Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Определение индивидуальной чувствительности организма к действию неблагоприятных факторов окружающей среды на основе клеточных реакций и метаболических сдвигов

На правах рукопиа

ДМИТРИЕВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА К ДЕЙСТВИЮ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СДВИГОВ

14.00.16- патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории полисистемных исследований Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН (Москва).

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Г.Н. Крыжановский

Доктор биологических наук, профессор М.Ю. Карганов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Г.Н. Сушкевич

Доктор биологических наук, профессор В.И. Торшин

Ведущее учреждение - Российский государственный медицинский университет

часов на заседании Диссертационного

исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., д. 8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан« ^ »

2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время не вызывает сомнения, что экологические и антропогенные факторы окружающей среды оказывают большое влияние на клеточные и гуморальные звенья систем организма животных и человека. Радиация, ряд химических соединений, отходы и продукция многих промышленных предприятий могут оказывать цитотоксиче-ское действие, вызывать мутации, а также обладать канцерогенным эффектом. Уровень поврежденности генома зависит от его способности устранять непрерывно возникающие в результате внешних воздействий повреждения и при дефектах в системах репарации будет повышен. Увеличение чувствительности генома к повреждающим факторам, в частности, к радиации, может приводить к возникновению дизрегуляционных изменений в деятельности различных систем организма (Г.Н.Крыжановский, 2003) и последующему развитию заболеваний (лучевая болезнь, радиационные новообразования и т.д.).

Влияние потенциально опасных факторов окружающей среды на развивающийся организм может приводить к еще более серьезным последствиям, чем у взрослых. Огромное количество физических, химических и биологических факторов, действуя на организм матери и эмбриона, могут вызвать нарушения развития плода - эмбриопатии, в частности, аномалии развития позвоночника (Е.Г. Скрябин, 2002). В первые годы жизни ребенка и пубертатный период любые генетические факторы, влияющие на метаболизм структурных компонентов позвоночника, могут стать причиной развития деформаций. Многолетние цитогенетические исследования детей и подростков, проживающих на территориях загрязненных радионуклеидами после аварии на ЧАЭС, на территориях различных промышленных городов с высокой степенью загрязненности воздуха, почвы и воды показывают повышенный уровень цитогенетических повреждений.

Среди факторов, оказывающих влияние на рост и развитие организма, также имеет значение сбалансированное питание, достаточное поступление с пищей и водой витаминов, минеральных компонентов, а также качество самих продуктов и питьевой воды.

Существующие методы изучения действия факторов внешней среды, обусловливающих характер проявления болезни, требуют большого числа субъектов и длительного времени наблюдения для получения значимых результатов. Традиционные эпидемиологические подходы не учитывают генетическую предрасположенность людей к развитию заболеваний. В связи с тяжестью заболеваний, вызываемых антропогенными факторами, выявлением их зачастую на поздних стадиях, когда терапия малоэффективна, особую актуальность приобретает разработка подходов к измерению параметров, определяющих ранние стадии заболевания, а также индивидуальный риск его развития.

Целью исследования являлась разработка методических подходов для определения индивидуальной чувствительности организма к действию факторов окружающей среды на основе выявленных сопряженных особенностей клеточных реакций и метаболических сдвигов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности клеточных реакций и метаболических сдвигов в условиях действия ряда факторов (регион проживания, различное водоснабжение, характер профессиональной деятельности, действие радиации, наличие хронических заболеваний и др.).

2. Изучить механизмы сопряжения клеточных реакций и метаболических сдвигов при действии некоторых антропогенных факторов окружающей среды.

3. Выявить закономерности в характере обнаруженных индивидуальных сдвигов и на их основе сформулировать критерии для формирования групп риска.

Научная новизна работы. Использование метода лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) в экспрессном режиме с применением современных компьютерных средств позволило провести массовые обследования работников предприятий ядерно-топливного цикла, а также учащихся общеобразовательных и специализированных учреждений.

В настоящем исследовании впервые показано, что вклад в светорассеяние некоторых субфракций сыворотки крови (6-8, 300, 400 нм) облученных людей, выявляемый методом ЛКС, коррелирует с общей накопленной дозой радиации и дозой, полученной за последние 9 месяцев. Изменения в составе биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, рото-глоточные смывы) зависят от характера воздействующих факторов, сетки вредности и трудового стажа работников.

Сопоставление данных, полученных с помощью ЛКС, с результатами цитологического обследования детей, проживающих и обучающихся в разных условиях, обнаружило высокую корреляцию между показателями, полученными различными методами, и продемонстрировало высокую информативность разработанного подхода. Впервые выявлены изменения в частоте встречаемости некоторых аномалий ядра буккальных эпителиоцитов у детей с деформациями позвоночника и у школьников, проживающих в неблагоприятных экологических условиях. Выявлена зависимость клеточно-метаболических показателей у детей дошкольного и младшего школьного возраста от состава потребляемой воды. Показана корреляционная связь между кариорексисом и кариолизисом ядер клеток буккального эпителия и ка-таболическим характером метаболических сдвигов в рото-глоточных смывах.

Теоретическое и практическое значение работы. Низкодозовые воздействия различной природы, в том числе облучение, приводят к разнообразным клеточным ответам: задержке деления в зависимости от стадии клеточного цикла, транскрипции генов репарации поврежденной ДНК и др. Эти ранние события определяют дальнейшую судьбу клетки — будет ли она подвергаться некрозу, апоптозу или, в конечном счете, выживет и приступит к делению. Первичному воздействию в этом процессе отводится роль триггера, который с определенной долей вероятности включает систему ответа со множеством регуляторных связей и точек возможного переключения механизмов, определяемую как чувствительность клеток к воздействию. Несмотря на то, что воздействия низкой интенсивности не вызывают соматической гибели организма, они способны модифицировать клеточно-ткаиевые эндогенные процессы, в конечном итоге приводя к развитию ряда заболеваний. Выявление изменений в метаболизме и характере клеточного ответа позволит прогнозировать индивидуальный риск развития заболевания для всего организма.

Основные трудности в выявлении эффектов воздействия антропогенных факторов окружающей среды связаны со слабой выраженностью проявлений и ограниченной чувствительностью методов исследования. Использованный в работе методический подход показал свою перспективность для мониторинга состояния здоровья работников потенциально опасных отраслей промышленного производства, населения экологически неблагополучных территорий и детей с риском развития заболеваний опорно-двигательного аппарата. Раннее выявление изменений в метаболизме и уровне цитогенетических повреждений для конкретного человека позволит своевременно проводить индивидуальные профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Исследованные экологические и антропогенные факторы окружающей среды вызывают изменения частоты встречаемости аномалий ядра бук-кальных эпителиоцитов и обусловливают преимущественно катаболическое направление метаболических сдвигов.

2. Сочетанное применения методов цитогснетичсского исследования клеток буккального эпителия и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека информативно для выделения групп риска в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды.

Внедрение в практику.

Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях внедрен в практику Федерального медико-биологического агентства РФ (акт от 3 ноября 2006г.).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Диз-регуляционная патология органов и систем», Москва, 2004; международной научной конференции «Физиология развития человека», Москва, 2004; 5-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Canada, Vanquover, 2004; VIII Международной конференции «Современные технологии восстановительной медицины», Сочи, 2005; Всероссийской научно-практической конференции «Природные факторы и социальные условия успешности обучения», Санкт-Петербург, 2005; Пленуме «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки», Москва, 2005; Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт — Петербургские научные чтения», СПб, 2005; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005; V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность», Москва, 2006; 6-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Belgium, Ghent, 2006.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 250 источников отечественной и иностранной литературы. Работа содержит 10 таблиц, 27 рисунков.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 5 статьях и 8 тезисах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование выполнено на сыворотке крови, моче, рото-глоточных смывах, лимфоцитах и эпителиоцитах 1235 человек, в том числе:

- работников предприятий ядерно-топливного цикла - 328 чел.

- учащихся общеобразовательных учреждений

г. Москвы - 472 чел.

с. Нагово Новгородской обл. - 23 чел.

г.Альметьевска- 81 чел.

- учащихся школы-интерната №76 (г. Москва) для детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата - 331 чел.

1. Исследование субфракционного состава биологических жидкостей (крови, мочи, рото-голоточных смывов) методом лазерной корреляционной спектроскопии.

Суть метода лазерной корреляционной спектроскопии заключается в определении спектральных характеристик квазиупруго рассеянного (рассматривается рэлеевское рассеяние) изучаемой системой света по спектру флуктуации интенсивности регистрируемого излучения.

Субфракционный состав биологических жидкостей регистрировали, используя лазерный корреляционный спектрометр ЛКС-03-«ИНТОКС», утвержденный Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ для определения размеров микрочастиц в биологических жидкостях (Сертификат ГШ.С. 39.003 .А N 5381). Спектрометр сопряжен с компьютерной системой, позволяющей быстро осуществить математическую обработку результатов.

Забор крови, мочи и РГС осуществляли натощак в утренние часы. Забор крови проводили в стационаре. Для этого 100 мкл цельной периферической крови наслаивали на 400 мкл физраствора, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин Надо-садочную жидкость отбирали для дальнейшего исследования.

Так как взятие образцов РГС является неинвазивным методом, его проводили на месте обследования. Ротоглоточньш смыв представляет собой многокомпонентную водную среду, содержащую клеточные элементы (эпи-телиоциты, лейкоциты), часть из которых частично или полностью разрушена, а также различные ферментные и неферментные молекулы, входящие в состав слюны. Слюна обладает высокой протеолитической активностью, поэтому большинство ее структурных ингредиентов (глико-, липопротеи новые комплексы, иммуноглобулины и др. молекулы) находятся в деградированном состоянии. Быстрое и значительное разведение этой высокоактивной в ферментном отношении жидкости приводит к резкому снижению протеолитической активности. Одновременно структурные компоненты слюны разводятся до той степени, когда обычными биохимическими и физико-химическими методами их выявление значительно затруднено.

Обследуемому предлагали прополоскать полость рта и глотки стерильным физраствором комнатной температуры на протяжении 30 сек. Полученный смыв собирали в одноразовый стакан. Затем отбирали 1,0-1,5 мл смыва в пластиковую пробирку.

Аликвоты мочи в объеме 1 мл отбирали в пластиковые пробирки и замораживали.

Образцы крови, мочи и РГС транспортировали и хранили до момента ЛК-измерений в замороженном виде при — 20 С. Перед непосредственным применением образец размораживали в термостате при комнатной температуре на протяжении 30 мин. Образцы центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин. Помещали 0,2 мкл надосадочной жидкости биологического образца в кювету спектрометра для проведения измерения с получением ин-

дивидуальных спектров. В качестве источника основной информации об исследуемой системе использовалась корреляционная функция электромагнитного поля рассеянного света. Регистрацию корреляционных функций проводили во временном интервале 6,37 мксек., при временном шаге 31,8 мксек. Эти величины соответствуют спектру рассеянного света в диапазоне 5 кГц, зарегистрированному с разрешением 25 Гц на точку, что позволяет визуализировать светорассеивающие частицы с размерами от 1 до 10000 нм. В этот диапазон попадают практически все биологически активные ингредиенты исследуемых биологических жидкостей. Полученные таким образом распределения фактически представляют характеристику метаболизма индивидуума.

Зарегистрированные параметры подвергали математической обработке методом регуляризации при помощи специальной процедуры, входящей в комплект программного обеспечения спектрометра. Результатом расчета являлась функция распределения светорассеивающих частиц по размерам, представленная в виде гистограммы. При этом по оси ординат определяется процентный вклад частиц в светорассеяние, а по оси абсцисс - их размеры (в нанометрах).

Для исследования тонких механизмов регуляторных сдвигов применяли 32-точечный диапазон размеров частиц, а для определения преобладающих направлений метаболических сдвигов - семиотический классификатор. В этом варианте обработки полученных данных весь диапазон спектра для рото-глоточных смывов делится на 4 информативные дискретные зоны (по размерам светорассеивающих частиц): I - 0-50 нм; II - 51-400 нм; III - 4002000 нм; IV - выше 2000 нм. Для крови - на 5 дискретных зон: 1-0-10 нм; II -11-30 нм; III - 31-70 нм; IV -71-150 нм; V - 150 и выше. Для мочи: I - менее 75 нм; II — 76-220 нм; III - 221-1500 нм; IV - выше 1500 нм. Согласно априорной информации, полученной при исследовании различных патологий, в эти зоны попадают молекулярные компоненты клеток от мономерных альбу-лярных белков до высокомолекулярных белковых комплексов.

В зависимости от увеличения (или снижения) процентного вклада в светорассеяние частиц той или иной фракции, предложенная семиотическая классификация ЛКС сыворотки/плазмы крови предполагает идентификацию 8 различных направлений сдвигов в обмене веществ и гуморальном иммунитете: интоксикационно-, катаболически-, дистрофически-, аллерго- и аутоиммунно-подобные, нормологические спектры и 2 типа смешанных спектров. При этом каждому симптомокомплексу соответствует несколько градаций, отражающих степень выраженности перечисленных спектральных сдвигов: начальная, умеренная и выраженная.

Третий способ представления результатов предполагает объединение семиотических сдвигов, характеризующихся преобладанием мелких частиц (дистрофически-подобный, катаболически-подобный, интоксикационно-подобный, интоксикационно-аллергоподобный) под общим названием ка-таболически-подобные. Соответственно, направления, отличающиеся пеоб-

ладанием крупных частиц (аллерго-интоксикационноподобное, аллерго-подобное, аллерго-аутоиммуноподобное, аутоиммунно-подобное) обозначали как анаболически-подобные. Нормологический характер обменных процессов при таком способе представления результатов сохранял свое обозначение.

2. Исследование цнтогенетического и цитологического статуса слизистых оболочек щеки и носа.

Клетки слизистой оболочки щеки являются удобным объектом для оценки функционального состояния организма, изменяющегося под действием эндогенных и экзогенных факторов. Критерием оценки влияния разных цитотоксических агентов служат наличие и частота встречаемости цитогене-тических нарушений: клеток с микроядрами, пикнозом, кариорексисом, ка-риолизисом и другими аномалиями ядра. Цитогенетическое исследование позволяет выявить наличие мутагенов, степень их воздействия на каждого субъекта обследуемой группы; провести сравнительный анализ кариологиче-ских изменений с другими показателями состояния здоровья, интенсивностью загрязнения окружающей среды, влиянием профессиональных вредностей и нагрузок, а также с результатами исследования другими методами (в том числе методом ЛКС). Основным показателем цнтогенетического действия антропогенных факторов является повышение частоты встречаемости клеток с микроядрами и другими аномалиями ядра.

Перед взятием образцов буккального эпителия обследуемому индивиду предлагали тщательно прополоскать рот физиологическим раствором. Затем деревянным шпателем со слизистой оболочки щеки в области коренных зубов брали соскоб. Эпителий в этой области многослойный, плоский, нео-роговевающий; поверхностно расположенные клетки здесь представлены зрелыми эпителиоцитами. Для окраски препарата проводили специфическую гистохимическую реакция на ДНК по Фельгену. Ядра приобретали фиолетовый цвет, цитоплазма - зеленоватый.

Оценка цнтогенетического статуса слизистой носа проводилась с помощью теста ядерных аномалий и методом мазков-отпечатков. Для приготовления отпечатков со слизистой носа одноразовую ватную палочку вводили в нос, прижимали к носовой перегородке в области преддверия и дыхательного отдела носовой полости и вращательным движением снимали поверхностный слой клеток. В этой части носа слизистая оболочка представлена многослойным плоским неороговевающим эпителием, который постепенно переходит в многорядный цилиндрический реснитчатый эпителий с бокаловидными клетками. Препараты окрашивали 2,5% раствором ацетоорсеина. Ядра приобретали бордовый цвет, цитоплазма — зеленовато-голубой (Н.Н.Беляева, 2005).

Препараты анализировали с помощью светового микроскопа в проходящем свете, используя объектив с масляной иммерсией при увеличении 1000. Подсчитывали от каждого человека не менее 1000 эпителиальных кле-

ток. В анализ включали отдельно лежащие неповрежденные клетки с хорошо окрашенной цитоплазмой и неповрежденной клеточной оболочкой. В образцах определяли наличие и частоту встречаемости клеток с микроядрами, двумя ядрами, кариорексисом, кариолизисом, пикнозом, «битым яйцом».

Оценка цитологического статуса слизистой щеки и носа основана на определении состояния слизистых оболочек рта и носа в результате качественного и количественного анализа эпителиоцитов, лейкоцитов и микрофлоры с помощью цитологических показателей на мазках (Беляева H.H., 2005).

Биоматериал брали у обследуемых из различных участков полости рта (слизистая щеки в районе коренных зубов) и носа (слизистая носовой перегородки в области преддверия и дыхательного отдела носовой полости).

При микроскопическом анализе от 100 до 300 клеток на препаратах от каждого обследуемого подсчитывали число буккальных эпителиоцитов 1-6 стадий дифференцировки, определяли число лейкоцитов (при воспалительных реакциях среди лейкоцитов в процентах определяли число нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов, эозинофилов); по морфологическим признакам на всех мазках определяли виды микрофлоры (кокки, микрококки, палочки, спирохеты, грибы) без дальнейшей их микробиологической идентификации и число всех видов микрофлоры.

3. Исследование эффектов фрагментов рДИК при воздействии ионизирующего излучения.

В работе использовали нестимулированные лимфоциты человека (Go-фаза), выделенные в системе фиколл-верографин из гепаринизированной периферической крови (Вейко H.H., 2003).

Лимфоциты облучали в малом объеме (80-100мкл) раствора Хенкса при комнатной температуре на установке импульсного рентгеновского излучения АРИНА-02 (Спектрофлеш, Россия). Мощность дозы составляла 0.16 Гр/мин После облучения каждый препарат (106кл/мл) инкубировали 3 часа при 37°С в растворе Хенкса, содержащего 10% сыворотки крупного рогатого скота и 10 ммоль/л HEPES ("Fluka").

В опытах с действием фрагментов рДНК фрагменты добавляли в концентрации 50 нг/мл и культивировали в течение 3,5 часов. После культивирования клетки отделяли центрифугированием (2000 об/мин, 5 мин), надоса-дочную жидкость подвергали JIKC-исследованию.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием стандартных пакетов программ "Primer Biostatistics", "StaWin". Для сопоставления двух групп использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни, если распределение признаков отлиалось от нормального. Различие в пределах каждой группы между показателями оценивали по парному Т-критерию Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эффекты низких доз ионизирующего излучения, определяемые методом ЛКС.

Анализ ЛК-спектров образцов плазмы крови работников предприятия ядерно-топливного цикла (ЯТЦ) г. Обнинск, разделенных по группам в зависимости от дозы полученного облучения показал, что с увеличением дозы радиации происходит нарастание вклада в светорассеяние мелких частиц первой зоны (радиусом 6-8 нм) и уменьшение вклада частиц пятой зоны (300 - 400 нм) (Рис.1). Была выявлена корреляционная связь между общей накопленной дозой, дозой, полученной за последние 9 месяцев и изменениями вклада в светорассеяние частиц определенного размера (р < 0,05; 0,005).

| 18 -

I

I 16 14 -12 -10 -8 6 -4 2 -0

Рис. 1. Изменение вклада в светорассеяние частиц различного радиуса в плазме крови при увеличении дозы облучения.

По оси абсцисс - радиус частиц (нм); по оси ординат — вклад частиц данного размера в светорассеяние (%); * - р < 0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни).

Одним из предполагаемых механизмов метаболических сдвигов, возникающих в плазме крови под действием низких доз ионизирующего излучения, может быть влияние рибосомальной ДНК поврежденных клеток на процессы жизнедеятельности нормальных клеток. Ранее в лаборатории молекулярной биологии Медико-генетического центра РАМН (H.H. Вейко и др., 2006) было показано, что концентрация рДНК в плазме крови зависит от общей накопленной дозы радиации.

В наших экспериментах была выявлена однонаправленная корреляция вклада в светорассеяние субфракций размером 300 и 400 нм с общей накопленной дозой и содержанием рДНК в плазме крови. Можно предположить, что изменение концентрации рДНК и наблюдаемые сдвиги в субфракционном составе плазмы крови облученных людей - части общего механизма клеточно-метаболического ответа на действие малых доз радиации.

В следующей серии экспериментов исследовали культуральную жидкость, в которой лимфоциты периферической крови человека либо подвергали действию облучения в дозе 3 и 10 сГр, либо инкубировали с рДНК, а также изучали сочетанное действие обоих факторов.

Показано, что различные виды воздействия на лимфоциты вызывали разнонаправленный эффект на молекулярном уровне: при облучении снижался вклад в светорассеяние крупных частиц (Рис.2а), а при инкубации клеток с рДНК увеличивалось количество крупных частиц (Рис.2б), что отражалось в гистограммах распределения частиц по размеру. При сочетании двух факторов (облучение и добавление рДНК) наблюдали уменьшение вклада в светорассеяние частиц зоны 300,4 — 734,2 нм, что характерно для влияния радиации, и увеличение вклада частиц зоны 11,3 - 91,3 нм, что, вероятно, является результатом совместного действия факторов (Рис.2 в).

□ контроль

I кон,ЗсГр

ВконЛОсГр

оЛ

Гк.

— мл*«»- * «'(лпочг'Л^О!«^

Я — — счтт^пг^о-тг».

□ контроль а рДНК

Рис. 2. Суммарная гистограмма вклада в светорассеяние частиц различного размера культуральной жидкости лимфоцитов человека: а) при облучении, б) при добавлении в среду рДНК, в) при сочетании облучения и добавления рДНК.

По оси абсцисс - радиус частиц (нм); по оси ординат — вклад частиц в светорассеяние (%).

Таким образом, каждое воздействие в отдельности - присутствие в среде культивирования лимфоцитов рибосомальной ДНК либо облучение лимфоцитов in vitro - активирует свой вариант клеточного ответа. Возможно, эффект сочетанного действия данных факторов является не простой сумма-цией клеточных ответов, а результатом их модификации. Можно предположить, что накопление свободной рДНК в крови людей, подвергающихся действию малых доз радиации, обусловливает более выраженные изменения в гомеостазе, зафиксированные методом ЛКС.

В следующей серии экспериментов изучали динамику метаболических сдвигов у работников предприятия ядерно-топливного цикла г.Электросталь, контактирующих с открытыми и закрытыми источниками радиоактивных излучений; с источниками обоих типов; комбинацией факторов радиационной опасности с химическими и физическими воздействиями. Были исследованы образцы сыворотки крови, мочи и рото-глоточных смывов. Повторные измерения проводили с интервалом в 1 год.

Характер распределения субклеточных компонентов сыворотки крови лиц, подвергающихся действию радиации, отличался от нормологического, полученного на здоровых людях из контрольной группы. В образцах сыворотки крови работников радиационно-опасного производства были обнаружены сдвиги в сторону преобладания мелких частиц (10-50 нм) при относительном снижения вклада в светорассеяние крупных (400 нм и выше). При повторном обследовании эти отличия несколько усилились. Частота встречаемости спектров с преобладанием мелких частиц повышалась с увеличе-

нием стажа работы на предприятии и у лиц с повышенной вредностью производственных процессов.

Из данных литературы известно, что радиационные воздействия в чистом виде вызывают преимущественно катаболически-подобные сдвиги, а химические воздействия - анаболически-подобные (Г.Д.Комаров и др., 2000, М.Ф.Киселев и др., 1999). В условиях современного производства человек сталкивается с сочетанным действием названных, а также целого ряда других (шум, вибрация, температура и др.) факторов. Особую актуальность приобретает индивидуализированная оценка происходящих в организме метаболических сдвигов, что позволит осуществить адресную коррекцию выявляемых изменений и, следовательно, профилактизировать развитие профессионально обусловленных заболеваний.

Все это позволяет предполагать, что применяемый нами подход может дополнить арсенал методов, традиционно используемых для гигиенической аттестации потенциально опасных производств.

2. Влияние внешних факторов на клеточно-тканевые реакции у детей.

2.1. Влияние питьевого режима на характер обменных процессов у детей.

На организм человека воздействует множество различных факторов окружающей среды. Для вычленения влияния каждого из них на здоровье населения следует проводить исследования групп по типу «копия-пара», различающихся лишь по одному из них. Именно по такой схеме были построены обсуждаемые эксперименты. В данном исследовании в группах, отличающихся по потреблению воды различного состава, проанализирован - цитологический статус слизистых оболочек носа и рта, а также характер метаболических сдвигов (определяемый методом ЛКС). Одним из значимых факторов, оказывающих существенное влияние на состояния здоровья человека, и, в частности, наиболее чувствительной части популяции — детей, является качество потребляемой воды. В рамках мероприятий по организации питьевого режима в образовательных учреждениях Северо-Западного и Северо-Восточного округов г. Москвы было проведено обследование 240 человек.

Экспериментальные группы состояли из детей, посещающих дошкольные образовательные учреждения (ДОУ) и начальные классы школ со специально организованным режимом водоснабжения. В контрольные группы вошли дети из образовательных учреждений, расположенных в тех же микрорайонах, но с обычными условиями потребления воды. Экспериментальные учебные заведения Северо-Западного АО снабжались минеральной водой «Московия», которую дети в течение полугода (сентябрь - май) получали для питья, и на основе которой им готовили еду. В Северо-Восточном АО дети получали воду «Троица», содержащую йод, кальций, фтор, магний, натрий с добавлением 30% от рекомендуемой производителем дозы витаминизиро-

ванного напитка «Золотой шар». Слабоминерализованные гидрокарбонатно-кальциево-магниевая воды «Троица» и «Московия» имеют высшую категорию качества (по СанПиН 2.1.4.1116-02) и предназначены для детского и диетического питания.

Анализ ЛК-спектров выявил, что исходный уровень распределения преобладающих направлений метаболических сдвигов (группа катаболиче-ски-направленных и группа анаболически-направленных ЛК-спектров) у детей обоих округов различался несущественно. Спустя 6 месяцев после начала употребления бутилированной воды у детей, получавших специально подготовленную воду (независимо от типа воды), была существенно снижена частота встречаемости отрицательной динамики (Рис.За).

При этом возрастал процент детей со стабильными показателями метаболизма и положительными сдвигами в характере обменных процессов.

Сравнение индивидуальной динамики метаболических сдвигов у детей, получавших воду «Московия» и воду «Троица» + «Золотой шар» показало, что специально организованный питьевой режим в обоих округах повысил долю детей с нормологическим характером обменных процессов (Рис.Зб). .

Однако у детей Северо-Восточного округа существенно возросла частота встречаемости аллергоподобного типа метаболических сдвигов по сравнению с контролем. В Северо-Западном округе у детей, получавших воду без добавок, доля анаболически-направленных сдвигов (аллергоподобных) меньше, чем в контрольной группе.

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% а

Рис 3. Индивидуальная динамика метаболических сдвигов у детей: «0»- отсутствие динамики, «-»-отрицательная динамика, «+»-положительная динамика, а) с обычным характером водоснабжения (контроль) и получавших специально подготовленную воду (опыт); б) получавших воду «Московия» и воду «Троица» с пищевой добавкой «Золотой шар» По оси абсцисс — направление динамики метаболиеских сдвигов; по оси ординат — количество человек, %.

Дополнительное обследование цитологического состояния слизистых оболочек методом мазков-отпечатков также показало улучшение цитологического статуса слизистых рта и носа по многим показателям и снижение частоты встречаемости отрицательной динамики цитостатуса после 6 месяцев специального питьевого режима у детей обоих округов по сравнению с контрольными группами детей.

Представленные данные показывают, что потребление воды улучшенного качества по микроэлементному и витаминному составу может применяться в профилактических целях или в восстановительной медицине, так как приводит к улучшению цитологического статуса слизистых носа и рта, нормализуя и /или благотворно влияя на цитологическое состояние слизистых оболочек носа и рта и характер локальных метаболических сдвигов. Обнаруженные в данной части исследований параллельные изменения в цитологическом статусе слизистой полости рта и направленности метаболических сдвигов, регистрируемых в РГС, побудили нас изучить возможную со-четанность внутри- и внеклеточных изменений в клетках буккального эпителия и рото-глоточных смывах.

2.2. Характер метаболических сдвигов у детей, отдыхающих в оздоровительном лагере.

Следующим шагом было выявление влияние условий проживания на метаболичесий статус организма детей. Школьники из г. Альметьевска были обследованы в первый день заезда в пионерский лагерь, находящийся в экологически чистом районе республики Татарстан, и спустя 4 недели после отдыха. В процессе обследования осуществлялось тестирование особенностей обмена веществ и гуморального иммунитета методом лазерной корреляционной спектроскопии рото-глоточных смывов, а также проводилось традиционное обследование медицинскими работниками.

В начале смены среди обследованного контингента (п = 62; возраст -11-15 лет) превалировали школьники с катаболически-направленными го-меостатическими сдвигами (Рис.4). К окончанию смены частота встречаемости катаболически-направленных гомеостатических сдвигов снизилась (р<0,01), но увеличился вклад аллергоподобных (р<0,01) , на фоне практически не изменившегося количества нормологических сдвигов.

С помощью метода ЛКС были зафиксированы различия в направленности метаболических сдвигов у детей в начале пребывания их в оздоровительном лагере и после проведенного там месяца отдыха. По окончании летнего отдыха в лагере почти у половины детей наблюдалась положительная динамика в изменении метаболического статуса; у 22 % испытуемых изменений не было выявлено, у 31% отдыхающих была отмечена отрицательная динамика.

Рис. 4. Направления метаболических сдвигов и индивидуальная динамика метаболических сдвигов у детей, отдыхавших в лагере в г.Альметьевск.

а) По оси абсцисс обозначены преобладающие направления метаболических сдвигов, по оси ординат - частота встречаемости соответствующего сдвига (%), * - р < 0,01 (точный двусторонний критерий Фишера).

б) По оси абсцисс направление динамики: «0» - отсутствие динамики, «-» -отрицательная динамика, «+» - положительная динамика, по оси ординат — доля детей с соответствующей динамикой, %.

Таким образом, была продемонстрирована информативность метода ЛКС даже при столь непродолжительном сроке изменения экологической обстановки. Влияние потенциально опасных факторов окружающей среды на развивающийся организм может приводить к еще более серьезным последствиям, чем у взрослых. Одним из примеров таких эффектов могут служить деформации позвоночника, возникающие у детей в экологически неблагополучных регионах.

3. Изменения клеточно-ткансвых реакций в неблагоприятных экологических условиях и при патологии опорно-двигательного аппарата.

3.1. Направленность метаболических сдвигов у учащихся школы-интерната для детей с нарушениями опорно-двигательного аппарата.

На первой стадии исследований определяли характер метаболических сдвигов у детей с диагностированными заболеваниями опорно-двигательного аппарата.

Анализ спектров с учетом преобладающего типа метаболических процессов показал, что в группе детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата спектры катаболического типа встречались в 66% случаев, в то время как в выборке учащихся общеобразовательных школ их доля не превышала 30%.

Обнаруженные нами сдвиги в метаболизме у детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата существенно различаются в зависимости от стадии заболевания и возраста. Если для ранних стадий более характерны катаболи-ческие сдвиги, то на поздних стадиях к ним добавляются анаболические (преимущественно аутоиммунно-подобные) (Рис.5). Независимо от возраста при 3-4 степенях сколиоза существенно возрастает частота встречаемости аутоиммунно-подобных сдвигов на фоне выраженных интоксикационно-подобных сдвигов и значительно уменьшенной частоты встречаемости нор-мологического характера обменных процессов.

СКОЛИО31 ст

I 2 3 ® В младшие

4 3 6 7 8 9 0 средние □ старшие

СКОЛИОЗ 3-4 сг

В младшие

4 5 6 □ средние

СКОЛИОЗ 2 ст

123456789 в младшие Е1 средние □старшие

Г-

\

1. • : „ .

|г

хэ1Т| 1 н _ГН

Ш

123454789 В младшие В средние □ старшие

Рис, 5. Преобладающие направления метаболических сдвигов у детей со сколиозом и кифозом разных степеней. По оси абсцисс - характер метаболического сдвига: 1- дистрофически-подобный, 2 — катаболически-подобный, 3 - интоксикационно-подобный, 4 - интоксикационно-аллергоподобный, 5 - нормологический характер метаболизма, 6 — аллерго-интоксикационноподобный, 7 — аллерго-подобный, 8 — аллерго-аутоиммуноподобный, 9 — аутоиммунно-подобный. По оси ординат — частота встречаемости соответствующего сдвига, %

Катаболические сдвиги могут быть связаны с активацией металлопро-теаз при сдавлении межпозвоночных дисков (Crean et al., 1997), а анаболические - с реакцией иммунной системы на появление продуктов разрушения матрикса. Однако остается непонятным, что является первичным — асимметричное сдавление дисков или разрушение матрикса, приводящее к искривлению позвоночника.

Общепринятым является мнение о том, что в возникновении и развитии сколиоза присутствует генетическая компонента (Miller, 2002; Burwell, 2003).

3.2. Корреляция между цитогенетическими показателями и направленностью метаболических сдвигов у детей.

Следующей задачей настоящей работы было оценить состояние цито-генетического статуса буккального эпителия учащихся интерната для детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата. В качестве контрольной группы были взяты ученики общеобразовательной школы №735 г. Москвы, проживающие в экологически неблагоприятном районе, и ученики школы с. Нагово Новгородской области, проживающие в экологически чистом районе.

Таблица 1.

Частота основных ядерных изменений в клетках буккального эпителия в детских учреждениях различного профиля.

4> SE Частота изменения (среднее число клеток на 1000 просчитанных по массиву)

X it ¡L 9 > е: и э- 7. Двуядер-ные клетки Пикноз Карио-рексис Карио-лизис Микроядра «Битое яйцо»

Интернат (Москва) 73 6,04±0,4 14,3±2,3 121,6±8,8 '•* 31,4±5,Г 0,19±0,05 0,6±0,1

Школа (Москва) 25 5,3±0,4 7,6±1,2 170,6±23,5* 3,0±0,4 0,13±0,07 0,6±0,2

Школа (Новгород) 23 4,7±0,4 12,2±2,9 13,9±8,5 7,8±1,9° 0 0,3±0,2

* — Р<0,001 по сравнению со школой в Новгородской области

• - Р<0,05 по сравнению со школой в Москве □ - Р<0,01 по сравнению со школой в Москве.

С помощью цитологического анализа препаратов буккального эпителия было обнаружено, что в каждой из исследованных групп наблюдалась своя собственная картина распределения нарушений генетического аппарата клеток буккального эпителия.

Из Таблицы 1 видно, что наименьшая средняя частота встречаемости клеток с кариорексисом наблюдалась у детей из школы в экологически чистом районе (сельская школа), а наибольшая - у детей из московской школы, причем у московских школьников она выше почти в 13 раз. Частота клеток с кариорексисом у детей из интерната имеет промежуточное значение.

Различались эти три массива и по средней частоте встречаемости клеток с кариолизисом: минимальное значение наблюдается в группе московских школьников, достоверно более высокое у новгородских школьников и максимальное у детей с нарушением осанки.

Не различались (Таблица 1) изученные массивы по частоте встречаемости двуядерных клеток (4,7 - 6,4 на 1000 просмотренных клеток) и по частоте встречаемости клеток с пикнозом. Во всех группах школьников средняя частота встречаемости клеток с микроядрами (МЯ) очень низкая — от 0,19 на 1000 просмотренных клеток до полного отсутствия. Средняя частота клеток с повреждениями «битое яйцо» также невелика - от 0,3 до 0,6 на 1000 просмотренных клеток. Это. совпадает с данными литературы (Tolbert et al., 1991; Ramirez et al., 2002; Torrs et al., 2003), в которых представлены результаты изучения клеток буккального эпителия в разных когортах населения.

Анализ спектров с учетом преобладающего типа метаболических процессов показал (Рис. 6), что в группе детей из сельской школы преобладали «нормальные» спектры (44,0%), велика доля спектров анаболического типа (40,0%) при низком представительстве спектров катаболического типа (16,0%).

У детей из московской школы по сравнению с сельской снижена доля спектров анаболического типа (Р<0,05). За счет этого возрастает процент спектров катаболического типа (Р<0,05).

В группе детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата спектры катаболического типа встречались еще чаще, достигая 66,1%, доля нормальных спектров достоверно снижена по сравнению с сельскими школьниками (Р<0,001). Все три обследованные группы детей различались по распределению преобладающего направления метаболизма (Р<0,001). Наиболее яркие отличия выявлены по доле катаболических сдвигов.

Обследования одних и тех же групп детей, проведенные независимо, выявили наличие качественных корреляций между этими методами.

Корреляционный анализ всего массива обследованных детей (N = 110) показал наличие зависимости между направленностью метаболических процессов и частотой встречаемости некоторых аномалий ядра. У детей с ката-болическими типами JIK-спектров обнаружилось большее число клеток с кариорексисом (г =0,33, Р<0,0001 по Спирмену) и кариолизисом (г=0,2,

Р<0,05). По-видимому, выход из клеток разрушенного ядерного материала, его лизис приводят к увеличению вклада в светорассеяние низкомолекулярной субфракции, которое характерно для катаболических процессов.

Ш шггернаг п сельская школа DD московская школа

70

I 60

р

о 60

40 -

ss

о 30 -

Б 20 -

10 -

о -

I

нормальные спектры

катаболнческого типа

анаболического типа

Рис.6. Частота встречаемости спектров, характеризующих метаболические процессы различной направленности.

По оси ординат - % детей с определенной направленностью метаболизма от общего количества детей в группе.

*,**,*** — Р<0,05; 0,005; 0,0001 соответственно - по сравнению с сельской школой; «#» — Р<0,02 по сравнению с московской школой; «+» — Р<0,02 по сравнению с сельской школой (точный двусторонний критерий Фишера).

Данные литературы свидетельствуют о том, что даже в семьях с широко представленным сколиозом далеко не всегда это заболевание с невыясненной этиологией наследуется. Было высказано предположение о том, что на его проявление в условиях генетической предрасположенности влияют факторы окружающей среды (Golding, 1991). Известно, что не только постоянное проживание на экологически неблагополучных территориях (С.С.Кувин, 2005) но даже кратковременное воздействие химических токсикантов (например, хлорирующих агентов в бассейне) (McMaster et al., 2006) вызывает увеличение частоты встречаемости спинальных деформаций.

Таким образом, в работе впервые были сопоставлены результаты двух различных методов (цитогенетический анализ клеток буккального эпителия

и ЛКС РГС), каждый из которых позволяет определить функциональное состояние организма и его реакцию на действие факторов среды. Оба метода показывают, что повышенная частота встречаемости клеток с кариорексисом и кариолизисом и увеличение доли спектров катаболического типа выявляются при проживании в неблагоприятных условиях и при заболеваниях опорно-двигательного аппарата.

Можно предполагать, что сочетанное применение этих методов позволит в дальнейшем более плодотворно использовать их для исследования влияния различных факторов на здоровье человека.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что вклад в светорассеяние некоторых субфракций плазмы крови облученных людей, выявляемый методом лазерной корреляционной спектроскопии, коррелирует с общей накопленной дозой радиации и дозой, полученной за последние 9 месяцев.

2. Показано, что изменения в составе биологических жидкостей (кровь, моча, рото-глоточные смывы) зависят от характера воздействующих факторов, сетки вредности и трудового стажа работников.

3. Выявлена зависимость клеточно-метаболических показателей у детей младшего возраста от состава потребляемой воды.

4. Выявлены изменения в частоте встречаемости некоторых аномалий ядра буккальных эпителиоцитов у детей с деформациями позвоночника и у школьников, проживающих в неблагоприятных экологических условиях.

5. Показана корреляционная связь между кариорексисом и кариолизисом ядер клеток буккального эпителия и катаболическим характером метаболических сдвигов в рото-глоточных смывах.

Автор выражает глубокую благодарность за сотрудничество, консультативную помощь и ценные рекомендации сотрудникам Института химической физики РАН проф. И.И. Пелевиной, Института биохимической физики РАН A.B. Алещенко и A.M. Серебряному, НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН проф. H.H. Беляевой и В.&. Юр-ченко, Медико-генетического центра РАМН H.H. Вейко, НИИ гигиены и охраны здоровья детей и подростков НЦЗД РАМН Ж.Ю. Гореловой.

Список публикаций по теме диссертации 1. М.Ю. Карганов, О.ШСовалева, Н.Н.Хлебникова, О.С.Дмнтриева, С.А.Саенко, Л.В.Довгуша, С.БЛанда. Полисистемная оценка состояния са-ногенеза работников предприятия ядерно-топливного цикла. Анализ регуля-

ции обменных процессов. // Радиационная биология. Радиоэкология,- 2004,-Т.44,- №3,- С. 251-261

2. M.Yu.Karganov, M.I.Kozhevnikova, N.N.Khlebnikova, O.S.Dmitrieva, G.P.Dmitrieva, L.A.Noskin. Evaluation of Metabolic Shifts in Schoolchildren during Scoliosis Development. // International Research Society of Spinal Deformities,Vanquover, Canada.- 2004,- P.243-245

3. Карганов М.Ю., Дмитриева O.C., Чугунова H.A., Хлебникова H.1I. Саногенстический подход к оценке индивидуального риска в условиях воздействия антропогенных факторов. // Третий Российский конгресс по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем». Тезисы докладов,- М„ 2004,- С. 196-197

4. Карганов М.Ю., Труханов А.И., Дмитриева О.С., Маркина И.Е., Алчинова И.Б. Полисистемная оценка функционального баланса работников предприятий ядерно-топливного цикла. // VIII Международная конференция «Современные технологии восстановительной медицины». Труды конференции.- Сочи, 2005,-С.315-319

5. Карганов М.Ю., Дмитриева О.С., Алчинова И.Б. Саногснетический подход к прогнозированию риска ущерба здоровью, обусловленного техногенными факторами. // «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки». Материалы пленума,- М., 2005,-С.133-134

6. Дмитриева О.С., Алчинова И.Б. Использование метода лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей для выявления метаболических сдвигов, происходящих в организме под воздействием ионизирующего излучения. // Тезисы Санкт-Петербургские научные чтения. Международный молодежный медицинский конгресс.- СПб, 2005.- С.112

7. Алчинова И.Б., Дмитриева О.С. Оценка динамики метаболических сдвигов у детей в условиях различных питьевых режимов с помощью экспрессных методик саногснетического мониторинга.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье»,- Суздаль, 2005.- С. 54-56

8. Карганов М.Ю., Дмитриева О.С., Алчинова И.Б., Вейко Н.Н., Ланда С.Б., Носкин JI.A. Изменения в составе биологических жидкостей человека в условиях действия малых дох радиации. // V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). Тезисы докладов,- М., 2006.- Т.1.- С. 151

9. Дмитриева О.С., Карганов М.Ю., Беляева Н.Н., Горелова Ж.Ю., Александрова В.П., Шамарин А.А., Мосов А.В., Тобис В.И., Колдобенко А.Н., Вирабова А.Р. Изменения в характере обменных процессов у детей, выявляемые методом лазерной корреляционной спектроскопии, в условиях различных питьевых режимов. // Научно-методические основы изучения адаптации детей и подростков к условиям жизнедеятельности / Ред. В.Р. Кучмы, Л.М. Сухаревой.- М., 2006,- С.64-70

10. А.В. Алещенко, И.Б.Алчинова, О.С, Дмитриева, Г.П. Дмитриева,

М.Ю. Карганов, М.И. Кожевникова, JI.A. Носкин, А.М. Серебряный, Н.Н. Хлебникова, И.И.Пелевина. Использование цитогенетического метода исследования буккального эпителия и метода лазерной корреляционной спектрометрии для мониторинга нарушений в организме детей. // Цитология.-2006,- Т. 48.- № 2,- С.169-172

11. М. Karganov, M.Kozhevnikova, A.AIeschenko, N.KhJebnikova, O.Dmitrieva, I. Alchinova, G. Dmitrieva, I.Pelevina and L. Noskin Correlation between cytogenetic abnormalities in cells and metabolic shifts in children with spinal deformities. // Studies in health technology and informatics.-2006.- V.123.-№5.- P.9-13

12. Карганов М.Ю., Ланда С.Б., Пивоваров B.B., Дмитриева О.С., Ал-чинова И.Б., Носкин Л.А. Полисистемный мониторинг функциональных показателей здоровья. // Неинвазивные методы в оценке здоровья населения./ Под ред. Ю.А.Рахманина.- М., 2006,- С. 33-55.

13. Алчинова И.Б., Вейко Н.Н., Дмитриева О.С., Ланда С.Б., Хлебникова Н.Н., Карганов М.Ю. Применение метода лазерной корреляционной спектроскопии для оценки метаболических сдвигов у работиков радиационно-опасного производства. П Гигиена и санитария,- 2006,- №5.- С. 77-79

Подписано в печать 09.11.2006. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 шт.

Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 162-00-16

Актуальность темы. В настоящее время не вызывает сомнения, что экологические и антропогенные факторы окружающей среды оказывают большое влияние на клеточные и гуморальные звенья систем организма животных и человека. Радиация, ряд химических соединений, отходы и продукция многих промышленных предприятий могут оказывать цитотоксическое действие, вызывать мутации, а также обладать канцерогенным эффектом. Уровень поврежденности генома зависит от его способности устранять непрерывно возникающие в результате внешних воздействий повреждения и при дефектах в системах репарации будет повышен. Увеличение чувствительности генома к повреждающим факторам, в частности, к радиации, может приводить к возникновению дизрегуляционных изменений в деятельности различных систем организма (Г.Н.Крыжановский, 2003) и последующему развитию заболеваний (лучевая болезнь, радиационные новообразования и т.д.).

Влияние потенциально опасных факторов окружающей среды на развивающийся организм может приводить к еще более серьезным последствиям, чем у взрослых. Огромное количество физических, химических и биологических факторов, действуя на организм матери и эмбриона, могут вызвать нарушения развития плода - эмбриопатии, в частности, аномалии развития позвоночника (Е.Г. Скрябин, 2002). В первые годы жизни ребенка и пубертатный период любые генетические факторы, влияющие на метаболизм структурных компонентов позвоночника, могут стать причиной развития деформаций. Многолетние цитогенетические исследования детей и подростков, проживающих на территориях загрязненных радионуклеидами после аварии на ЧАЭС, на территориях различных промышленных городов с высокой степенью загрязненности воздуха, почвы и воды показывают повышенный уровень цитогенетических повреждений.

Среди факторов, оказывающих влияние на рост и развитие организма, также имеет значение сбалансированное питание, достаточное поступление с пищей и водой витаминов, минеральных компонентов, а также качество самих продуктов и питьевой воды.

Существующие методы изучения действия факторов внешней среды, обусловливающих характер проявления болезни, требуют большого числа субъектов и длительного времени наблюдения для получения значимых результатов. Традиционные эпидемиологические подходы не учитывают генетическую предрасположенность людей к развитию заболеваний. В связи с тяжестью заболеваний, вызываемых антропогенными факторами, выявлением их зачастую на поздних стадиях, когда терапия малоэффективна, особую актуальность приобретает разработка подходов к измерению параметров, определяющих ранние стадии заболевания, а также индивидуальный риск его развития.

Целью исследования являлась разработка методических подходов для определения индивидуальной чувствительности организма к действию факторов окружающей среды на основе выявленных сопряженных особенностей клеточных реакций и метаболических сдвигов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности клеточных реакций и метаболических сдвигов в условиях действия ряда факторов (регион проживания, различное водоснабжение, характер профессиональной деятельности, действие радиации, наличие хронических заболеваний и др.).

2. Изучить механизмы сопряжения клеточных реакций и метаболических сдвигов при действии некоторых антропогенных факторов окружающей среды.

3. Выявить закономерности в характере обнаруженных индивидуальных сдвигов и на их основе сформулировать критерии для формирования групп риска.

Научная новизна работы. Использование метода лазерной корреляционной спектроскопии (J1KC) в экспрессном режиме с применением современных компьютерных средств позволило провести массовые обследования работников предприятий ядерно-топливного цикла, а также учащихся общеобразовательных и специализированных учреждений.

В настоящем исследовании впервые показано, что вклад в светорассеяние некоторых субфракций сыворотки крови (6-8, 300, 400 нм) облученных людей, выявляемый методом J1KC, коррелирует с общей накопленной дозой радиации и дозой, полученной за последние 9 месяцев. Изменения в составе биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, рото-глоточные смывы) зависят от характера воздействующих факторов, сетки вредности и трудового стажа работников.

Сопоставление данных, полученных с помощью J1KC, с результатами цитологического обследования детей, проживающих и обучающихся в разных условиях, обнаружило высокую корреляцию между показателями, полученными различными методами, и продемонстрировало высокую информативность разработанного подхода. Впервые выявлены изменения в частоте встречаемости некоторых аномалий ядра буккальных эпителиоцитов у детей с деформациями позвоночника и у школьников, проживающих в неблагоприятных экологических условиях. Выявлена зависимость клеточно-метаболических показателей у детей дошкольного и младшего школьного возраста от состава потребляемой воды. Показана корреляционная связь между кариорексисом и кариолизисом ядер клеток буккального эпителия и ка-таболическим характером метаболических сдвигов в рото-глоточных смывах.

Теоретическое и практическое значение работы. Низкодозовые воздействия различной природы, в том числе облучение, приводят к разнообразным клеточным ответам: задержке деления в зависимости от стадии клеточного цикла, транскрипции генов репарации поврежденной ДНК и др. Эти ранние события определяют дальнейшую судьбу клетки - будет ли она подвергаться некрозу, апоптозу или, в конечном счете, выживет и приступит к делению. Первичному воздействию в этом процессе отводится роль триггера, который с определенной долей вероятности включает систему ответа со множеством регуляторных связей и точек возможного переключения механизмов, определяемую как чувствительность клеток к воздействию. Несмотря на то, что воздействия низкой интенсивности не вызывают соматической гибели организма, они способны модифицировать клеточно-тканевые эндогенные процессы, в конечном итоге приводя к развитию ряда заболеваний. Выявление изменений в метаболизме и характере клеточного ответа позволит прогнозировать индивидуальный риск развития заболевания для всего организма.

Основные трудности в выявлении эффектов воздействия антропогенных факторов окружающей среды связаны со слабой выраженностью проявлений и ограниченной чувствительностью методов исследования. Использованный в работе методический подход показал свою перспективность для мониторинга состояния здоровья работников потенциально опасных отраслей промышленного производства, населения экологически неблагополучных территорий и детей с риском развития заболеваний опорно-двигательного аппарата. Раннее выявление изменений в метаболизме и уровне цитогенетических повреждений для конкретного человека позволит своевременно проводить индивидуальные профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Исследованные экологические и антропогенные факторы внешней среды вызывают изменения частоты встречаемости аномалий ядра буккаль-ных эпителиоцитов и обусловливают преимущественно катаболическое направление метаболических сдвигов.

2. Сочетанное применения методов цитогенетического исследования клеток буккального эпителия и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека информативно для выделения групп риска в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды.

Внедрение в практику. Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях внедрен в практику Федерального медико-биологического агентства РФ (акт от 3 ноября 2006г).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Диз-регуляционная патология органов и систем», Москва, 2004; Международной научной конференции «Физиология развития человека», Москва, 2004; 5-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Canada, Vanquover, 2004; VIII Международной конференции «Современные технологии восстановительной медицины», Сочи, 2005; Всероссийской научно-практической конференции «Природные факторы и социальные условия успешности обучения», Санкт-Петербург, 2005; Пленуме «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки», Москва, 2005; Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт - Петербургские научные чтения», СПб, 2005; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005; V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность», Москва, 2006; 6-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Belgium, Ghent, 2006.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что вклад в светорассеяние некоторых субфракций плазмы крови облученных людей, выявляемый методом лазерной корреляционной спектроскопии, коррелирует с общей накопленной дозой радиации и дозой, полученной за последние 9 месяцев.

2. Показано, что изменения в составе биологических жидкостей (кровь, моча, рото-глоточные смывы) зависят от характера воздействующих факторов, сетки вредности и трудового стажа работников.

3. Выявлена зависимость клеточно-метаболических показателей у детей младшего возраста от состава потребляемой воды.

4. Выявлены изменения в частоте встречаемости некоторых аномалий ядра буккальных эпителиоцитов у детей с деформациями позвоночника и у школьников, проживающих в неблагоприятных экологических условиях.

5. Показана корреляционная связь между кариорексисом и кариолизисом ядер клеток буккального эпителия и катаболическим характером метаболических сдвигов в рото-глоточных смывах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема прогнозирования биологических эффектов низкодозовых радиационных воздействий, развивающихся в организме на фоне других антропогенных факторов, занимает одно из ключевых мест в радиобиологии и радиационной медицине. Анализ многочисленных работ в этой области показывает (см. Обзор литературы), что в большинстве из них используется ставшая классической схема исследований: определяется уровень действующих доз или концентраций и затем оценивается эффект (заболеваемость, смертность или снижение продолжительности жизни). Результаты данных работ позволили сделать заключение, что использование такой схемы при оценке пострадиационных реакций при низкодозовом облучении не позволяет прогнозировать биологический ответ на индивидуальном уровне. В этом случае необходимо учитывать изменения в организме, которые развиваются на фоне длительного компенсаторного напряжения его адаптационных возможностей, обусловленного действием радиации и сопутствующих факторов. Поэтому для проведения исследований был предложен подход, основанный на изучении функционального состояния основных саногенетических систем организма, одновременная регистрация многих параметров которых в мониторинговом режиме позволяет оценить его адаптационные возможности и, в конечном итоге, индивидуальную реакцию при радиационных воздействиях в низких дозах в сочетании с другими антропогенными факторами. По эффективному диапазону воздействий все существующие реальные опасности радиационной, нерадиационной, химической и биологической природы можно разделить на две категории: 1) опасности в детерминистском диапазоне доз и концентраций (дозы и концентрации, существенно превышающие регламенты ПДК и ПДЦ); 2) опасности в стохастическом диапазоне доз и концентраций (дозы и концентрации вблизи ПДК и ПДД). В детерминистском диапазоне доз и концентраций биологические последствия воздействий практически строго зависят от доз и концентраций антропогенных воздействий и достаточно строго могут быть определены существующими методами санитарноэпидемиологического анализа. В стохастическом диапазоне доз и концентраций антропогенных воздействий последствия строго зависят от уровня индивидуальной чувствительности биообъекта, в том числе и человека. На всех уровнях организации организма человека функционирует бесчисленное множество регуляторных систем, обеспечивающих сенситивность или резистентность целого организма к действию как внешних, так и внутренних факторов, т.е. обеспечивающих поддержание его здоровья (в силу чего их можно определить как саногенетические-здоровьеобеспечивающие). Анализ функциональной полноценности систем саногенеза прогнозирует уровень устойчивости или чувствительности организма к относительно переносимым дозам и концентрациям, в том числе антропогенных воздействий. Отсюда следует, что саногенетический мониторинг преимущественно информативен для диапазонов доз и концентраций, вызывающих стохастические эффекты.

В силу индивидуальной изменчивости объема функционирования сано-генетических процессов один и тот же антропогенный фактор в равной дозе и концентрации вызовет определенные последствия в одних организмах (сенситивных), не вызовет в других и будет сопровождаться резистентностью в третьих. Отсюда следует, что на популяционном уровне при относительно низкодозовых и низкоконцентрационных воздействиях необходимо определять три субпопуляции: сенситивную, нейтральную и устойчивую. Их соотношение, в конечном счете, и может быть критерием оценки популяционного риска данного воздействия.

К числу систем, определяющих адаптационные резервы организма, относятся обмен веществ и система гуморального иммунитета. Важно подчеркнуть, что изменение характера обменных процессов и гуморального иммунитета не только предшествуют фиксации того или иного патологического следа, но и предопределяют нозологию последующего заболевания. Поэтому ранняя идентификация природы обменных и иммунных сдвигов позволяет выявлять группы риска по отдельным заболеваниям и интоксикациям, что имеет первостепенное значение для выбора наиболее адекватных методов медико-биологической и санитарно-гигиенической профилактики. К тому же, перечисленные мероприятия, применяемые на донозологическом уровне, намного эффективнее, чем лечение развившихся заболеваний. Немаловажное значение имеет и тот факт, что динамическое отслеживание состояния систем обмена веществ и гуморального иммунитета может быть использовано в качестве экспертизы эффективности рекомендуемых профилактических мероприятий. Совершенно очевидно, что мониторинговые системы должны быть экспрессными, простыми в эксплуатации и не дорогостоящими. Всем этим требованиям соответствует метод ЛКС биологических жидкостей.

Обнаруженные нами доза-зависимые закономерности в изменениях субфракционного состава сыворотки крови (Глава 3) - повышение вклада в светорассеяние частиц размером 6-8 нм вполне согласуются с данными литературы. Ранее было показано (М.Ф.Киселев и др., 1999; L.A. Noskin et al., 2000), что при радиационно-индуцированном канцерогенезе в плазме крови происходит увеличение числа частиц с радиусом до 10 нм. Прогноз развития процессов канцерогенеза по указанным сдвигам JIK-спектров осуществляется на 1-2 месяца раньше, чем принятыми методами детекции опухолевых процессов. Методом ЖС плазмы крови специфические сдвиги в системе гомеостаза (в основном по типу анаболической супрессии и нарастающей тканевой дистрофии) у животных, у которых развивались опухоли, четко дифференцировались уже к 6-8 месяцам после облучения. У популяции, где опухолевый рост не был зарегистрирован (смерть наступала в результате пневмоний, множественных дегенеративно-дистрофических и нагноительных процессов), сдвиги в гомеостазе носили принципиально иной характер.

При современном уровне обеспечения безопасности производств с вредными условиями труда персонал и контактирующее население достаточно надежно защищены от воздействий антропогенных факторов в диапазоне детерминистских доз, то есть доз, заметно превышающих ПДД и ПДК. Поэтому основная проблема оценки биологического риска антропогенных воздействий в условиях данных производств относится к дозам, не превышающим ПДД, или незначительно ее превышающим. Именно в этом диапазоне воздействий ответ организма на действие антропогенных факторов предельно персонифицирован.

В ситуации многофакторного воздействия, характерного для ядерно-топливного предприятия, обнаружились различия в последствиях влияния условий производства. Так, статистически значимо более высокая частота встречаемости нормологического характера метаболизма в системе крови обнаружена у работников цеха №55 (контакт с закрытыми источниками излучения). Несмотря на заметную дифференциацию производственного риска в отдельных группах, прогнозировать уровень риска только на основе представленных результатов достаточно сложно в силу двух обстоятельств. Во-первых, по степени выраженности перечисленные трансформации преимущественно представлены начальными и умеренными сдвигами, которые в 13 и 66 цехах составляют 65-66%, а в 55 и остальных цехах - 76-79%. Во-вторых, сдвиги в регуляции обменных процессов могут нивелироваться другими регуляторными процессами в организме. Поэтому уровень и направленность сдвигов в системе плазменного гомеостаза надо анализировать в сравнении с другими гомеостатическими сдвигами.

При исследовании мочи у работников всех трех цехов выявлено преобладание катаболических сдвигов. Это вполне ожидаемый результат, поскольку известно, что образующиеся при радиационно-индуцированном апоптозе продукты деградации хроматина - полинуклеотиды размером от 180-200 до 50000 пар оснований - экскретируются с мочой из облученного организма. Для феномена дезоксинуклеозидурии, являющегося адекватным отражением выраженности апоптоза, описаны закономерности «доза-эффект» и «время-эффект» (В.К.Мазурик, В.Ф.Михайлов, 1999). В то же время условия производства внесли свой вклад в различия между характером метаболических сдвигов и в этом случае: наибольшая частота встречаемости интокикацион-но-подобных спектров (21%) была зафиксирована в цехе №66, где работники подвергаются воздействию химических веществ.

Исследование РГС продемонстрировало статистически значимую наивысшую частоту встречаемости нормологических спектров в условиях действия только закрытых источников излучения (цех №55). При этом контакт с химическими факторами обусловил резкое возрастание доли катабо-лических сдвигов у работников цеха №66. Как и при исследовании мочи, в этом цехе зафиксирован наибольший процент интоксикационно-подобных сдвигов (18%) по сравнению с другими участками производства.

Сходная картина, а именно преобладание мелких частиц в образцах РГС у работников цеха № 66, дает основания предполагать возможность развития системных нарушений. Напротив, высокий процент анаболических спектров в образцах РГС, на фоне 68% катаболических спектров в пробах мочи работников цеха №13 свидетельствует о течении местного процесса в слизистых ротовой полости, верхних дыхательных путей и верхних отделах пищеварительной системы, вызванного воздействием открытых источников излучения.

Специфика производства состоит в том, что внутри одного цеха работники в разной степени подвергаются воздействию потенциально опасных факторов. Для квалиметрического учета этих различий введена сетка вредности. Статистически значимая наименьшая частота встречаемости нормологи-ческого характера метаболизма зафиксирована у работников с высшей степенью вредности, и этот результат вполне прогнозируем. Неожиданно наибольшая доля таких спектров и статистически значимый минимальный процент катаболических сдвигов у работников с промежуточной степенью вредности могут быть объяснены адаптивными сдвигами в организме под действием малых доз производственных факторов.

Интересным представляется монотонное нарастание доли анаболических спектров. С учетом данных о нарастании вклада в светорассеяние зоны до 90 нм при совместном действии облучения и рДНК, обсужденных выше, можно сделать предположение о том, что в условиях работы с повышенной вредностью в плазме крови накапливается все большее количество рДНК.

Таким образом, у лиц, контактирующих с производственными факторами, наблюдается кумулятивный эффект действия этих факторов.

Для обеспечения массовых обследований детских популяций инвазивный способ пальцевого забора цельной крови (даже в минимальных объемах- до 0,1 мл.) представляется достаточно сложным. Отсюда возникла необходимость в дополнительной модификации метода ЖС, направленной на анализ других биологических жидкостей. Наиболее приемлемыми для исследований в условиях массового мониторинга являются рото-глоточные смывы (РГС) и моча. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что лучевая терапия, применяемая для лечения опухолей, приводит к снижению содержания низкомолекулярных белков, обогащенных пролином, в слюне облученных больных по сравнению с необлученными (Hannig et al., 2006). Обнаружена корреляция между изменениями в содержании иммуноглобулинов в крови и слюне при инфекционных заболеваниях (Zhang et al., 2006; Malla et al., 2005; Cock et al., 2005).

Несмотря на выявленную чувствительность и информативность метода ЖС, использование только данного подхода для надежной интерпретации природы индивидуального биологического ответа на воздействие факторов окружающей среды недостаточно. Одним из неинвазивных способов оценки цитогенетических эффектов этих факторов является исследование буккаль-ных эпителиоцитов.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка выявить влияние одного из важнейших факторов окружающей среды - качества потребляемой воды - на метаболический и цитогенетический статус детей, наиболее чувствительную часть популяции. Обнаруженные различия в динамике метаболических сдвигов позволяют утверждать, что примененный метод ЖС информативен для достижения этой цели. Как и цитогенетическое исследование, он продемонстрировал улучшение измеряемых показателей при полугодовом специально организованном питьевом режиме. В данном случае эксперимент был организован таким образом, что влияние всех остальных факторов окружающей среды было нивелировано: опытные и контрольные группы детей проживали в одном и том же микрорайоне и обучались в одном и том же образовательном учреждении. Представляло интерес выяснить, каким образом смена экологической обстановки окажет влияние на характер обменных процессов у детей и оценить эффективность влияния оздоровительных мероприятий.

В начале смены среди обследованного контингента в г.Альметьевск превалировали школьники с интоксикационно-подобными (38,7%) и дистрофически-подобными (30,6%) гомеостатическими сдвигами. При этом 49% этих сдвигов дифференцировались как выраженные, а 51% - как начальные и умеренные. В целом в начале смены преобладали катаболически-направленные сдвиги (79%) относительно анаболически-направленных (10%) на фоне 11% нормологически-направленных.

К концу смены заметно снижается частота встречаемости интоксика-ционно-подобных (с 38% до 22%) и дистофически подобных (с 30% до 14%) гомеостатических сдвигов в тканях верхних дыхательных путей обследуемых школьников, но увеличивается вклад аллергоподобных сдвигов (с 3% до 14%), на фоне практически не изменившегося количества нормологически-направленных (13%). К концу смены преобладали начальная и умеренная степень выраженности катаболически-направленных сдвигов (68%). Анабо-лически-направленные сдвиги в конце смены также дифференцируются в основном как начальные и умеренные (84%). В целом к концу смены соотношение катаболически-направленных сдвигов к анаболически-направленным составило 44% : 39%, соответственно, на фоне 17% нормологически-направленных.

По степени выраженности (независимо от направления) 45,5 % всех сдвигов в начале смены дифференцировались как выраженные, 54,5% - как начальные и умеренные. К концу смены заметно преобладание сдвигов начальной и умеренной степени (74%) над сдвигами выраженной степени (26%). Обнаруженные в данной части исследований параллельные изменения в цитологическом статусе слизистой полости рта и направленности метаболических сдвигов, регистрируемых в РГС, побудили нас изучить возможную сочетанность внутри- и внеклеточных изменений в клетках буккального эпителия и рото-глоточных смывах.

Обнаруженные нами сдвиги в метаболизме у детей с заболеваниями опорно-двигательного аппарата существенно различаются в зависимости от стадии заболевания и возраста. Если для ранних стадий более характерны ката-болические сдвиги, то на поздних стадиях к ним добавляются анаболические (преимущественно аутоиммунно-подобные). Катаболические сдвиги могут быть связаны с активацией металлопротеаз при сдавлении межпозвоночных дисков (Crean et al., 1997), а анаболические - с реакцией иммунной системы на появление продуктов разрушения матрикса. Однако остается непонятным, что является первичным - асимметричное сдавление дисков или разрушение матрикса, приводящее к искривлению позвоночника?

Данные литературы свидетельствуют о том, что даже в семьях с широко представленным сколиозом далеко не всегда это заболевание с невыясненной этиологией наследуется. Было высказано предположение о том, что на его проявление в условиях генетической предрасположенности влияют факторы окружающей среды (Golding, 1991). Обнаруженные нами сходные картины влияния неблагоприятной экологической обстановки (московская школа) и заболеваний опорно-двигательного аппарата (специализированная школа-интернат) на частоту встречаемости кариорексиса и кариолизиса в буккальных эпителиоцитах и корреляция этих показателей с катаболическим характером метаболизма говорят в пользу такого предположения. Известно, что не только постоянное проживание на экологически неблагополучных территориях (Кувин и соавт., 2005), но даже кратковременное воздействие химических токсикантов (например, хлорирующих агентов в бассейне) (McMaster et al., 2006) вызывает увеличение частоты встречаемости спинальных деформаций. Интересно, что эта закономерность характерна не только для человека, поскольку появление химических продуктов в воде приводило к искривлению позвоночника у рыб (Nachemson et al., 1984).

Таким образом, в работе впервые были сопоставлены результаты двух различных методов (цитогенетический анализ клеток буккального эпителия и ЖС РГС), каждый из которых позволяет определить функциональное состояние организма и его реакцию на действие факторов среды. Оба метода показывают, что повышенная частота встречаемости клеток с кариорексисом и кариолизисом и увеличение доли спектров катаболического типа выявляются при проживании в неблагоприятных условиях и при заболеваниях опорно-двигательного аппарата.

Можно предполагать, что сочетанное применение этих методов позволит в дальнейшем более плодотворно использовать их для исследования влияния различных факторов на здоровье человека.

Констатация самого факта перестроек в системе регуляции обмена веществ и гуморального иммунитета не позволяет определить степень функционального дисбаланса других систем организма, обеспечивающих сохранение индивидуального здоровья. Тяжесть антропогенных воздействий будет определяться тем, в какой степени к индуцированным сдвигам в системе регуляции обмена веществ и гуморального иммунитета адаптированы такие важнейшие функции, как регуляция дыхания, сосудистого давления, сердечного ритма и психомоторики.

Важность оценки функционального состояния этих систем при изучении отдаленных последствий антропогенных воздействий совершенно очевидна. Степень выраженности функциональных изменений в той или иной саногенетической системе, в конечном счете, сформирует основные направления развивающейся чувствительности организма к воздействию фактора или группы факторов и определит прогноз развития того или иного патологического процесса. Такой прогноз можно осуществить на уровне регистрации напряжений физиологически адекватных функций, что и отвечает принципам донозологической диагностики. При этом необходимо не только регистрировать напряжение физиологически адекватных функций одной системы, но и устанавливать характер межсистемных взаимоотношений.

Завершая изложение работы, следует отметить, что при ее выполнении мы отошли от классической схемы изучения реакций организма при низко-дозовых воздействиях, когда вначале определяется уровень действующих доз или концентраций, а затем определяется эффект (заболеваемость, смертность или снижение продолжительности жизни). В данной работе в основу оценки биологических реакций организма, возникающих при низкодозовых воздействиях, положен учет интегральных воздействий всех «стрессов» (радиационного, химического, а также влияние климатогеографических условий и экологической ситуации) на систему гомеостаза и адаптационный потенциал, которые определяются функциональным состоянием основных саногенетиче-ских систем организма.

И, как нам представляется, самый важный результат данной работы состоит в том, что предложены методы, позволяющие на уровне биологической индивидуальности одновременно учитывать интегральные результаты действия всех факторов. Применение, дальнейшее совершенствование и дополнение этих методов должно способствовать объективному научному пониманию роли и места низкодозовых антропогенных воздействий в развитии тех или иных патологических процессов в организме.