Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Оптимизация технологий борьбы со стафилококковыми инфекциями

005556306

ЧАНЫШЕВА Римма Фанильевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЙ БОРЬБЫ СО СТАФИЛОКОККОВЫМИ

ИНФЕКЦИЯМИ

14.02.02 — эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 ш гт

Нижний Новгород - 2014

005556306

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Ковалишеиа Ольга Васильевна,

доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты: Сергевнпн Виктор Иванович,

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Пермь), профессор кафедры эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФПК и ППС

Брусина Елена Борисовна,

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Кемерово), заведующий кафедрой эпидемиологии

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Москва

Защита состоится « 23 » декабря 2014 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.061.04 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (603950, г. Н. Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии (603104, г. Н. Новгород, ул. Медицинская,

д.ЗА)

Автореферат разослан » 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Богомолова Елена Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. К стратегическим направлениям профилактики инфекций в медицинских организациях в соответствии с «Национальной концепцией профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (2011) относится рационализация применения антимикробных препаратов (АМП) на основе проведения мониторинга чувствительности основных возбудителей, а также совершенствование технологий по обеспечению эпидемиологической безопасности медицинского персонала и пациентов. Это особенно актуально в отношении инфекций, вызванных Staphylococcus spp. Данная группа микроорганизмов характеризуется распространенностью в человеческой популяции, значительным видовым разнообразием, при этом в развитии инфекционного процесса имеют значение как S.aureits, так и представители коагулазоотрицательных стафилококков (CoNS) (Caputo G.M. et al„ 1999; Von Eiff C. et al., 2002, Венцел P. и соавт., 2004; Брусина Е.Б. и соавт., 2006; Благонравова А.С. и соавт., 2009; Ефимова Т.В. и соавт., 2011; Кузнецова М.В. и соавт., 2011).

В борьбе со стафилококковыми инфекциями широко используются различные группы АМП — антибиотики (АБ), дезинфектанты (ДС), антисептики (АС), бактериофаги (БФ), применяются различные способы и формы их применения (растворы, ткани, салфетки с антимикробной активностью). Несомненно, что эффективность данных препаратов во многом будет определяться распространенностью приобретенной устойчивости в популяции этиологически значимых стафилококков. Распространенность антибиотикорезистентности Staphylococcus spp. наиболее изучена. Увеличение доли штаммов, устойчивых к метициллину (MRS) является наиболее актуальной проблемой (Дехнич, А.В., 2002; Страчунский Л.С. и соавт., 2005; Martins А. et al.,2007). В популяции стафилококков также распространена устойчивость к ДС и АС разных групп, которая может находиться на достаточно высоком уровне, а формироваться вне зависимости от состояния чувствительности микроорганизма к применяемым АБ; присутствуют видовые различия чувствительности (Красильников

A.П., 1995; Шкарин В.В. и соавт., 2003; Саперкин Н.В., 2009; Aarestrup F.M. et al., 2004; Bricez WJ. et al., 2005; Weisser M. et al., 2010).

В условиях распространения резистентных к АМП штаммов микроорганизмов становится актуальным применение с лечебно-профилактической целью препаратов БФ (Иванов А.В., 2000; Послова Л.Ю., Ковалишена О.В., 2009; Брусина Е.Б. и соавт., 2010). Преимущества БФ хорошо известны: специфичность, возможность сочетания с любыми лекарственными средствами, отсутствие противопоказаний, эффективность в отношении штаммов, устойчивых к АМП и др. Однако, некоторые особенности биологии стафилококковых фагов, а также формирование фагорезистентности, могут ограничивать их применение как средства лечения и профилактики (Brussow Н. et al., 2004, Зуева Л.Г1. и соавт., 2012). В сфере производства препаратов лечебно-профилактических БФ важными задачами являются конструирование препаратов на основе чувствительных штаммов-продуцентов, совершенствование технологического процесса, создание поливалентных препаратов, расширение номенклатуры лекарственных форм (Sulakvelidse A. et al., 2004, Функнер Е.В., 2007; Ковязина Н.А. и соавт., 2013).

В борьбе со стафилококковыми инфекциями в условиях МО, особое значение придается разработке и применению эпидемиологически безопасных медицинских технологий, внедрение современных мер защиты медицинского персонала (Сергевнин

B.И., 2011, Брико Н.И. с соавт., 2014). Принимая во внимание стратегию профилактики

ИСМП на национальном уровне и учитывая накопленные эпидемиологические данные о распространенности устойчивости Staphylococcus spp. к различным АМП, включая БФ, представляется крайне важным оптимизация существующих мер борьбы с инфекциями указанной этиологии.

Степень разработанности темы исследования.

БФ, гомологичные 5. aureus, достаточно широко распространены и тщательно изучены. С изменением представлений о значимости CoNS активно ведутся исследования по выделению коагулазоотрицательных БФ и изучению их генома, а также возможности их применения (Christie G. Е. et al., 2010; Deghorain М. et al., 2012; Kutter E. et al., 2012; Gutiérrez D. et al., 2012). К настоящему времени имеются данные об использовании БФ для эффективного лечения и профилактики различных бактериальных инфекций, в том числе стафилококковых (Благонравова А.С., 2004; Асланов Б.И. и соавт., 2012; Дмитренко О.А. и соавт., 2013). Обращает на себя внимание относительно небольшое - в сравнении с АБ и ДС - количество публикаций, которые бы касались детальной оценки чувствительности возбудителей различных инфекций к препаратам бактериофагов.

Проблема устойчивости микроорганизмов-возбудителей ИСМП к дезинфицирующим и антисептическим средствам не нова, но в последние десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении механизмов и условий формирования устойчивости, разработке методических подходов к ее исследованию, накопление научных данных о распространенности и характеристиках устойчивости дифференцированно по видам микроорганизмов, группам биоцидов, типам МО и другие (Пантелеева Л.Г., 2003, Шкарин В.В., Ковалишена О.В., 2006; Благонравова А.С., 2012; Акимкин В.Г., 2014). Проблема устойчивости к JIC и АС в большей степени изучена для грамотрицательных микроорганизмов, прежде всего, P.aeruginosa, E.coli, что обусловлено особенностями строения данных микроорганизмов и их экологией, а также адаптационным потенциалом. В отношении стафилококков устойчивость к ДС и АС изучена недостаточно, требуется комплексный подход.

Еще один важный аспект проблемы - комбинированная устойчивость, возникающая к нескольким АМП. Систематическое изучение механизмов, закономерностей и характеристик комбинированной устойчивости является новым перспективным научным направлением, востребованным в медицине.

Таким образом, имеется довольно большой арсенал средств борьбы и профилактики инфекций в МО, однако требуется совершенствование имеющихся технологий эпидемиологического надзора и контроля, создание новых технологий с оценкой фактической эффективности.

Цель исследования: научное обоснование, разработка и внедрение усовершенствованных технологий эпидемиологического надзора и контроля за инфекциями стафилококковой этиологии.

Задачи исследования:

1. Оценить распространенность устойчивости внутри- и внебольничных штаммов Staphylococcus spp. к АМП (АБ, ДС, АС, БФ) по результатам регионального микробиологического мониторинга:

1.1. распространенность устойчивости Staphylococcus spp. к коммерческим препаратам, содержащим гомологичные БФ;

1.2. распространенность комбинированной устойчивости (АБ, БФ);

1.3. распространенность устойчивости Staphylococcus spp. к ДС, АС.

2. Выделить и селекционировать БФ, активный в отношении штаммов CoNS.

3. Изучить возможность и условия формирования устойчивости Staphylococcus spp. к дезинфектантам группы ПАВ (ЧАС).

4. Провести оценку различных способов и форм применения АС и ДС (в составе хирургических перчаток с внутренним антисептическим покрытием, тканей, пропитанных ДС), конструктивных решений (укладки со смотровыми перчатками), как антисептических и асептических технологий, обеспечивающих эпидемиологическую безопасность манипуляций/операций (в экспериментальных условиях).

5. Усовершенствовать технологии борьбы с инфекциями стафилококковой этиологии.

Научная новизна

Впервые на региональном уровне определена распространенность устойчивости клинических штаммов Staphylococcus spp. к коммерческим препаратам лечебно-профилактических БФ, а также распространенность комбинированной устойчивости к АБ и БФ.

Впервые выделен стафилококковый коагулазонегативный БФ высокой литической активности, относящийся к хвостатым фагам с длинным несократимым отростком (отряду Caudovirales, сем. Siphoviridae; IV морфологическая группа по А.С. Тихоненко).

Впервые осуществлен эксперимент по формированию устойчивости у грамположительных бактерий (тест-штамм S. aureus) к ДС из группы ЧАС.

Теоретическая н практическая значимость работы

Результаты исследования позволяют обосновать новые подходы к решению важной задачи в области здравоохранения по улучшению качества и безопасности оказания медицинской помощи населению и профилактики ИСМП, путем совершенствования компонентов эпидемиологического надзора и контроля за инфекциями стафилококковой этиологии.

Расширены научные представления о фагочувствителыюсти стафилококков, научно подтверждена необходимость проведения мониторинга чувствительности к применяемым коммерческим препаратам БФ не только в пределах МО или при назначении индивидуальной терапии и профилактики, но и на региональном уровне с учетом территориальной циркуляции микроорганизмов и распространении устойчивости в микробной популяции к применяемым коммерческим препаратам. Научно обоснована необходимость периодического обновления коммерческих препаратов БФ по результатам регионального мониторинга фагочувствительности.

Разработаны параметры мониторинга фагочувствителыюсти Staphylococcus spp. в рамках комплексной оценки устойчивости к АМП на территориальном уровне как компонента эпидемиологического надзора за ИСМП.

Выделенный стафилококковый БФ, активный в отношении CoNS, может быть в дальнейшем использован для конструирования лечебно-профилактического препарата.

Доказана возможность использования модели по формированию индуцированной устойчивости к ДС на грамположительных микроорганизмах, а также дана характеристика условий формирования устойчивости S.aureus к ДС из группы ПАВ.

Результаты оценки эффективности различных технологий асептики и антисептики позволяют рекомендовать их ко внедрению в практическое здравоохранение как технологий, обеспечивающих эпидемиологическую безопасность инвазивных манипуляций и больничной среды.

Методология н методы исследования

Методология исследования определена принципами доказательной медицины и организована в соответствие с целью и задачами исследования. Для решения поставленных задач было проведено многолетнее комплексное региональное исследование, структурно выделенное в несколько направлений. Материалы, объемы, методы и типы исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Характеристика материалов, объемов, методов и типов исследования

Направления исследования Материалы исследования Объем исследования Типы и методы исследования

Определение чувствительности Staphylococcus spp. к АМП Журналы лабораторных исследований 17 ед. Описательно-оценочные, аналитические исследования. Микробиологический мониторинг. Статистические методы

Клинический материал; смывы с рук медицинских работников и объектов внешней среды (1133 пробы) 1141 культур Staphylococcus spp. " Микробиологические методы выделения и видовой идентификации. Определение чувствительности к АБ, ДС, АС, БФ

Выделение БФ Клинический материал (26 проб) 26 культур CoNS Экспериментальное исследование. Микробиологические методы выделения и видовой идентификации. Метод агаровых слоев Грациа

Формирование устойчивости к ЧАС 'Гест-штамм S. aureus, №906 238 культур Экспериментальное исследование. Определение чувствительности к АБ, ДС, БФ

Экспериментальная оценка медицинских технологий Тест-штамм S. aureus, №906 1 штамм Экспериментальное исследование. Определение проницаемости для тест-штамма. Оценка бактерицидного эффекта внутреннего АС-покрытия.

Хирургические перчатки с внутренним АС-покрытием 70 пар

Хирургические перчатки без АС-покрытия 25 пар

Тест-штамм S. aureus, №906 1 штамм Экспериментальное исследование. Определение проницаемости для тест-штамма. Оценка эффективности укладки

Смотровые перчатки с укладкой SD (опыт) 2 упаковки по 50 пар

Смотровые перчатки (контроль) 1 упаковка по 50 пар

Тест-штамм S. aureus, №906 1 штамм Экспериментальное исследование. Оценка антимикробной активности

Образцы тканей, пропитанные ДС 60 образцов. 15x15 см

Образцы тканей, не обработанные ДС 30 образцов, 15x15 см

Примечание'. АС-покрытие - антисептическое покрытие

При определении чувствительности Staphylococcus spp. к АМП выделение и идентификация культур проводились стандартными бактериологическими (МЗ СССР № 535 от 22.04.1985г.) и биохимическими методами исследования (тест-системы ПБДС, производства НПО «Диагностические системы» г. Н.Новгород; «СТАФИтест16» PLIVA-Lacheraa Diagnostica, Чехия; «BBL Crystal», Becton Dickinson, США). Оценка чувствительности к АБ осуществлялась диско-диффузионным методом на плотной питательной среде в соответствие с МУК 4.2.1890-04. Для выявления фагорезистентности штаммов к коммерческим стафилококковым моно- и

комбинированным препаратам («Бактериофаг стафилококковый жидкий», «Интести-бактериофаг жидкий», «Пиобактериофаг комбинированный жидкий», производства ФГУП «НПО «Микроген», г, Н, Новгород) была использована методика «стерильного пятна» (spot-методика). Определение устойчивости к ДС и АС проводилось по методике «Способ определения чувствительности микроорганизмов к ДС (варианты)» (В.В. Шкарин, О.В. Ковалишена, О.Н. Воробьева, A.C. Благонравова и др., 2010), патент РФ 2378363.

Для обнаружения и выделения БФ из культур CoNS была выбран метод агаровых слоев Грациа, определение активности БФ проводилось методом Аппельмана и Грациа (Адаме М., 1961; Гольдфарб Д.М., 1961). Исследование структуры вириона - методом негативного контрастирования 2,0% водным раствором уранилацетата при увеличении в 60-120 тыс. раз и ускоряющем напряжении 70 кВ.

Исследование возможности формирования устойчивости у грамположительных бактерий к ДС включало проведение лабораторного эксперимента на модели воздействия суббактерицидных концентраций ЧАС на суточную культуру тест-штамма S. aureus (№906). Эксперимент проводился по методике «Способ моделирования формирования устойчивости бактерий к дезинфицирующему средству» (Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Благонравова A.C., Саперкин Н.В. и др., 2011), патент РФ 2437932.

Экспериментальная оценка эффективности различных технологий асептики и антисептики в плане обеспечения эпидемиологической безопасности медицинских манипуляций включала исследования: проницаемости смотровых и хирургических перчаток [Сергевнин В.И. Экспериментальная оценка возможности проникновения возбудителей гнойно-септических инфекций через латексные и нитриловые медицинские перчатки // Здоровье населения и среда обитания, 2011г., №9, с.11-14]; бактерицидного эффекта внутреннего антисептического покрытия, бактерицидной активности тканей, пропитанных ДС и исследование укладок смотровых перчаток -методики оценки бактерицидной активности ДС и АС (с изменениями) (Р 4.2.2643.3.5.).

В рамках перечисленных направлений были проведены описательно-оценочные продольные, аналитические, микробиологические и лабораторные экспериментальные исследования. Всего в исследование вошло: 17 медицинских документа, 923 образца клинического материала, 236 проб смывов с объектов внешней среды, 1405 культур микроорганизмов. Всего произведено 3578 лабораторных исследований, из них экспериментальных - 1382.

Основные клинические базы - 15 НПО г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Также в исследование вошли штаммы стафилококков, собранные в ходе регионального микробиологического мониторинга за 2009-2011 гг., охватывающего более 50 МО.

Статистическая обработка материала проводилась с использованием стандартных пакетов программ STATISTICA 6.0 и Epilnfo version 3.5.1. прикладных компьютерных программ Excel, Word. Были использованы методы вариационной статистики, методы оценки достоверности различий показателей. Относительные показатели рассчитывались с определением доверительных границ колебаний показателей с вероятностью безошибочного прогноза 95% [95% ДИ]. Различия между независимыми группами данных считались достоверными при р <0,05.

Личное участие автора в получении результатов

Автором самостоятельно и в полном объеме выполнены все эпидемиологические исследования, анализ и обработка результатов, проведены экспериментальные

исследования по формированию устойчивости к ДС и оценки технологий асептики и антисептики, проведена большая часть микробиологических исследований. Выделение специфического коагулазоотрицателыюго стафилококкового БФ было выполнено совместно с д.м.н., профессором Григорьевым A.A. Изучение ультраструктуры выделенного БФ выполнено сотрудниками института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди Staphylococcus spp., циркулирующих на территории Нижегородской области и вызывающих внутри- и внеболышчные инфекции, установлена высокая распространенность устойчивости к АМП, включая фагорезистентность, перекрестную устойчивость к двум и боле препаратам БФ, комбинированную устойчивость к АБ и БФ. Полученные результаты являются научным обоснованием оптимизации микробиологического мониторинга в рамках комплексной оценки устойчивости к АМП, а также необходимости актуализации выпускаемых препаратов стафилококковых БФ и разработки новых препаратов на основе фагов, активных в отношении CoNS.

2. Выделенный в результате эксперимента гомологичный коагулазонегативный стафилококковый БФ обладает высокой литической активностью, по своим морфологическим свойствам относится к отряду/порядку Caudovirales, семейству Siphoviridae (международная классификация ICTV); по классификации, предложенной A.C. Тихоненко - к фагам с длинным несокращающимся отростком (IV морфологическая группа вирусов бактерий).

3. Новые технологии асептики (укладки смотровых перчаток) и антисептики (перчатки с внутренним антисептическим слоем) относятся к медицинским технологиям, обеспечивающим эпидемиологическую безопасность манипуляций/операций, как для медицинского персонала, так и для пациентов.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность результатов исследования определяется методами исследования и обработки первичной информации (современные, правильно подобранные), большим объемом фактического материала, репрезентативностью выборки.

Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании проблемной комиссии по иммунологии, инфекционной патологии и эпидемиологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России (17 сентября 2014 г.)

Результаты работы доложены и обсуждены на I Всероссийской и XII ежегодной научной сессии молодых ученых и студентов с международным участием «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 14-15 марта 2013 г.), 18 Нижегородской сессии молодых ученых (29-31 мая 2013 г.), III Международном конгрессе по профилактике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (Москва, 20-21 ноября 2013 г.), XV Международном Медицинском форуме «Качество и безопасность оказания медицинской помощи» (Н.Новгород, 27-29 мая 2014 г.), на заседании постоянно действующей Школы-семинара госпитальных эпидемиологов Нижегородской области (Н.Новгород, 2014 г.). Результаты исследования отмечены дипломом I степени на 18 Нижегородской сессии молодых ученых; дважды дипломом победителя регионального этапа Всероссийского конкурса программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») и грантов Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на осуществление проекта (2012, 2014 гг.).

Рекомендации по комплексной оценке чувствительности клинических штаммов стафилококков к АМП внедрены в практику работы Центра мониторинга устойчивости на базе НИИ профилактической медицины ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России (акт внедрения 05.2014 г.).

Подобрана и передана в филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России (г. Н.Новгород) коллекция штаммов Staphylococcus spp. для актуализации и обновления коммерческих препаратов БФ (акт приема-передачи 08.2014г.).

Материалы исследования вошли в Федеральные клинические рекомендации «Организация мониторинга устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам в МО» (В.В. Шкарин, О.В. Ковалишепа, А.С. Благонравова, Л.А. Башкатова, О.Н. Княгина, И.Н. Окунь, Н.В. Саперкин, И.Ю. Широкова, НЛО. Иванова, Р.Ф. Чанышева, 2013), протокол №2 от 26.09.2013г. Общего собрания членов НП «НАСКИ» и протокол №2 от 26.09.2013г. заседания Профильной комиссии МЗ РФ по эпидемиологии в период проведения Всероссийской конференции с международным участием «Эпидемиология в XXI веке: новые горизонты профилактики», Кемерово, 2527 сентября 2013г.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры эпидемиологии и кафедры профилактической медицины факультета повышения квалификации врачей ГБОУ ВПО «НижГМА Минздрава России» при чтении лекций, проведении семинаров со студентами, ординаторами, интернами, врачами-специалистами, а также включены в программу дополнительного профессионального образования и повышения квалификации госпитальных эпидемиологов МО Нижегородской области.

Результаты диссертационного исследования ихчожены в 11 публикациях, в т. ч. 3 статьи из списка, рекомендованного ВАК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

С целью оценки эффективности применяемых средств борьбы со стафилококковыми инфекциями и определения необходимости их совершенствования на первом этапе исследования была проведена оценка распространенности среди штаммов Staphylococcus spp. устойчивости к АМП: БФ, АБ, ДС и АС.

Для оценки распространенности устойчивости среди стафилококков на территории г. Н. Новгорода и области к лечебным БФ были исследованы 289 штаммов Staphylococcus spp. от пациентов с признаками инфекционного процесса (74,4%) и от медицинского персонала (25,6%) МО, выделенные в ходе регионального мониторинга. Штаммы стафилококков включали 239 культур S.aureus (82,7%) и 50 — CoNS (17,3%), из них 64,0% S.epidermidis, 30,0% S.saprophyticus, 4,0% S.lentus, 2,0% S. xylosus. Фагочувствительность культур определялась к разрешенным на территории РФ коммерческим препаратам, содержащим в своем составе гомологичные БФ: монопрепарат «Бактериофаг стафилококковый жидкий» (Ст-БФ), комбинированные препараты «Интести-бактериофаг жидкий» (Инт-БФ) и «Пиобактериофаг комбинированный жидкий» (Пио-БФ). По результатам исследования все стафилококки были разделены на 3 категории (по интенсивности лизиса): чувствительные, слабочувствительные и устойчивые к действию БФ.

Установлена широкая распространенность устойчивости этиологически значимых Staphylococcus spp. к каждому из препаратов БФ. Доля устойчивых штаммов Staphylococcus spp. колебалась от 41,6%, [95% ДИ 35,8-47,4%] для Ст-БФ до 48,7%, [95%ДИ 42,2-54,7%] для Инт-БФ. Препарат Ст-БФ продемонстрировал относительно большую литическую активность, доля чувствительных штаммов к нему составила

31,8%, [95% ДИ 26,4-37,2%] vs 28,20%, [95% ДИ 22,8-33,6%] у Пио-БФ и 26,0%, [95% ДИ 20,6-31,4%] у Инт-БФ (р>0,05). Слабочувствительными к БФ оказ&тись 25,3 - 26,6% культур.

Аналогичная ситуация отмечена и по распространенности устойчивости к препаратам БФ среди различных видов стафилококков — S.aureus, CoNS (табл.2). При этом доля устойчивых штаммов CoNS была среднем в 2 раза больше, чем у S.aureus (р=0,01), и составила 74,0 - 82,2%. Относительно всех 3-х БФ доля фагорезистентных CoNS достоверно превосходила долю фагочувствительных CoNS. Чувствительность же в популяции CoNS значительно более низкая (в зависимости от препарата в 3,3 - 3,6 раза ниже, чем у S.aureus).

Широкая распространенность устойчивости на уровне 34,7-42,1% штаммов отмечалась по отношению ко всем БФ. Достоверных отличий среди удельного веса чувствительных, слабочувствительных и устойчивых штаммов S. aureus нет. Однако, доля чувствительных штаммов составила только 29,4-36,4% в зависимости от препарата, что ограничивает применение этих препаратов для борьбы с инфекциями данной этиологии.

Таблица 2 — Спектр литической активности коммерческих препаратов БФ в отношении клинических штаммов Staphylococcus spp._

Препарат БФ Доля Staphylococcus spp., %, [95% ДИ]

S. aureus, %, [95% ДИ] CoNS, "/о, [95% ДИ]

чувствительные сл/чувстви-тельные устойчивые чувствительные сл/чувстви-тельньге устойчивые

Ст-БФ 36,4' [30,2-42,6] 28,9 [23,1-34,7] 34,7' [28,5-40,9] 10,0 [1,6-18,4] 16,0 [5,6-26,4] 74,0 * [61,6-86,4]

Инт-БФ 29,4''2 [23,4-35,4] 28,5 2 [22,5-34,5] 42,1 " [35,5-48,7] 8,9 [0,5-17,3] 8,9 [0,5-17,3] 82,2 3 [70,8-93,6]

Пио-БФ 32,0' [25,8-38,2] 29,4' [23,4-35,4] 38,6' [32,2-45,0] 8,9 [0,5-17,3] 11,1 [1,7-20,5] 80,0 3 [60,0-92,0]

Примечания:' - показатели S. aureus vs CoNS статистически достоверны (р=0,01)

2 - показатели достоверно ниже доли устойчивых штаммов S. aureus (р=0,01) 3 - показатели достоверно выше доли чувствительных штаммов CoNS (р=0,01)

В целом, распространенность устойчивости к БФ (одному или более) среди штаммов CoNS составила 84,4%, [95% ДИ 73,6-95,3%], что в 1,7 раза достоверно больше, чем среди S.aureus - 49,6%, [95% ДИ 42,9-56,2%] (р=0,01) (табл.3). Доля чувствительных и слабочувствительных CoNS в 2,9 и 3,7 раза меньше, чем в популяции S.aureus (р=0,01). При этом сами фагочувствительные S.aureus составляют только 25,9%, что в 2 раза меньше доли устойчивых штаммов.

Высокая распространенность устойчивости к стафилококковым БФ у CoNS может быть объяснена тем, что данные БФ создавались с учетом литической активности в отношении прежде всего S.aureus. Однако, в соответствии с инструкцией по применению исследуемых препаратов БФ, они указываются как активные в отношении рода Staphylococcus, соответственно, должны проявлять литическую активность в отношении как S.aureus, так и CoNS. Результаты же исследования показали значительно более низкую чувствительность в популяции CoNS (в 2,9 раза ниже, чем у S.aureus).

Принимая во внимание значимость Со№> в этиологии стафилококковых инфекций, устойчивость к стафилококковым БФ должна учитываться при назначении терапии наряду с этиологической расшифровкой инфекций до вида для адекватного выбора терапии. Результаты распространенности устойчивости к применяемым БФ поставили задачу по выделению и получению препарата БФ, гомологичного СоЛ®.

Таблица 3 — Распространённость устойчивости и чувствительности к БФ среди клинических штаммов стафилококков

Фагочувствитель-ность S. aureus (п=228) CoNS (п=45) Staphylococcus spp. (n=273)

Абс. Распространенность, на 100 культур, [95% ДИ] Абс. Распространенность на 100 культур, [95% ДИ] Абс. Распространенность на 100 культур, [95% ДИ]

Устойчивые к одному БФ 113 28 49,56 [42,93-56,18] 12,28 [7,93-16,63] 38 2 84,44* [73,63-95,25] 4,44 [0,00-10,58] 151 30 55,3 [48,75-61,25] 10,99 [7,20-14,78]

к двум БФ 20 8,77 [5,02— 12,52] 2 4,44 [0,00-10,581 22 8,06 [4.76- 11,361

к трём БФ 65 28,51 [22,53 — 34,491 34 75,56 [62,75-88,37] 99 32,26 [26,44-38,081

Слабочувствительные 56 24,56' [18,86-30,26] 3 6,67 [0,00-14,11] 59 21,61 [16,63-26,59]

Чувствительные 59 25 88' [20,08 — 31,681 4 8 89 Г0,40-17,38] 63 23,08 Г17,98-28,181

Примечание: * - показатели S. aureus vs CoNS статистически достоверны (р=0,01)

' - показатели достоверно ниже доли устойчивых штаммов 5. aureus (р=0,01)

При изучении устойчивости культур микроорганизмов к БФ особое значение имеет исследование возможности формирования перекрестной устойчивости к различным препаратам, содержащим стафилококковые фаги. Доля штаммов, характеризующихся отсутствием чувствительности к двум и более препаратам БФ (перекрестно устойчивые), значительно высока как среди S. aureus, так и в популяции CoNS (достоверно выше, р=0,025) и составляет 75,2%, [95% ДИ 67,1-83,3%] и 94,7%, [95% ДИ 87,5-100,0%] соответственно (рис.1). Среди фагорезистентных штаммов достоверно преобладают культуры, устойчивые ко всем трем препаратам: Staphylococcus spp. (32

3%), S.aureus (28,5%) и CoNS (75,6%) (табл.3).

spp.

Рисунок 1 - Структура устойчивости стафилококков к БФ

Полученные данные о распространенности на значительном уровне устойчивости к различным препаратам лечебно-профилактических БФ (у Staphylococcus spp., S. aureus и CoNS), наличие перекрестной устойчивости (к двум и более БФ) явились научным обоснованием необходимости комплексной оценки устойчивости к АМП, включая мониторинг устойчивости к препаратам лечебно-профилактических БФ. Были разработаны параметры мониторинга устойчивости к БФ для включения в региональный микробиологический мониторинг:

• объекты исследования: а) все штаммы определенного вида микроорганизма, выделенные от пациентов, персонала, из внешней среды; б) планируемые к применению и уже применяемые коммерческие препараты БФ (монопрепараты и комплексные);

• тип мониторинга - направленный на отделения, где применяют БФ, на категории пациентов, которым может быть назначено применение БФ;

• режим мониторинга - периодический (до начала применения и весь период применения);

• анализ результатов - динамическая оценка частоты выделения фагорезистентных культур, как в целом, так и по видам стафилококков, по территориям, по препаратам БФ, анализ перекрестной устойчивости.

Предложенная модель мониторинга позволит усовершенствовать эпидемиологический надзор за стафилококковыми инфекциями, динамически оценивать литическую активность используемых БФ, производить своевременную замену самих препаратов или стафилококковых штаммов в составе, путем подбора высокоактивных адаптированных фагов на основе культур стафилококков, циркулирующих на определенной территории или в МО, с последующим обновлением.

Для оценки распространенности комбинированной устойчивости к БФ и АБ, были проанализированы резистограммы 240 штаммов стафилококков к АБ и лечебно-профилактическим БФ по данным территориального мониторинга устойчивости микроорганизмов к АМП.

Доля антибиотикорезистентных стафилококков оказалась достаточно высокой (более 80%). Различия между S. aureus и CoNS незначительны: 89,5%, [95% ДИ 85,193,8] и 82,9%, [95% ДИ 71,2-94,7] соответственно. Распространенность устойчивости к антибиотикам в популяции Staphylococcus spp. составила 88,3%. Чувствительны ко всем тестируемым АБ 10,6%, [95% ДИ 6,2-14,9] S.aureus и 17,1%, [95% ДИ 5,3-28,8] CoNS. Доля чувствительных культур всей совокупности стафилококков - 11,7%. [95% ДИ 7,515,8].

Фагочувствительность Staphylococcus spp. к одному и более препаратам БФ, выше

в 2 раза (р<0,05), чем к АБ, но также на весьма невысоком уровне - только 24,6%, [95%ДИ 19,0-30,1] всех стафилококков оказались чувствительны. Ожидаемо

распространенность фагочувствительных штаммов S. aureus в 2,8 раза выше, чем у CoNS (27,6%, [95% ДИ 21,3-34,0] vs 9,8%, [95% ДИ 0,5-19,0]), р=0,02.

Оценивая комбинированную устойчивость к двум группам АМП - БФ и АБ -установлено, что доля изолятов одновременно резистентных к действию АБ и БФ колебалась от 64,3 % среди S.aureus до 73,2% - у CoNS; среди всех Staphylococcus spp. доля резистентных культур составила 65,8% (рис.2). Распространенность фагорезистентных культур при сохранившейся антибиотикочувствительности, и, наоборот, антибиотикорезистентных стафилококков с чувствительностью к гомологичным препаратам БФ, достоверно различна в популяции CoNS и S.aureus. Среди CoNS большая доля приходится на фагорезистентные штаммы (17,1%), а у

S.aureus - на культуры с антибиотикорезистентностью (25,1%). Чувствительными и к АБ, и к БФ оказались 2,1% всех стафилококков, представленные исключительно S. aureus.

чувствительность к АБ и БФ устойчивость только к АБ устойчивость только к БФ комбинированная устойчивость

)

.2,1 2,5

22,5 25,13

.6

_ 17,1 8,0

пп л

73,2

н 64,3

н

0 20 40 60 80 100

■Staphylococcus spp. sCoNS aS. aureus %

Рисунок 2 - Распространенность различных видов устойчивости к АМП (АБ, БФ) клинических штаммов стафилококков

Сравнительная оценка профилей резистентности к антибиотикам разных групп у CoNS и S.aureus с комбинированной устойчивостью показала, что уровень устойчивости у штаммов CoNS выше (исключение - бензилпенициллин), причем доля CoNS с перекрестной устойчивостью ко всем 14- и15-членным макролидам составила 63,3%, [95% ДИ 45,7-80,9], что в 2,6 раза выше, чем у S.aureus (24,2%, [95% ДИ 16,7-31,8]), р=0,032.

Частота выделения метициллинрезистентных стафилококков (MRSA, MRSE, MRCoNS) вне зависимости от наличия/отсутствия устойчивости к АБ или БФ составила 5,0%, [95% ДИ 2,2-7,8] (12/240) - по 50,0% MRS А и MRCoNS. Видовой состав MRCoNS представлен S.epidermidis (3/6), S.saprophytics (2/6) и S.lentus (1/6). Среди культур с комбинированной устойчивостью доля MRS-штаммов выше, хотя и не значительно — 5,7% (vs 5,6%). Из них на долю MRCoNS приходится 55,6% (5/9) {S.epidermidis (2/5), S.saprophytics (2/5), S.lentus (1/5)). Резистентными ко всем трем препаратам БФ оказались 55,6% (5/9) MRS, на долю CoNS приходится 80,0% (4/5). В свою очередь 2/4 MRSA оказались слабочувствительными к БФ, 1/4-устойчивый к действию одного БФ.

Изучение связи между приобретенными фаго- и антибиотикорезистентностью проводилось среди Staphylococcus spp. и S.aureus путем расчета критерия соответствия (Х2)- Необходимость проведения анализа связана с распространенностью комбинированной устойчивости у штаммов S. aureus при уровне фагорезистентности 8,0%. По результатам проведенного анализа связи между фагорезистентностью и устойчивостью к АБ (Staphylococcus spp.), фагорезистентностью и полирезистентностью к АБ (Staphylococcus spp.), фагорезистентностью и полирезистентностью {S.aureus), фагорезистентностью и метициллинрезистентность {S.aureus) установлено не было (%2 -от 0,001 до 0,7; р>0,05). Это указывает на самостоятельность и независимость таких характеристик стафилококков, как устойчивость к БФ (одному и более препаратам) и антибиотикополирезистентность и отсутствие общих механизмов формирования устойчивости к данным группам АМП.

Чувствительность штаммов Staphylococcus spp. к ДС, АС изучалась в рамках действующего с 2009 г. регионального мониторинга устойчивости к данным группам

АМП. Были проанализированы результаты исследования 852 штаммов Staphylococcus spp. (479 штаммов S. aureus и 373 культуры CoNS) к 11 группам ДС и АС.

Устойчивость к ДС и АС была отмечена только среди S. aureus и S. epidermidis на сопоставимом уровне - 0,8% и 0,6% соответственно, а вот неполная чувствительность распространена более широко — на более высоком (9,7% среди всех стафилококков, 14,2% среди S. aureus, 6,3% среди CoNS) — и встречалась среди всех видов стафилококков. Наибольшая распространённость неполной чувствительности отмечена среди S.aureus (14,2%), среди CoNS у S.capitis - 12,5%, наименьшая была среди штаммов S.haemolyticus - 2,1%. Распространенность устойчивости и неполной чувствительности к разным группам ДС, АС была проанализирована только для тех видов стафилококков, среди которых были устойчивые культуры. Штаммы S.aureus демонстрировали устойчивости к спиртсодержащим АС (0,8%) и композиционным ДС (ЧАС+ гуанидины+кислородсодержащие средства) - 0,3%. Для S.epidermidis было характерно также наличие устойчивости к композиционным средствам на основе ЧАС+ гуанидины+кислородсодержащие средства - 0,6%.

От 0,3% до 4,8% штаммов S.aureus продемонстрировали неполную чувствительность. По группам ДС изоляты распределились следующим образом: к кислородсодержащим ДС - 3,2%, к спиртсодержащим (АС) - 2,4%, к хлорсодержащим ДС- 1,3%; к композиционным средствам на основе ЧАС+гуанидин -4,8% (наибольшая), ЧАС+амины - 2,1%, ЧАС+альдегиды - 1,9%, ЧАС+гуанидины+амины - 0,5%, ЧАС+ гуанидины+кислородсодержащие средства - 0,8%, и гуанидины+кислородсодержащие средства - 0,3%.

В популяции S.epidermidis была установлена неполная чувствительность по отношению ко всем протестированным группам ДС, кроме композиционного средства на основе ЧАС+гуанидин+амин. К остальным ДС неполная чувствительность распределилась следующим образом: 2,8% к кислородсодержащим, 1,1% к спиртсодержащим (АС), по 0,6% к хлорсодержащим, гуанидинам и ЧАС; композиционные ДС - по 1,7% к ЧАС+амины, ЧАС+альдегиды, ЧАС+гуанидины+кислородсодержащие средства, по 0,6% к ЧАС+гуанидины, гуанидины+кислородсодержащие ДС. Столь широкая распространенность среди S. aureus и CoNS неполной чувствительности и наличие устойчивости является прогностически неблагоприятным признаком и определяет необходимость мониторинга устойчивости к ДС и АС при эпидемиологическом надзоре за стафилококковыми инфекциями и адекватного выбора как самих препаратов ДС и АС, так и режимов их применения.

В условиях роста антибиотикоустойчивости и при имеющихся трудностях в создании новых групп АБП, БФ видятся эффективным средством этиотропной терапии различных инфекций, в т. ч. стафилококковых. Необходимость выделения высокоактивного специфического коагулазонегативного стафилококкового БФ (CoNS-БФ) из клинических штаммов, циркулирующих в МО г. Н.Новгорода и Нижегородской области, научно обоснована уровнем фагорезистентности в популяции CoNS.

Лабораторный эксперимент по выделению CoNS-БФ представлен на рис.3, выделение БФ проводилось метод}' Грациа. На 1-ом этапе была составлена и охарактеризована коллекция CoNS, насчитывающая 26 штаммов - возбудителей ИСМП, выделенных от пациентов и актуальных для стационаров г. Н.Новгорода (18 штаммов S.epidermidis, 6 - S.saprophytics и по одному - S.haemolyticus, S.lugdunensis). На начальном этапе (после трех постановок) 10 культур S. epidermidis явились продуцентами БФ, который формировал мутные бляшки (негативные колонии (НК))

правильной округлой формы. d=l,5-3 мм. с признаками вторичного роста индикаторной культуры. После 4 пересевов, были обнаружены единичные НК с прозрачным центром, микроскопия бляшек показала на дне НК слабый рост культуры. Продуценты фаговых линий (SE-1 - SE-7) S. epidermidis. 7/10, выделены из клинического материала (раневое отделяемое, содержимое интубационной трубки и желудочного зонда, гемокультура, медицинские устройства (ЦВК), отделяемое зева) пациентов 4 МО г. Н.Новгорода. Путем многократных пассажей изолированных НК из штамма S.epidermidis, MSSE, был выделен CoNS-БФ с высокой логической активностью (10"9 - Ю"10 /мл). На агаре полученный БФ формировал прозрачные НК правильной округлой формы, d до 3,0 мм. По морфологии вирион состоял из головки гексагональной формы (55x30 нм) и длинного несокращающегося отростка (70±5 нм) (рис.4). В соответствие с классификацией Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV, International Committee on Taxonomy of Viruses), 1998 г., БФ был отнесен к отряду/порядку Caudovirales (хвостатые фаги), семейству Siphoviridae (с длинным несократимым хвостом. По классификации A.C. Тихоненко (1968 г.) данный БФ относится к IV морфологической группе вирусов бактерий - «фаги с длинным несокращающимся отростком».

Рисунок 4 — Морфология фаговых частиц, х 120 тыс. раз

В рамках совершенствования технологий борьбы с инфекциями, вызванными CoNS, необходимо выделение гомологичных высокоактивных БФ и создание на их основе лечебно-профилактических препаратов для преодоления высоких уровней фагорезистентности к имеющимся на рынке стафилококковым БФ и применения как эффективного средства этиотропной терапии.

В целях установления возможности формирования резистентности грамположительных микроорганизмов (на модели тест-штамма S.aureus) к ДС из группы ЧАС, определения условий ее возникновения и выявления изменений свойств микроорганизма в процессе формирования устойчивости, а также для сравнения полученных результаты с результатами работ по индуцированной устойчивости к ЧАС у грамотрицательных микроорганизмов был проведен лабораторный эксперимент.

При подборе опытной концентрации ДС установлено, что концентрация ЧАС, оказывающая суббактерицидное действие на культуру S. aureus оказалась выше, чем в эксперименте с E.coli (0,03% vs 0,02%). Чувствительность на уровне бактерицидных концентраций была сохранена в обоих случаях. В ходе эксперимента единичные изменения культуральных свойств были отмечены после 5 воздействия суббактерицидных концентраций (полиморфизм колоний), закрепились за всеми штаммами после 7-го. У одних линий исследуемой культуры более выражен полиморфизм КОЕ (1 мм -2-3 мм — >5 мм), другие штаммы, при достаточной однородности размеров (2-4 мм), отличались степенью пигментации (бледно-желтые

13 к

о <<

я о я

I. Создание рабочей коллекции СоМ5

С

штаммы рабочей \ коллекции СоИБ /

1 Г" II. Выделение БФ

1 24 ч, 37°С

обнаружение БФ на ППС (метод Грациа) шш ТГЧа

1 □ 1

I. Изучение свойств БФ

НАБОР ИЗУЧАЕМЫХ СВОЙСТВ

НК с признаками вторичного

п

! 1

пересев на ППС (метод Грациа)

□ □ с

НК без признаков вторичного

пересев на ЖПС (МПБ) накопление фаговых частиц

изучение морфологии НК

изучение литической активности

изучение ультраструктуры фаговых частиц

14 сут., 37 С

НК без признаков вторичного роста

пересев на ППС (метод Грациа)

□ □

«Чистая» линия бактепио&ага

НК — негативные колонии ППС — плотная питательная среда МПБ — мясо-пептонный бульон ЖПС — жидкая питательная среда

КОЕ средних размеров с единичными крупными беловатыми КОЕ (=4 мм) и мелкими ярко-желтыми КОЕ). По тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам культуры не отличались. Чувствительность к АБ и БФ сохранялась. Чувствительность к бактерицидной концентрации ЧАС сохранялась до 9 воздействия, когда было отмечено неполное бактерицидное действие ЧАС. После 12-го воздействия наблюдался более стабильный рост тест-культуры в количестве >300 КОЕ/мл. По результатам проведенного эксперимента установлено: формирование устойчивости к ЧАС после 12-го воздействия суббактерицидных концентраций, появлению неполной чувствительности предшествовало ограниченное изменение культуральных свойств тест-штамма. Сравнение результатов данного исследования на модели S.aureus с экспериментом на тест-штамме Е. coli выявило различия в условиях формирования устойчивости: для S.aureus характерен более высокий порог чувствительности к ЧАС и формирование устойчивости происходит медленнее (12 воздействий vs 6, 5 месяцев vs 2). Таким образом, доказана возможность применения экспериментальной методики на модели грамположительных микроорганизмов и выявлены отличительные особенности формирования устойчивости у S.aureus к ЧАС.

С целью оценки новых технологий асептики и антисептики с позиций обеспечения эпидемиологической безопасности пациентов и медицинского персонала было проведено испытание в лабораторных условиях различных способов применения АС, ДС и конструктивных решений.

Среди различных технологий по обеспечению эпидемиологической безопасности большое значение придается гигиене рук и обеспечению эпидемиологической безопасности медицинских манипуляций в отношении не только пациентов, но и персонала. Это одно из положений «Национальной концепции профилактики ИСМП».

Была проведена оценка проницаемости и бактерицидной эффективности хирургических перчаток с внутренним антисептическим покрытием (АС-покрытием) (технология антисептики). Данные перчатки имеют многослойную структуру, внутренний слой содержит дезинфицирующий состав на основе хлоргексидина (ХЛГ) для снижения микробной нагрузки при нарушении целостности перчаток. Были проведены исследования проницаемости перчаток по методике, предложенной Сергевниным В.И. (с изменениями). Схема эксперимента представлена на рисунке 5.

Тест-образцы изготавливались из разных локусов перчатки («рукав», «ладонь», «пальцы»). Смачивание внутренней поверхности необходимо для имитации образования «перчаточного сока» и активации АС. Поэтому в исследовании были представлены опытная группа (образцы с АС-покрытием, со смачиванием) и 2 контрольные группы: 1-я - образцы перчаток с АС-покрытием, но без смачивания, и 2-я - образцы перчаток без АС-покрытия. По результатам исследований образцов опытной группы (п=180) установлено отсутствие роста тест-штамма S.aureus во всех случаях - по всем локусам и со всеми экспозициями. Проницаемость образцов контрольных групп 1 и 2 составила соответственно 3,9, [95%ДИ 0,77-6,93] и 4,2, [95%ДИ 0,9-7,5] на 100 исследований.

При оценке результатов исследований контроля-1 и контроля-2 установлены различия проницаемости в зависимости от времени экспозиции S.aureus и локуса перчаток. При разных экспозициях микробной взвеси проницаемость образцов контроля -1 колебалась от 0 до 7,7%, а образцов контроля-2 - 2,8%-8,3%. Наибольшая проницаемость в обеих группах отмечена при 5-минутной экспозиции.

и я

I

О

я п -о л

хирургические перчатки

У

смотровые перчатки

□

+ 0,2 мл

дистиллированной воды

хирургические перчатки

со смачиванием внутренней поверхности (с АС-покрытием) (опыт)

хирургические перчатки

без смачивания внутренней поверхности (контроль-1, контроль-2)

смотровые перчатки

Рост S. aureus после удаления тест-объектов расценивался как факт проникновения бактерий через

анализ и интерпретация результатов

экспозиция 5,10,15,30,60 мин / \

взятие смыва с чашки Петри

Различия проницаемости перчаток в зависимости от времени экспозиции между опытом и контролями и между контролем-1 и контролем-2 статистически недостоверны Of =0,01-1,27, р=0,26-0.95; у_2=1.17-3.59, р=0,12-0,28), кроме проницаемости при 5-минутной экспозиции - достоверно ниже у опытных образцов по сравнению с контрольными (х2 = 3,89, р=0,048). Изучение проницаемости перчаток в разных локусах продемонстрировало, что в контрольных группах наиболее проницаемыми оказались «пальцы» перчаток (6,3% и 5,6% соответственно), достоверно выше по сравнению с опытной группой (х2=0,386, р=0,046). А наименее проницаемы в контроле-1 — «рукав» (1,7%), в контроле-2 - «ладонь» (2,1%), но без статистически значимых различий (Х2=0,02-3,40, р=0,065-0,32).

Оценка бактерицидного эффекта внутреннего покрытия перчаток осуществлялась стандартным методом (Р 4.2.2643-10.3.5). Алгоритм был следующий: обработка рук по режиму обработки рук хирургов с контролем качества (смывы с рук непосредственно после проведения обработки); искусственная контаминация рук тест-штаммом S.aureus; часовое ношение перчаток и взятие смывов. Критерием бактерицидного эффекта АС-покрытия перчаток являлось отсутствие роста S.aureus после использования перчаток. В оценку эффективности внутреннего АС-покрытия хирургических перчаток были включены только те опыты, при которых была качественно проведена обработка рук (отсутствие роста микроорганизмов). Из 15 опытов в 4-х при контроле качества обработки рук был отмечен рост микроорганизмов, в остальных 11 - роста не было.

В 11 опытах после искусственной контаминации рук и ношения перчаток, в последующих смывах с рук роста микроорганизмов не было (0,0%), т.е установлена 100% эффективность антисептического воздействия. Бактерицидный эффект был отмечен в отношении и транзиторной, и резидентной флоры. В тех опытах, где была проведена некачественная обработка рук - в смывах с рук обнаруживали S.aureus, CoNS, споровая флора, после ношения перчаток, обнаружены не были. Бактерицидный эффект АС-покрытия на основе ХЛГ, и, соответственно, эффективность самих хирургических перчаток в плане снижения бактериальной нагрузки, не освобождает медицинских работников от необходимости качественной обработки рук. Однако данный эффект может рассматриваться как дополнительный фактор, повышающий защитные свойства данных перчаток.

Таким образом, можно заключить об эффективности инновационного способа использования АС — в составе многослойных хирургических перчаток, характеризующихся непроницаемостью для микроорганизмов и бактерицидной активностью при взаимодействии с «перчаточным соком». Выраженный бактерицидный эффект внутреннего покрытия продемонстрирован в отношении транзиторной и резидентной микрофлоры рук. Полученные результаты позволяют рекомендовать хирургические перчатки с внутренним антисептическим покрытием для широкого внедрения в практическое здравоохранение как технологию антисептики, обеспечивающую эпидемиологическую безопасность медицинского персонала и пациентов. Применение таких перчаток особенно целесообразно при проведении инвазивных манипуляций/операций с повышенным риском инфицирования медицинского персонала и пациентов (при длительных инвазивных манипуляциях, операциях, вмешательства типа «контаминированные» и «грязные», с высоким риском травматизации медицинского персонала и нарушении целостности перчаток.

Также была проведена оценка защитных свойств смотровых нитриловых перчаток и оценка эффективности их укладки, которая вследствие конструктивных решений должна предотвращать контаминацию отверстия самого диспенсера и перчаток в

процессе эксплуатации, т.е. при извлечении и при хранении в уже открытом блоке. Данный гигиенический диспенсер с укладкой типа «интерфолдинг» (Safe Done, SD), обеспечивает подачу перчаток снизу по одной, манжетой вперед, для исключения контакта рук персонала с другими перчатками, диспенсером и основной поверхностью извлекаемой перчатки.

Оценка проницаемости велась по методике, изложенной выше (рис.5) Средняя проницаемость составила 3,5 на 100 исследований, при этом определенной зависимости между локусами перчаток и длительностью экспозиции установлено не было.

Экспериментальная оценка эффективности укладок SD (опыт) проводилось в сравнении со стандартной укладкой смотровых перчаток (контроль). Сам эксперимент заключался в искусственной контаминации рук тест-штаммом S. aureus (после предварительной обработки), с последующим извлечением перчаток искусственно контаминированными руками и забором смыва с края отверстия укладки. Рассчитывались риски, при этом использование укладок SD расценивалось как воздействие профилактического фактора (F+), использование стандартных укладок -как его отсутствие (F-). Реальную контаминацию определяли по наличию (К+) или отсутствию (К-) роста культуры в смывах с края отверстия укладок. Установлено, что применение укладок типа SD снижает контаминацию отверстия укладки в 3 раза по сравнению с обычными укладками смотровых перчаток (относительный риск контаминации при укладке SD в сравнении со стандартной укладкой составил RR=0,33). Доля случаев контаминации отверстия диспенсера снижается на 67% при работе с перчатками в укладках типа SD (профилактическая фракция укладки SD PF=67%). Это позволяет рассматривать смотровые перчатки, как технологию асептики, обеспечивающую эпидемиологическую безопасность, и рекомендовать для использования при повышенном риске возникновения и распространения инфекции контактным путем, при высокой интенсивности работы.

Оценка других способов применения ДС и АС, а именно, использование тканей, пропитанных растворами ДС, с заявленной антибактериальной активностью, не подтвердила их бактерицидной эффективности. Требуются дальнейшие изыскания по данному вопросу.

Таким образом, результатом проведенного комплексного исследования явилось научное обоснование необходимости оптимизации технологий борьбы со стафилококковыми инфекциями, а также разработка усовершенствованных компонентов эпидемиологического надзора и мероприятий по контролю: региональный микробиологический мониторинг с комплексной оценкой чувствительности к АМП, в т.ч. к БФ; разработка новых и актуализация применяемых АМП (БФ, ДС, АС); использование технологий асептики и антисептики, обеспечивающих

эпидемиологическую безопасность медицинских манипуляций и совершенствование профилактики ИСМП медицинских работников и пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выводы

1. Оценка фагочувствительности этиологически значимых Staphylococcus spp., циркулирующих в медицинских организациях по результатам регионального микробиологического мониторинга, показала широкую распространенность устойчивости ко всем трем коммерческим препаратам БФ, содержащим стафилококковые фаголизаты - от 41,6 до 48,7% в зависимости от препарата. Установлена более низкая активность всех препаратов БФ в отношении CoNS:

фагоустойчивость колебалась от 74,0 до 82,2% (vs 34,7-42,1% у S. aureus, р=0,01); доля культур, резистентных к действию одного или более препаратов БФ среди CoNS в 1,7 раз больше, чем у S.aureus (84,4% vs 49,6%, р=0,01). Описано явление перекрестной резистентности к различным препаратам БФ, достаточно широко распространенное как среди S.aureus (75,2%), так и в популяции CoNS (94,7%), р=0,025. При этом доминирует устойчивость ко всем трем препаратам БФ и составляет 57,5% среди S.aureus, 89,4% среди CoNS.

2. Установлен высокий уровень комбинированной устойчивости стафилококков к АБ и БФ (64,3-73,1%), достоверно превышающий уровень монорезистентности к АБ либо БФ (9,8-25,1% и 8,0-17,1% соответственно). При этом была подтверждена относительная независимость таких характеристик микроорганизмов рода Staphylococcus spp. как устойчивость к БФ и АБ. Выявлена широкая распространенность неполной чувствительности и наличие устойчивости среди S. aureus и CoNS к ДС и АС, что является прогностически неблагоприятным признаком и определяет необходимость мониторинга. Полученные результаты о широкой распространенности устойчивости к АМП, включая фагорезистентность, перекрестную устойчивость к двум и более препаратам БФ, комбинированную устойчивость к АБ и БФ, наличие устойчивости к ДС и АС, являются научным обоснованием оптимизации микробиологического мониторинга в рамках комплексной оценки устойчивости к АМП, а также необходимости актуализации выпускаемых препаратов стафилококковых БФ на основе клинических штаммов Staphylococcus spp., циркулирующих на конкретной территории, и разработки новых препаратов на основе фагов, активных в отношении CoNS.

3. Выделена линия БФ высокой активности (S. epidermidis, №166, MSSE). По морфологии фаговых частиц (многогранная удлиненная головка гексагональной формы и длинный отросток) установлена таксономическая принадлежность фага. В соответствие с классификацией Международного комитете по таксономии вирусов (ICTV), 1998 г., что БФ относится к отряду/порядку Caudovirales (хвостатые фаги), семейству Siphoviridae (с длинным несократимым хвостом). По классификации вирусов бактерий, предложенной А.С. Тихоненко, 1968 г., выделенный стафилококковый коагулазонегативный БФ был отнесен к IV морфологической группе - «фаги с длинным несокращающимся отростком».

4. Доказана возможность применения модели эксперимента по формированию индуцированной устойчивости к ДС в отношении грамположительной флоры (на модели тест-штамма S. aureus, №906, и ЧАС). В лабораторных условиях сформирована устойчивость к средству из группы ЧАС исходно чувствительного тест-штамма S.aureus и определены условия ее формирования. Установлено, что у культуры S. aureus порог чувствительности к дезинфектанту на основе ЧАС выше, чем у Е. coli (более высокая суббактерицидная концентрация, 0,03% vs 0,02%) и формирование устойчивости происходит медленнее: потребовалось большее число воздействий (12 воздействий vs 6) и более длительное время (5 месяцев vs 2).

5. Дана оценка эффективности различных технологий по обеспечению эпидемиологической безопасности медицинских манипуляций: асептических (укладки смотровых перчаток) и антисептических (перчатки с внутренним антисептическим слоем; ткани, пропитанные ДС) технологий, способов применения ДС и АС. Хирургические перчатки с внутренним антисептическим покрытием продемонстрировали хорошие защитные свойства в отношении проникновения тест-штамма: отсутствие проницаемости перчаток (при активации антисептика) вне зависимости от локуса перчаток и времени экспозиции взвеси тест-штамма;

эффективность антисептического воздействия составила 100%. Установлено, что применение укладок типа ЯЭ снижает контаминацию отверстия укладки в 3 раза, по сравнению с обычными укладками смотровых перчаток (11Я=0,33). Доля случаев контаминации отверстия диспенсера снижается на 67% при работе с перчатками в укладках типа 50 (РР=67%).

6. Разработаны параметры динамического регионального микробиологического мониторинга фагорезистентности как компонента микробиологического мониторинга и комплексной оценки чувствительности к АМП. Они позволяют оценить соответствие применяемых препаратов БФ штаммам, циркулирующим на данной территории, обеспечить своевременную замену препарата, актуализацию его состава, что, соответственно, позволит проводить адекватное лечение и усовершенствовать эпидемиологический надзор за стафилококковыми инфекциями.

7. Научно обоснованы и разработаны следующие усовершенствованные технологии по борьбе с инфекциями стафилококковой этиологии. К технологиям эпидемиологического надзора относится микробиологический мониторинг комплексной устойчивости к АМП на региональном уровне. Технологии контроля включают: создание новых АМП -лечебно-профилактические БФ; новые ДС и АС с учетом знаний о факторах, условиях формирования резистентности; оценка различных технологий по обеспечению эпидемиологической безопасности медицинского персонала и пациентов.

Практические рекомендации

• При организации и проведении регионального микробиологического мониторинга за стафилококковыми инфекциями необходимо внедрение компонента мониторинга устойчивости к лечебно-профилактическим препаратам БФ.

• При производстве коммерческих препаратов стафилококковых БФ необходимо учитывать распространенность фагочувствителыюсти культур с учетом различий устойчивости по препаратам, по видам микроорганизмов для своевременного реагирования на ее изменения путем замены штаммов в составе препарата на высокоактивные, и актуализации состава препарата в соответствие с видовым составом циркулирующих на данной территории микроорганизмов.

• При осуществлении лечебно-диагностического процесса рекомендовано использование технологий, в отношении которых доказана эффективность в обеспечении эпидемиологической безопасности. Оценка эпидемиологической безопасности новых технологий асептики и антисептики является необходимым этапом их внедрения в практику здравоохранения.

• Применение перчаток с внутренним антисептическим покрытием рекомендовано при проведении инвазивных манипуляций/операций с повышенным риском инфицирования, как медицинского персонала, так и пациентов, а смотровые перчатки в укладке «интерфолдинг» — и в отделениях с повышенным риском инфицирования.

• При разработке ДС новых химических групп, или при усовершенствовании существующих композиций, необходимо учитывать данные по распространенности устойчивости и неполной чувствительности среди стафилококков к ДС той или иной группы, а также условия, факторы и механизмы формирования устойчивости.

Перспективные направления дальнейшей разработки темы. Существует несколько актуальных направлений дальнейшей разработки темы. Важнейшей задачей является

дальнейшая разработка компонентов эпидемиологического надзора в части эпидемиологической диагностики и микробиологического мониторинга. Остается актуальной проблема создания лечебно-профилактических препаратов БФ, активных в отношении СоЛ®, как дополнительного эффективного средства борьбы со стафилококковыми инфекциями. Требуется дальнейшее исследование механизмов и условий формирования устойчивости к ДС и АС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние учебного процесса на стафилококковое бактерионосительство среди студентов медицинского вуза / НЛО. Широкова, О.В. Ковалишена, Г.А. Шишкин, Р.Ф. Чанышева // Инфекционные болезни: материалы II Международного конгресса по внутрибольничным инфекциям (Москва, 23-24 ноября 2011 года) - 2011. - Т.9, приложение №3. - С.123-124.

2. Широкова, И.Ю. Представленность Staphylococcus spp. в этиологии инфекций в ЛПО различного профиля / ИЛО. Широкова, Р.Ф. Чанышева, О.В. Ковалишена // Инфекция и иммунитет: материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — 2012. — Т.2, №1-2. — С.501.

3. Чанышева, Р.Ф. Характеристика метициллинрезистентных стафилококков и их распространенность среди студентов медицинского вуза / Р.Ф. Чанышева, Г.А. Шишкин // Актуальные проблемы управления здоровьем населения: сборник науч. Трудов. Под общ. Ред. И.А. Камаева / Н.Новгород, 2012. - Вып. V. - С. 215-217.

4. Чанышева, Р.Ф. О коагулазоотрицательном стафилококковом бактериофаге / Р.Ф. Чанышева, А.А. Григорьев, О.В. Коватишена // Инфекционные болезни: материалы V Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - 2013. - T.l 1, приложение №1. - С.440.

5. Чанышева, Р.Ф. Выделение коагулазоогрицательного стафилококкового бактериофага / Р.Ф. Чанышева // Медиаль: материаты I Всероссийской, XII научной сессии молодых ученых и студентов с международным участием. - 2013. - №1 (6). - С.76.

6. Чанышева, Р.Ф. Результаты исследования по выделению специфического бактериофага, активного в отношении коагулазоотрицательных стафилококков / Р.Ф. Чанышева, А.А. Григорьев, О.В. Ковалишена // Медицинский альманах. -2013. - №2(26). - С.68-71.

7. Чанышева, Р.Ф. Эксперимент по выделению бактериофага из клинических штаммов коагулазоотрицательных стафилококков // Эпидемиология в XXI веке: новые горизонты профилактики: материалы Всероссийской конференции с международным участием (Кемерово, 25-27 сентября 2013г). - Кемерово: КемГМА, 2013. - С. 104.

8. Результаты оценки носнтельства S.aureus у студентов медицинских вузов (двухцентровое исследование) / И.Ю. Широкова, Г.А. Шишкин, Р.Ф. Чанышева [и др.] // Медицина в Кузбассе. - 2013. - Т.12, №2. - С.79-83.

9. Чанышева, Р.Ф. Фагочувствительность клинических штаммов Staphylococcus spp. / Р.Ф. Чанышева, О.В. Ковалишена // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. Материаты III международного конгресса по профилактике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. - 2013. - №6 (73). - Приложение 1. - С. 143-145.

10. Чанышева, Р.Ф. Возможности применения бактериофагов в борьбе с инфекциями стафилококковой этиологии / Р.Ф. Чанышева, О.В. Ковалишена // Сборник научных трудов «Профилактическая медицина как научно-практическая основа сохранения и укрепления здоровья населения». -2013. - С.150-153.

11. Чанышева, Р.Ф. Состояние фагочувствнтелыюсти стафилококков -возбудителей инфекций в медицинских организациях Нижегородской области / Р.Ф. Чанышева, О.В. Ковалишена // Медицинский альманах. - 2014. - №2(32). -С.32-35.

Список использованных сокращений

АДВ АМП

АС-покрытие ИОХВ

исмп

КОЕ МЗ РФ МО МУК

НП «НАСКИ»

ПАВ

ПБДС

Р

ХЛГ ЦВК ЧАС

а

МЯСо^ МЯ8А MR.SE М88Е

- активное действующее вещество

- антимикробные препараты

- антисептическое покрытие

- инфекции в области хирургического вмешательства

- инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи

- колониеобразующие единицы

- Министерство здравоохранения Российской Федерации

- медицинская организация

- методические указания

-некоммерческое партнерство «Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи»

- поверхностно-активные вещества

- планшета биохимическая диагностическая для стафилококков

- руководство

- хлоргексидин

- центральный венозный катетер

- четвертичные аммониевые соединения

- диаметр

- метициллинрезистентные СоМБ

- метициллинрезистентные Я.аигеш

- метициллинрезистентныеер'к1егппсИ$

- метициллинчувствительные 5'. ер'иЛетиа^

Подписано в печать 21.10.2014 г. Гарнитура Тайме. Печать 570 ЕР.

. Заказ № 214. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6

Тел.:(831)278-44-26