Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Особенности ангиогенеза в первичных злокачественных эпителиальных опухолях печени и значение их в прогнозе заболевания (клинико-иммуногистохимическое исследование)

На правах рукописи

ТЕН

Владислав Петрович

Особенности ангиогенеза в первичных злокачественных эпителиальных опухолях печени и значение их в прогнозе заболевания (клинико-иммуногистохимическое исследование).

14.00.15 - патологическая анатомия 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

□03460Т13

003460713

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Пожарисский Казимир Марианович; доктор медицинских наук, профессор Гранов Дмитрий Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Нейштадт Эдуард Львович доктор медицинских наук, профессор Барчук Алексей Степанович

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Санкт Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «_»__ 2009 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.089.04 при ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82).

Автореферат разослан «_»_ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета / п )

доктор медицинских наук, снс / Угл А.В. Соболев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из наиболее часто встречаемых злокачественных опухолей, особенно в определенных регионах мира, и составляет более 90% всех первичных раков печени (Гранов A.M., Петровичев H.H., 1977). Ежегодно в мире регистрируется более 500000 новых случаев этой опухоли, однако распространенность ее неравномерна. Так, в Северной Америке ежегодно регистрируется 3,2 случая на 100000 населения, а в странах Юго-Восточной Азии возрастает до 35,8/100000 населения (Hirphashi S. и соавт., 2000). В то же время имеются сведения о резком учащении этих опухолей в США (El-Serag Н. В., Mason А. С., 1999), что привело к двукратному увеличению смертности от онкологических заболеваний за последние 20 лет. ГЦК занимает пятое место по частоте заболеваемости и третье место в качестве причины смерти (Parkin D.M. и соавт. 2001) среди всех опухолей. Вторая разновидность злокачественных опухолей печени - холангиоцеллюлярный карцинома (ХЦК) также характеризуется резко выраженными географическими различиями: США-0,4, а Таиланд-84,6 на 100000 жителей (Nakamuna Y. и соавт., 2000) Средняя продолжительность жизни у больных с первичными раками печени (гепатоцеллюлярным раком и холангиоцеллюлярным раком) является одной из наименьших и не превышает 8 мес. с момента установления диагноза (Schoniger-Henike М, 2001).

Низкая эффективность различных хирургических, химио- и

й

радиотерапевтических методов лечения заставляет искать новые подходы к

*

терапии первичных раков печени. Одним из таких направлений может быть разработка так называемой антиангиогенной терапии (Kerbel Т., 2002), которая базируется на специфическом действии противоопухолевого

химиотерапевтического средства на сосудистое русло опухоли и таким образом

*

редуцируя его, приводит к некробиотическим и апоптотическим изменениям в

1

самой опухоли. В настоящее время опухолевый неоангиогенез интенсивно изучается во многих странах в различных аспектах: роль его в патогенезе

опухолевого роста, диагностических методах, в качестве противоопухолевой терапии, прогностических маркеров течения онкологических заболеваний, значение разработки методов интервенционной радиологии и хирургических способов лечения разнообразных опухолей.

Учение об опухолевом ангиогенезе, инициированное и обоснованное J. Folkman (1971), и развитое другими исследователями (Harris A.L., 1997; Höeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт.,1999; Kerbel R.S., 2000), оказалось весьма продуктивным в онкоморфологии. Оно, с одной стороны, внесло много важных фактов в патогенез опухолевого роста (Hanahan D., Folkman J., 1996; Harris A.L., 1997; Hoeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт., 1999), а, с другой стороны, стало значительным достижением в практической медицине как для поиска новых мишеней лекарственного воздействия на опухоль, так и в определений прогноза при многих онкологических заболеваниях. В последнем отношении проведено огромное количество исследований, показавших, что степень кровоснабжения опухоли является фактором, определяющим клиническое течение новообразования (Gasparini G., Harris A.L., 1999). Такие сведения получены для рака молочной железы (Vartanian R.K., Weidner N., 1994), простаты (Halvorsen OJ. и соавт., 2000), легкого (Fontanini G. и соавт., 1997), меланомы (Graham С.Н. и соавт., 1994). К сожалению, в нашей стране это важное и крайне перспективное направление практически не получило развития. В то же время, в связи с внедрением в научные исследования методов иммуногистохимии, создались хорошие предпосылки для широкого и глубокого изучения проблемы опухолевого неоангиогенеза в самых различных направлениях. Сейчас трудно найти опухоли, которые не подвергались бы изучению в плане особенностей их ангиогенеза.

Однако, ангиогенезу в опухолях печени посвящено мало исследований. Кроме того, в работах, по изучению ангиогенеза в гепатоцеллюлярной карциноме, обычно используются единичные иммуногистохимические маркеры [Kamura Н. и соавт.. 1998; Jin-no К. и соавт., 1998; Li Х.М. и соавт., 2004; Sasaki Y. и соавт., 2002; Sugimachi К. И соавт., 2003; Moon W.S. и соавт., 2003; Chen X. И соавт., 2004.], что не дает возможности получить целостное представление об этом

процессе в опухоли. Для этого необходимы комплексные исследования с анализом экспрессии многочисленных маркеров, отражающих как уровень неоангиогенеза, так и факторы его регуляции.

Этому способствует широкое распространение компьютерных технологий для использования морфометрии, в частности для количественной и качественной характеристики кровоснабжения новообразований. При компьютерной обработке изображений достигается высокая воспроизводимость результатов за счет большого массива исследованных объектов (Baak К., 1994; Sallinen С., 1994). Осуществление такого изучения возможно только в центрах, занимающихся оперативной гепатологией и владеющих многочисленными иммуногистохимическими технологиями и способами морфометрического анализа.

Цель. Целью настоящей диссертационной работы является комплексное сравнительное иммуногистохимическое изучение уровня развития микроциркуляторного русла, степени его дифференцировки и факторов ангиогенеза в гепатоцеллюлярном и холангиоцеллюлярном раках для определения роли степени кровоснабжения опухоли в ее биологическом поведении (клиническом течении) и исходе заболевания.

Эта цель реализована путем использования широкой панели иммуногистохимических маркеров (15), отражающих гистогенетическое происхождение опухоли, степень развития ее микроциркуляторного русла и факторов, способствующих опухолевому неоангиогенезу с количественной оценкой перечисленных факторов при помощи компьютерного анализа изображений.

Задачи исследования.

1. Разработка оптимальной иммуногистохимической панели для определения нозологической формы (гистогенеза) первичных опухолей печени (гепатоцеллюлярные, холангиоцеллюлярные карциномы)

Разработка оптимальных способов исследования сосудистого статуса опухоли, методики измерения плотности микрососудистой сети, экспрессии факторов ангиогенеза и их соотношения с выраженностью микроциркуляторного русла.

3. Количественная оценка микроциркуляторного русла в первичных раках печени.

4. Изучение морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла в первичных раках печени с помощью маркеров, отражающих дифференцировку гладкомышечных клеток.

5. .Выявление значения плотности микрососудов, уровни их дифференцировки и факторов ангиогенеза в клиническом поведении первичных опухолей печени (рецидивирование, метастазирование, выживаемость) на основании изучения корреляционных связей между изучаемыми параметрами

6. Изучение факторов ангиогенеза: УЕвР, ангиопоэтин - 1 и 2 в сопоставлений с количественными параметрами микроциркуляторного русла.

7. Построение математической модели клинического поведения опухоли печени по количественным показателям оценки экспрессии иммуногистохимическИх маркеров.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее адекватным гистогенетическим маркером ГЦК является гепатоцитарный антиген (НерРаг1) (чувствительность - 100%, специфичность 92%), а ХЦК - СК19 (чувствительность 83%, специфичность 78%).

2. ГЦК характеризуется богатой, равномерно распределенной сосудистой сетью, что может служить дифференциально-диагностическим признаком для отличия ее от гиперпластических изменений печени, с одной стороны, холангиоцеллюлярной карциномы, с другой.

3. Выраженность микроциркуляторного русла ГЦК, определенная по сумме периметров сосудов и или сумме площади сечения сосудов, выявляемых иммуногистохимическим маркером эндотелия С031, служит достоверным прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных этим типом рака.

4. Экспрессия факторов ангиогенеза (УЕвР, ангаопоэтины 1 и 2), определенная иммуногистохимически, не является прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных ГЦК.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное клинико-иммуногистохимическое исследование первичных карцином печени с одновременным определением ряда маркеров, характеризующих наиболее важные патогенетические особенности опухоли, а именно, микрососудистую плотность (количество микрососудов сосудов, суммарный периметр микрососудов и суммарная площадь просвета на единицу площади препарата), ядерно-цитоплазматическое соотношение, воспалительную лейкоцитарную реакцию, экспрессия факторов ангиогенеза (эндотелиальный сосудистый фактор роста, ангиопоэтины 1 и 2).

Показано, что суммарный периметр стенки микрососудов и суммарная площадь просвета являются высокозначимыми прогностическими признаками. Впервые показано взаимодействие изученных морфометрических показателей микрососудистой плотности, ядерно-цитоплазматического соотношения, воспалительной лейкоцитарной реакции и экспрессии факторов ангиогенеза, обусловливающее биологическое поведение ГЦК.

Практическая значимость. Обнаруженные факты могут быть использованы в клинической практике при оценке прогноза заболевания. Результаты диссертационного исследования показывают необходимость определения суммарного периметра или площади сечения микрососудов, оцененного по экспрессии С031, а так же экспрессии гепатоцитарного антигена, гладкомышечного актина, СК19, СК10 для полноценного дифференциального диагноза ГЦК от ХЦК и метастазов других локализаций.

Вклад автора в проведенное исследование. Соискатель является непосредственным участником определения основной идеи исследования, исполнителем методической, диагностической и статистической частей работа, анализа полученных результатов.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены на IV съезде онкологов и радиологов СНГ в Баку, 25-28 мая 2006 г. «Ангиогенез в опухолях печени и его прогностическое значение »; на заседании проблемной комиссии по интервенционной радиологии и оперативной хирургии ФГУ РНЦРХТ

27.10.2008 г.; на заседании Сообщества патологоанатомов Санкт-Петербурга 25.11.2008 г.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в список, рекомендуемый ВАК.

Внедрение результатов исследования. Методы комплексного морфологического исследования операционного и биопсийного материала больных с первичными карциномами печени введены в практику патологоанатомического отделения ФГУ «РНЦ радиологии и хирургических технологий Росмедтехнологий».

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик, результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста, включает 55 таблиц, 22 графика и 35 микрофотографий. Библиографический указатель включает 309 литературных источников, в том числе 6 отечественных и 303 иностранных авторов.

си

СОДЕРЖНИЕ РАБОТЫ.

Материал и методы исследования. В настоящем исследовании представлены данные о 55 больных первичным раком печени, проходивших различные виды терапии в РНЦРХТ за период с 1985 по 2005 г. Всем больным была произведена резекция опухоли. Критерием отбора больных был морфологически верифицированный диагноз и хирургическое лечение.

Кроме того, объектом исследования является нормальная человеческая печень. В работе были использованы 6 парафиновых блоков секционного материала, 4 из которых были взяты из архива лаборатории патологической анатомии НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова, 2 блока были предоставлены паталогоанатомическим отделением городской больницы №2.

Методика морфологического исследования операционных препаратов заключалась в одновременном исследовании опухоли, пограничных с ней тканей.

Для изучения брали операционный материал, фиксировали в 10% нейтральном формалине с обычной стандартной проводкой и последующей заливкой в парафин. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином и проводили ШИК-реакцию. После пересмотра гистологических препаратов выбирался блок опухоли с периферической тканью печени, из которого изготавливались гистологические препараты для иммуногистохимических реакций.

В опухолях всех больных и нормальной человеческой печени определяли экспрессию следующих иммуногистохимических маркеров (табл. 1):

1. Для уточнения нозологической формы было проведено исследование тканевыми маркерами (гепатоцитарное антитело (НерРаг2), цитокератин низкого молекулярного веса (СК. Ь\¥), канцероэмбриональный антиген (СЕАр), эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), цитокератин 10 (СК10), цитокератин 19 (СК19), цитокератин высокого молекулярного веса (СК Н\У), тиреоидный транскрипционный фактор СПТ), хромогранин А и др.)

2. Для изучения микроциркуляторного русла в опухоли и перифокальной зоне были использованы: эндотелиальный маркер С031, гладкомышечный актин (БМА) и маркер дифференцировки гладкомышечных элементов медии - калпонин.

3. Для изучения воспалительной инфильтрации в опухоли и окружающей ткани печени - общий лейкоцитарный антиген - С04511В.

4. Для изучения опухолевого ангиогенеза были использованы факторы ангиогенеза: УЕвР - эндотелиальный сосудистый фактор роста (специфический митоген эндотелиальных клеток), ангиопоэтин 1 и ангиопоэтин 2 - специфические лиганды рецепторов тирозин - киназы в эндотелиальных клетках.

Процедура оценки экспрессии иммуногистохимических маркеров: положительным результатом являлось наличие специфического (зернистого) коричневого окрашивания цитоплазмы более 10% опухолевых клеток и гепатоцитов перифокальной зоны - гепатоцитарного антигена, УЕвР, ангиопоэтйНа 1, ангиопоэтина 2; мембран - в случае экспрессии СЕА поликлональный, ЕМА, СКЬ\У, окрашивание мембран эндотелия - СБЗ1, гладкомышечные элементы сосудистой стенки - гладкомышечный актин, калпонин, мембранно-

цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток и желчных капилляров CD 10, СК19.

Таблица 1

Характеристика изученных антител.

Антитело Клон Производитель Титр Биологические свойства молекулы

Гепатоцитарное антитело OCHIE5 DAKO 1:400 Маркер гепатоцитов

СЕАр поликлональные DAKO 1:5000 Маркер желчных капилляров

CK 8 35рН11 DAKO 1:200 Цитокератин низкой молекулярной плотности, маркирующий гепатоциты

CK 19 RCK108 DAKO 1:500 Цитокератин, маркирующий биллиарный и другие эпителии

а фетопротеик поликлональные DAKO 1:10000 Гликопротеин, продуцируемый ГЦК

TTF1 SPT24 NOVOCASTRA 1:500 Тиреоидный транскрипционный фактор, экспрессирующийся преимущественно в щитовидной железе и легком

CD10 56С6 NOVOCASTRA 1:100 Кроме лимфоцитов экспрессируется в желчных протоках и почечном эпителии

CD 31 JC70A DAKO 1:300 Маркер эндотелия

SMA A4 DAKO 1:500 Гладкомышечный маркер

Калпонин h-calp Sigma 1:10000 Маркер гладкомышечной дифференцировки

ЕМА М DAKO 1:1000 Эпителиальный мембранный антиген

CD45RB DAKO 1:500 Общий лейкокитарный антиген

VEGF Поликлональные, Santa Cruz 1:200 Сосудистый эндотелиальный ростковый фактор

Ангиопоэтин 1 поликлональные Santa Cruz 1:150 Специфические рецепторы тирозинкиназы на эндотелиальных клетках

Ангиопоэтин 2 поликлональные Santa Cruz 1:150 Специфические рецепторы тирозин-киназы на эндотелиальных клетках

Для морфометрических исследований опухоли, перифокальной ткани печени и нормальной ткани печени использовался компьютерный анализатор изображения: системный блок на базе процессора Intel Pentium III, с оперативной памятью 512 MB, микроскоп Leica, цифровой фотоаппарат Leica, система анализа изображений Leica Qwin Pro.

Для выявления сосудов и их измерения использовали специфический маркер эндотелия CD31. Морфометрическое определение плотности микрососудистого русла (MVD) по способу, предложенному N. Weidner: препарат изучали при малом

увеличении (ув. хЮО) с целью определения т.н. «горячих точек» (hot spot) - Мест с наиболее высокой концентрацией капилляров и с максимально выраженной экспрессией маркера, затем, при большом увеличении (ув. х200-х400) производили цифровые фотографии и вели подсчет капилляров: эндотелиальных клеток, замкнутых в полости, не замкнутых в полости, а также единичных окрашенных эндотелиоцитов, причем, каждый объект считали единицей измерения. Подсчет велся в 5-10 полях зрения, при увеличении х400, площадь измерения 0,054 мм2.

Морфометрическое определение выраженности микрососудистого русла по сумме периметров сосудов. Цифровые фотографии, произведенные для подсчета микрососудистой плотности обрабатывали в компьютерной системе анализа изображения Leica Qwin Pro с помощью оператора «измерение-линия». В каждом фиксированном изображении определяли суммарную длину периметра сосудов.

Одновременно с помощью оператора «изображение» выделяли эндотелий сосудов и определяли площадь экспрессии маркера CD31 в процентах к площади изображения, без учета степени экспрессии маркера, а также автоматическое определение суммарной длины периметра сосудов с помощью оператора «изображение».

Дополнительно в качестве пробного исследования с помощью оператора «измерение площадь» определяли суммарную площадь поперечного сечения сосудов на поле зрения (в тех же полях зрения, где определялась микрососудистая плотность).

Морфометрическое определение ядерно-цитоплазматического соотношения по иммуногистохимическим маркерам: CKLW. СЕАр. БМА.

После просмотра гистологического среза на малом увеличении х50 или хЮО,, производилось по 5-10 цифровых фотографий с увеличением х400, для опухоли, перифокальной зоны и нормальной печени поля зрения выбирались случайным образом, измерения проводились только в тех полях зрения, в которых опухолевые клетки и гепатоциты имели наиболее отчетливое и полное окрашивание цитоплазматической мембраны. Каждая цифровая фотография обрабатывалась в компьютерной системе анализа изображения Leica Qwin Pro с помощью оператора

«измерение-площадь», в каждом фиксированном изображении измерялась площадь ядра и цитоплазмы у 25-30 клеток, и вычислялось ядерно-цитоплазматическое соотношение.

Статистический анализ. Обработка полученного массива информации проводилась с применением пакета прикладных программ Statistica 6 для операционной среды Windows (Боровиков В.П., 1993).

Информация вносилась в специально созданную реляционную базу данных. Значимость различий между средними величинами оценивали с помощью t-test, и считалась статистически достоверной, если значение «р» было менее или равное 0,05 (исследование аналогичное однофакторному дисперсионному анализу). Достоверность полученных количественных показателей оценивали с помощью t-test для отдельных вариантов (дополнительно по гистограммам) и считалась статистически достоверной, если значение «р» было менее или равное 0,05. Для анализа выживаемости по каждому оцениваемому показателю исследуемые больные были разделены внутри групп положительных и отрицательных к гепатоцитарному антигену на две подгруппы относительно медианы показателя, в дальнейшем эти подгруппы сравнивали по выживаемости и безрецидивной выживаемости с помощью t-test для групп. Дополнительно анализ выживаемости и безрецидивной выживаемости производился с помощью метода Каплана-Мейера (1958), достоверность различий между кривыми выживаемости подтверждалась Cox'F-Test. Оценка силы и значимости связи между выявленными факторам прогноза определялась методом корреляционного одно- и многофакторног анализа. Для проверки силы и формы связи строились диаграммы рассеяния зависимости выживаемости и безрецидивной выживаемости. Для подтвержДени различий экспрессии тканевых маркеров в разных группах использовали анали непараметрических данных путем построения таблиц сопряженности. Д) построения математической модели выживаемости и безрецидивной выживаемост в зависимости от полученных показателей использовали многофакторны" регрессионный анализ.

Результаты исследования.

Клинико-морфологическая характеристика больных представлена в табл. 2. Первоначальное подразделение первичных опухолей печени на 2 основных типа -ГЦК и ХЦК - произведено на основании морфологии новообразования и их экспрессии гепатоцитарного антигена (НерРаг1), что привело к следующему соотношению опухолей (табл. 2)

Таблица 2

Клинико-морфологическая характеристика пациентов с первичными карциномами печени.

Показатель По данным обычного гистологического исследования По данным микроскопического исследования с использованием иммуногистохимии

ГЦК Смешанная ГХЦК ГЦК ХЦК

число пациентов 49 6 32 23

мужчин 30 1 25 5

женщин 19 5 7 18

Возраст, годы 48,3 52,3

минимум 17 27 17 27

максимум 80 67 80 67

Локализация опухоли

правая доля 32 3 23 12

левая доля 17 3 9 11

Размер опухоли (диаметр), средний, см 12,1

минимум, 5 см 5 5 5 . 5

максимум, 22 см 22 тотальное поражение 22 тотальное поражение

Стадия ТОМ

Т2-3 15 3 13 5

Т 4 34 3 19 18

N0 39 3 28 14

N 1 10 3 4 9

МО 38 3 28 13

М 1 11 3 4 10

Степень злокачественности (Ес1топ5оп-$1етег)

1 степень 6 0

2 степень 14 0

3 степень 12 7

4 степень 0 16

Результаты иммуногистохимического исследования первичных карцином печени с целью их дифференциальной диагностики суммированы в табл. 3.

Таблица 3

Чувствительность и специфичность иммуногистохимических маркеров в первичных карциномах печени

ИГХ маркер Результаты диагностических тестов

ГЦК ХЦК

чувствительность специфичность чувствительность специфичность

Гепатоцитарный антиген 100% 92% 0(0%) 8%

СК LW (СК8) 55% 31% 45% 69%

СК.19 17% 21% 83% 78%

СЕАр (каналик) 63% . 55% 47% 45%

CD10 (каналик) 89% 58% 11% 42%

Из таблицы можно заключить, что гепатоцитарный антиген, СОЮ и СК 19 обладают высокой диагностической значимостью для дифференциальной диагностики ГЦК и ХЦК

Выявление микроциркуляторного русла с помощью иммуногистохимического маркера эндотелия CD31 показывает, что в ГЦК имеется богатое кровоснабжение, выраженное густой, равномерной сетью синусоидных сосудов, более обильной, чем в нормальной печени и ткани, окружающей опухоль (табл.4). В нормальной печени, полученной от практически здоровых людей, погибших от травматических повреждений, в среднем на единицу площади (0,216 мм2) приходилось 5,8 микрососуда, периметр которых составлял 922 мкм. В перитуморозной области эти параметры увеличивались до 9,7 и 502 мкм, а в самой опухоли достигали 55 и 1845 мкм соответственно. В противоположность этому в ХЦК, для которой характерна богатая фиброзная строма, степень кровоснабжения уменьшена более чем в 5 раз И распределение сосудов не отличается такой равномерностью, как в ГЦК. Поэтому отмеченные особенности микроциркуляторного русла ГЦК могут служить диагностическим признаком этой опухоли для отличия ее от гиперпластйческих изменений печени, с одной стороны, и от ХЦК, с другой.

Таблица 4

Количественная характеристика микроциркуляторного русла первичных карцином

Параметр Гепатоцеялюлярная карцинома Холангиоцеллюлярная карцинома

Среднее значение Медиана I Минимум Максимум Ошибка средней Среднее значение Медиана Минимум Максимум Ошибка средней

Количество сосудов

опухоль 55,3 55,5 7 45,2 5,55 12,1 11,0 4,0 ' 22,0 1,09

перитуморозна я область 7,7 6,0 1,4 28 1,14 5,8 4,5 1,0 14,0 1,25

Сумма периметров сосудов, мкм

опухоль 1844 1632 819 3547 122,7 1111 1088 446 1820 90,2

перитуморозная область 502 398 181 1648 53,7 791 816 503 1214 67,8

Сумма площади поперечного сечения сосудов опухоли, мкм2 6292 5920 843 15205 563,6 3553 3594 1002 6746 342,6

Во многих работах отмечено прогностическое значение интенсивности развития сосудов в опухоли для оценки продолжительности жизни больных и показано: чем она выше, тем короче эта продолжительность. Мы также провели сопоставление выраженности микроциркуляторного русла ГЦК с общей и безрецидивной выживаемостью больных и получили противоположные данные. Так, при значении микрососудов выше медианы (>56) средняя выживаемость составила 83,8 мес., а при показателе ниже медианы - 43,7 мес. Пятилетняя выживаемость при таких же условиях была равна соответственно 45% и 25%. Эти результаты противоречат большинству исследований ангиогенеза в самых разнообразных злокачественных новообразованиях. Хотя полученные нами показатели оказались статистически недостоверными (р=0,06б), мы решили искать другие способы оценки развития микроциркуляторного русла. К этому нас побуждали также результаты работ, в которых только что упомянутый метод определения уровня кровоснабжения ГЦК оказывался прогностически информативным только при размерах опухоли меньше 5 см (Sun НС, 1999, Рооп

ЯТ, 2002). Мы посчитали, что наиболее полно функциональное значение сосудов отражает их площадь взаимодействия с питаемой ими паренхимы опухоли. Таким показателем, по нашему мнению, более соответствует суммарный периметр сосудов на единицу площади новообразования.

Использовав такую методику оценки развития микроциркуляторного русла ГЦК в сопоставлении с длительностью общей выживаемости больных мы получили следующие результаты: при сумме периметров сосудов в опухоли больше медианы (равной 1632 мкм) средняя выживаемость равнялась 19,3 мес., а при ее значении меньше медианы - она увеличивалась до 86,7 мес. (р=0,035). Пятилетняя выживаемость составила соответственно 0% и 43% (р=0,038) (рис. 1). Средняя безрецидивная выживаемость при этих же условиях была соответственно равна 15,3 мес. и 62,4 мес. (р=0,026), а 20-месячная безрецидивная выживаемость -38% и 67% соответственно (рис. 2). Таким образом, следует признать, что применяемый нами способ определения развития микроциркуляторного русла является более информативным для оценки прогноза при ГЦК, так как он лучше отражает функциональные взаимоотношения опухоли с питающей ее сосудистой системой.

Учитывая тот факт, что выраженность ангиогенеза в ГЦК не имеет достоверных корреляций с такими клинико-морфологическими признаками, как возраст больных, локализация, размеры, степень дифференцировки опухоли, позволяет заключить, что степень развития сосудов в этом типе рака является независимым прогностическим признаком.

о полное исследование цензурирование исследование

100 150 200 месяцы

350 .

— ниже 1632 мкм

- - выше 1632 мкм

Рис. 1. Общая выживаемость по методу Каплана-Мейера в зависимости от суммарного периметра сосудов в ГЦК.

Суммарная пропорциональная выживаемость (Кар1ап-Ме)эг) о полное исследование цензурированное исследование

80 100 120 140 160 180 200 месяцы

-ниже 1632 мкм

---выше 1632 мкм

Рис. 2. Безрецидивная выживаемость по методу Каплана-Мейера в зависимости от суммарного периметра сосудов в ГЦК.

Попытка выяснить значимость развития ангиогенеза в клиническом течении ХЦК оказалась безуспешной: вне зависимости от количественных показателей степени кровоснабжения этого типа рака печени общая выживаемость при нем равна только 19,7 мес. (безрецидивная выживаемость - 15,2 мес.). По-видимому, биологические свойства этой опухоли, обусловливающие ее чрезвычайную

агрессивность, нивелируют некоторые другие патогенетические факторы, в том числе и ангиогенез.

Среди многочисленных факторов ангиогенеза ведущее значение придается VEGF (васкулярный эндотелиальный ростовый фактор). Ему присущи разнообразные функции: он участвует в воспалении, регенерации и ангиогенезе тканей, обладая митогенными свойствами и способностью увеличивать проницаемость эндотелиальных клеток. В нашей работе VEGF экспрессировался в цитоплазме и плазматической мембране преимущественно в опухолевых клетках, и в прилежащих к опухоли гепатоцитах; он был выявлен в 63% ГЦК в виде интенсивного окрашивания. Ангиолоэтины-1 и -2 обладали тем же характером экспрессии, как и VEGF, т.е. они выявлялись в цитоплазме опухолевых клеток, гепатоцитов и эндотелии сосудов.

В нашем исследовании абсолютные показатели экспрессии изученных факторов ангиогенеза не влияли на показатели клинического течения и исхода заболевания, но если использовать отношение выраженности экспрессии этих факторов в опухоли и ее перифокальной зоне, то можно отметить худший прогноз выживаемости в опухолях, в которых экспрессия VEGF в опухоли превышает таковую в перитуморозной зоне (медиана 1,1). Та же закономерность обнаружена для ангиопоэтина - 2 и обратная зависимость при исследовании экспрессии ангиопоэтина - 1. Некоторые исследователи не находят прогностической значимости показателей микрососудистой плотности при гепатоцеллюлярном раке. К настоящему времени нам известно о 6 публикациях, в которых исследовано 481случай ГЦК, из них в 189 случаях (2 исследования) A. Yamamoto с соавт. [1998] и J. Но с соавт. [2005] не обнаружили прогностической значимости показателей микрососудистой плотности, а в 292 случаях (4 статьи) N. Tanigawa с соавт. [1997], Н.С. Sun с соавт. [1999], O.N. El Assal с соавт. [1998], R.T. Рооп с соавт. [2002] она была выявлена. Причем в двух публикациях (Н.С. Sun с соавт. и R.T. Рооп с соавт.) подчеркивается, что эти данные получены только для опухолей размерами менее 5 см,. Мы применили другой способ оценки развитости микроциркуляторного русла в ГЦК, заключающийся в измерении периметров

сосудов опухоли, который, по-нашему мнению, более функционально отражает взаимоотношение опухолевых клеток со средой питания и обмена веществ, что дало возможность продемонстрировать значимость количественных параметров ангиогенеза для характеристики клинического поведения опухоли а, следовательно, для исхода онкологического заболевания.

Хорошим маркером синусоидов считается гладкомышечный антиген Действительно он вне опухоли отчетливо подчеркивал синусоидный рисунок печеночной ткани, но был резко редуцирован в ГЦК. Среднее количество перивазальных гладкомышечных клеток на единицу площади составило 26,б±1,87 шт/0,054 мм2. Для определения количества гладкомышечных элементов, приходящихся на единичный сосуд, мы использовали отношение числа маркированных гладкомышечным актином перивазальных элементов к микрососудистой плотности, измеренной по экспрессии CD31. Среднее количество перивазальных гладкомышечных клеток на единичный сосуд составило 0,8±0,17.

Были введены 2 новых показателя: отношение суммарного периметра и площади сечения микрососудов к количеству гладкомышечных клеток сосудистой стенки на единицу площади препарата (0,054 мм2). По показателю отношения суммарного периметра к количеству гладкомышечных клеток средняя составила 89,4±8,32 |!м/шт/0,054 мм2.

По показателю отношения суммарной площади поперечного сечения сосудов к количеству гладкомышечных клеток средняя составила 318,8±39,97 цм2/шт/0,054 мм2. При анализе общей и безрецидивной выживаемости способом t-test для группирующих показателей только показатель отношения суммарной площади к количеству гладкомышечных клеток показал значимое влияние на выживаемость, в подгруппе с показателем выше медианы - 267 |лп2/шт/0,054 мм2 средняя общая выживаемость составила 14,4 мес., ниже медианы 70,0 мес. (р=0,013). График выживаемости по методу Каплана-Мейера (рис. 3) (Cox's F-Test, р = 0,016), 5-тилетняя выживаемость 0% и 50% соответственно.

о полное исследование 1,0

цензурированное исследование

-> 267 мгт?/шт/0,054 мм2

350 - - - < 267 мп?/шт/0,054 ммг

Рис. 3. Общая выживаемость по методу Каплана-Мейера в зависимости от отношения суммарного периметра сосудов к количеству гладкомышечных клеток в ГЦК.

Описание экспрессии гладкомышечного актина в ХЦК в литературных источниках не встречается. В нашем исследовании выявлено наличие у ХЦК характерного рисунка по экспрессии гладкомышечного актина - «сетчатого» или «трабекулярно - синусоидного», что, по нашему мнению, является важным диагностическим критерием для дифференциального диагноза ХЦК

При сравнительном анализе показателей цитоморфометрии в первичных раках печени можно отметить достоверное отличие групп первичных раков печени ГЦК и ХЦК, наиболее достоверная разница выявлена по ядерно-цитоплазматическому соотношению 0.228 и 0.251 соответственно (р=0,00001). Можно отметить недостаточно высокую достоверность зависимости выживаемости от морфометрических показателей клеток опухоли и перифокальной зоны, наиболее значимым оказался показатель ядерно-цитоплазматического соотношения в опухоли - тенденция (р<0,058).

Группы опухолей ГЦК и ХЦК достоверно различаются только по количеству клеточных элементов, маркированных СБ45Б1В в перифокальной зоне р=0,02, т.е. по реакции окружающей ткани печени 42 и 54 шт/п.зр.

В результате однофакторного регрессионного анализа клинико-морфологических и иммуногистохимических факторов выявлено, что

существенное влияние на показатели выживаемости оказывают (в порядке убывания): суммарная площадь сечения микрососудов (г=0,56); соотношение ядерно-цитоплазматического показателя в опухоли и перитуморозной ткани печени (г=0,45); суммарный периметр стенки микрососудов (г=0,41); количество лимфоцитов перитуморозной ткани печени, маркированных С045ТШ (г=0,35).

По результатам однофакторного анализа провели многофакторный анализ прогностической значимости признаков (табл. 5, 6).

Таблица 5

Многофакторный дисперсионный анализ прогностических факторов общей выживаемости больных ГЦК (Р(5,12)=7,2793 р<0,0023 стандартная ошибка: 43,860)

Показатели Коэффициент Ве1а 1 Р

Я/Ц (о/п) -0,335195 -1,97906 0,066468

Площадь сосудов(о) -0,573021 -3,41667 0,003825

Количество С045 клеток(п) -0,407459 -2,14363 0,048861

Экспрессия УЕОР(п) 0,392641 2,00278 0,063616

Таблица 6.

Регрессионная модель Кокса в анализе выживаемости

Показатели Коэффициент Ве1а Ст. ошибка. г Статист. Вальда Р

я/ц0/п 2,474304 0,893782 2,768353 7,66378 0,005637

Площадь сосудов0 0,000519 0,000145 3,582517 12,83443 0,000341

СБ45КВ0/„ 0,446026 0,237434 1,878525 3,52886 0,060318

Проведенный одно - и многофакторный анализ выживаемости дает возможность построить математическую модель клинического течения заболевания и выявить наиболее значимые прогностические показатели - ими являются: суммарный периметр и площадь микрососудов.

Выводы.

1. Морфологическая дифференциальная ги сто генетическая диагностика первичных карцином печени является сложной задачей и решающее значение в ее разрешении принадлежит иммуногистохимическим исследованиям. Для ГЦК характерна экспрессия гепатоцитарного антигена (НерРаг1) и СБ 10; для ХЦК патогномоничным является обнаружение СК19. Кроме того, ГЦК обладает густой равномерной сетью синусоидных сосудов, выявляемых с помощью

CD31 и CD34. В противоположность этому в ХЦК микроциркуляторное русло более бедно и характеризуется неравномерностью распределения

2. Предлагаемый нами способ оценки выраженности ангиогенеза по сумме периметра микроциркуляторного русла на единицу площади обладает большей прогностической информативностью, чем обычно используемая плотность микрососудов (MVD; WeidnerN и соавт., 1991).

3. В первичных карциномах печени имеется статистически значимая разница в выраженности микроциркуляторного русла: в ГЦК в среднем 58,4±5,47 микрососудов, суммарный периметр 1830±130,3 ¡im, суммарная площадь сечения микрососудов 6239±601 цм2; в ХЦК - 11,8±1,01 микрососудов, суммарный периметр 1201± 103,3 |хм.

4. Степень развития микроциркуляторного русла в ГЦК, оцененная по величине суммы периметров микрососудов, обладает высокой статистически значимой прогностической информативностью: при величине этого показателя выше медианы (равной 1632 рм) средняя выживаемость больных составляла 19,3 мес, а при ее значении меньше медианы она увеличивалась до 86,7 мес. (р=0,035); 5-летнаяя выживаемость равна соответственно 0% и 43% (р=0,038). Средняя безрецидивная выживаемость при этих же условиях соответственно равна 15,3 мес и 62,4 мес. (р=0,026). Выраженность ангиогенеза в ГЦК является независимым прогностическим признаком.

5. Факторы ангиогенеза - VEGF, ангиопоэтин - 1 и ангиопоэтин - 2 экспрессируются в цитоплазме опухолевых и неопухолевых (перитуморозная зона) гепатоцитов и эндотелиальных клетках. Степень экспрессии этих факторов не коррелирует со степенью выраженности микроциркуляторного русла и не отражается на агрессивности опухоли и выживаемости больных.

6. Количественная и качественная оценка экспрессии иммуногистохимических маркеров в перифокальной зоне опухоли не выявила значимого влияния на биологическое поведение опухоли окружающей ткани печени.

7. Математическая модель, построенная на данных суммарного периметра и площади микрососудов, ядерно-цитоплазматического соотношения и индексе

CD45RB в перифокальной зоне печени дает возможность с высокой точностью предсказать клинический исход заболевания. Наиболее важным является суммарный периметр сосудов. Уравнение регрессии имеет вид: Выживаемость (месяцы) = 258 - 61(я/ц о/п) - 0,0129 (суммарная площадь микрососудов в опухоли, мкм2) - 1,52(количество CD45RB позитивных клеток в перитуморозной зоне) + 2,5(площадь экспрессии VEGF в перитуморозной зоне, %). Практические рекомендации.

1. Все резецированные первичные опухоли печени, после рутинного гистологического исследования необходимо для выделения ГЦК проводить иммуногистохимическое исследование на определение экспрессии гепатоцитарного антигена. Среди первичных опухолей негативных к гепатоцитарному антигену необходимо выделить ГЦК негативные к гепатоцитарному антигену путем исследования экспрессии CD31 (равномерность сосудистого рисунка, равномерность распределения сосудов, паттерн - трабекулярный или синусоидный тип сосудов), и др. антитела.

2. Первичные опухоли печени позитивные к гепатоцитарному антигену для выделения метастазов других локализаций, необходимо проводить исследование ШИК и ШИК с диастазой (наличие или отсутствие гликогена -дифференциальная диагностика с аденокациномами), иммуногистохимическое исследование с использованием следующих антител CD3I (равномерность распределения сосудов - дифференциальная диагностика с аденомами); СК10, СК19 (дифференциальная диагностика с ХЦК).

3. ГЦК для оценки сосудистого статуса иммуногистохимически исследуются на один из панэндотелиальных маркеров (CD31, CD34). По экспрессии маркера на малом увеличении х50-100 определяются участки с наибольшей концентрацией сосудов и наиболее отчетливым окрашиванием (hot spot). С помощью цифровой камеры производятся 5-10 фиксированных изображения с увеличением х200-400. С помощью компьютерного анализатора изображения - оператор измерения дистанции определяется суммарный периметр стенки микрососудов на единицу площади или оператор площадь определяется

суммарная площадь сечения микрососудов на единицу площади. Для оценки сосудистого статуса ГКЦ не приемлема методика определения микрососудистой плотности по Weidner, т.к дает результат не согласующийся с теорией ангиогенеза.

4. При исследовании факторов ангиогенеза (VEGF, ангаопоэтин - 1 и ангиопоэтин - 2) в ГЦК следует исследовать экспрессию маркеров в опухоли и перитуморозной зоне, и оценивать степень превышения экспрессии факторов ангиогенеза в опухоли над перитуморозной зоной.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Пожарисский K.M. Ангиогенез в опухолях печени и его прогностическое значение/ K.M. Пожарисский, Д.А. Гранов, В.П. Тен, А.И. Рассказов// IV съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. - Баку, 2006. - С. 51.

2. Пожарисский K.M. Особенности ангиогенеза в раке печени и их прогностическое значение (клинико-иммуногистохимическое исследование)/ K.M. Пожарисский, Д.А. Гранов, В.П. Тен, А.И. Рассказов// Арх. пат. - 2006. - Вып. 6. - С, 6-10.

3. Тен В.П. Способы оценки выраженности ангиогенеза в гепатоцеллюлярном раке и их прогностическое значение/ В.П. Тен// XII межрегиональная конференция онкологов. - Якутск. - 2007. - С. 102.

4. Тен В.П. Иммуногистохимический дифференциальный диагноз гепатоцеллюлярной и холангиоцеллюлярной карционом печени/ Тен В.П.// XII межрегиональная конференция онкологов. - Якутск. - 2007. - С. 103.

5. Пожарисский K.M. Значение иммуногистохимии для изучения новообразований печени: дифференциальный диагноз, прогностические маркеры/ K.M. Пожарисский, Д.А. Гранов, В.П. Тен, А.Г. Кудайбергенова, Е.Е. Леенман, А.И. Рассказов// Вопр. онкол. - 2008. - Т. 54 (№4). - С. 417-433.

Подписано в печать 15. 01. 2009 г. Формат 60x84 1/16. Объем 1.0.п.л. Тираж 100 экз. Заказ 1194.

Типография «СПбМАПО» 191015,СПб., ул.Кирочная д.41

Актуальность темы.

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из наиболее часто встречаемых злокачественных опухолей, особенно в определенных регионах мира (Гранов A.M., Петровичев Н.Н., 1977), и составляет более 90% всех первичных раков печени. Ежегодно в мире регистрируется более 500 ООО новых случаев этой опухоли, однако распространенность ее неравномерна. Так, в Северной Америке ежегодно регистрируется 3,2 случая на 100000 населения, а в странах Юго-Восточной Азии доходит до 35,8/100000 человек (Hirphashi S. и соавт., 2000). В тоже время имеются сведения о резком учащении этих опухолей в США (El-Serag Н. В.2002), что привело к двукратному увеличению смертности от онкологических заболеваний за последние 20 лет. Вторая разновидность злокачественных опухолей печени - холангиоцеллюлярный карцинома (ХЦК) также характеризуется резко выраженными географическими различиями: США-0,4, а Таиланд-84,6 на 100000 жителей (Nakamuna У. и соавт., 2000) Средняя продолжительность жизни у больных с первичными раками печени (гепа-тоцеллюлярным раком и холангиоцеллюлярным раком) является одной из наименьших, не превышая 8 мес. с момента установления диагноза (Schoniger-Henike М, 2001).

Известно, что лучшие данные выживаемости среди пациентов со злокачественными опухолями печени достигаются путём выполнения радикальных резекций (Таразов П.Г., 2001). Однако такие операции до сих пор осуществимы лишь у 5-15% больных (Гранов A.M. и Таразов П.Г., 1999). Низкая эффективность различных хирургических, химио- и радиотерапевтических методов лечения заставляет искать новые подходы к терапии первичных раков печени (Гранов A.M., Петровичев Н.Н., 1977).

Одним из таких направлений может быть разработка так называемой антиангиогенной терапии (Kerbel Т., 2002), которая базируется на специфическом действии противоопухолевого химиотерапевтического средства на сосудистое русло опухоли, таким образом, редуцируя его, приводит к некробиотическим и апоптотическим изменениям в самой опухоли.

В настоящее время опухолевый неоангиогенез интенсивно изучается во многих странах в различных аспектах: роль его в патогенезе опухолевого роста, диагностических методах, в качестве противоопухолевой терапии, прогностических маркеров течения онкологических заболеваний, значение разработки методов интервенционной радиологии и хирургических способов лечения разнообразных опухолей.

Учение об опухолевом ангиогенезе, инициированное и обоснованное J. Folkman (Folkman J., 1971), и развитое другими исследователями (Harris A.L., 1997; Hoeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт.,1999; Kerbel R.S., 2000), оказалось весьма продуктивным в онкоморфологии. Оно, с одной стороны, внесло много важных фактов в патогенез опухолевого роста (Hanahan D., Folkman J., 1996; Harris A.L., 1997; Hoeben А. и соавт., 2004; Holash J. и соавт., 1999), а, с другой стороны, стало значительным достижением в практической медицине как для поиска новых мишеней лекарственного воздействия на опухоль, так и в определении прогноза при многих онкологических заболеваниях. В этом направлении проведено огромное количество исследований, показавших, что степень кровоснабжения опухоли является фактором, определяющим клиническое течение новообразования (Gasparini G., Harris A.L., 1999). Такие сведения получены для рака молочной железы (Vartanian R.K., Weidner N., 1994), простаты (Halvorsen O.J. и соавт., 2000), легкого (Fontanini G. и соавт., 1997), мела-номы (Graham С.Н. и соавт., 1994). К сожалению, в нашей стране это важное и крайне перспективное направление практически не получило развития. В то же время, в связи с внедрением в научные исследования методов иммуногистохимии, создались хорошие предпосылки для широкого и глубокого изучения проблемы опухолевого неоангиогенеза в самых различных направлениях. Сейчас трудно найти опухоли, которые не подвергались бы изучению в плане особенностей их ангиогенеза.

Однако, ангиогенезу в опухолях печени посвящено мало исследований. Кроме того, в работах, по изучению ангиогенеза в гепатоцеллюляр-ной карциноме, обычно используются единичные иммуногистохимиче-ские маркеры [Kimura Н. и соавт. 1998; Jin-no К. и соавт., 1998; Li Х.М. и соавт., 1999; Sasaki Y. и соавт., 2002; Sugimachi К. и соавт., 2003; Moon W.S. и соавт., 2003; Chen X. и соавт., 2004.], что не дает возможности получить целостное представление об этом процессе в опухоли. Для этого необходимы комплексные исследования с анализом экспрессии многочисленных маркеров, отражающих как уровень неоангиогенеза, так и факторы его регуляции.

Этому способствует широкое распространение компьютерных технологий (цифровые камеры, анализаторы изображений и т.д.) для использования морфометрии, в частности для количественной и качественной характеристики кровоснабжения новообразований. При компьютерной обработке изображений достигается высокая воспроизводимость результатов за счет большого массива исследованных объектов (Ваак К., 1994; Sallinen С., 1994). Осуществление такого изучения возможно только в центрах, занимающихся оперативной гепатологией и владеющих многочисленными иммуногистохимическими технологиями и способами мор-фометрического анализа.

Цель исследования.

Целью настоящей диссертационной работы является комплексное сравнительное иммуногистохшшческое изучение уровня развития микро-циркуляторного русла (плотности микрососудов на единицу площади), степени его дифференцировки и факторов ангиогенеза в гепатоцеллю-лярном и холангиоцеллюлярном раках с для определения роли степени кровоснабжения опухоли в ее биологическом поведении (клиническом течении) и исходе заболевания.

Эта цель реализована путем использования широкой панели имму-ногистохимических маркеров (более 15), отражающих гистогенетическое происхождение опухоли, степень развития ее микроциркуляторного русла и факторов, способствующих опухолевому неоангиогенезу с количественной оценкой перечисленных факторов при помощи компьютерного анализа изображений.

Задачи исследования.

1. Разработка оптимальной иммуногистохимической панели для определения нозологической формы (гистогенеза) первичных опухолей печени гепатоцеллюлярные, холангиоцеллюлярные карциномы

2. Разработка оптимальных способов исследования сосудистого статуса опухоли, методики измерения плотности микрососудистой сети, экспрессии факторов ангиогенеза и их соотношения с выраженностью микроциркуляторного русла.

3. Количественная оценка микроциркуляторного русла в первичных раках печени.

4. Изучение морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла в первичных раках печени с помощью маркеров, отражающих дифференцировку гладкомышечных клеток.

5. .Выявление значения плотности микрососудов, уровни их дифферен-цировки и факторов ангиогенеза в клиническом поведении первичных опухолей печени (рецидивирование, метастазирование, выживаемость) на основании изучения корреляционных связей между изучаемыми параметрами

6. Изучение факторов ангиогенеза: VEGF, ангиопоэтин - 1, ангиопоэтин - 2 в сопоставлении с количественными параметрами микроциркуля-торного русла.

7. Построение математической модели клинического поведения опухоли печени по количественным показателям оценки экспрессии имму-ногистохимических маркеров.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено комплексное клинико-иммуногистохимическое исследование первичных карцином печени с одновременным определением ряда маркеров, характеризующих наиболее важные патогенетические особенности опухоли, а именно, микрососудистую плотность (количество микрососудов сосудов, суммарный периметр микрососудов и суммарная площадь просвета на единицу площади препарата), ядерно-цитоплазматическое соотношение, воспалительную лейкоцитарную реакцию, экспрессия факторов ангиогенеза (эндотелиальный сосудистый фактор роста, ангиопоэтины 1 и 2).

Показано, что суммарный периметр стенки микрососудов и суммарная площадь просвета являются высокозначимыми прогностическими признаками. Впервые показано взаимодействие изученных морфометри-ческих показателей микрососудистой плотности, ядерно-цитоплазматического соотношения, воспалительной лейкоцитарной реакции и экспрессии факторов ангиогенеза, обусловливающее биологическое поведение ГЦК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее адекватным гистогенетическим маркером ГЦК является ге-патоцитарный антиген (HepParl) чувствительность 100%, специфичность 92%, а ХЦК - СК19 чувствительность 83%, специфичность 78%

2. ГЦК характеризуется богатой, равномерно распределенной сосудистой сетью, что может служить дифференциально-диагностическим признаком для отличия ее от гиперпластических изменений печени, с одной стороны, холангиоцеллюлярной карциномы, с другой.

3. Выраженность микроциркуляторного русла ГЦК, определенная по сумме периметров сосудов и или сумме площади сечения сосудов, выявляемых иммуногистохимическим маркером эндотелия CD31, служит достоверным прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных этим типом рака.

4. Экспрессия факторов ангиогенеза (VEGF, ангиопоэтины 1 и 2), определенная иммуногистохимически не является прогностическим признаком для оценки общей и безрецидивной выживаемости больных ГЦК.

Выводы.

1. Морфологическая дифференциальная гистогенетическая диагностика первичных карцином печени является сложной задачей и решающее значение в ее разрешении принадлежит иммуногистохимическим исследованиям. Для ГЦК характерна экспрессия гепатоцитарного антигена (HepParl) и CD 10; для ХЦК патогномоничным является обнаружение СК19. Кроме того, ГЦК обладает густой равномерной сетью синусоидных сосудов, выявляемых с помощью CD31 и CD34. В противоположность этому в ХЦК микроциркуляторное русло более бедно и характеризуется неравномерностью распределения

2. Предлагаемый нами способ оценки выраженности ангиогенеза по сумме периметра микроциркуляторного русла на единицу площади обладает большей прогностической информативностью, чем обычно используемая плотность микрососудов (MVD; Weidner N и соавт., 1991).

3. В первичных карциномах печени имеется статистически значимая разница в выраженности микроциркуляторного русла: в ГЦК в среднем 58,4±5,47 микрососудов, суммарный периметр 1830±130,3 р.м, суммарная площадь сечения микрососудов 6239±601 р.м2; в ХЦК - 11,8±1,01 микрососудов, суммарный периметр 1201±103,3 |ш.

4. Степень развития микроциркуляторного русла в ГЦК, оцененная по величине суммы периметров микрососудов, обладает высокой статистически значимой прогностической информативностью: при величине этого показателя выше медианы (равной 1632 цм) средняя выживаемость больных составляла 19,3 мес, а при ее значении меньше медианы она увеличивалась до 86,7 мес. (р=0,035); 5-летнаяя выживаемость равна соответственно 0% и 43% (р=0,038). Средняя безрецидивная выживаемость при этих же условиях соответственно равна

15,3 мес и 62,4 мес. (р=0,026). Выраженность ангиогенеза в ГЦК является независимым прогностическим признаком.

5. Факторы ангиогенеза — VEGF, ангиопоэтин - 1 и ангиопоэтин - 2 экспрессируются в цитоплазме опухолевых и неопухолевых (перитуморозная зона) гепатоцитов и эндотелиальных клетках. Степень экспрессии этих факторов не коррелирует со степенью выраженности микроциркуляторного русла и не отражается на агрессивности опухоли и выживаемости больных.

6. Количественная и качественная оценка экспрессии иммуногистохимических маркеров в перифокальной зоне опухоли не выявила значимого влияния на биологическое поведение опухоли окружающей ткани печени.

7. Математическая модель, построенная на данных суммарного периметра и площади микрососудов, ядерно-цитоплазматического соотношения и индексе CD45RB в перифокальной зоне печени дает возможность с высокой точностью предсказать клинический исход заболевания. Наиболее важным является суммарный периметр сосудов. Уравнение регрессии имеет вид:

Выживаемость (месяцы) = 258 - 67{я/ц о/п) - 0,0129 {суммарная площадь микрососудов в опухоли, мкм ) - 1,52{количество CD45RB позитивных клеток в перитуморозной зоне) + 2,5{площадь экспрессии VEGF в перитуморозной зоне,%).

Практические рекомендации.

1. Все резецированные первичные опухоли печени, после рутинного гистологического исследования (необходимо для выделения ГЦК) проводить иммуногистохимическое исследование на определение экспрессии гепатоцитарного антигена. Среди первичных опухолей негативных к гепатоцитарному антигену необходимо выделить ГЦК негативные к гепатоцитарному антигену путем исследования экспрессии CD31 (равномерность сосудистого рисунка, равномерность распределения сосудов, паттерн - трабекулярный или синусоидный тип сосудов), и др. антитела.

2. Первичные опухоли печени позитивные к гепатоцитарному антигену (для выделения метастазов других локализаций), необходимо проводить исследование ШИК и ШИК с диастазой (наличие или отсутствие гликогена - ' дифференциальная диагностика с аденокациномами), иммуногистохимическое исследование с использованием следующих антител CD31 (равномерность распределения сосудов — дифференциальная диагностика с аденомами); CD 10, СК19 (дифференциальная диагностика с ХЦК).

3. ГЦК для оценки сосудистого статуса иммуногистохимически исследуются на один из панэндотелиальных маркеров (CD31, CD34). По экспрессии маркера на малом увеличении х50-100 определяются участки с наибольшей концентрацией сосудов и наиболее отчетливым окрашиванием (hot spot). С помощью цифровой камеры производятся 5-10 фиксированных изображения с увеличением х200-400. С помощью компьютерного анализатора изображения - оператор измерения дистанции определяется суммарный периметр стенки микрососудов на единицу площади или оператор площадь определяется суммарная площадь сечения микрососудов на единицу площади. Для оценки сосудистого статуса ГКЦ не приемлема методика определения микрососудистой плотности по Weidner, т.к дает результат не согласующийся с теорией ангиогенеза.

4. При исследовании факторов ангиогенеза (VEGF, ангиопоэтин — 1 и ангиопоэтин - 2) в ГЦК следует исследовать экспрессию маркеров в опухоли и перитуморозной зоне, и оценивать степень превышения экспрессии факторов ангиогенеза в опухоли над перитуморозной зоной.