Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Онкоген HER2 в раке молочной железы: механизм влияния на поведение опухоли (сравнительное количественное иммуногистохимическое исследование)

На правах рукописи

РАСКИН Григорий Александрович

ОНКОГЕН HER2 В РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ НА ПОВЕДЕНИЕ ОПУХОЛИ

(СРАВНИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Специальность:

14.00.14 - онкология

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

00306 1btj»

Казань-2007

003061659

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор ПЕТРОВ Семен Венедиктович.

Доктор медицинских наук ОРЛОВА Рашида Вахидовна. Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор МАЦКО Дмитрий Евгеньевич - руководитель лаборатории патоморфологии ФБУ НИИ онкологии им проф Н Н Петрова

Доктор медицинских наук, КАГОНИЯ Лали Михайловна -профессор кафедрьк онкологии ФУВ Московского областного научно-исследовательского клинического института ( МОНИКИ)

Ведущая организация:

СПб Медицинская Академия им И И.Мечникова

Защита состоится «3 » питлъъл 2007 г в __ часов на

заседании диссертационного совете! Д 215 008.01 при ФБУ НИИ онкологии им проф НН Петрова (197758, г Санкт-Петербург, Песочный-2, ул Ленинградская, д 68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www mioncolii ru ФБУ НИИ онкологии им проф НН Петрова

Автореферат разослан «3D» и ло лА_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Семенов И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы

Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре онкологических заболеваний у женщин Ежегодно в мире этот диагноз ставят более, чем у 1 млн пациенток, из которых 400 тысяч умирает в первый год В России в 2004 г зарегистрировано 408 399 женщин раком этой локализации, что составило 17,6% от всех онкологических больных (Чиссов В И, 2004) Наиболее высокие показатели характерны для крупных регионов России Так, в Санкт-Петербурге в 2004 г на учете состояло 22500 женщин с РМЖ (Мирабишвили В М , 2004), в республике Татарстан за 2004 год было выявлено 1072 новых случаев РМЖ (Губайдуллин ХМ, Исмагилов А X , Гимранов А М, Куртасанов Р С , 2004)

Показано, что одним из факторов, ухудшающих прогноз с точки зрения выживаемости этой категории больных является повышенная активность онкогена HER2 (Волченко Н Н, Завалишина Л Э, Шимберева И Б , Франк Г А , 1998, Piccart-Gebhart М, Procter М , Lichmitser М , 2005) Однако остается неясным механизм, благодаря которому, данное негативное влияние осуществляется Большинство авторов утверждают, что сверхэкспрессия HER2 приводит к активации пролиферации и быстрой прогрессии опухоли (Durbecq V , Desmed С , Paesmans М et al, 2004, Pinto A E, Andre S , Laranjeira С , Soares J, 2005) Это осуществляется за счет формирования гомо -гетеродимеров HER2, которые в результате трансфосфорилирования запускают киназные пути, приводящие к активации клеточной пролиферации, ингибированию апоптоза, клеточной диссоциации

Другие исследователи полагают, что сверхэкспрессия HER2 ведет к повышенному синтезу p21/wafl (Yu D , Jmg T, Lm В et al, 1998, Yang W, Klos K, Yang Y et al, 2002), в половине случаев сопровождается делецией гена топоизомеразы-П-а и некоторым другим явлениям, что ведет к подавлению пролиферации (Hams L, Tang С , Yang С et al, 1998, Jarvmen ТА., Tanner M, Rantanen V et al, 2000, Sorlie T, 2004) Кроме того, сверхэкспрессия HER2 также приводит к подавлению синтеза молекул адгезии (Е-кадгерина) и

интегринов, что повышает метастатическую способность опухолевой клетки (Baeckstrom D , Lu P-J, Taylor-Papadimitnou J, 2000)

Таким образом, в настоящее время имеются противоречивые данные о влиянии HER2 на пролиферацию клеток РМЖ и поведение опухоли

Цель и задачи работы

Изучение влияния экспрессии HER2 на молекулярные параметры некоторых форм РМЖ

Для достижения данной цели решались следующие задачи

1 Исследовать уровень экспрессии HER2, эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в клетках РМЖ

2 Определить наиболее достоверный маркер для оценки опухолевой пролиферации

3 Оценить уровень пролиферации в клетках РМЖ для выявления различных по предиктивному и прогностическому значению групп с последующим сравнительным анализом пролиферации при различном уровне экспрессии HER2 и эстрогеновых рецепторов

4 Проанализировать амплификацию гена HER2 при его сверхэкспрессии, а также экспрессию ряда молекул клеточного цикла и молекул адгезии, которые могут оказывать влияние на уровень пролиферации раковых клеток

5 Разработать и апробировать методику определения экспрессии топоизомеразы-П-а и p21/wafl в клетках РМЖ как молекул-предикторов эффективности антрациклинов и таксанов.

6 Исследовать особенности влияния HER2 на поведение опухолевых клеток в раке Педжета молочной железы

Научная новизна

В работе получены новые данные о влиянии сверхэкспрессии HER2 на поведение РМЖ Было показано, что подобное влияние оказывается на количественном, а не на качественном уровне

Впервые был применен метод сравнительной количественной иммуногистохимии, которой основан на знании ключевых параметров клеточного цикла и участии каждого из исследованных маркеров в нем При различной экспрессии данных молекул в фазах клеточного цикла, после их сопоставления между собой мы делали вывод об активности каждого из маркеров, повышенной или пониженной их экспрессии

Впервые, при сверхэкспрессии HER2 выявлена ядерная реакция, на p21/wafl, что доказало супрессорную активность в условиях стимуляции пролиферации гетеро- и гомо - димерами HER2

Был выявлен ряд случаев рака Педжета молочной железы без сверхэкспрессии HER2 Это свидетельствует об отсутствии классического пути патогенеза в этих опухолях, для которого характерен хемотаксис раковых клеток за счет гетеродимеров HER2

Практическая значимость

В данной работе было оценено влияние сверхэкспрессии HER2 на поведение опухоли Было показано, что HER2 оказывает влияние на течение заболевания количественным образом Разработана новая высокоточная методика сравнительной количественной иммуногистохимии, позволяющая оценивать данное влияние, что даст возможность лучше прогнозировать клиническое течение РМЖ

Получены данные о невозможности широкого использования иммуногистохимической реакции на PCNA и топоизомеразу-П-а для достоверной оценки пролиферации опухолевых клеток

Разработана платформа для последующего внедрения в рутинную практику определения маркеров эффективности химиотерапии перед ее назначением Топоизомераза-П-а - мишень антрацшшинов, p21/wafl - маркер для применения таксанов При помощи методики сравнительной количественной

иммуногистохимии можно определять состояние экспрессии данных маркеров, активность p21/wafl Это позволит подходить к лечению больных РМЖ индивидуально, используя знания о предполагаемом ответе конкретной опухоли на назначаемую химиотерапию Методика позволяет определять маркеры на архивном материале и отличается относительно невысокой стоимостью

Приведены конкретные примеры использования данной методики в 23 наблюдениях РМЖ для оценки экспрессии каждого из маркеров, сравнения их между собой и клиническая интерпретация результатов в каждом случае

Апробация работы

Результаты исследования были представлены в докладах на

1 III Съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, Беларусь,

2004),

2 Научной и образовательной конференции ЕБМО (Европейское общество медицинской онкологии) - ЕЭЕС (Будапешт, Венгрия,

2005),

3 Всемерном противораковом конгрессе (ЛСС (Международное общество против рака) Вашингтон, США, 2006,

4 31-ом Конгрессе ЕБМО (Стамбул, Турция, 2006),

5 X Российском онкологическом конгрессе (Москва, Россия,

2006), где получено второе место на Всероссийском конкурсе молодых ученых на лучшую онкологическую работу 2006 года,

6 5-ом Международном симпозиуме по таргетной терапии рака (Амстердам, Нидерланды, 2007),

7 Всероссийской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, Россия, 2007),

8 XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, Россия, 2007), где был получен диплом I степени

Публикации

Материалы диссертации отражены в 23 опубликованных работах, в том числе в 4 за рубежом

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 187 страницах машинописи и состоит из введения, литературного обзора, описания материала и методов, главы результатов собственного исследования, обсуждения полученных данных и выводов Текст иллюстрирован 16 таблицами,

24 рисунками Список литературы содержит 200 наименований, из которых 28 отечественных и 172 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы

Было изучено 452 случая РМЖ у больных, оперированных в Республиканском клиническом онкологическом диспансере и в онкологическом диспансере г Казани в 1998-2007 годах Согласно поставленным задачам, анализируемые наблюдения были разделены на 3 группы

1-я группа - 414 случаев РМЖ В данных случаях были проведены рутинные гистологические исследования и иммуногистохимический анализ уровня пролиферации с помощью маркеров Кд-67 (336 наблюдений) и PCNA (78 случаев), выраженности экспрессии HER2, а также эстрогеновых и прогестероновых рецепторов

2-я группа - 23 случая РМЖ с известной позитивной иммуногистохимической реакцией на HER2 («++» и «+++» по критериям HercepTest), где проводился анализ амплификации гена при помохци FISH (флуоресцентная m situ гибридизация) реакции (21 случай) и CISH (хромогенная in situ гибридизация) (2 случая) В данных наблюдениях также проводилось иммуногистохимическое исследование Е-кадгерина, CD 44 V6, p21/wafl, топоизомеразы-II- а, анализ пролиферации по экспрессии Ki-67

3-я группа - 15 случаев рака Педжета молочной железы с подлежащим инвазивным протоковым раком В клетках рака Педжета и подлежащей опухоли изучалась экспрессия HER2, Е-кадгерина, CD 44 V6, Ki-67, коллагена-IV, GCDFP-15 (Gross Cystic Disease Fluid Protein 15 - белок №15 жидкости при кистозной болезни молочной железы), прогестероновых и эстрогеновых рецепторов Уровень пролиферации опухолевых клеток оценивался по индексу Ki-67

Оценка экспрессии HER2 осуществлялась согласно критериям DAKO HercepTest™ Учитывалась только мембранная реакция Для контроля качества выполнения иммуногистохимической реакции

перед оценкой степени экспрессии HER2 по критериям HercepTest анализировались нормальные протоки молочной железы на этом же срезе. При отсутствии реакции в них результаты иммуногистохимического исследования признавались достоверными Применялись также контрольные срезы культуры клеток рака молочной железы, которые прилагаются к набору HercepTest™ Каждое стекло содержало 3 среза с парафиновых блоков клеточных линий РМЖ Данные клеточные линии имеют разную степень экспрессии HER2 MDA-231 (0), MDA-175 (1+), SK-BR-3 (3+)

Экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов оценивалась полуколичественно при помощи системы гистосчета (Histoscore (Н)) Оценивалась только ядерная реакция Н представляет собой сумму из трех составляющих. 1) Процент сильно окрашенных ядер опухолевых клеток умноженный на три, 2) Процент умеренно окрашенных клеток умноженный на два, 3) Процент слабо окрашенных клеток Значения Н<50% для эстрогеновых рецепторов и Н<15% для прогестероновых рецепторов расценивались как негативная реакция Оценивалась только ядерная реакция Величины Н= 15-100 для прогестероновых и Н=50-100 для эстрогеновых рецепторов расценивались как позитивная реакция «+» Н=100-200 для эстрогеновых и прогестероновых рецепторов расценивалось как позитивная реакция «++». 11=200-300 для эстрогеновых и

прогестероновых рецепторов расценивалось как позитивная реакция

«+++»

Подсчет окрашенных раковых клеток на Ki-67, топоизомеразу-П-а, P21/wafl, Е-кадгерин, CD44v6 выполнялся при помощи морфометрической станции Leica CTR5000 и программы Leica Qwin Plus Он производился автоматически при возможности стандартизации размера и цвета опухолевых клеток (солидный пласт) либо мануально, если имелся мезенхимальный компонент и стандартизация клеток была невозможна Оценивались поля зрения при увеличении х200 (2000 клеток) максимальной экспрессией данного маркера, минимальной и средней экспрессией Высчитывался средний процент позитивных опухолевых клеток Далее производилось сравнение полученных относительных величин каждого маркера и делались соответствующие выводы Мы имели право производить арифметические действия между относительными

величинами, так как анализировались серийные срезы, экстраполяция результата каждого маркера осуществлялась на весь срез

Реакция на Е-кадгерин, CD44V6 расценивалась как негативная (- нет реакции, ± отдельные позитивные клетки), слабо позитивная (+ 25% окрашенных клеток), средне- или сильнопозитивная реакция (++/+++ соответственно для 25-50% и > 50% опухолевых клеток с умеренной и сильной реакцией) В клетках РМЖ принято оценивать только мембранную реакцию на Е-кадгерин и CD 44 V6

Реакция на белок GCDFP-15 расценивалась как позитивная, если более чем 25% раковых клеток имели любую по интенсивности (слабую, умеренную, сильную) степень окрашивания цитоплазмы

Интактность базальной мембраны оценивалась при помощи иммуногистохимического исследования коллагена IV типа Базальная мембрана считалась прерванной, если на протяжении некоторой области она не визуализировалась, в этом же месте находились фрагменты базальной мембраны и очаги опухолевых клеток

Уровень пролиферации оценивался при помощи подсчета позитивных на Ki-67 и PCNA ядер в 2000 раковых клеток Ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная для Ki-67 и только сильная ядерная реакция фиксировалась как позитивная для PCNA Уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% раковых клеток имели позитивную реакцию, умеренный, если 15-30% ядер опухолевых клеток показывали позитивную реакцию и высокий, если >30% опухолевых клеток имели позитивную ядерную реакцию

При проведении CISH реакции ген ERBB2 считался амплифицированным, если среднее число меток превышало 6 при их подсчете в 60 ядрах опухолевых клеток При проведении FISH реакции ген ERBB2 считался амплифицированным, если соотношение суммы меток на ERBB2 ген и суммы меток на 17 хромосому превышало 2 при подсчете 20 ядер опухолевых клеюк

Статистический анализ проводили на персональном компьютере с использования пакета программ Statistica 6.0 Непараметрические данные анализировались с использованием теста %2 . Различия считались статистически достоверными при р < 0,05 Графическая обработка данных проводилась при помощи программы Microsoft Office Excel 2003.

Результаты и обсуждение исследования

Патогенетическое и прогностическое значения воздействия сверхэкспрессии HER2 на ряд молекул адгезии и клеточного цикла (апробация методики сравнительной количественной иммуногистохимии)

Положительная реакция на HER2 по критериям HercepTest была отмечена в 96 случаях из 414 (24%) Учитывалась позитивная реакция HER2 на «++» и «+++» Реакция на эстрогеновые рецепторы была положительной у 231 больных (56%), отрицательные результаты отмечались у 179 пациенток (44%) При иммуногистохимической реакции HER2 на «два креста» эстрогеновые рецепторы показывали различный уровень экспрессии, начиная от Н=50 (+) и заканчивая сохранными рецепторами до Н=300 или «+++» Реакция на прогестероновые рецепторы была положительной в 199 случаях (48%), отрицательная реакция наблюдалась в 215 случаях (52%), и незначительно отличалась от реакции на эстрогеновые рецепторы

Сравнительный анализ уровней пролиферации, измеренных по экспрессии PCNA и Кл-67 показал, что пролиферация, измеренная при помощи PCNA значительно превышала аналогичную при использовании маркера Ki-67 (р<0,001) Это объясняется тем, что Кл-67 экспрессируется в поздней Gl, S, G2, М фазах клеточного цикла (Starborg М, Gell К, Brundell Е , Hoog С , 1996, Saiwaki Т , Kotera I, Sasaki М et al, 2005) В то же время PCNA помимо перечисленных фаз экспрессируется в ранней Gl, а слабая иммуногистохимическая реакция выявляется и в GO фазе клеточного цикла (Kelman Z , 1997, Ando Т, Kawabe Т, Ohara Н, 2001) Таким образом, иммуногистохимическая реакция на PCNA не может быть достоверным критерием оценки уровня пролиферации В дальнейших исследованиях мы применяли только Ki-67 в качестве универсального маркера пролиферации

В наших исследованиях мы выявили, что пролиферация имеет более высокий уровень в эстроген-рецептор негативных случаях (р=0,0046, табл 1) Очевидно, что в данных наблюдениях имеет место иной, гормонально независимый механизм активации пролиферации опухолевых клеток Одним из таких механизмов, описанных в литературе, является сверхэкспрессия онкогена HER2,

запускающая каскадные пути, которые способны заставить войти клетку в клеточный цикл (Alimandi M , Romano А , Curia MC et al, 1995, Olayiloye M A , Neve RM, Lane HA et al, 2000; Thor A D , Liu S , Edgerson S et al, 2000, DiGiovanna MP , Chu P , Davison TL et al, 2002, Llombart-Bosch A , Felipo V, 2003)

Таблица 1

Уровень пролиферации в раке молочной железы в зависимости от

Группа опухолей Высокий уровень пролиферация Умеренный уровень пролиферации Низкий уровень пролиферации р=0,0046*

Позитивные на ЭР (Н=50-300) 23% (52 случая) 16% (37 случаев) 61% (142 случая)

Негативные на ЭР (Н<50) 35% (63 случая) 21% (38 случаев) 44% (78 случаев)

Примечание - для применения критерия % составлялись таблицы сопряженности 2 х 2, в которых случаи с умеренным и низким уровнями пролиферации были объединены Таким образом, р=0,0046 показывает достоверную зависимость уровня пролиферации от статуса эстротеновых рецепторов

Таблица 2

Уровень пролиферации в раке молочной железы при позитивной («++», «+++» - первая группа) и негативной (вторая группа) иммуногистохимических

Высокая пролиферация Умеренная пролиферация Низкая пролиферация р = 0,3209*

Первая группа (HER2+) 30 случаев (31%) 22 случая (23%) 44 случая (46%)

Вторая группа (HER2-) 83 случая (26%) 57 случаев (18%) 178 случаев (56%)

- для применения критерия % составлялись сопряженности 2 х 2, в которых случаи с умеренным и низким уровнями пролиферации были объединены Таким образом, р=0,3209 показывает отсутствие зависимости уровня пролиферации от состояния экспрессии НЕК2

После анализа уровня пролиферации в первой группе больных, состоящей из 414 наблюдений, мы не выявили статистически

значимую зависимость влияния экспрессии HER2 на пролиферативный уровень (р - 0,3209, табл 2)

Данное явление предполагает, что каскадные пути с гетеро- и гомо- димеров HER2 недостаточны для того, чтобы опухоль имела высокий пролиферативный индекс Это может иметь несколько объяснений Первое из них- сверхэкспрессия HER2 приводит к ингибированию экспрессии и исчезновению на клеточной мембране a2pl интегрина и Е-кадгерина, что ведет, в свою очередь, к исчезновению физически связанной с ними FAK (Gomm J, 2000) FAK- киназа местной адгезии (focal adhesion kinase), ее исчезновение делает невозможным прохождение киназного пути с гетеро- или гомодимеров HER2, так как MAP- киназа МЕК1 не фосфорилирует свои мишени ERK1/2 (Jarpe MB , Widmann С , Knall С et al, 1998, Parsons J T , 2003) (рис 1)

_, Сверхэкспрессия I

I L_HER2_i

N Гетеродимеризация

Е-кадгерин V

а2Ь1 интегрин Grb2

Потеря активности

FAK - м-Н*

Sos /

Ras

I

\ Л

V/

Рис 1 Схема киназного пути с гетеродимеров С-егЬВ-2 при исчезновении Е-кадгерина

Однако, вероятно, данное влияние количественное, а не качественное, на что указывает 31% случаев РМЖ со сверхэкспрессией HER2, в которых была выявлена высокая пролиферация, измеренная по Ki-67 Даже если этот высокий уровень пролиферации обусловлен не сверхэкспрессией HER2 (так как примерно эквивалентный процент опухолей имел высокую пролиферацию при отсутствии сверхэкспрессии HER2), очевидно, что MAP- киназа МЕК1 в этих случаях фосфорилирует свои мишени

ERK1/2, ибо другой способ вхождения в G1 стадию клеточного цикла невозможен Однако Ю-67 экспрессируется, начиная с поздней G1 стадии и заканчивая всей М-фазой (Starborg М , Gell К, Brundell Е , Hoog С , 1996) Таким образом, даже высокий уровень пролиферации, выявленный в наших наблюдения по индексу Ki-67, не может указывать на то, что клетки в данных случаях обязательно делятся, а не остановились в одной из сверочных точек клеточного цикла

Рядом авторов было показано, что сверхэкспрессия HER2 вызывает повышение экспрессии p21/wafl (Yu D , Jmg T , Liu В et al, 1998). При анализе второй группы случаев, состоящей из 23 наблюдений, мы также показали, что сверхэкспрессия HER2 во всех случаях сопровождается позитивной иммуногистохимической реакцией на p21/wafl Однако некоторые исследователи отмечают, что в условиях сверхэкспрессии HER2 белок гена p21/wafl находи гея в цитоплазме клетки, где данный ингибитор циклин-зависимых киназ не может выполнять свою функцию (Asada М, Yamada Т , Ichijo Н. et al, 1999, Winters Z E , Leek R D , Bradbum M J et al, 2003, Xia W , Chen J S , Zhou X et al, 2004) Наши исследования не подтверждают эти данные, так как при сверхэкспрессии HER2 в 65% случаях мы выявили ядерную реакцию на p21/wafl Более того, проведенные Orend и соавторами исследования указывают на то, что в цитоплазму клетки p21/wafl уходит только в связи с комплексами cdk-циклин Так, в фазе G1, весь p21/wafl связывается с комплексами cdk2-E-циклин и в таком виде выводится в цитоплазму, в результате чего в S фазе клеточного цикла p21/wafl в ядре отсутствует (Orend G , Hunter Т, Ruoslahti Е, 1998) Поэтому мы полагаем, что в ряде случаев цитоплазматическая реакция на p21/wafl свидетельствует о нахождении клетки в S фазе клеточного цикла, а не о том, что p21/wafl не активен Если в фазу G1 экспрессия p21/wafl преобладает над комплексами cdk2-E-HHKjmii, то клетка останавливается на данной сверочной точке В своих исследованиях это состояние раковой клетки мы выявляли либо по отсутствию экспрессии Ki-67, либо по его крайне неяркой, зернистой иммуногистохимической реакции Подобная зернистая окраска объясняется тем, что в этой фазе клеточного цикла Ki-67 лишь начинает экспрессироваться и находится в небольшом количестве преимущественно в области ядрышек (Т Saiwaki, I. Kotera, М Sasaki et al, 2005) Данные случаи вошли в 69% наблюдений с умеренной и

низкой пролиферацией из первой исследуемой группы. Однако у белка p21/wafl имеется второй пик ядерной экспрессии- это G2/M сверочная точка. Здесь происходит связывание р2 i/wai'l с A-Cdk2. [)1 -Cdk2 и Bl-Cdk2 комплексами, что приводит к остановке клеточного цикла и препятствует прохождению клетки в М-фазуфиШ V., Stein Gil., Far D.F., Reed S.I., 1998). Таким образом, лаже те 31% случаев из первой исследуемой группы со сверх'йгспрессией IIER2, которые обладают высокой экспрессией Ki-67, вовсе не обязательно делятся, а могут находиться в G2/M сверочно§ точке. Другими словами, по соотношению ядерной и пито плазматической реакций на P21/wafl и по индексу Ki-67 можно делать выводы о фазе нахождения клетки в цикле, об активности белка P21/wafl или об его отсутствии (рис. 2).

белки

Кроме raro, P21/waiT оказывает влияние на эффективность терапий таксаиами. Так, активно функционирующий P21/wafl делает

цитопл^з^а

"Цитоплазм^ С=К2

Ё I

CDK2

Шгоэ

Takcori)

GÍTÉfckppifVT

'Клеточный

lJHlín

■игхкге?.

■ topo-I I-з .' 'пезкт/з

Цитоплазма

Рис. 2. Клеточный цикл. Характер и ni му йоги сто хи м и ч о с кой реакции на P21/wafi, Ki-67. топа изо vi е рач у-1 i-к а различная фазы клеточного цикла.

применение таксанов неэффективным (Уи Б, Дищ Т, Ьш В й а!, 1998)

Кл-67 экспрессируется в раковых клетках в тех же фазах клеточного цикла, что и топоизомераза- П-а (поздняя 01, Б, 02, М фазы) Таким образом, уровни экспрессии данных молекул должны соответствовать друг другу Однако в наших наблюдениях мы выявили три возможных варианта соотношений экспрессий данных молекул в опухолях (табл 3) 1) Когда количество раковых клеток, экспрессирующих Кь67, соответствовало числу опухолевых клеток позитивных на топоизомеразу- П-а, 2) Когда количество раковых клеток, экспрессирующих К.1-67, было меньше числа опухолевых клеток позитивных на топоизомеразу- П-а, 3) Когда количество раковых клеток, экспрессирующих К1-67, было больше числа опухолевых клеток позитивных на топоизомеразу- П-а Вторую позицию мы обозначили как сверхэкспрессия топоизомеразы- П-а, а третью как гипоэкспрессия В тех же случаях, где количество раковых клеток, экспрессирующих К1-67 и топоизомеразу-П-а, примерно соответствовало друг другу (первая позиция), мы обозначили как норма

Таблица 3

Распределение случаев в зависимое ги от соотношения экспрессии _топоизомеразы-П-а и Ki-67__

Экспрессия топоизомеразы > экспрессии Ki-67 Экспрессия топоизомеразы < экспрессии Ki-ó 7

9 случаев 14 наблюдений

Топоизомераза-П-а является мишенью многих химиопрепаратов, таких как антрациклины (доксорубицин, эпирубицин и др ) (Harns L , Tang С, Yang С et al, 1998) In vitro было доказано, что амплификация данного гена сопровождается высокой чувствительностью к антрациклинам (Tanner M, Isola J, Wiklund et al, 2006) и отсутствием ее по отношению к алкилирующим агентам В то же время делеция i ена топоизомеразы-П-а сопровождается резистентностью к антрациклинам с одной стороны и чувствительностью к алкилирующим агентам с другой (Harns L , Tang С , Yang С et al, 1998, Harns L N , Yang L , Liotcheva L et al, 2001) Исследования, которые оценивали экспрессию топоизомеразы-П-а m vivo в РМЖ до и после лечения

антрациклинами свидетельствуют, в основном о корреляции положительного эффекта терапии антрациклинами и сверхэкспрессии топоизомеразы-П-а (Holland R, Peterse JL, Milhs RR, 1994, Leo D A , Larsimont D , Gancberg D et al, 2001, Arpmo G , Ciocca D R, Weiss H et al, 2005) Проблема, которую не могли разрешить данные исследования - это интерпретация результатов оценки экспрессии топоизомеразы-П-а Наши исследования по сравнительному количественному анализу экспрессии топоизомеразы-П-а и Ki-67 способны разрешить данную проблему Таким образом, нормо- и сверх- экспрессия топоизомеразы-П-а в раковых клеток может означать эффективность применения антрациклинов, а гипоэкспрессия - отсутствие эффективности

Влияние сверхэкспрессии HER2 на патогенез рака Педжета

Болезнь Педжета является малоизученной формой РМЖ, имеет апокриновый фенотип и характеризуется инвазией опухолевыми клетками эпидермиса соска, природа которой до конца не изучена Считается, что ключевую роль в этом процессе играют гетеродимеры HER2, лигандами которых являются белки херегулины массой 45 килодальтон (Schelfhout V, Coene Е D , Delaey В et al, 2000) Под влиянием эффекта херегулинов, близкого к хемотаксису, раковые клетки, имеющие сверхэкспрессию HER2, движутся по протокам молочной железы в сторону зернистого слоя, результатом чего будут гистологические картины присутствия опухолевых клеток в верхних слоях эпидермиса (Potter С R., Quatacker J G , Maertens G et al, 1989, Potter С R, Quatacker J , 1993, Schelfhout V , Coene E D , Delaey В et al, 2000) Очевидно, что в негативных на HER2 наблюдениях «хемотаксис» по механизму связывания гетеродимеров HER2 с херегулином-а осуществляться не может, поэтому до настоящего времени остается нерешенным вопрос о том, что заставляет раковые клетки в этом случае двигаться в верхние слои эпидермиса Надо отметить, что во всех случаях рака Педжета независимо от экспрессии HER2 картины дефектов базальной мембраны эпидермиса (которая выявлялась антителами к коллагену IV типа, что использовалось и в более ранних работах (Пожарисский КМ., Кыштобаева А Ш , Туркевич Е А., 1997) возникали не во всех местах скопления опухолевых клеток и клетки Педжета ниже границы

разрыва базальной мембраны не обнаруживались Более того, в некоторых случаях рака Педжета базальная мембрана эпидермиса оставалась интактной В то же время нами была выявлена позитивная иммуногистохимическая реакция на GCDFP-15, свидетельствующая об апокриновой дифференцировке клеток Педжета При сравнительном иммуногистохимическом исследовании рака Педжета с подлежащей опухолью оказалось, что они имели идентичный фенотип Таким образом, рак Педжета можно рассматривать как вариант рака in situ, при котором раковые клетки из подлежащей опухоли по протокам достигают эпидермиса соска, инвазируя его в местах их открытия Мы полагаем, что разрывы базальной мембраны эпидермиса следует считать вторичными и отсутствие опухолевых клеток ниже базальной мембраны указывает на удержание клеток Педжета внутри эпидермиса хемотаксическими молекулами

Интересно отметить, что клетки Педжета в молочной железе в 100% случаев описывают как позитивные на муциноподобный антиген MUC1 (Kuan S F , Montaq A G , Hart J et al, 2001) Однако показано, что гомодимеры HER2 ведут к снижению уровня MUC1 (Canbay Е , 2003) Таким образом, несмотря на го, что рак Педжета со сверхэкспрессией HER2 всегда имеет амплификацию гена, вероятно, в нем не происходит образование гомодимеров, а все молекулы HER2 идут на посгроение гетеродимеров с другими членами семейства HER Такая высокая концентрация гетеродимеров HER2 на поверхности раковой клетки, вероятно, и создает тот хемотаксический потенциал, необходимый для инвазии раковых клеток в эпидермис

26,7% случаев рака Педжета показали относительно сохранную его экспрессию Е-кадгерина (категория «++»), в то время как во второй группе случаев 48% опухолей молочной железы соответствовали категории «++» по экспрессии Е-кадгерина Высокий уровень пролиферации по экспрессии Ki-67 отмечался в 67% случаев рака Педжета по сравнению с 31% HER2 позитивных наблюдений в первой группе РМЖ

выводы

1 Сверхэкспрессия HER2 наблюдается в 24% случаев рака молочной железы

2 Статистически значимая зависимость влияния экспрессии HER2 на пролиферативный уровень опухолевых клеток при раке молочной железы отсутствует (р = 0,3209)

3 Влияние HER2 на пролиферацию опухолевых клеток осуществляется на количественном уровне, а не на качественном, так как в случаях со сверхэкспрессией HER2 были выявлены различные состояния гена ERBB2 (амплификация, или ее отсутствие), экспрессии P21/wafl, топоизомеразы-II-a, Е-кадгерина

4 При использовании PCNA и топоизомеразы-II-a в качестве маркеров пролиферации можно получить ложные результаты Так, пролиферация, измеренная при помощи PCNA, значительно превышала аналогичную при использовании маркера Кл-67 (р<0,001), а экспрессия топоизомеразы-II-a в 57% случаев была ниже индекса пролиферации по Кл-67

5 Сравнительная количественная иммуногистохимия топоизомеразы-II-a, p21/wafi, Ki-67 позволяет достоверно оценивать экспрессию топоизомеразы-II-a и активность p21/wafl, что может быть использовано для оценки предполагаемой эффективности химиотерапии рака молочной железы антрациклинами и таксанами

6 P21/wafl обладает супрессорной активностью в случаях рака молочной железы со сверхэкспрессией HER2, так как в 65% наблюдений выявлялась ядерная реакция на данный белок

7 Болезнь Педжета молочной железы можно разделить на два типа 1 тип- со сверхэкспрессией HER2 и 2 тип- без сверхэкспрессии HER2 Эти варианты рака Педжета не отличаются гистологически, но обладают различным фенотипом и имеют различный механизм возникновения

8 Рак Педжета представляет более агрессивную форму рака молочной железы по уровню пролиферации, так как высокий уровень пролиферации по экспрессии Ki-67 отмечался в 67% случаев рака Педжета по сравнению с 31% HER2 позитивных наблюдений в общей группе рака молочной железы. Однако

инфильтративный рост опухолевых клеток ограничен хемотаксическим влиянием херегулинов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Оценено влияние сверхэкспрессии НЕ112 на поведение опухоли Было показано, что НЕЛ2 оказывает влияние на течение заболевания количественным образом Разработана новая высокоточная методика сравнительной количественной иммуногистохимии, позволяющая оценивать данное влияние, что позволит лучше прогнозировать клиническое течение рака молочной железы

2 Получены данные о невозможности широкого использования иммуногистохимической реакции на РСИА и топоизомеразу-П-а для достоверной оценки пролиферации опухолевых клеток

3 Разработана платформа для последующего внедрения в рутинную практику определения маркеров эффективности химиотерапии перед ее назначением Топоизомераза-И-а - мишень антрациклинов, р21ЛуаП - маркер для применения таксанов При помощи методики сравнительной количественной иммуно гистохимии можно определять состояние экспрессии данных маркеров, активность р21/\уаП Рекомендуется использовать данный метод, это позволит подходить к лечению больных раком молочной железы индивидуально, используя знания о предполагаемом ответе конкретной опухоли на назначаемую химиотерапию Методика позволяет определять маркеры и на архивном материале, отличается относительно невысокой стоимостью

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Иммуногистохимическое выявление некоторых биомаркеров рака молочной железы анализ 414 наблюдений / С В Петров, Н В Балатенко, Г И Винокурова, Ф.М Мазитова, Г.А. Раскин, Г 3 Мухаметшина, Е М Ганошенко, И Г Гатаулин // Новые направления и разработки в онкоморфологии Тезисы IX научной конференции -М , 2003 - С 42-43,

2 Пролиферация клеток рака молочной железы и ее связь с некоторыми маркерами опухолевого роста / Г.А. Раскин // Актуальные проблемы морфоло1 ии Сборник работ - Красноярск, 2003 -С 177-178,

3 Анализ активности ряда биомаркеров молочной железы / Г.А. Раскин//ВестникРГМУ -2003 -№2(28).-С 201,

4 Новый взгляд на патогенез рака молочной железы / Г.А. Раскин // Вестник РГМУ -2004 -№3(34) - С 180-181,

5 Гипотеза о роли онкогена с-егЬВ2 (ЫЕи\ШЖ2) в прогрессии рака молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ - Минск, 2004 - С 284-285,

6 Новый взгляд на участие онкогена с-егЬВ2 в прогрессии рака молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин // Российский биотерапевтический журнал -2004 -№2 -С 73-74,

7 Гипотеза о роли онкогена с-егЬВ2 в прогрессии рака молочной железы / С.В Петров, Г.А. Раскин // Материалы VI всероссийского съезда онкологов - Ростов, 2005 - т 1, С. 393-394,

8 Иммуногистохимическая диагностика опухолей молочной железы (ИДО) определяет химиотерапию рака / С В Петров, Г.А. Раскин // Лечение рака и предраковых заболеваний молочной железы Материалы межрегиональной конференции - Казань, 2005 - С 238-241,

9 Молекулярные маркеры раковой клетки в выборе таргетной терапии / С В Петров, Г.А. Раскин // Актуальные проблемы онкологии. Материалы I конгресса онкологов республики Узбекистан - Ташкент, 2005 - С 188,

10 Молекулярные параметры опухоли в повседневной химиотерапии, предсказывающие ее эффективность / С В Петров, Г.А. Раскин // Материалы VI всероссийского съезда онкологов -Ростов, 2005 - т 2, С 396-397,

11 О некоторых функциональных параметрах гена с-егЬВ2 в раке молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин // Актуальные проблемы онкологии Материалы I конгресса онкологов республики Узбекистан - Ташкент, 2005. - С 189,

12 О различном значении сверхэкспрессии с-егЬВ2 без амплификации и с амплификацией гена в раке молочной железы / С.В Петров, Г.А. Раскин // Лечение рака и предраковых

заболеваний молочной железы Материалы межрегиональной конференции - Казань, 2005 - С 241-246,

13 Различное значение сверэкспрессии с-егЬВ2 без амплификации и с амплификацией гена в раке молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин // Материалы VI всероссийского съезда онкологов -Ростов, 2005 -т2, С 397-398,

14 Новая гипотеза о роли онкогена с-егЬВ2 в прогрессии рака молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин, Р 111 Хасанов / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2006 -№7 - С. 106-109,

15 О некоторых молекулярных особенностях рака Педжета молочной железы / Г.А. Раскин, С В Петров, Д Э Цыплаков // Вопросы онкологии -2006 -Приложение 1 -С 29-30,

16 О сверхэкспрессии HER2 без амплификации гена в раке молочной железы / Г.А. Раскин, С В Петров, Д Э Цыплаков // Вопросы онкологии - 2006 - Приложение 1 - С 28-29,

17 Сравнительное иммуногистохимическое исследование с-егЬВ2-позитивного инвазивного протокового рака и болезни Педжета молочной железы / С В Петров, Г.А. Раскин, Р Ш Хасанов, Д Э Цыплаков // Архив патологии - 2006 - №5 - С 10-14,

18 Топоизомераза-П-а и р21- новые маркеры в скрининге рака молочной железы? / С В Петров, Г.А. Раскин, Д Э Цыплаков // Вопросы онкологии - 2006 - Приложение 1 - С 26,

19 Влияние сверхэкспрессии HER2 на пролиферацию в раке молочной железы / Г.А. Раскин; С В Петров /7 Вопросы Онкологии -2007 - Приложение 1 -С 22-23,

20 The new hypothesis about the role of c-erbB2 m breast cancer pathogenesis / G.A. Raskin, S V Petrov // Annals of Oncology -2005 -V 16(S2) -P 273,

21 About some particularities of Paget's disease caused by C-erb-B2 overexpression (comparative immunohistochemical study) / G.A. Raskin, S V Petrov, R Sh Khasanov, D E Tsyplakov // Annals of Oncology -2006 -V 17(S9) -P 62,

22 Some particularities of breast cancer with overexpression of HER2 withou gene's amplification / G.A. Raskin, S V Petrov, R Sh Khasanov, DE Tsyplakov//Education/Abstract Book of UICC World Cancer Congress - Washington D С , USA, 2006 - P 224,

23 Influence of HER2 over-expression on level of proliferation m breast cancer / G.A. Raskin, S V Petrov, R Sh Khasanov // Proceeding of 5th International Symposium on Targeted Anticancer Treatment -Amsterdam, The Netherlands, 2007. - P 78

Выражаю глубокую благодарность главному врачу Республиканского клинического онкологического диспансера, г Казань профессору Р ШХасанову и сотрудникам ПАО за поддержку при выполнении этой работы

Подписано к печати 25 07 2007г Формат 60x84 1/16 Заказ 0072-2007

ООО "Изображение+" 420080 г Казань, пр Ибрагимова, 30 т/ф (843) 542-71-14

Актуальность работы

Рак молочной железы занимает первое место в структуре онкологических заболеваний у женщин. Показано, что повышенная активность онкогена HER2 приводит к ухудшению прогноза исхода заболевания [5, 13, 14, 16, 19, 113]. Однако остается неясным механизм, благодаря которому, данное негативное влияние осуществляется. Большинство авторов утверждают, что сверхэкспрессия HER2 приводит к активации пролиферации и быстрой прогрессии опухоли [34, 35, 50, 67, 70, 90, 130, 187]. Это осуществляется за счет формирования гомо- и гетеро- димеров HER2, которые в результате трансфосфорилирования запускают киназные пути, приводящие к активации клеточной пролиферации, ингибированию апоптоза, клеточной диссоциации.

Другие исследователи полагают, что сверхэкспрессия HER2 ведет к повышенной экспрессии p21/wafl [94, 148], в половине случаев сопровождается делецией гена топоизомеразы-И-а [40, 125], что ведет к подавлению пролиферации [114, 166, 170, 181]. Однако сверхэкспрессия HER2 также приводит к угнетению экспрессии молекул адгезии (Е-кадгерина) и интегринов, что повышает метастатическую способность опухолевой клетки [52].

Таким образом, в настоящее время имеются противоречивые данные о влиянии HER2 на пролиферацию клеток и поведение опухоли.

Цель и задачи работы

Изучение влияния экспрессии HER2 на молекулярные параметры некоторых форм рака молочной железы.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать уровень экспрессии HER2, эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в клетках РМЖ.

2. Определить наиболее достоверный маркер для оценки опухолевой пролиферации.

3. Оценить уровень пролиферации в клетках РМЖ для выявления различных по предиктивному и прогностическому значению групп с последующим сравнительным анализом пролиферации при различном уровне экспрессии HER2 и эстрогеновых рецепторов.

4. Проанализировать амплификацию гена HER2 при его сверхэкспрессии, а также экспрессию ряда молекул клеточного цикла и молекул адгезии, которые могут оказывать влияние на уровень пролиферации раковых клеток.

5. Разработать и апробировать методику определения экспрессии топоизомеразы-П-а и p21/wafl в клетках РМЖ как молекул-предикторов эффективности антрациклинов и таксанов.

6. Исследовать особенности влияния HER2 на поведение опухолевых клеток в раке Педжета молочной железы.

Научная новизна

В работе получены новые данные о влиянии сверхэкспрессии HER2 на поведение РМЖ. Было показано, что подобное влияние оказывается на количественном, а не на качественном уровне.

Впервые был применен метод сравнительной количественной иммуногистохимии, которой основан на знании ключевых параметров клеточного цикла и участии каждого из исследованных маркеров в нем. При различной экспрессии данных молекул в фазах клеточного цикла, после их сопоставления между собой мы делали вывод об активности каждого из маркеров, повышенной или пониженной их экспрессии.

Впервые, при сверхэкспрессии HER2 выявлена ядерная реакция, на p21/wafl, что доказало супрессорную активность в условиях стимуляции пролиферации гетеро- и гомо - димерами HER2.

Был выявлен ряд случаев рака Педжета молочной железы без сверхэкспрессии HER2. Это свидетельствует об отсутствии классического пути патогенеза в этих опухолях, для которого характерен хемотаксис раковых клеток за счет гетеродимеров HER2.

Практическая значимость

В данной работе было оценено влияние сверхэкспрессии HER2 на поведение опухоли. Было показано, что HER2 оказывает влияние на течение заболевания количественным образом. Разработана новая высокоточная методика сравнительной количественной иммуногистохимии, позволяющая оценивать данное влияние, что даст возможность лучше прогнозировать клиническое течение РМЖ.

Получены данные о невозможности широкого использования иммуногистохимической реакции на PCNA и топоизомеразу-П-а для достоверной оценки пролиферации опухолевых клеток.

Разработана платформа для последующего внедрения в рутинную практику определения маркеров эффективности химиотерапии перед ее назначением. Топоизомераза-П-а — мишень антрациклинов, p21/wafl — маркер для применения таксанов. При помощи методики сравнительной количественной иммуногистохимии можно определять состояние экспрессии 1 данных маркеров, активность p21/wafl. Это позволит подходить к лечению больных РМЖ индивидуально, используя знания о предполагаемом ответе конкретной опухоли на назначаемую химиотерапию. Методика позволяет определять маркеры на архивном материале и отличается относительно невысокой стоимостью.

Приведены конкретные примеры использования данной методики в 23 наблюдениях РМЖ для оценки экспрессии каждого из маркеров, сравнения их между собой и клиническая интерпретация результатов в каждом случае.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены в докладах на:

1. Ill Съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, Беларусь, 2004);

2. Научной и образовательной конференции ESMO (Европейское общество медицинской онкологии) - ESEC (Будапешт, Венгрия, 2005);

3. Всемирном противораковом конгрессе UICC (Международное общество против рака) Вашингтон, США, 2006;

4. 31-ом Конгрессе ESMO (Стамбул, Турция, 2006);

5. X Российском онкологическом конгрессе (Москва, Россия, 2006), где получено второе место на Всероссийском конкурсе молодых ученых на лучшую онкологическую работу 2006 года;

6. 5-ом Международном симпозиуме по таргетной терапии рака (Амстердам, Нидерланды, 2007);

7. Всероссийской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, Россия, 2007);

8. XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, Россия, 2007), где был получен диплом I степени.

Публикации

Материалы диссертации отражены в 23 опубликованных работах, в том числе в 4 за рубежом.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 187 страницах машинописи и состоит из введения, литературного обзора, описания материала и методов, главы результатов собственного исследования, обсуждения полученных данных и выводов. Текст иллюстрирован 16 таблицами, 24 рисунками. Список литературы содержит 200 наименований, из которых 28 отечественных и 172 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Сверхэкспрессия HER2 наблюдается в 24% случаев рака молочной железы.

2. Статистически значимая зависимость влияния экспрессии HER2 на пролиферативный уровень опухолевых клеток при раке молочной железы отсутствует (р = 0,3209).

3. Влияние HER2 на пролиферацию опухолевых клеток осуществляется на количественном уровне, а не на качественном, так как в случаях со сверхэкспрессией HER2 были выявлены различные состояния гена ERBB2 (амплификация или ее отсутствие), экспрессии P21/wafl, топоизомеразы-II-а, Е-кадгерина.

4. При использовании PCNA и топоизомеразы-II-a в качестве маркеров пролиферации можно получить ложные результаты. Так, пролиферация, измеренная при помощи PCNA, значительно превышала аналогичную при использовании маркера Ki-67 (/?<0,001), а экспрессия топоизомеразы-II-a в 57% случаев была ниже индекса пролиферации по Ki-67.

5. Сравнительная количественная иммуногистохимия топоизомеразы-11-a, p21/wafl, Ki-67 позволяет достоверно оценивать экспрессию топоизомеразы-II-a и активность p21/wafl, что может быть использовано для оценки предполагаемой эффективности химиотерапии рака молочной железы антрациклинами и таксанами.

6. P21/wafl обладает супрессорной активностью в случаях рака молочной железы со сверхэкспрессией HER2, так как в 65% наблюдений выявлялась ядерная реакция на данный белок.

7. Болезнь Педжета молочной железы можно разделить на два типа: 1 тип- со сверхэкспрессией HER2 и 2 тип- без сверхэкспрессии HER2. Эти варианты рака Педжета не отличаются гистологически, но обладают различным фенотипом и имеют различный механизм возникновения.

8. Рак Педжета представляет более агрессивную форму рака молочной железы по уровню пролиферации, так как высокий уровень пролиферации по экспрессии Ki-67 отмечался в 67% случаев рака Педжета по сравнению с 31% HER2 позитивных наблюдений в общей группе рака молочной железы. Однако инфильтративный рост опухолевых клеток ограничен хемотаксическим влиянием херегулинов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценено влияние сверхэкспрессии HER2 на поведение опухоли. Было показано, что HER2 оказывает влияние на течение заболевания количественным образом. Разработана новая высокоточная методика сравнительной количественной иммуногистохимии, позволяющая оценивать данное влияние, что позволит лучше прогнозировать клиническое течение рака молочной железы.

2. Получены данные о невозможности широкого использования иммуногистохимической реакции на PCNA и топоизомеразу-П-а для достоверной оценки пролиферации опухолевых клеток.

3. Разработана платформа для последующего внедрения в рутинную практику определения маркеров эффективности химиотерапии перед ее назначением. Топоизомераза-Н-а - мишень антрациклинов, p21/wafl - маркер для применения таксанов. При помощи методики сравнительной количественной иммуногистохимии можно определять состояние экспрессии данных маркеров, активность p21/wafl. Рекомендуется использовать данный метод, это позволит подходить к лечению больных раком молочной железы индивидуально, используя знания о предполагаемом ответе конкретной опухоли на назначаемую химиотерапию. Методика позволяет определять маркеры и на архивном материале, отличается относительно невысокой стоимостью.