возможность применения гепарина для определения дота преахтивированных моноцитов при аутоиммунных заболеваниях ревматического круга. //Тезисы докл. I съезда иммунологов России. - Новосибирск, 1992. С. 521-523.

B, Цибулькин А. П., Арлеевская М. И. Состояние моноцитов периферической крови при бактериальном и аутоиммунном воспалении. //Казанский кед. ж. - 1992. - У 3. - С. 178-181.

9о Арлеевская М. И., Слабпов Р. Д., Цибулькин А. П. Функциональная активность клеток ММС периферической крови у больных ревматоидным артритом. //Материалы VI научно-практической конференции членсЕ диагностической медицинской ассоциации "Опыт деятельности диагностических центров". - Омск, 1903.. -

C. 6-7.