Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Оптимизация методов пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного

На правах рукописи

ЧЕЛИДЗЕ Татьяна Топузовна

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ПРЕНАТАЛЫЮЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО

14 00 01 - Акушерство и гинекология 14 00 36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2007

003173865

Работа выполнена на базе ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им академика Е А Вагнера Росздрава», МУЗ МСЧ№9 им М А Тверье г Пермь и Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Падруль Михаил Михайлович кандидат медицинских наук, доцент Гей» Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дворянскин Сергей Афанасьевич; доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Валерьян Федорович.

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава»

Защита диссертации сосгоигся « » _ 2007 г в__часов на

заседании диссертационного совета Д 208 067 04 при ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е А Вагнера Росздрава» (614990, г Пермь, ул Куйбышева, 39)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Г1ГМА им акад ЕА Вагнера Росздрава» (614000 г Пермь, ул Коммунистическая, 26) и на сайте академии www psma iu

Автореферат разослан « »__ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Сандакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Иммунологические взаимоотношения матери и плода формируются в рамках единой функциональной системы, где системообразующим фактором является оптимальное развитие зародыша (С И Колесников, 1985, Н Б Найговзина, 1979, KB Шмагель, 2002, G Malmvaud, 1975, М Czeszynska, 1991) Нарушение целостности иммунобиологических взаимосвязей в системе мать-плацента-плод является ведущим звеном патогенеза различных форм патоло! ии матери и плода, определяет течение перинатального периода (А Г Коноплянников, 2005, Р Gurevich, 1997) В настоящее время иммунологические взаимоотношения матери и плода являются предметом изучения физиологов, иммунологов, перинатоло1 ов, акушеров-гинекологов В связи с этим одной из актуальных проблем иммунизации матери к антигенам системы резус плода является гемолитическая болезнь гшода (ГБП) и новорожденного (ГБН) (В И Кулаков, 2005, А В Макогон, 2002, Л И Мальцева, 2006, В Ю Талаев, 1999, D R Brathd, 2001, Oktay, 1996) В популяции встречаемость резус-несовместимых браков составляет 14%, резус-несовместимость в системе мать-плод - 10%, которая предполагает иммунизацию беременной женщины эритроцитарньтми фетальными антигенами и реализацию ее в гемолитическую болезнь плода и новорожденного (Н В Минеева, 2002, В А Мороков, 1999) Несмотря на то, что патогенез заболевания трактуется с позиции агрессии антител матери против эритроцитов плода, в диагностике не учитывается иммунологическая реактивность плода и новорожденного, нет достаточных сведений о напряженности клеточного иммунитета организма резус-отрицательной матери при иммуноконфликтной беременности (НН Кеворков, 1979, И А Геворкян, 2005, Т Г Гоцадзе, 1990,010 Севостьянова, 1990) С внедрением в клиническую практику профилактики гемолитической болезни по резус-факгору антирезус-Б-иммуноглобулином человека риск ее развития уменьшился, но остается высоким число резус-отрицательных пациенток, которым не разрешено проведение такой иммунопрофилактики, либо она является неэффективной (А Г Антонов, 2006, В А Мороков, 1988, В van Dijk, 1997, J Chilcott, 2004, R Fox, 1998)

В связи с этим индивидуальная тактика и клиническая эффективность ведения беременных при резус-О-сенсибилизации зависит от точности пренатальной диагностики гемолитического поражения гшода и прогнозирования степени тяжести этого заболевания у новорожденного Необходимость совершенствования способов диагностики гемолитической болезни определяют актуальность исследований иммунных реакций беременных и формирование пре- и ностнагальных диагностических и прогностических критериев патологического процесса Учитывая большое количество методов, позволяющих изучить in vitro различные функции лимфоидных клеток, было решено провести оценку уровня пролиферативной

активности лимфоцитов резус-отрицательных женщин в присутствии аллогенных лимфоцитов генетического отца будущего ребенка с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) (Т Вгипе, 2001, М1 Ьегептап, 2004, М К Рапёеу, 2003, П С Гуревич, 1988)

Цель исследования - оптимизация методов пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного на основании оценки пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин в присутствии аллогенных лимфоцитов генетического отца будущего ребенка и мигогенов

Основные задачи исследования:

1 Изучить особенности течения беременности и родов у резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью

2 Оценить в сравнительном аспекте эффективность современных методов пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного

3 Исследовать и сравнить выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцированного аллогенными лимфоцитами генетического отца будущего ребенка и митогенами, у резус-отрицательных женщин с целью прогнозирования риска развития гемолитической болезни плода и новорожденно1 о

4 Обосновать целесообразность сочетанного применения исследования пролиферативного ответа лимфоцитов резус-огрицательной беременной женщины на лимфоциты югге/ического отца будущего ребенка для диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного в акушерстве, гинекологии, неонагологии

Научная новизна исследования.

Проведена оценка диагностической значимости клинико-иммунологических критериев антенатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного. Впервые обоснован и апробирован новый подход к пренатальной диагностике гемолитической болезни плода и новорожденного различной степени тяжести во время беременности у резус-отрицательных женщин Предложен эффективный и патогенетически обоснованный метод пренатальной диагностики гемолитической болезни плода, основанный на оценке пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцированного аллогенными лимфоцитами генетического отца будущего ребенка и митогенами Вследствие этого выведен диагностический критерий трансформации прогрессирующей Шьсенсибилизации в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, что позволяет определить дальнейшую тактику ведения беременной женщины, показания к использованию инвазивных методов диагностики, а так же стратегию лечения плода

На основании установленных закономерностей разработан алгоритм комплексного обследования семьи, входящей в группу риска по развитию иммуноконфликтной беременности, для проведения антенатальной диагностики и прогноза развития гемолитической болезни при наличии Ш1-сенсибилизации Разработан и предложен алгоритм обследования резус-отрицательных беременных женщин, позволяющий выделть из категории предполагаемой и прогрессирующей изосенсибилизации группу беременных с развивающимся иммунным конфликтом и исходом его в гемолитическую болезнь плода и новорожденною

Обоснована необходимость комплексного подхода к оценке клинико-иммунологических критериев пренаталыюй диагностики гемолитической болезни новорожденных для отбора среди резус-отрицательных беременных пациенток, категории женщин с прогрессирующей изосенсибшшзацией, что позволит избежать дополнительных инвазивных методов пренатальной диагностики этих состояний

Практическая и теоретическая значимость работы.

Предложен эффективный и патогенетически обоснованный метод пренатальной диагностики гемолитической болезни - оценка пролиферативного ответа лимфоцитов резус- отрицательной беременной женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов (лимфоцитов генетического отца будущего ребенка) в реакции бласттрансформации лимфоцитов

Предлагаемый метод диагностики позволяет не только увеличить процент выявления гемолитической болезни в пренатальном периоде, но и сггро! позировать иммунный конфликт при планировании беременности, а также проводить соответствующие лечебные мероприятия в пренатальном и постнатальном периоде, что повысит эффективность терапии и сократит сроки пребывания в стационаре

В теоретическом плане работа дополняет и расширяет существующие представления о патогенезе и роли иммунных механизмов в развитии 1емолитической болезни Предложенный способ диагностики защищен патентом на изобретение (№ 2304780 от 20 08 2007г)

Положения, выносимые на защиту:

1 Традиционные методы пренатальной диагностики гемолитическая болезнь плода и новорожденного являются недостаточно эффективными для оценки ее степени тяжести и формы

2 Оценка пролиферативного ответа лимфоцитов резус- отрицательной беременной женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов (лимфоцитов генетического отца будущего ребенка) в реакции бласттрансформации является патогенетически обоснованным методом пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного

3 Использование индекса стимуляции для пренатальной диагностики гемолитической болезни плода является более эффективным но сравнению с рутинными общепринятыми методами обследования резус-отрицательной женщины во время беремешгости

Внедрение в практику.

Результаты исследования используются в клинической практике учреждений родовспоможения г Перми, городского диагностического центра пренатальной диагностики и планирования семьи на базе МСЧ № 9 имени МА Тверье и в учебном процессе на кафедрах акушерства и гинекологии лечебно1 о и педиатрического факультетов ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е А Вагнера Росздрава»

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на областной конференции акушеров-шнекологов «Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья» (Пермь, 2005), научной сессии Пермской государственной медицинской академии 2006 года (Пермь, 2006), на конференции молодых ученых Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 2007)

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, получен патент на изобретение РФ № 2304780 от 20 08 2007г

Объем и о руктура диссертации.

Диссертация изложена на 159 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, рекомендации практическому здравоохранению Библиография представлена 121 работами отечественных и 70 - зарубежных авторов Изложенный материал иллюстрирован 41 таблицей, 23 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач исследование было проведено в два этапа На первом этапе проведен ретроспективный анализ 96 случаев развития гемолитической болезни новорожденно! о (по материалам городского перинатального центра МСЧ № 9 им М А Тверье г Перми за 2004-2006 ir) Проанализировано течение беременности и родов у резус-отрицательных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью, при этом оценены результаты применения различных диагностических методов выявления гемолитической болезни в гестациониом периоде (ультразвукового исследования, определения титра антирезусных антител) На втором этапе с целью совершенствования методов пренатальной

диагностики гемолитической болезни плода наряду с клинико-лабораторным обследованием проведено изучение пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин на аллогенные лимфоциты будуще! о отца ребенка и митогены При этом основную группу составили 55 резус-отрицательных беременных женщин, входящих в группу риска по развитию i емолитической болезни плода и новорожденного В дальнейшем в зависимости от реализации гемолитической болезни было выделено две под1руппы группа А - 30 беременных женщин, родивших впоследствии детей с гемолитической болезнью, подгруппа В - 25 беременных женщин, родивших впоследствии здоровых детей Для сравнительной оценки показателей пролиферативного ответа лимфоцитов были сформированы контрольная группа (14 беременных женщин с резус-положительной кровью) и группа сравнения (20 небеременных женщин с резус-отрицательной кровью и отягощенным по иммуноконфлпкту репродуктивным анамнезом) Состав групп был адекватен по возрасту, объему проведенных исследований, кратности наблюдения и времени обследования По анамнестическим данным, возрасту, экстрагенитальной патологии, течению беременности группы были сопоставимы

Комплекс проведенных исследований включал следующие методы Обследование включало сбор анамнеза, общеклинические и лабораторные методы Пренатальная диагностика гемолитической болезни плода осуществлялась при помощи определения титра полных и неполных антирезусных антигел (непрямая пробой Кумбса и с применением желатина), исследование оптической плотности околоплодных вод (после проведения диагностического амниоцентеза) Для оценки внутриутробного состояния плода использовалп такие методы, как УЗИ для выявления признаков отечной формы гемолитической болезни плода и фетоплацентарной недостаточности, а так же определяли уровни альфа-фетопротеина (АФП) и хорионического i онадотронина (ХГЧ) Объектом иммунологических исследований m vitro являлись лимфоциты периферической крови обследуемых пациенток Для опенки пролиферативной активности лимфоцитов использовали метод, основанный на включении ^Н-тимидина Диагностическим критерием развития гемолитической болезни плода явился индекс стимуляции (ИС), который рассчитывали по формуле ИС= число импульсов в минуту в культуре с индуктором / число импульсов в минуту в культуре без индуктора На основании ИС оценивали зависимость пролиферативно! о ответа лимфоцитов беременных резус-отрицательных женщин от типа и дозы митогена При значении ИС 2,5 и выше пренаталыю диагностировали гемолитическую болезнь плода Для обработки полученного материала использовались общепринятые методы статистики на основании абсолютных значений, относительных величин Методы вариационной статистики включали определение средней арифметической, вычисление среднего квадратичного отклонения, средней ошибки Для определения достоверности результатов исследования использовали параметрические (критерий Стыодента) и непараметрическне методы

(критерий Уитни-Манна) Обработка результатов проводилась на IBM PS с использованием электронных таблиц «Excel», программы «Statistica 6 О»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Частота гемолитической болезни по Rh-фактору на основании ретроспективного анализа, проведенного за 2004-2006 гг по материалам городского перинатального центра МСЧ № 9, составила 36.7% от общего количества иммуноконфликтных (по системе ABO и Rh) беременностей Несмотря на использование современных методов диагностики и лечения, частота гемолитической болезни, а также осложнений этою заболевания не снижается Проведен ретроспективный анализ течения беременности и родов у 96 женщин в возрасте от 15 до 35 лет, родивших детей с гемолитической болезнью (средний возраст 27,9±4,8) 66,7% женщин были повторнородящими, причем у 16,2% женщин предыдущие роды закончились рождением детей с гемолитической болезнью В настоящую беременность антирезусные антитела выявлены только в 38,5% случаев

При изучении особенностей течения беременности и родов у резус-отрицатсльных женщин, родивших детей с ГБН, большая часть женщин с наличием антирезусных антигел в i естационный период были с O(I) (45,9%) и А(П) (29,7%) группами крови, и не отличались от пациенток без антирезусных антител, у которых так же преобладали А(Н) (40,68%) и O(I) (33,89%) группы крови В зависимости от наличия или отсутствия антирезусных антител отмечены некоторые особенности анамнеза У большинства обследуемых был отягощен акушерско-гинекологический анамнез Выявлено, что при наличии антирезусных антител в анамнезе таких женщин чаще отмечались самопроизвольные выкидыши (у 18,9% против 5,1%) и большим было общее количество беременностей в анамнезе (4,3±2,72 и 2,4_¡J ,4 соответственно), а так же у половины женщин предыдущие беременности заканчивались медицинскими абортами Вне зависимости от выявления антирезусных антигел анамнез был отягощен воспалительными заболеваниями гениталий (у 37,5% — сальпингоофорит, у 25% - эндометрит) и наличием урогенитальной инфекции в 34,4% случаев У 78,3% беременных с антирезусными антителами угроза прерывания беременности возникала в сроки от 21 до 30 нед, тогда как в группе женщин без антирезусных ангител у 50% угроза выкидыша проявлялась до 15 недель беременности Течение беременности у трети женщин, родивших детей с ГБН, осложнилось гестозом, анемией легкой степени (47,9%), проявляясь у беременных с наличием антирезусных антител чаще до 20 нед и после 30 нед беременности, в то время как у беременных женщин без антирезусных антител - только после 30 нед На основании кчинических, лабораторных и инструментальных методов обследования (ультразвуковое исследование, доплерометрическое исследование, кардиотокограмма) выявлено, что в группе с наличием антирезусных антшел в период беременности была несколько выше частота преждевременного созревания плаценты (29,7% против 10,2%), многоводия (соответственно у 21,6% и

10,2%) и низкого расположения плаценты (29,7% и 13,6% соответственно) В каждом пятом случае (по группам в 21,6% и 18,6%) диагностированы нарушения маточно-плацентарного кровотока первой степени Хроническая гипоксия плода также чаще наблюдалась у женщин с выявленными ангирезуснъши антителами (27,03% против 10,2 %), как и гипотрофия плода (соответственно у 21,6% и 13,6%)

В группе женщин с антирезусными ангителами в гестационный период в большинстве случаев эти антитела обнаруживали в основном у повторнородящих женщин Самые высокие титры антирезусных антител (от 1 540 до 1 1024) отмечены с 16 до 30 недель беременности, что явилось показанием для проведения диагностического амниоцентеза у 43,24% женщин в сроке 33-34 нед гестации для определения оптической плотности околоплодных вод Полученные данные соответствовали верхней 3-ей зоне карты 1л1еу (средние показатели оптической плотности околоплодных вод 0,065± 12,5), которая указывала на тяжелую форму ГБН При сопоставлении степени изоиммунизации матери и тяжести развившейся гемолитической болезни заболевания плода выявлено, что прямая зависимость обнаруживается только при реализации тяжелой степени ГБН

Из 96 новорожденных детей с ГБН доношенными родились около половины в группе с антирезусными антителами (56,76%), и большинство (86,44%) — в группе без антител У трети новорожденных было выявлено перинатальное поражение центральной нервной системы, у кажтого четвертого ребенка - синдром двигательных дисфункций В раннем неонатальном периоде у большинства детей наблюдалась субиктеричность кожных покровов, анемия чаще имела место у новорожденных при наличии антирезусных антител у маюри в гестационный период (75,68% против 42,37%), в основном тегкой степени тяжести Клиника желтухи у новорожденных от женщин с антирезусными антителами проявилась раньше - на 1-2 сутки, тогда как в группе детей от матерей без антител — на 2-3 сутки жизни Незначительно выше была средняя концентрация билирубина у детей с Г БН при наличии антирезусных антител у матери во время беременности, а почасовой прирост билирубина составил 3,75 <-3,64 и 1,44±3,05 мкмоль/л соответственно В целом гемолитическая болезнь легкой степени диа1 ностирована у трети новорожденных (29,73%) в группе с наличием антирезусных антител у матерей во время беременности и у большинства (86,7%) детей от матерей без антирезусных антител Детям от матерей с антирезусными антителами в 27,03% случаев проводили заменное переливание крови

Гаким образом, среди женщин, родивших детей с ГБН, преобладали повторнородящие, старше 26 лет, более половины из них имели отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, только у 38,54% во время беременности выявлены антирезусные антитела, причем отсутствует прямая зависимость между их наличием и реализацией, тяжестью течения ГБН По результатам определения оптической плотности околоплодных вод тяжелая форма ГБН предположительно была диагностирована в 44,4%

случаев, тогда как среди родившихся детей с ГБН тяжелая форма выявлена только у 28,6% новорожденных Высокий уровень антител в крови беременной женщины не определяет обязательного развития гемолитической болезни новорожденного, а тяжелые формы заболевания могут возникать и при отсутствии антирезусных антител

Исследование иммунологических взаимоотношений систем матери и ее ребенка, рожденного от изоконфликтнон беременности, позволяет сделать предположение о взаимосвязи развития гемолитической болезни новорожденных со значительными изменениями функциональной способности Т- и В- лимфоцитарного клона организма женщины Для достижения поставленных задач исследования мы посчитали необходимым изучить пролиферагивную активность лимфоцитов в РБТЛ в присутствии митогенов (аллогенных лимфоцитов, ФГА, ЛПС) у 55 резус-отрицательных беременных (основная группа) и 20 резус-отрицательных небеременных женщин с имму неконфликтной беременностью в анамнезе (группа сравнения), а также у 14 резус-положительных беременных женщин (контрольная группа) По возрасту, социальному статусу и анамнестическим данным (перенесенным соматическим и гинекологическим заболеваниям) все группы обследованных женщин были сопоставимы Пациентки основной группы в дальнейшем были разделены на 2 группы группа А (30 чел) -родившие детей с гемолитической болезнью, группа В (25 чел) - родившие здоровых детей В анамнезе у резус-отрицательных небеременных женщин группы сравнения отмечено рождение детей с ГБН различной степени тяжести с последующим заменным переливанием крови, у всех этих женщин имелись нарушения репродуктивной функции (привычное невынашивание беременности у 15%, у 35% - первичное и вторичное бесплодие, у 20% -нарушения менструального цикла) Первобеременных среди резус-отрицательных женщин, родивших в дальнейшем детей с ГБН, было 26,7%, первородящих - 33,3%, а в группе резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей - соответственно 40% и 24% Более 3 беременностей в анамнезе имели 43,3% женщин группы А и 24% - в группе В Аборты наблюдались у половины обследованных, самопроизвольные выкидыши - у трети женщин При изучении анамнеза выявлено, что хирургическим вмешательствам чаще подверглись беременные группы А (23,3%, в гом числе в 6,7% - гемотрансфузиям), что является фактором риска реализации резус-иммунизации в гемолитическую болезнь плода и новорожденного Однако самая большая доля хирургических вмешательств отмечена у пациенток группы сравнения В основной группе обследуемых женщин доминировала 0(1) группа крови, в отличии от группы сравнения и контрольной группы, где преобладали В(ПТ) и А(И) группы крови

За весь период гестации общая прибавка веса у беременных основной и контрольной группы достоверно не отличалась Кроме того, отсутствие острого течения урогенитальной инфекции во время беременности во всех исследуемых группах исюпочачо возможность внутриутробного инфицирования плода Тем не менее, более 10 кг за период беременности

прибавили в 60 % случаев изосенсибилизированные беременные, родившие впоследствии детей с гемолитической болезнью В 44,4% случаев течение гестационного периода осложнялось угрозой прерывания до 16 недель беременности в группе А, что, возможно, свидетельствует о сенсибилизации материнского организма и развитии иммуноконфликта Число беременных, получавших в качестве сохраняющей терапии гормональные препараты (дюфастон), достоверно отличалось в группе А - 27%, в группе В - 8%, в контрольной - 14,3% Частота раннего токсикоза была достоверно выше у КЬ (-) беременных (23,3%), родивших впоследствии детей с ГБН, развитие которой, возможно, и обусловлено развитием иммуноконфликтной ситуации Течение беременности осложнилось развитием гестоза у 21,4% беременных женщин в контрольной группе и у 10,9% - в основной Анемия легкой степени имела место во всех группах (у 34,5% в основной группе и у 35,7% -в контрольной) Беременность при рождении детей с ГБН в 20% случаев протекала на фоне ФПН, тогда как в группе В и контрольной группе признаков ФПН выявлено не было При оценке прогностической значимости АФП и ХГЧ в пренатальной диагностике гемолитической болезни плода отмечено, что значегшя ХГЧ у всех сенсибилизированных женщин находились в пределах нормы, но его средний уровень несколько превышал соответствующий показатель при физиологически протекающей беременности

Ультразвуковая диагностика позволила нам выявить некоторые неспецифические признаки для гемолитической болезни плода во втором и третьем триместре беременности Достоверно чаще при УЗИ во втором триместре в группе беременных с иммуно конфликтным плодом регистрировались хакие особенности фетоплацентарного комплекса, как СЗРП (13,3%), аномалии расположения плаценты (10%), гипотрофия плода (16%) и обвитие пуповины (20%) О недостаточной информативности УЗИ для определения признаков гемолитической болезни плода можно судить по низкой частоте маловодия, обнаруженного у 6,7% пациенток с иммуноконфликтной беременностью

Несмотря на возможною сенсибилизацию всех КЬ (-) беременных, антирезусные аштела были выявлены только среди беременных группы А -в 33,3% случаях, а пик их титров отмечен в сроках 26-35 нед, в основном у повторнобеременных Причем в группе сравнения у 15% пациенток также были обнаружены антирезусные антитела в титрах от 1 8 до 1 128, с фенотипом сс(1с1ЬЕК, несмотря на отсутствие беременности в период обследования, что говорит о ИИ сенсибилизации, возникшей в предыдущие беременности В группе А у 11,4% беременных были диагностированы у 5,7% - ^ОЗ, соответственно с высоким и средним риском гемолиза В 5,7% случаях выявлен фенотип ссс!<1ееК, в 2,9% - сссМЕЕппК, в 2,9% случаев -сссЫееММ Плазмаферез с лечебной целью проводили у 11,4% беременных, однако значительною, клинически значимого, снижения титров антирезусных антител не наблюдалось Обращает внимание, что пик роста

титра антирезусных антител отмечен с 31 до 35 недель беременности Снижение титров происходило после 36 недель беремешгости

Учитывая рост антирезусных антител, несмотря на проводимую консервативную терапию, 16,7% беременным с диагностической целью был проведен амниоцентез (для определения оптическои плотности околоплодных вод) Поскольку отмечался рост титра антител (до 1-1024), в 5,7% случаев процедуру проводили дважды Показатели оптической плотности околоплодных вод колебались в пределах от 0,1 ед до 0,46 ед, средние показатели соответственно составили в 26-30 нед - 0,01±0,01, в 3035 нед - 0,03±0,01ед

К моменту родоразрешения средний гестационный срок в группе А составил 37,8±0,04 нед, чго меньше, чем в группе В (39,6±1,07 нед) и контрольной группе (40,3±0,02 нед) Большее количество преждевременных родов отмечено в группе беременных женщин, родивших впоследствии детей с гемолитической болезнью Большинство детей родились в срок, однако с признаками недоношенности чаще рождались дети в группе А (30% против 8% в группе В) Статистически значимых межгрупповых различий по массе тела, длине новорожденных и оценке по шкале Апгар выявлено не было В основном дети родились с 0(1) и В(Ш) группой крови Среди родившихся с гемолитической болезнью совпадение по группе крови новорожденного и матери было в 55,6%, с отцом - в 16,6% случаях, причем при совпадении группы крови ребенка с группой крови обоих родителей (27,8%) чаще реализуется средняя степень тяжести ГБН

При сравнении состояния новорожденных отмечено, что в группе А у всех женщин родились дети с гемолитической болезнью различной степени тяжести, вне зависимости от выявления антирезусных антител в гестационный период У детей, матери которых не имели антирезусных антител (66,7%) за весь период беременности, в 6,7% случаев развилась гемолитическая болезнь тяжелой степени тяжести, в 20% - средней степени тяжести и в 40% - легкой степени тяжести Уровень билирубина у детей с ГБН был достоверно выше, чем у здоровых Самый высокий уровень гемоглобина крови оказался у новорожденных от резус-положигельных матерей (контрольная группа), составляя 208,67*12,05 г/л, что в 1.17 раза выше, чем у детей с ГБН

Выписка детей с гемолитической болезнью осуществлялась преимущественно на 5-6 сутки (60% детей) Выписаны на 7-8 сутки 20%, позже (на 9-10 сутки) - 20% детей Но дети, матерям которых проводилась комплексная пренатальная диагностика гемолитической болезни с учетом индивидуальной пролиферативной активности лимфоцитов матери (60%) с проведением соответствующей терапии во время беременности и с первых суток жизни новорожденных, выписывались раньше, чем в целом дети с ГБН Следовательно, адекватная пренатальная диагностика с использованием РБТЛ в целях изучения пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка и последующее своевременное лечение

позволило снизить время пребывания в отделении патологии новорожденных и раньше провести выписку новорожденных с гемолитической болезнью

Таким образом, вне зависимости от рождения здоровых детей или детей с ГБН, резус-отрицательные женщины, составившие основную группу, существенно не отличались по возрасту, социальному статусу, особенностям акушерско-гинекологического анамнеза Течение гестационного периода у резус-отрицательных женщин в половине случаев осложнялось наличием угрозы прерывания беременности, развитием у трети женщин анемии и гестоза Титры антирезусных антител были выявлены только в 33,3% случаев, в основном у повторнобеременных женщин, при проведении диаг ностического амниоцентеза показатели оптической плотности околоплодных вод, соответствующие тяжелой степени гемолитической болезни, выявлены чаще, чем в дальнейшем у новорожденных была диагностирована тяжелая форма эюго заболевания, что свидетельствует о недостаточной информативности традиционно используемых методов пренатальной диагностики гемолитической болезни

Нормальному течению беременности способствует физиологически обусловленное угнетение активности Т-систем здоровой беременной женщины, не имеющей различий с плодом по основным эритроцитарным антигенам, что препятствует отторжению плода как чужеродного объекта При изоспецифической беременности антигенное раздражение материнского организма значительно усиливается, происходит стимуляция Т- и В-лимфоцитов, нарастает продукция гоогемагглютининов, относящихся в основном к классу Однако в клинической практике часто отмечается отсутствие прямой зависимости между титрами антител в крови беременной женщины и реализацией изоконфликгной ситуации В связи с этим нами исследован индекс стимуляции в качестве диагностического и прогностического критерия гемолитической болезни плода

Анализ пролиферативного ответа лимфоцитов резус-положительных и резус-отрицательных беременных женщин в присутствии лимфоцитов генетического отца будущего ребенка и митогенов. При анализе интенсивности пролиферативного ответа лимфоцитов резус отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей были получены следующие результаты Как видно из табл 1, наиболее выраженный пролиферативный ответ наблюдался на 72 ч культивирования в культурах с оптимальной дозой ФГА (20 мкг/мл) В присутствии клеток мужа также наблюдалась тенденция к усилению пролиферации лимфоцитов в группе беременных резус-отрицательных женщин, родивших детей с ГБ При межгругтповом сравнении в 72 часовых культурах выявлено статистически достоверное усиление пролиферативного ответа лимфоцитов в СКЛ у беременных резус-отрицательных женщин, родивших детей с Г Б, в отличие от резус-отрицагельных беременных женщин, родивших здоровых детей

Анализ пролиферативного ответа в 144 часовых культурах показал, что результаты были схожими с таковыми при культивировании в течение более короткого времени (72 ч) (табл 2) Статистически достоверных межгрупповых различий в интенсивности пролиферативного ответа лимфоцитов, стимулированных ФГА и ЛПС, получено не было Такая закономерность может быть связана с сенсибилизации лимфоцитов женщины к антигенам генетического отца будущего ребенка, а так же с угнетением пролиферативной активности на 144 ч в СКЛ в группе резус-отрицательных беременных женщин, родивших впоследствии здоровых детей Межгрупповых различий в интенсивности пролиферативной активности в присутствии ФГА и ЛПС зарегистрировано не было

Таблица 1

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов (имп/мин) в группах резус-

отрицательных беременных женщин, отрицательных беременных женщин,

родивших детей с ГБН, и резус-родивших здоровых дегей, при

Группа Без митогеиа Аллогенныс лимфоцит ФГА ЛПС

2,5 20 1 0,1

Ш1(-) женщины, 710 06± 1118,86± 9817,28± 37686,21± 805,61± 376,6ь±

родившие детей 211,84 264,91* 2995,60 6986,8 199,78 75,19

с ГБ п=18

И»(-) женщины, 443,55± 454,46± 10873,7± 46632,1± 783,69± 412,35±

родившие 83,52 115,31 3766,44 12256,8 214,25 80,11

здоровых детей п=10

Примечание * - р<0,05 по непарному ^критерию Стьюдента по сравнению с группой резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей

Таблица 2

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов женщин (в имп/мин) в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших дегей с ГБН, и резус-отрицательных беременных женщин родивших здоровых детей, при

Группа Без Аллогеиные Мигоген и его концентрация, мкг/мл

митогена лимфоциты ФГА ЛПС

2,5 20 1 ОД

КН(-) женщины, 1279,84± 1345,35± 4065,23± 30130,3± 715,69* 1059,1±

родившие детей 775 20 338,88* 1563,24 9551,79 349,63 560,51

с ГБ п=18

Ш1(-) женщины, 1010,00± 333,59± 3837,84± 49989,6± 682,57± 471 36±

родившие 312,16 79,58 1336,6 15540,1 203,37 266,53

здоровых детей п=10

Примечание * - р<0,05 по непарному ^критерию Стьюдента по сравнению с группой резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей

Статистически достоверных различий между группами резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей и детей с ГБН, на 3-й сутки после родов выявлено не было

В дальнейшем при сравнении индексов стимуляции отмечен более высокий ИС лимфоцитов на аллогенные лимфоциты при культивировании в течении 72 ч в группе резус- отрицательных женщин, родивших детей с различной степенью тяжести гемолитической болезни по сравнению с женщинами, родивших здоровых детей При культивировашш на 144 ч индекс стимуляции на аллогенные лимфоциты в группе резус-отрицательных береме1шых женщин, родивших детей с ГБН был статистически достоверно выше индекса стимуляции группы группе резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей Показатели индекса стимуляции свидетельствуют о разной силе пролиферативного ответа лимфоцитов на клетки мужа в обеих основных группах Как видно из табл 3 и 4, выявлено статистически значимое угнетение ИС на субонтимальную дозу ФГА (2,5 мкг/мл) и угнетение на оптимальную дозу ЛПС (1 ми/мл) при культивировании в течении 144 ч в группе резус-отрицательных беременных женщин, родивших впоследствии детей с ГБН, по сравнению с группой беременных резус-отрицатепьных женщин, родивших здоровых детей При сравнении индексов стимуляции в послеродовом периоде нами статистически значимых различий выявлено не было

Таблица 3

Индекс стимуляции в РБТЛ с аллогенными лимфоцитами и ФГА в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей, при

Группа На клетки мужа Minoren и его кончен грация, мкг/мл

ФГА

72 144 72 ч 144 ч

20 2,5 20 2,5

Ш1(-) женщины, родившие детей с ГБ п=18 2,62± 0,44* 3,4Ь 1,08* 119,07± 32,98 23,21± 7,64 78,66± 31,92 4,07± 1,74*

НЬ(-) женщины, родившие здоровых детей п=10 1,16± 0,35 0,78± 0,38 123,39± 29,57 30,78± 10,78 130,35± 70,09 11,33± 7,13

Примечание * - р<0,05 по непарному ^критерию Стыодеша по сравнению с группой резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей

Таблица 4

Индекс стимуляции в РБТЛ с аллогенными лимфоцитами и ЛИС в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей, при

Группа На клетки мужа Митоген и его концентрация, мкг/мл

ЛПС

72 144 72 ч 144 ч

1 0,1 1 0,1

Ш1(-) женщины. 2,62± 3,41± 1,76± 0,44± 0,02± 0,63±

родившие дсгей с ГБН 0,44* 1,08* 0,60 0,07 0,005* 0,33

11=18

Ш1(-) женщины, 1,16± 0,78± 2,34± 1,10± 1,35± 0,62±

родившие здоровых 0,35 0,38 0,83 0,26 0,49 0,20

детей п=10

Примечание * - р<0,05 по сравнению с женщин, родивших здоровых детей

группой резус-отрицательных

Таким образом, увеличение ИС в основной группе по сравнению с группой сравнения, свидетельствует об усилении пролиферативного ответа в СКЛ на аллогенные лимфоциты генетического отца ребенка в группе резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН

При сравнешш функциональной активности лимфоцитов здоровых неиммунизированных резус-положительных беременных женщин и резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью (табл 5), при культивировании лимфоцитов в течение 72 ч выявлено повышение уровня пролиферации на аллогенные лимфоциты, ФГА 2,5 мкг/мл и ЛПС 1 мкг/мл в фуппе женщин, родивших детей с ГБН

Таблица 5

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов (имп/мин) в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-положительных беременных женщин при культивировании в течение 72 ч

Группа 1>ез Аллоген- Митоген и его концентрация, мкг/мл

мигогеиа ные лимфо- ФГА ЛПС

цкгы 2,5 20 1 0,1

Ш1(-) женщины, 710,06+ 1118,86± 9817,28± 37686,21+ 805,61± 376,66±

родившие де!ей с 211,83 264,91* 2995,6* 6986,77 199,78* 75,18

ГБН п=18

Ш|(+) беременные 508,10± 443,864- 3772 94± 30776,3± 345,03+ 454,91±

женщины 179,80 138,59 1993,95 16620,3 95,37 161,67

п=7

Примечание * - р<0,05 по непарному г-критерию Стыодента по сравнению с группой резус-положительных беременных женщин

При более длительном культивировании лимфоцитов на 144 ч статистически достоверное усиление пролиферации выявлено только в культурах с добавлением 2,5 мкг/мл ФГА В случаях спонтанной пролиферации, в присутствии аллогенных лимфоцитов и ЛПС достоверных межгрупповых различий нами выявлено не было (табл 6)

Таблица 6

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов (имп/мин) в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-положительных беременных женщин при культивировании в течение 144 ч

Группа Без Аллогенные лимфоциты Митоген и его концентрация, мкг/мл

MiïToi ена Ф1А ЛПС

2,5 20 1 0,1

Rh(-) женщины, родившие детей с ГБН п=18 1279,84± 775,20 1345,35± 338,88 4065,23* 1563,24* 30130,3± 9551,78 715,69± 349,63 1059,1± 560 51

Rh(+) беременные женщины п=7 447,35* 105,97 455,69-t 181,16 957,15* 236,19 26944 4± 9997,39 243,12* 75,94 533,62± 323,04

Примечание * - р<0,05 по непарному t-критерию Стьюдента но сравнению с группой резус-положительных беременных женщин

При сравнении индексов стимуляции (ИС) на аллогенные лимфоциты при культивировании на 72 ч в этих группах достоверных различий выявлено не бычо (табл 7)

Таблица 7

Изменения индексов стимуляции в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-положительных беременных жешцин при культивировании в течение 72 и 144 ч_

Iруппа На клетки мужа Митоген и его концентрация, mki/mji

ФГА

72 144 72 ч 144 ч

20 2,5 20 2,5

Rh(-) женщины, родившие детей с ГБ п=18 2,62± 0,44 3,41* 1,08* 119,07± 32,97* 23,21-t 7,64* 78,66* 31,92 4,02± 1,74

Rh(+) беременные женщины п=7 1,10± 0,18 0,41 75 02* 24,48 7,71± 1,83 96,24* 68,34 2,38± 0,58

Примечание * - р<0,05 по непарному ^критерию Стьюдента по сравнению с группой резус- положит ельных беременных женщин

Статистически достоверный эффект наблюдался на 144 ч культивирования на аллогенные лимфоциты в группе резус- отрицательных беременных жешцин, родивших детей с различной степенью тяжести

гемолитической болезни, но сравнению с резус-положительными женщинами, родившими здоровых детей Как видно из табл 7, выявлено статистически значимое повышение индекса стимуляции на разные дозы ФГА в основной исследуемой группе при сроке культивирования 72 ч При культивировании на 144 ч достоверных значимых различий в присутствии ФГА и ЛПС выявлено не было

На оигимальн>ю и субоптимальную дозу ЛПС в основной группе на 72 ч культивирования индекс стимуляции (табл 8) был достоверно выше в группе резус- отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью, в отличие от резус-положительных беременных женщин

Таблица 8

Изменения индексов стимуляции в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с ГБН, и резус-положительных беременных женщин при культивировании в течение 72 и 144 ч__

На клетки мужа Миюген и его концентрация, ми/мл

Группа ЛПС

72 144 72 ч 144 ч

1 0,1 1 0,1

Ш|(-) женщины. 2,62-ь 3,41А 1,76± 0,44± 0,02± 0,63±

родившие детей с 0,44 1,08* 0,59* 0,07* 0,005 0,34

ГБ п=18

КЬ(+) 1,10± 1,3 7± 1,42± 1,16± 0,68± 1,17±

беременные 0,18 0,41 0,58 0,40 0,13 0,47

женщины п—7

Примечание * - р<0,05 по непарному (-критерию Стьюдента по сравнению с группой резус-положительных беременных женщин

При сравнении функциональной активности лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей, и резус-положительных беременных женщин выявлено, что спонтанная и индуцированная пролиферация лимфоцитов в двух сравниваемых группах достоверно не отличалась нри культивировании в течение 72 ч (табл 9), за исключением статистически достоверного усиления пролиферативного ответа на субоптимальную дозу ФГА при культивировании в течение 144 ч в группе резус-отрицательных беременных женщин, родивших впоследствии здоровых детей (табл 10) При сравнении индексов стимуляции при культивировании на 72 и 144 ч достоверных различий между группами выявлено не было Это говорит об отсутствии отличий в функциональной активности лимфоцитов у резус-отрицательных женщин, родивших здоровых детей, и у резус-положительных беременных женщин

Таблица 9

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов в РБТЛ на аллогенные лимфоциты, ФГА и ЛПС (абсолютные значения в имп/мин) за 72 ч в группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых детей, и

1руина Без Аллогенные Митоген и его концентрация, мкг/мл

ми гогена лимфоциты ФГА ЛПС

2,5 20 1 0,1

11Ь(-) женщины, 443,55± 454,46± 10873,7± 46632,1± 783,69± 412,35+

родившие 83,52 115,31 3766,44 12256,8 214,25 80,11

здоровых детей п=10

]*!!(+) 508,10+ 443,86± 3772,94± 30776,3± 345,03± 454,91±

беременные 179,80 138,59 1993,95 16620,3 95,37 161,67

женщины п=7

Примечание * - р<0,05 по непарному (-критерию Стьюдента по сравнению с группой резус-положительных беременных женщин

Таблица 10

Изменения пролиферативного ответа лимфоцитов в РБТЛ на аллогетшые лимфоциты, ФГА и ЛПС (абсолютные значения в имп/мин) за 144 ч в группе группах резус-отрицательных беременных женщин, родивших здоровых

Группа Без миюгена Алю1 синие лимфоциты ФГА ЛПС

2,5 20 1 0,1

КЬ(-) женщины, 1010,00+ 333,59+ 3837,84+ 49989,6+ 682,57^ 471,36+

родившие 312,16 79,58 1336,6* 15540 1 203,37 266,53

здоровых детей п=10

ЮМ+) 447,35± 455,69* 957,15± 26944,4+ 243,12+ 533,62±

беременные 105,97 181 16 236,19 9997,39 75 94 323,04

женщины п=7

Примечание *- р<0,05 но непарному ^критерию Стьюдента по сравнению с группой резус-положительных беременных женщин

Обращает на себя внимание, что обнаружены статистически значимые закономерности при изучении выраженности пролиферативного ответа лимфоцитов в гестационном периоде в реакции бласттрансформации с аллогенными лимфоцитами (мужа) и ФГА у резус-отрицательных женщин, родивших в дальнейшем детей с ГБН При исследовании индекса стимуляции выявлено, что его уровень у женщин во время беременности был достоверно выше при реализации тяжелой формы гемолитической болезни (р<0,05, сравнение проводилось по непараметрическому методу - критерию Уитни-Манна)

Именно изучение иролиферативного ответа лимфоцитов является наиболее информативной интегральной моделью иммунного ответа в системе m vitro Полученные нами результаты свидетельствуют о целесообразности и эффективности применения данного метода в качестве диагностического критерия гемолитической болезни при иммуноконфликтной беременности

ВЫВОДЫ

1 Гемолитическая болезнь новорожденного развивается чаще при повторной беременности у резус-отрицательных женщин с отягощенным репродуктивным анамнезом, при этом только у трети выявляются антирезусные антитела в гестационный период Течение беременности у 78% осложняется угрозой прерывания, преимущественно во втором триместре

2 Результаты методов пренатальной диагностики (наличие и характер изменения титра антирезусных антител в динамике, ультразвуковое исследование показатели оптической плотности околоплодных вод) не соответствуют степени тяжести иммуноконфликта, реализовавшегося в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, не предоставляют достаточной информации для оценки степени иммунизации и исхода ее для плода

3 Пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии неспецифического митогена (фитогемагглютинина) угнетается у резус-отрицательных беременных женщин по сравнению с чебеременными женщинами

4 При оценке пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью, наблюдается усиление уровня пролиферации в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка по сравнению с резус-отрицательными беременными женщинами, родившими здоровых детей

5 Эффект усиления пролиферативного ответа лимфоцитов в виде повышения индекса стимуляции у беременных резус-отрицательных женщин в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка можно использовать в качестве диагностического теста в комплексной пренатальной диагностике гемолитической болезни плода и новорожденного, а также на этапе предгравидарной подготовки для оценки степени иммунизации

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1 В целях улучшения диспансерного ведения резус-отрицательных беременных пациенток, входящих в группу риска по развитию иммуноконфликтной беременности, а так же реализации и исходов резус-иммунизации в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, в специализированных родовспомогательных учреждениях наряду с

известными, общепринятыми методами диагностики I емолитической болезни плода и новорожденного целесообразно внедрение иммунологического метода - реакции бласттрансформации, для оценки уровня пролиферации лимфоцитов резус-отрицательной женщины в присутствии лимфоцитов генетического отца будущего ребенка на доклиническом этапе (на этапе до образования антирезусных антител)

2 Показанием для проведения инвазивных методов диагностики и лечения гемолитической болезни плода должно являться значение индекса стимулцни 2,5 и более

3 При планировании беременности на этапе предгравидарной подготовки у резус-отрицательных женщин с отягощенным репродуктивным, иммунологическим, оперативным и трансфузионным анамнезом, входящих в группу риска но развитию иммуно конфликтной беременности, а так же гемолитической болезни плода и новорожденного, в алгоритм обследования следует включить иммунологический метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов (РБТЛ) резус-отрицательнои женщины в присутствии алло! енных лимфоцитов

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 К вопросу о диагностической ценности антирезусных антигел в развитии гемолитической болезни новорожденных // Материалы научной сессии Пермской государственной медицинской академии 2005 года - Пермь-Ижевск, 2005 - С 81-84 (Соавт М М Падруль, Н Н Кеворков)

2 Использование реакции бласттрансформации лимфоцитов для пренатальной диагностики i емолитической болезни новорожденных // Материалы V Российского Форума «Мать и дитя» - М , 2005 — С 582583 (Соавт М М Падруль, С В Г'ейн)

3 Оценка пролиферативной активности лимфоцитов беременных женщин для диагностики гемолитической болезни новорожденных // Медицинская иммунология -2006-№2-3 -С 316 (Соавт ММ Падруль, С В Гейн)

4 Изучение пролиферативнои активности лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин для ранней диагностики гемолитической болезни новорожденных // Пермскии медицинский журнал -2007 - Т XXIV, №1-2- С 100-102

5 Оценка пролиферативной активноеги лимфоцитов беременной женщины для диагностики гемолитической болезни новорожденных // Вестник Российской военно-медицинской академии - 2007 - Т XXVII, № 1 приложение, часть 1 - С 421 (Соавт М М Падруль)

6 Способ диагностики гемолитической болезни новорожденных Патент на изобретение № 2304780 от 20 08 2007г (Соавт ММ Падруль, С В Гейн)

Подписано в печать 28 09 2007 Формат 60X90/16 Набор компьютерный Тираж 100 экз Уст печ ч 1,0 Заказ № 101/2007

Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм» Аарес 614025, г Пермь, уп Г<_роев Хасана, 105

Актуальность проблемы.

Иммунологические взаимоотношения матери и плода формируются в рамках единой функциональной системы мать-плацента-плод, где системообразующим фактором является оптимальное развитие зародыша [12, 17, 23, 54, 136].

Нарушение нормальных взаимоотношений в системе мать-плацента-плод является ведущим звеном патогенеза различных форм патологии, матери и плода, и определяет течение перинатального периода [17]. В настоящее время иммунологические взаимоотношения матери и плода являются предметом изучения физиологов, иммунологов, перинатологов, акушеров-гинекологов, репродуктологов. Одной из актуальных проблем иммунизации матери к антигенам системы резус плода является гемолитическая болезнь плода и новорожденного [142].

Распределение резус-О-фактора в популяции обуславливает резус-несовместимость 14% всех браков, 10% сочетания мать-плод, и подразумевает иммунизацию беременной эритроцитарными фетальными антигенами, а так же реализацию гемолитической болезни плода и новорожденного [59, 66].

Несмотря на то, что патогенез заболевания трактуется с позиции агрессии антител матери против эритроцитов плода, в диагностике не учитывается иммунологическая реактивность плода и новорожденного, нет достаточных сведений о напряженности клеточного иммунитета биологической системы мать-плод [45,46]. С внедрением в клиническую практику профилактики резус-О-иммунизации антирезус-D-иммуноглобулином человека риск её развития уменьшился, но остаётся высоким число резус-отрицательных пациенток, которым не разрешено проведение анти-Б-иммунопрофилактика, либо она является неэффективной [30, 36, 59, 98, 123, 128].

В связи с этим индивидуальная тактика и клиническая эффективность ведения беременных при резус-Б-сенсибилизации зависит от точности пренатальной диагностики гемолитического поражения плода и прогнозирования степени тяжести заболевания новорожденного. Необходимость совершенствования способов диагностики гемолитической болезни определяют актуальность исследований иммунных реакций беременных и формирование пре- и постнатальных диагностических и прогностических критериев патологического процесса. Учитывая, что существует большое количество методов, позволяющих исследовать in vitro различные функции лимфоидных клеток, было решено провести исследование пролиферативной активности лимфоцитов женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов (лимфоидные клетки генетического отца ребенка) с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) [64].

Цель исследования - оптимизация методов пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного на основании оценки пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин в присутствии аллогенных лимфоцитов генетического отца будущего ребенка и митогенов.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности течения беременности и родов у резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью.

2. Оценить в сравнительном аспекте эффективность современных методов пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного.

3. Исследовать и сравнить выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцированного аллогенными лимфоцитами генетического отца будущего ребенка и митогенами, у резус-отрицательных женщин с целью прогнозирования риска развития гемолитической болезни плода и новорожденного.

4. Обосновать целесообразность сочетанного применения исследования пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательной беременной женщины на лимфоциты генетического отца будущего ребенка для диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного в акушерстве, гинекологии, неонатологии.

Научная новизна исследования.

Проведена оценка диагностической значимости клинико-иммунологических критериев антенатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного. Впервые обоснован и апробирован новый подход к пренатальной диагностике гемолитической болезни плода и новорожденного различной степени тяжести во время беременности у резус-отрицательных женщин. Предложен эффективный и патогенетически обоснованный метод пренатальной диагностики гемолитической болезни плода, основанный на оценке пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцированного аллогенными лимфоцитами генетического отца будущего ребенка и митогенами. Вследствие этого выведен диагностический критерий трансформации прогрессирующей Rh-сенсибилизации в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, что позволяет определить дальнейшую тактику ведения беременной женщины, показания к использованию инвазивных методов диагностики, а так же стратегию лечения плода.

На основании установленных закономерностей разработан алгоритм комплексного обследования семьи, входящей в группу риска по развитию иммуноконфликтной беременности, для проведения антенатальной диагностики и прогноза развития гемолитической болезни при наличии Rh-сенсибилизации. Разработан и предложен алгоритм обследования резус-отрицательных беременных женщин, позволяющий выделить из категории предполагаемой и прогрессирующей изосенсибилизации группу беременных с развивающимся иммунным конфликтом и исходом его в гемолитическую болезнь плода и новорожденного.

Обоснована необходимость комплексного подхода к оценке клинико-иммунологических критериев пренатальной диагностики гемолитической болезни новорожденных для отбора среди резус-отрицательных беременных пациенток, категории женщин с прогрессирующей изосенсибилизацией, что позволит избежать дополнительных инвазивных методов пренатальной диагностики этих состояний.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Предложен эффективный и патогенетически обоснованный метод пренатальной диагностики гемолитической болезни - оценка пролиферативного ответа лимфоцитов резус- отрицательной беременной женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов (лимфоцитов генетического отца будущего ребёнка) в реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Предлагаемый метод диагностики позволяет не только увеличить процент выявления гемолитической болезни в пренатальном периоде, но и спрогнозировать иммунный конфликт при планировании беременности, а также проводить соответствующие лечебные мероприятия в пренатальном и постнатальном периоде, что повысит эффективность терапии и сократит сроки пребывания в стационаре.

В теоретическом плане работа дополняет и расширяет существующие представления о патогенезе и роли иммунных механизмов в развитии гемолитической болезни. Предложенный способ диагностики защищен патентом на изобретение (№ 2304780 от 20.08.2007г).

Положения, выносимые на защиту:

1. Традиционные методы пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного являются недостаточно эффективными для оценки ее степени тяжести и формы.

2. Оценка пролиферативного ответа лимфоцитов резус- отрицательной беременной женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов (лимфоцитов генетического отца будущего ребёнка) в реакции бласттрансформации является патогенетически обоснованным методом пренатальной диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного.

3. Использование индекса стимуляции для пренатальной диагностики гемолитической болезни плода является более эффективным по сравнению с рутинными общепринятыми методами обследования резус- отрицательной женщины во время беременности.

Внедрение в практику.

Результаты исследования используются в клинической практике учреждений родовспоможения г. Перми, городского диагностического центра пренатальной диагностики и планирования семьи на базе МСЧ №

9 имени М.А. Тверье и в учебном процессе на кафедрах акушерства и гинекологии лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава».

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на областной конференции акушеров-гинекологов «Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья» (Пермь, 2005), научной сессии Пермской государственной медицинской академии 2006 года (Пермь, 2006), на конференции молодых ученых Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, получен патент на изобретение РФ № 2304780 от 20.08.2007г.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 159 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, рекомендаций практическому здравоохранению. Библиография представлена 121 работами отечественных и 70 - зарубежных авторов. Изложенный материал иллюстрирован 41 таблицей, 23 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Гемолитическая болезнь новорожденного развивается чаще при повторной беременности у резус-отрицательных женщин с отягощенным репродуктивным анамнезом, при этом только у трети выявляются антирезусные антитела в гестационный период. Течение беременности у 78% осложняется угрозой прерывания, преимущественно во втором триместре.

2. Результаты методов пренатальной диагностики (наличие и характер изменения титра антирезусных антител в динамике, ультразвуковое исследование, показатели оптической плотности околоплодных вод) не соответствуют степени тяжести иммуноконфликта, реализовавшегося в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, не предоставляют достаточной информации для оценки степени иммунизации и исхода ее для плода.

3. Пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии неспецифического митогена (фитогемагглютинина) угнетается у резус-отрицательных беременных женщин по сравнению с небеременными женщинами.

4. При оценке пролиферативного ответа лимфоцитов резус-отрицательных беременных женщин, родивших детей с гемолитической болезнью, наблюдается усиление уровня пролиферации в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка по сравнению с резус-отрицательными беременными женщинами, родившими здоровых детей.

5. Эффект усиления пролиферативного ответа лимфоцитов в виде повышения индекса стимуляции у беременных резус-отрицательных женщин в присутствии лимфоцитов генетического отца ребенка можно использовать в качестве диагностического теста в комплексной пренатальной диагностике гемолитической болезни плода и новорожденного, а также на этапе предгравидарной подготовки для оценки степени иммунизации.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1. В целях улучшения диспансерного ведения резус-отрицательных беременных пациенток, входящих в группу риска по развитию иммуноконфликтной беременности, а так же реализации и исходов резус-иммунизации в гемолитическую болезнь плода и новорожденного, в специализированных родовспомогательных учреждениях наряду с известными, общепринятыми методами диагностики гемолитической болезни плода и новорожденного целесообразно внедрение иммунологического метода - реакции бласттрансформации для оценки уровня пролиферации лимфоцитов резус-отрицательной женщины в присутствии лимфоцитов генетического отца будущего ребенка — для выявления на доклиническом этапе (на этапе до образования антирезусных антител).

2. Показанием для проведения инвазивных методов диагностики и лечения гемолитической болезни плода должно являться значение индекса стимуляции 2,5 и более.

3. При планировании беременности на этапе предгравидарной подготовки у резус-отрицательных женщин с отягощенным репродуктивным, иммунологическим, оперативным и трансфузионным анамнезом, входящих в группу риска по развитию иммуноконфликтной беременности, а так же гемолитической болезни плода и новорожденного, в алгоритм обследования следует включить иммунологический метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов (РБТЛ) резус-отрицательной женщины в присутствии аллогенных лимфоцитов.