Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Особенности антиоксидантных механизмов предотвращения функционально-метаболических нарушений митохондриальных структур при повреждающих воздействиях

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНСКОЙ ССР

ЛЬВОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

МАРТЫНЮК Вера Богдановна

УДК 511-018.1:612.015.3

ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСЩШШЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ЬЕТАВОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ аИТОХОНДРИАЛШЫХ СТРУКТУР ПРИ ПОВРЕЖДАЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

14.00.17 - нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЬВОВ - 1990

Работа выполнена во Львовском ордена Дружбы народов государственном медицинском институте

Научные руководители: заслуженный деятель науки УССР, доктор медицинских наук, профессор Е.Н.ЛАНАСЮЯ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.Ф.ШМОЧКО

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Я.й.ГОНСКИЙ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Е.А.ГОЙДА

Ведущая организация: Институт, физиологии АН УССР им.А.А.Богомольца

Защита диссертации состоится " 2й" О^КС^бр-.к^ 1990 г. в / Я часов на заседании специагширойшнога обвета К 088.21.02 , во Львовском ордена Дружбы народов государственном медицинском институте /г.Львов, ул. Пекарская, 69/.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Львовского медицинского института /г.Львов, ул. 17-го Вересня, 6/.

Автореферат разослан "2г " НОШЭр-лг^ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

А.Д.ЛУЦИК

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время общеизвестно, что. з формировании адаптации организма к изменяющимся условиям внешней среды важнейшую -роль играет активация и перестройка энергетического оомена на всех уровнях его организации /Ф.З.Меерсон, 1981; Л.Е.Панин, 1983; D.Xekagi et ai., 1987/. Одним из существенных и быстродействующ::: компонентов этого процесса служит модуляция терниналъных стадий знергопродукцин, локализованных в митохондриях /М.Н.Кондрашова и др., 1987; В.И.Кулинский, 1986; a.ii.Sc-nton, J.G.McCorissck, 1985/. 7становлено, что поврегдение этих органелл приводит к нарушениям энергообеспечения адаптационной реакции а способствуем ее переходу в патологический процесс /Б.й.Лв, 1956; Л, femenil et el., 198 2; I.Wiswedel et al., 1988/.

Известно, что в реализации наспепифаческого коврэадаммго эффекта стрессорных я патогенных воздействий решающее значение принадлежит чрезмерной активации перекисного окисления лшшдов /ПОЛ/ биомембрая /Ю.А.Владимиров, 1985; В.Е.Каган, 1981; B.Halii-nell, J.H.C.Gutteridge, 1986/. В частности, при действии на ор-ганизы многих токсических соединений в тканях развивается состояние так называемого окислительного стресса, ■характеризующееся смещением редокс-раиаовесия внутриклеточной среда и повыаениеи уровня липопероксидации / S.iíicaadei et el., 1988; I.F.Slater, 1984/. При этом активация ПОЛ затрагивает также митохондриальные мембраны, вызывая дискоординадию и угнетение функционирования органелл /А.С.Сейланов и др., 1984; C.Ceco¿i et al., I988;H.2fe-гаЬвуазл! et al., 1982/. В зтих условиях основой формирования адаптационной реакции, а также преимущественным объектом повреж-дащего действия оказывается ткань печени вследствие концентрации в ней детоксикациошшх систем организма /А.Ф.Блюгер и др., 1981; К.Г.Карагбзян и др., 1990; K.n±oolas, B.de&miff, 1987/.

Несмотря на то, что необходим звеном адаптационного процесса является мобилизация ан т к окислительной системы организма, ее мощность не всегда оказывается достаточной для регуляции активированного ПОЛ и противодействия перекисноыу повреяденив тканей /Ф.З.Меерсон, И.Г.Ппенникова, 1988; В.С.Соколовский, 1988/. Поэтому все более широкое лечебное и профилактическое применение находят различные препараты с противоокислительными свойствами /М.Ф.Виноградов, 1989; Л.В.Голубеза и др., 1989; М.М.Тарских

и др., 1Э87; G.Pasooe et al., 1587/. Однако влияние регуляции перекисных процессов экзогенными антиоксидантами на метаболическое состояние тканей, в частности, на митохондриальную энерго-продукцив изучено недостаточно, что и определяет актуальность нашего исследования.

Лвлъ работы. Изучить регуляцию перекисного окисления липи-дов митохондриальных мембран антиоксидантами и ее роль в поддержании структурно-метаболического состояния органелл при повреждающих воздействиях, сопровождаемых активацией ПОЛ.

Основные задачи исследования:

1. Изучение роли наруиений ПОЛ в структурно-функциональном повреждении изолированных митохондрий печени этиловым спиртом.

2. Сравнительное изучение влияния включения природного ан-тиоксиданта «^-токоферола и синтетического - ионола в аитохонд-риалъные мембраны на перекисные процессы и функциональное состояние органелл при их повреждении этанолом in vitro.

3. Изучение особенностей-влияния ы. -токоферола и ионола на функционирование митохондрий печени при введении антиоксидазтов интактным животным с нормальной витаминной обеспеченностью.

4-. Изучение роли ранних нарушений перекисного, энергетического и кальциевого гомеостаза митохондрий в поражении печени солянокислым гидразином.

5. Сравнительное изучение влияния предварительного введения животным ос-токоферола и ионола на индуцированные гидразином структурно-метаболические нарушения митохондрий в начальный период интоксикации.

. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Природный антиоксидант ос -токоферол, обладающий не только противоокислительным, но и мембрансстабилизирущищи действием, оказывает защитное влияние на митохондриальную энергопродукцию при реализуемом посредством различных механизмов перекискоц повреждении тканей.

2. Синтетический антиоксидант ионол не способен оказывать защитное действие на энергетические процессы в митохондриях печени при его включении в мембраны органелл вследствие вызываемых этим соединением структурных нарушений, оказывающих неблагоприятное влияние на состояние метаболических процессов.

3. Влияние антиоксиданхов на стабильность биомемСрая наряду

с их прстивоокислительныии свойствами вносит решающий вклад в

суммарную эффективность эле препаратов в условиях активации ПОЛ.

4. Определенна влияния антиоксидантов на уровень ПОЛ недостаточно для оценки их загцитного эффекта при перекиснем повреаде-нии тканей. Для этого наобхсдимо также изучение действия препаратов на состояние метаболических процессов, лежагщх в основе формирования адаптационной реакции организма.

Научная новизна работы.

Впервые проведено комплексное сравнительное изучение действия природного антиоксиданта с^-токоферола и синтетического - полола на состояние перекисных, энергетических и регудяторных процессов в митохондриях при повреждающих влияниях, опосредованных эндо- и экзогенной индукцией повышения ¡101 в мембранах органелл. Установлено решавдее значение мембранотропного действия ангаокси-дантов для их эффективности в условиях активации ПОЛ.

Проведено сравнительное изучение эффективности протквоокис-ли тельного действия антиоксидантов при. их введении кивотнш и включении в мембраны изолированных органелл. Доказано, что ш vitro еонол оказывает белее выраженное антиокислительное влияние, однако при введении в организм эффективность ©¿-токоферола значительно вше благодаря регуляции зго поступления в биомембраны и способности нормализовать цембраво'связагшые метаболические процессы.

Проведен- сравнительное изучение роли активированного ПОЛ ъ структурао-£уккциональиом повреждении митохондрий под влиянием этилового спирта in vitro и при гидразинсвой интоксикации животных. Установлено значение непосредственного проокевданхного влияния и структурных нарушений мембран органелл для активации ПОЛ в митохондриях. Показано, что начальный период гидразиаозой интоксикация ллвотн.их связан с поражением митохондрий печени. Обнаружена индуцированная гидразином энергонезависимая стимуляция переноса кальция в митохондриях печени. Выявлена более высокая чувствительность окислительного фосфорилирозания и транспорта Са , обеспечиваемых сукцинатом, к повышению уровня ПОЛ и структурным нарушениям цитохондриальных мембран по сравнении с НАДН-зависимыми процессами.

Теоретическая и практическая значимость.'

Расширены теоретические представления о роли нарушений стационарности ПОЛ в поражении тканей и о значении регуляции липо-переокисления в поддернанаи энергообеспечения компенсаторных и адаптационных процессов при действии на организм повреждавада: факторов. Выявленные особенности влияния природного и синтетического антиоксидантов на перекисные процессы и функционалыоа состояние митохондрий печени позволяют разработать более дифференцированный подход к использованию этих препаратов как факторов стабилизации клеточных мембран и коррекции направленности метаболических процессов. Обнаруженный защитный эффект ос-гоко-ферола может быть полонен в основу его профилактического применения при работе с гидразином в промышленных условиях и назначения этого антиоксиданта совместно с лекарственным препаратами -производными гидразина - для предупрзкдения их побочного действия. Разработанный метод определения антиокислительной активности мсает быть использован в экспериментальных исследованиях и клинической практике.

Апробация работа. Основные положения диссертационной работы доложены и обсукдены на научных конференциях ЦНИЛ ЛоДНШ /19831530/, конференциях молодых ученых и специалистов-медиков ' . ЛоДНГШ /1984-1986/, III съезде Республиканского научного общества врачей-лаборантов /Ужгород, 1983/, XII съезде Украинского физиологического общества им. И.П.Павлова /Львов,'1986/, У1 Всесоюзной конференции по окислению органических веществ в жидкой фазе "Окисление-вб" /Львов, 1986/, У'П Билатеральном сикпо-зиуме СССР-ЧССР "Современные аспекты теоретической и прикладной гастроэнтерологии: экзо-, эндоэкология и желудочно-кишечный тракт" /Укхород, 1989/.

Пубдикадии.По теме диссертации опубликовано 12 работ, получено авторское свидетельство об изобретении и 2 свидетельства о рационализаторских предлокенйях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов собственных исследований /3 главы/, заключения, выводов и списка цитируемой литературы /22? отечественных и -223

наостренных источника/. Работа содержит 23 таблицы и 21 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на беспородных белых крысах-самцах массой 0,18-0,20 кг. Митохондрии печени выделяли иетодон дифференциального центрифугирования /М.Н.Коадрашова, Е.Е.Григоренко, 1985; с.ш^еъооа, 1955/. Для изучения действия ангаокскдантов на изолированные иитохондраи суспензию органелл /50 иг болна/ыл/ инкубировали б течение 10 икнут в присутствии растворов <*-токоферода и повода в 50;ь-ном этиловом спирте, что создает условия для быстрого включения исследуемых соединений в иембраиы /£.Сиет1ег1 е*

, 1373; ^ «1.. 1980/. Конечные концентрации ан~

тиокскдантов составляли 0,5; 5 и 50 мкМ. Отдельную порцию органелл обрабатывали атанолоц для индукции яовреддеяия митохшдркальных кембрав. По окончанию инкубации оргазеллы промывались средой выделения для исключения непосредственного влияния добавок на ход последующих определений*

йселедуеше антиоксидавты вводились жнвотныы одЕОкрайю вну-трибрюшинно в зиде касляного раствора в дозе 50 шй!/кг кассы. Ерыс декапитировали в сроки, соответствующие мзяснмальвоцу накоплению препаратов в ткани печена - 18 часов посла введения ос—токоферола /Е.Б.Бурлакова и др., 1982; В.З.'Ланкин и др., 1978/ и б часов после инъекции ионола /Е.Б.Бурлакова и др., 1971; х.Нвка-, 1978/.

Водный раствор солянокислого гидразина вводился однократно вкутрибрвшиЕно в,дозе 18 мг/кг массы, и животные деаапитировзлись в период начальной активации ПОЛ в митохондриях печени /через 1,5 часа после иньекцки токсина/. Для исследований профилактического действия ос-токоферола и ионола при гидразиновой интоксикации сроки введения автиокеидантсв рассчитывались таким образец, чтобы их максимальное накопление соответствовало времени начального повышения ПОЛ /о£-токоферол вводился за 16,5 часа, ионол - за 4,5 часа до инъекции гидразина/.

Уровень ПОЛ в изолированных митохондриях печена оценивали по содержанию диеновых коньюгатов, определяемых методом З.Плацера /1970/ в модификации Б.Б.Газрилова и М.И.Мкшкорудаой /1983/, и накоплению малонозого диальдегида /Р.А.Ткишрбулатов, Е.И.Селезнев,

- б -."

1981/. Общую антаокисдительвую активность /АОА/ определяли разработанный нами методой. Окислительное фосфорнлированае к транспорт ионов кальция в митохондриях изучали рН-метрически с измерением скорости и объема синтеза АТФ /к.1ЛаШпшга et в1., 1962/, Н+-АТФ-азной активности /И.Л.Фишов, 1983/, скорости переноса Са2+, кальциевой емкости органелл и времени удержания субмаксиыальных количеств катиона /Ю.В.Евтодиенко, 1979/. В качестве субстратов окисления использовали ог -кетоглутарат и сукцинат в концентрации б мМ. Для оценки стабильности митохондриальных мембран изучала спонтанное набухание органелл в солевой среде /«т.С1е18пс1$ 1952/. Белок митохондрий определяли по Лоури /о.Хоота? et а1., 1951/. Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с оценкой достоверности по Стьюденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие этилового спирта на изолированные митохондрии печени приводит к повыиению содержаний коньюгированных диенов в 1,5 раза по сравнению с контролем без достоверных изменений уровня АОА и накопления малонового диальдегида. При этом происходит угнетение митохондриальной энергопродукции. Так, скорость фосфо--рилирования при окислении ос-кетоглутарата снижается, в 1,6 раза ' по сравнению с контролем, -хотя количество синтезируемого АТФ проявляет лишь недостоверную тенденцию к уменьшению. Подавление энергетических процессов еще более заметно при использовании в качестве субстрата окисления сукцината /табл. I/.

Изучение влияния этанола ва транспорт ионов кальция в митохондриях показывает заметные нарушения этого процесса. При недостоверной тенденции к угнетению переноса катиона, поддерживаемого окислением ос-кетоглутарата, кальциевая емкость снижается в 1,5 раза по сравнению с контролем. Нарушение сукцинат-зависиао-го процесса, как и обеспечиваемой зтиь субстратом энергопродукции, выражено значительно сильнее /табл. 2/.

Инкубация митохондрий со спиртовым раствором «-токоферола предотвращает как активацию ПОЛ, так и нарушения энергетических и кальцийтранснортных процессов, вызываемые этанолом. Б тех ае условиях ионол, снижая содержание диеновых коньюгатов в 1,3 раза по сравнению с контролем, не нормализует функциональное состояние органелл /табл. I, 2/. Четко выраженное защитное влияние ог-токо-

Таблица I.

Окислительное фосфоралирозание в митохондриях печена при инкубации с этанолом и спиртовыми растворами ангаонсядантов' /субстрат окисления - сукцават/

:Скорость фосфорклнрования,:Сумма синтезированного Услоеия : ш! АТф/мин.»мг белка : АТФ, кМ/мг белка

инкубации

М ± ш : р| : р| : il ± ■ m : pj : р2

Контроль 74,35±5,36 - - 50,85+2^33 - -/а =15/

Этанол 53,21+3,25 <0,01 - 37,90+2,50 <0,01 -

/а =15/ • •

С*-Токоферол 60,41±5,44 >0,05 <0,01 58,82+3,91 >0,05 <0,01

/50 мкЦ/ ..........-.

+этанол /а ¿8/

ЙОЕОЛ /50 мкМ/ 48,10+4,97 <0,05> 0,05 36,90+1,68 <0,05 >0,05

+зтанол /а =9/ ...............

8 рт - достоверность изменений по отношению к контроля; р? - до- стовернссть изменений по отношении к митохондри- с ям, проинкубированным с этанолом.

ч , Таблица 2.

Транспорт Са2+ в митохонлриях печени при инкубации с этанолом и антпоксидантами /субстрат окисления - сукцинат/

Скорость , : Кальциевая .-Время удержания • """""ть, : кальция,

белка : сек./мг белка

* WifcWjJWV/ л JJ п, • 4*

тлтт-шмг : транспорта Ca , : емкость, : кальция, иЙ?б5!и :_нй/мкн..мг белка : нМ/мг" ' "

й+я; ?г • Pf : ^ : Pj : ?2 :tä-m : Pj : ?2

Контроль 249,38 72,57 " 3,09

/Ь=13/ 10*49 " " 3*67 " " С{-30

Этанол 154,41 52,56 1,43

/а=1?/ ^46 <0'01 " 3*20 ~ оЬ"^01 "

«-Токоферол 250,57 69,96 3,36 _

/50 мкй/ i >0,05 <0,01 ± >0,05<0,01 + >0,05 <0,01

+этанол 6734 ■ 3,29 - 071?

¿онол' 171,95 60,85 л я . _ 1,57 \ п<г ^ пг /50 НЕМ/ + <0,01 >0,05 + <0,05 >0,05 + <0,01 >0,05 +этаяол I1T7S 5Т22 0715 /* =П/_ •- •__•_

* см. примечание к габлиде I.

ферола и отсутствие такового у ионола при однотипности юс авти-окислителъного действия показывает, что индукция ПОЛ этанолом является вторичным процессом а происходит вследствие структурных нарушений митохондриадьных мембран, повышающих доступность мембранных липадов для действия эндогенных инициаторов сзободноради-кального окисления /Е.Б.Бурлакова, 1986; Н.Г.Храпова, 1981; в.НвШяеИ» ¿г.м.с.Ои«ег±с^э, 1986/. Это подтверждается характером изменения набухания изолированных органелл в солевой среде под влиянием этанола /рис. I А/. Повышение уровня ПОЛ наряду со структурной дестабилизацией мембран способствует угнетении энергопродукции а ионного транспорта, причем нарушения каждого из этих процессов вследствие их тесной регу литерной взаимосвязи усугубляет повреждение других, приводя к развитию общего структурно-функционального дисбаланса органелл.

<аг Оптическая плотность

Oß

V

Oß

AS с," 0,3

H-H-fJ

-H-i-г

JO

60

эо

Время, мин.

с^9Г0птическая плотность

07 Cfi № а*

Бремя, мин.

Бис. I. Спонтанное набухание изолированных митохондрий печени - в солевой среде /150 uM KCl, ОД иМ трис, рй 7

f: I - контроль; 2 - этанол.

: 3 - ос -токоферол + этанол; Ь - ионол + этанол.

■ Включение в иитохондрашгьные мембраны ы. -токоферола, обладающего мощным стабилизирующим влиянием /А.Н.Ерин и др., 1988; A.T.Diplock, 1982; J.A.Lucy, 1978/, блокирует повреждающее действие этанола, предупреждая структурные нарушения и пресекая развитие дальнейших повреждений мембраносвязанных процессов. При этой антирадикальные свойства Ы. -токоферола играют лишь вспомога-. тельную роль, а реиавдее значение принадлежит его стабилизирующему действию на митохондриальные мембраны /рис. I Б/.

В тех zs условиях йснод способен про тазе стоять повреядааще-су действии этилового спирта только на стадия активации ПОЛ, что ияь частично перекрывает пути повреждающих влияний, но не устра-яет ах полностью. Кроме того, иснол такаа способ .-н вызызать ка-¡упенгя структуры бисмембран /ЯЛ.йваноз, IS86; Н.П.Еоролез а др., 389; К.Я.Cheung et al., В85; P.Law et al., 1986/, ЧТО MCZ3? гсугублять повреждение митохондрий а индуцировать дополнагельйый ¡небаланс функционирования органедл /рис. I Б/.

Введение энтисясидаятов изтактнкм аизотнаы приводит к неболь-юму, но достоверному угнетению НОЛ з митохондриях пзченл а пзра-;д максимального накопления препарата в ткани /содержание коньи-?ированных дней о в снияается на антнокислительная активность ювызается на 10% от контрольных величин/. При этом ос-токоферол ¡е вызывает существенных изменений энергетических я кальцзйтреяс-юртных процессов, что свидетельствует о недостаточности амплитуде изменения ПОЛ для.индукции функционально значимых перестроек Убранных липздов и показывает устойчивость регуляторных систем штактаого организма по отношению к избыточном^ поступления природного аятиоксиданта.

В отличие от этого, введение идентичной молярной дозы иояола зризсг.2Т к достоверному снааенио скоростей сукцинат-зависииого окислительного фосфорияивованзя на ХЭ% и обеспечиваемого этим субстратом транспорта Са2г на 34^, а такзе резкому падению кальциевой ретенции /в 4,3 раза/ по сравнению с контролем. В основе различий эффекта исследуемых антнокезданхов на энергетические и каль-цийтранспортные процессы лежит ах разнонаправленное влияние на иитохондрваяъныз мембраны - стабилизирующее у ос -токоферола я пэртурбирующее у ионола. Неблагоприятное действие синтетического антиоксиданта на митсх^здряальнув энергопродукцшо и рехуляторные процессы, поддеряизас-мыэ окислением сукцината, монет нарушать функционирование органелд в физиологических услозиях, a такзз снижать ах вклад в поддергазие клеточного.гомеостаза при действии патогенных факторов.

При гидразиновей интоксикации яязотных обнаружена активация ПОЛ митохондрий печени, начальный период которой приходится на второй час после введения токсина /те(бл. 3/. Отсутствие одновременного снижения антаокислигельаой активности свидетельствует о непосредственном прооксидантном дейстзии гидразина, обусловленном

JO —

образованием радикальных продуктов при метаболизме этого соединения в гепатоцитах /о.АиеивЪ е* в1., 1985; О.Ыоав et в1., 1985/.

Таблица 3.

Перекисные продукты и антиокислптельная активность митохондрий печени при действии гидразина и предварительном введении автиоксидантов / а» 9/

: Еоньюгированные : Малоновый ; АОА, Уггп-отгя : диены, ед.опт. : дкальдегид, : относительные опытов : ЕЛ0И1«/Г бедка : нМ/мг белка : единицы

HiaS Pf Pf • Mí» ♦ Pf Pf i Pf i Pf

Контроль 10,76 0*62 - 7,79 efe - 1,29 0^03

Гидразин - 13,36 OÍ62 <0,05 Ю,70 0*66 <0,05 - 1,25 Й2>0-05

ог.-Токофе-рол + гидразин 8,01 0^58 <0,05 <0,01 8,75 0^51 >0,05 <0,05 1,28 ^ >0,05 >0,05

Ион os + гидразин 14,55 Ot53 <0,01 >0,05 9,04 0^37 <0,05 <0,05 1,21'

ь рт - достоверность изменений по отношению к контролю; р, - до-А стоверкость изменений по отношению к еивотным, получавшим гидразин.

Предварительное введение животным с*-токоферола предотвращает усиление перекисных процессов в митохондриях при действии гидразина. В то же время яонол почти не влияет, на активированное •• токсином ПОЛ. Различия эффективности действия автиоксидантов в условиях гкдразивовогс поражения печени не обусловлены ни особенностями их фармакокиветики, ни влиянием на активность ферментов протизоокислительного действия. Способность «-токоферола предупреждать активацию ПОЛ митохондрий под влиянием гидразина и отсутствие таких свойств у ионбла при однотипности их антисксидант-ного влияния на интактные органеллы вызвано противоположным влиянием этих соединений на/структуру ыитохондриедьных мембран. В условиях радикальной атаки разршрхение китохондриальных мембран соколом способствует усилению инициации цепного окисления лияидов, так антиокекдантнш свойства этого препарата оказываются не-достаточнкыи 'для предойвраценея активации ПОЛ.

~п -

Через 1,5 часа посла введения животным гидразина наблюдается езкое угнетение окислительного фосфорилирозания, обеспечиваемого унцднато^ /табл. 4/, При этом нарушения знергопродукции при окис-енля ос-кетоглутарата значительно иенеа заметны. Считывая значз-ае энергоснабжения для поддержания гомеостаза ткани и организма целом, можно полагать, что обнаруженное раннее угнегезяе окис-лтельного фосфоризирозаяйя является одним из пусковых механизмов азвития дальнейшего метаболического дисбаланса, з том числе нару-зний синтетических процессов, лежащих в основе гарового перерсз-зная геаатоцитов на более поздних стадиях интоксикации.

Таблица 4.

Окислительное фссфорилирование з штохондриях печени 1р'л действа гидразина а предварительной введении автиоксидантов /субстоат окисления - сукцинат, п~Э/

Условия опытов

Скорость фосфорилирования,:Суша синтезированного нМ АТФ/мян..мг белка : АТФ, нМ/мг белка

М + в : р| : р| : М + т : р^ : р2

эвтроль 77,37^4,81 - - 46,09*3,71

вдразин 41,96±3,92 <0,01 - 15,05*1,25 <0,01 -

-Токоферол 80,06^2,13 >0,05 <0,01 38,00+2,12 >0,05 <0,05

гидразин • ....

жол 49,26±3,Ю <0,01 >0,05 34,93^4,78 >0,05 >0,05

гидразин

см. примечание к таблице 3.

„ При действии гидразина на фоне предварительного взедения с*-жоферола скорость и объем фосфорилирования, обеспечиваемого сук-гаатом, не претерпевают достоверных изменений по отношению к коа-»ольному уровню, Завдтное влияние этого препарата основывается, с (ной стороны, на предупрекдеаии активации ПОЛ, а с другой - на ■руктурной стабилизация мембран, снижающей доступность липидов и инициации свободнорадякального окисления а компонентов днха-¡льной цепи для непосредственного повреждающего действия токсина.

Предварительное введение животным ионола незначительно улучат состояние окислительного фосфорилирования при гидразиновоа :токсккациа. Частичное предупреждение падения количества синтези-■емого АТФ осуществляется главным образом за счет снижения непо->едствеяного поврегдавщего действия гидразина на митохондриальные '.рменты вследствие индукции пролиферации эндоплазматического ре-1кулума гепатоцитов /Е.В»Кадяяина и др., 1988; г.с.ЫааЪЫ. et

га., 1983/ и усиление детоксякации гидразина в этих структурах.

Ранний период гидразиновоЁ интоксикации не сопровоЕдается из менеяиямн скорости митохондриальвого транспорта кальция и его максимального накопления при окислении сукцкната. Однако при этом вреик удержания катиона снижается в 4,5 раза по сравнению с контролем. В повреждающем действии гидразина на кальциевую ретенцию основная роль принадлежит аквизиция ПОЛ, способствующей увеличению неспецифической ионной проницаемости мембран /Е.Ф.Антонов, I9S2; Б.С.Соколов, 19В1/ и индукции выхода кальция из органелл /С.А.НоЕгородов и др.,1985/.

Характерной особенностью влияния гидразина на транспорт Са^+ является повышение скорости <*-кетоглутарат~зависиыого процесса при значительном уменьшении кальциевой емкости митохондрий, обеспечиваемой атин субстратом "/табл. 5/. ,

Таблица 5.

Транспорт Са"+ в митохондриях печени грк действии гидразина и предварительном введении анхиоксндазтов - /субстрат окисления - ос-кетоглутатзат, п =9/

; Скошсть транспорта Са Условия : "нМ/мйн.-мг белка опытов 2—

i » I Pj ? Р*

Кальциевая емкость, нМ/мг белка

^ ± » ; Рг : Р?

Контроль 147,97*14,24 - - ■ 38,82*3,15

Гидразин 226,37*13,86 <0,01 18,37*1,53 <0,05 -

<х -Токоферол £05,95+'5,26 >0,01 <0,05 31,69*1,63 >0,05 <0,01 + гидразин

-Ионол П4,45* 6,99 >0,05 <0,01 15,78*1,09 <0,01 >0,05

+ гидразин .....

* см. пршгечвниа к таблице 3.

Наряду с отсутствием снижения скорости транспорта кальция, поддерживаемого сукцинатом, на фоне резкого угнетения энергообеспечения процесса эти изменения указывают на энергонезависимую стимуляцию переноса катиона вследствие непосредственного модифицирующего влияние гидразина иди его метаболитов на миФохондриальнне мембраны. Вызываемые гидразином нарушения кальциевого гомеосгаза митохондрий способствуют углублению дисбаланса тканевого метаболизма, блокируя еле извращая ответ,органелл и клеток на регудаторные влияния.

Предварительное введение животным ос-токоферола в значительно! егепена предотвращает Нарушения каяьцийтранснорташс процессов гид-

1азином, почти полностью восстанавливая способность митохондрий к ■дернаняю катиона и частично устраняя энергонезависимую активацию гереноса кальция. Ионол предупреждает возрастание скорости транссорта Са2+ при окислении ос-кетоглутарата, не снимая снижения на-сопленид катиона, что наряду с падением скорости сукцинат-зависп-шго кальциевого переноса в 1,5 раза по сравнение с контролем и действием одного токсина свидетельствует об устранении этим препаратом энергонезависимой активации переносчика вследствие усиления детоксикации гидразина з энлоплазматическом ретикулуне. Несмотря 1а это, ионол не только це улучаает состояние митохондриальных ::зльпийтргнспоргкых процессов, но еще более усугубляет ах ааруше-пия, вызиззя дополллт'гльное угнзтзние поддергиваемого сукцикаюм перекоса и накопления катиона. Такта образои, 'несмотря на выражен-аое антяокислительное действие иокола на иятактныа млтзгонирки я его способность стимулировать микросомальнуа детоксицирующуа систему, этот препарат вследствие его пертурбируодего влияния на митохондриальные мембраны неспособен предотвращать активацию ПОЛ и нарушения метаболических процессов под влиянием гидразина.

В тех за условиях ос-токоферол, обладающий на только анти-оксидзятяымк свойствами, но и меыбраностабидазарующим действием, успесяо протичсстот: усилению ПОЛ гидразином а в значительной степени зосстанэвлигсзт залшейдие функциональные характеристики митохондрий, тем саьил: предотвращая даскоординацио метаболизма гзпатс-цитов при гидразин озой интоксикации, способствуя протеканию защитных. реакций и конденсаторных процессов. Поэтогду и -токоферол может быть рекомендован в качестве эффективного и безвредного профилактического средства при работе с гидразином в промыаленных условиях, а таюе для совместного назначения с лекарственными препаратами - производными гидразина /ряд противотуберкулезных и психотропных средста/ для предотвращения их побочного действия. Попытки применения в аналогичных ситуациях синтетических антиоксидан-тов, в частности, ионола, требуют большой.осторожности.

выводы

I. Поврегдакцее действие этанола на митохондрии обусловлено дестабилизацией мембранных структур, что приводит к усилению ПОЛ за счет эндогенных прзоксидантных факторов и способствует нарушении окислительного фссфорилирозания и транспорта ионов кальция.

2. Интоксикация еивотных солянокислым гидразином приводит в ранней активации ПОЛ митохондрий печени вследствие прооксидантнс го действия этого соединения, что приводит к резким нарушениям знергопродукции и транспорта кальция. Обнаруженное раннее поврег декие митохондриальных процессов является одним из пусковых мехг низмов гкдразинового поражения печени.

3. Высокая чувствительность сукцкаат-зависимых энергетических и регуляторных процессов к перекисным повреждениям митохондриальных: мембран представляет собой существенное звено в мехазиз ме нарушения обменных процессор при повреждающих воздействиях, опосредованных активацией ПОЛ.

4. Включение *в мембраны изолированных митохондрий »¿-токофе рола блокирует повреждающее влияние этанола, предупреждая возник новение структурных нарушений и обусловленного ими угнетения мем браносвязанных процессов.

5. Введение о£-токоферола интактным животным вызывает снике ние уровня ПОЛ в митохондриях и повышение антиокислительной акти кости, не сопровождаемые заметными изменениями энергетических и Еальцийтранспортных процессов, за исключением некоторого возрастания шс функционального резерва.

6. Предварительное введение животным <*-токоферола полност! предотвращает нарушения' перекисных и энергетических процессов пр гидразиновой интоксикации и в значительной степени препятствует развитию дисбаланса кальциевого транспорта в митохондриях печени Защитное действие о£-токоферола обусловлено как его антиоксидант ными свойствами, так и мембраностабилизирующим влиянием.

?. йнгибирование перекисного окисления липидов митохондрий ионолом при его включении в мембраны изолированных органелл лишь частично предотвращает повреждающее действие этилового спирта. Неспособность ионола оказывать защитное влияние по отношению к индуцируемому этанолом повреждению митохондрий обусловлена деста билизацией мембранных структур, вызываемой этим антиоксидантом.

8. Введение ионола интактным животным способствуем снижению интенсивности сукцинат-зависимого окислительного фосфорилировани и транспорта ионов кальция в митохондриях вследствие структурной дестабилизации мембран органелл.

9. Предварительное введение животным ионола блокирует непосредственное действие гидразина на ферментные системы митохондри:

зчеки, предупревдая энергонезависимую активацию переноса кальция, зтиокислительпое дейстзиэ этого препарата недостаточно для пред-твращения индукции ПОЛ гидразином и коррекции последующих метабо-ачзских сдвигов вследствие его дестабилизирующего влияния на ш-охсндриальные мембраны.

Ю. -Токоферол может быть рекомендозан в качестве эффежтив-ого и безвредного профилактического средства при работе с гидра-инои в промышленных условиях и применении лекарственных препара-оз - производных гидразина - для предотвращения их побочного лияния.

II. Действие антиоксидантов на метаболические процессы я ста-ильность мембранное структур наряду с их противоэкислятелькыми войствами оказывает решающее влияние на суммарную эффективность тих препаратов, что следует учятывазв при оценке я прогнозировали возможности их клинического применения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Новый метод определения антиокислительной активности кро~ ¡и// Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внут-юнких органов.- Ужгород, 1983.-С.396-397 /соавторы М.Ф.Тиаочко, 1.С.Гуренко, 0.К.Черняк, Л.М.Лесяк, Т.Л.Выгнан/.

2. Метод совместного определен:!" перекясного окисления липнув и антиокислктельной акт.тзности в клинической практике хирургического лечения заболеваний печени// Рекомендация по результатам- научных исследований для внедрения з практику. Хирургия. -1ьбоз, 1983.-С.30 /соазторы М.П.Пазлззский, Г.Л.Орел, М.Ф.Тамочко, ).И.Терлецкая, Т.Н.Макаренко/.

3. Взаимосвязь оксндазного и оксигеназного путей окисления з китохондриальных мембранах// Тез. докл. У1 Всасоюзн. конф. по экаслени» органических веиестз в звдкой фазе "Окисление - 86я.-¡1ьвоз, 1586.-Т.2.-С. 186 /соазторы С.Н.Кональчук, М.Ф.Тимочко/.

4. Взаешззв'язок перекасного окисления л!п1д1з х евергетично-го обн1ну у визначаши функц1онально-метабол1чного стану мз.тохснд-Р1Л// Тез'л допев. XII з'хзду Украхнсысого ф1зз.олог1чного товариот-за 1!£.1.П.Павлова.- Льв1в, 196б.-С.263-264 /стивавтори С.М.Козаль-чук, С.З.Чучиан, М.Ф.Тимочко/.

5. Энергетические процессы в митохондриях при гидразинозоы поражении печени крыс и профилактическом действии ©¿-токоферола/'/

Проблемы патологии в зксперименте и клинике.- Львов, I989.-B.H.-С.89-90.

6. Лерекискые процессы в митохондриях при гидрааиновон поражении печени крыс и профилактическом действии «.-токоферола//Про-блемы патологии в эксперименте и клинике,- Львов, I289.-B.II.-C. 90-91 /соавторы Е.Н.Панасюк, М.Ф.Тимочко, С.Н.Ковальчук/.

?. Влияние природных и синтетических антиексидантов на пере-кисные, энергетические и ионтранспортные процессы в митохондриях пищеварительных оргавов//Современные аспекты теоретической и прикладной гастроэнтерологии. Тез.докл. УН Билатерального симпозиума СССР-ЧССР.- Ужгород, I9SS.~С.I20-I2I /соавторы Е.Н.Панасюк, И.Ф.Тимочко, С.Н.Ковальчук/.

8. Влияние природных и синтетических ьктиоксидантсв на состояние энергетического обмена яеченк//Рекомендации молодых ученых для введрения в практику,- Львое, I990.-C.II-I2 /соавтор С.Н.Ковальчук/.

S. Профилактическое действие антиоксидактов при гидразиновом поракэкии печеаи//Фармакология: состояние к перспективы исследований. Тез.докл. У1 съезда фармакологов Украинской ССР.- Харьков,-1990.-С.201-202 /соавторы С.Н.Ковальчук, М.Ф.Тимочко/.

' 10. Влияние антиоксиданта ионола на процессы перекисного окисления /ПОЛ/ в митохондриях печени//Проблемы патологии в эксперименте и клинике. Львов, I99Û.-B.I2 /в печати, соавторы М.Ф.Тимочко, С.Н.Ковальчук/.

11. Влияние антиоксиданта ионола на энергетические процессы

в митохондриях печени//Проблемы патологии в эксперименте и клинике.- Львов, I990.~B.I2 /в печа!и, соавторы М.Ф.Тимочко, С.Н.Коваль чук/.

12. Влияние антиоксидантов на выраженность повреждения гидразином кальцийтранспортных процессов в митохондриях печени//Проб-леыы патологии в эксперименте и клинике.- Львов, 1990.-Б.12 /в печати, соавторы М.Ф.Тимочко, С.Н.Козальчук/,

13. Способ определения антиокислительной активыоси: сыворотки крови/ АС 1425539 AI СССР, G 01 33/48. Заявлено 05.03.84. Опубл. 23.09.88. Бюл. ё 35.- 2 с. /соавторы С.Н.Ковальчук, М.Ф.Тимочко/.