Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Очистка, биологическая и биохимическая характеристика фактора роста тимоцитов

\\\Ъ 9 31

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР • шстатут таотюлотт

На правах рукописи УДК 612.419.014.2. ТАЛАЕВ 017.1:612.112.94.017.1

Влядиидр Юрьевич 1СТКА , БИОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРА РОСТА тшоцитов.

14.00.36. Аллергология шшунолопая.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва 1990 г.

Работа шшшаш в Институте иицунояоиш Ешастерагвс здравоохранения СССР и с Горькое скоп ШМ впмдвкиояопв; « робнологка 1Ьшэстерства вдргщоохраьсыш Р®СР,

Научный руководитель : кшдащи- бколопгчоешк каук £ Еичяин.

Официальные оппоненты : доитор биологических паук, г А.А. Михайлова и доктор модецкнсепх даук, проф. Б.Б.

Ведущая оргашиащад - Институт экспериментальной ызд на АШ СССР.

л

Задита диссертации состоится ....... 199

в .... часов па заседашш специализированного совета Д074 при Институте имцунолопш Ш СССР ( 115478, Носква, Кгшшр шоссе, 24, корп. 2 ).

Автореферат разослан • .... 199

Учений секретарь специелизировшшого Совета доктор биологических наук

А.В. Коле

ОБЩДЯ ХЛР/.1СТИН:СШСЛ РАШШ

туальпость проблем.

Лим* ¡опо эгачосшю клетки в ходе созревания в зралне унокошетентше Т -лимфоцита исходят стадии внутритимусных дшествзнников Г-лимфоцигов. Несмотря на малочисленность гок , представляюцих эту стадии , она явля&тся узловой в цессе созревания Т-клегок : именно на этой стадии происхо-реарапгировтса генов цэпей Т-клеточного аптпгэнсвязывп?, э рецептора и от исхода этого процесса зависит буду шипи ьОа клеток-предшественников. Патологии лимфогоэза , в тон пе и лшЕопролпферативные заболевания , такга связаны с рдениями созревания клеток на стадии предшественников а.ф'цдтов. Эти обстаятельства определили пристальный эрос исследователей к механизмам регуляции созревания атих гок : в последние года резко возросло количество работ зяпош-гнх изучению внутритимусных предшественников.

Эффективны?! методом изучения свойств предав ственникоп о-флштов явилось получение трансформированных линий этих гок. В надосадках индуцированных введением шшам зрлейкин г -содеркащего препарата линий предшественников Т-Еюцитов ТС.50-1.1.1 и ТС.БС-1.2.0. была обнаружена шность, стимулирующая пролиферации гимоцитов (Шичкин В.П. ).1Э87). В отличиэ от известных лго.фэкинов, стимулируицих рост щитов, новый фактор , содержащийся в суиернатанте этих ей, стимулирует рост неактивированных тимоцитов и добавле-митогена не усиливает ростового эффекта фактора. Мишенью нового фактора , названного фактором роста тимоцитов , потея радио- и кортизонрезистентные , БС-1* , тпмозинчуво ?елыше внутрйтимусние предшественники Т-лимфоцитги.

Важность стыдим внутритимусшп предшественников Т-лим цитов в процессе назревания Т-клетип, и также в патоген нарушений Т-лтфлюэза определяй! актуальность пробх изучения фактора роста тимоцитов , рнгулирупцего рост внут тимусных предшественников Т-лимфоцит.ш. Рост количества ц ликаций посвященных изучению регуляции созревания предше ввннико Т-лимфоцитов таюкэ говорит о своевременности актуальности данной работы.

Целью исследования является очистка и изучение биоло чески и биохимических свойств очищенного препарата факт роста тимоцитов (ФРГ).

Задачи исследования :

1. Получение ФРТ-содераащего суиернатанта и исследова его ростового действия на различные клетки-мишени.

2. Очистка и биохимическая характеристика ФРГ.

3. Исследование ростовой активности очищенного препар ФРГ и сравнение ростовой активности ФРТ с извести цитокинами .

Новизна исследования :

Впервые разработан метод очистки фактора роста тимоци и исследованы его биохимические свойства : показано , что является гликопротеидом с молекулярной массой 22 Показано , что очищенный препарат ФРГ стимулирует пролифе цип неактивированных тимоцитов и спленоцитов . Мишенью ФРТ в тимусе являются ЬЗТ4 Ьуг2- предшественники Т-лимфоци В селезенке на ФРТ отвечают как 1&- так и 18*- лимфоциты.

Практическая значимость :

Диссертационная работа относится ;1к фундаменталь научным .исследованиям. Полученные у ней ' данные -дополи современные представления о белках-регуляторах,участвующих

3

щессэ созревания Т-^йетзттоз.

Вйолэгичэскеэ свойства фактора роста тимоцитов , и тую очередь способность Еосстплотийватъ клеточноеть тгалуов ¡ле облучензя , говорят о возкоетастп щиювошя этого ташна в качестве тэраиевтлческого препарата. IIb для этого »бходимо получение челиючосного сншгога фактора роста ти-ситаз iязей , что , в своз очередь , кепозиозпо баз опозеш-зшх исследований SPT.

Полсязгеп , шгосгапз па зс^зту s

1. Проведена очистка фактора роста та-юцптоз из сушрна-гга клеток лзшш T0.SC-I.2.0.

2. Фактор роста тпксцптов является глшгонротепдет с ¡экулярноа массой 21 кД.

3. Полученный препарат ФРГ обладает биологической ектпв-:тью отличной от активности нзвестхшг цнтслсппов. <DPT кулируег прсшфзращш но активированных тимоцитов п •оноцдтов , мешэнягш для ФРГ являятся прэдсэствеппшт вафщитов п В-клетки.

йпробйцзп работа. Основные полосешш диссертации издавались на конкурсе. работ колодах ученых Института гунологки МЗ СССР (Москва , 1838), на Всесоюзном совещании юлогия клеток в культуре" ( Ленинград, 1937 ), на агазиука с международным участием "Структура, биосинтез п всцшх гюлекулярных элементов йлмунной системы" ( Пущино, (7 )., Апробация диссертаций состоялась 20 апреля 1990 года меалабораторной конфэрещдш'Лйгститута нммунолйгии МЗ СССР ¡1 мая 1990! года на,-. сой,!эстйом . заседании йробло?,шого шара "Иммунология . и шфгашонная патология" ' й Ученого ¡эта Горьковского . ЮМ ■'.эпидегжологйи :и- шкробиологий МЗ ЮР.

Цуйкиэдал Оеаовшэ рзауль»иад цродстовхаЕзш: в дао« хоцпи пссеэдршеей ¡иаккзва ' п 6 ииучшк публикациях.

СЗ^сц s стрэта^ра дасеоргвСеа. Диссертация лзлск

на.....стр. шшшошсеого текста, киаяая 25 pic. е 6 гас

и состоит па Евэдашаа, обзора лзтордтура, раздала натерпг п готодов, раздала результатов исследований , w обсуздзния результатов, влеодоз и санска литература es пстощшга.

СОДСгЛ^ПГЕ РШУГЫ.

Ksaapaasa a vsi^i 3 работа кспольгог

ujzaiï лишщ ОВД , сыа:: в соораога 6-0 кодада ез питона ¿111 СССР "Столбовая". Источшкоа штерсала' душ отос (фактора росга тз^оцатов (GPT ) сдушл Оевснвороточ супзрлахаш' { КСН ), коздвдЕюжсровадаый клвткаыа трансфор,: вшноа ликш тааагеосках нрздгестБЗШшкоа Т-лгкфоцпт ÏC.SG-I.2.0. âi-iTZSZccvh СНГ ьа оцоггзали в госте с*ЕЗ.!уля прсышфэращш И2Л0ЩГГ0В. Для этого ЕэвкишЕровашшв ее:оц гзшоа СМ хгультшаровшш в 95-лушчпшс плаваетах в ср ШШ-1640 с разведешяш КСН шш ®РТ-содергацэго иатврав полученного па различных втшаг очистки ; па â су культивировазпя в лунгш добавляли цэчвшшй трлткем ччзгц (ЗНГ), внкубарсваш ¡слэиш есд сутка , затеи собирала хьрвестэрш на стекловолошшстыэ 1^шьтра в оценивали радиоактивность па р-сщшцалляцкошса счетчшсе.

Цродуцонтш 1Ш-2-содэргащэго супврнатанта (ИЛ-2-i слупила ишишая лашя EL-4.

Шшхш селезенки и тшуса разделяли используя цито.

шноклоналышш антителами и ко.мшгемонтм , а такие дошнг

>

uthkob'jz чаглсах, нагругепшх антптэлеет it мшшнм уноглобулинам.

Очистку Фактора роста тшюцлтов проводили пооледоватоль-трштеняя шсаливаше сульфатом агаония, годь-фзлътрацтэ колонке с Ultrogel АсА 54 и гысокосфБвктшшую гшдаоснуп «атографгга (ВЭЗЗХ) в обращенных фазах на колонка ihropack С-18, хроматограф Altex. Электрофорез в циенташ голпакриледидном геле с додэцилсульфатогл lía t gel 8-25 и окраску геля серебром проводили на ашорате t system (Pharmacia).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЦДЕШЕ.

I. Получение и характеристика активного КСН.

Материалом для очистки и биологических тестов слушл зывороточшй супернатант клеток линии TC.SC-I.2.0.

Для отработки метода получения КСН, нестпмулированные гки двухсуточной культура засэвалп в различных концентра-Е - от 3-105 до ю' кл/ш, - в безсывороточнув среду . эсев клеток производили через I и 2 суток , контролируя jeспособность клеток , биологическую активность голучаемо-КСН и содержание общего белка в нем. Оптимальной получения КСН оказалась концентрация клеток ТС.SC.1.2.0. d' в мл. При такой концентрации клетки были способны энвсти два пассана в безсывороточной среде и дать экоактивный КСН содержащий небольшое количество яастного белка. Использование меньших концентраций клеток позволяло.получить- высокоактивный КСН,' при. концентрациях зше 7' 10* клетки-продуценты погибали: 'поело парного

6

uauuaaa.

Елшзютосиую сктеееость еоеуздшюго КСН сцэшаши 1зсто пвдукцип пролкфзрациа шраздвленншс нестидулированн '/л^оцятоа. В соответствии с даяни^п прадвдущгх псслэдованм ( ЕЕгазш В.П. п др. ISS9 ) КСН доз ©зависимо сгп,клиров Ешяоша ЗНГ тшоццтаыа на пятно сутка культивирован штогеш 3 форболцирнстатацета? е IUí-2 по увеличивала К Ендуцаровашой пролЕГврацш.

Для изучения дейстзкш КШ па отдельные группы тпкоциг с поз^одьз цатолзза апта-ЬЗИ4 п cnra-Lyt2 мхД в прпсутстк шшшзцэнта сшзороЕш пралпиа бана плделепа популяция дуб. отрзцательны! телоцнгоз » а такго L3'í<í- к Lyt2~- группа глз Как неразделенные телэщгш , Tas? 11 3 грушш клеток , получ шо цдтолизоа , отвечала па ПСИ. ^ровзнь Еадиакш кзт дабль-отрпцателышш тдшццтаыи прл культивировали! ш в 1 ч8н1ш 3 суток и 1Ш0 с 60 % КСН составил 1253 еш/кш , а О КСН - 164 пш/г£лн. ХЗТ4- н Ly £2- группа клеток» содзраадаэ около 35S L3S4 lyt2- тимоцнтов , дала больше значения радиоактивности , но при высоких уровнях контроля.

Нз йРТ-содераащиЕ КСН отвечает teicb субнлон лишш-п дуцэнта ОРТ , которая емэот тшоцитарное происхождение. Эт< субклон - TC.SC-I.2.0.A. был получен солокцяей на содердвд озагуанин среда п адаптацией к росту tn vivo. При шутрабр; винном введении этне клеток обработанным пристанои шакл . ыиа BALB/C они дают асцит , солидные узлы по бршине и кэ' стазируют в тшус. Эта клетки , фэнотипически сходные с кл< кала исходной линии , нэ способны продуцировать ОРТ ни сп танно , ни после стимуляции китогепаш Конй н ОГА или облу ния. Клетки TC.SC-I.2.0.A. но отвечают пролиферацией на <ЕГ. М-2 и ИЛ-З-содэркащие СН, но дозозависгаю отвечает на кон,

7

юванну® клб ткачи исходной линии среду , прячем добавление •огена не усиливает индуцированную КЬН пролиферации. КСН и -2-СН клеток линии ЕЬ-4 согместпо вызывают иощпую пролифе-(ию клеток ТС.ЗС-1.2.0.Д. , что связано , го-ввдамому , со юобностью ФРТ-КСН активировать клетки и вызывать зкстгоао-1 внсокоафшшого ИЛ-2-рецептора,

На кондиционированную клетками TC.S0-I.2-0. среду, кроме гацитов и клеток линии тикоцптарного происхождения , нключе-¡м ЗНГ отвечали клетки селезенка и лимфатических узлов. От-р бал такзе дозозависшл, но для стагфляции клеток лимф, уз-з требуются больше дозы КОН . Штогвт , ®.!А и ШГ-2 не шивают индуцированную КСН пролиферацию.

Ростовое действие КСН на клетки ли.®, узлов и селезенки, х £в , как и на тимоциты (Е.А.Процак, 1988), снизается пред-зительной обработкой клеток а-таыозином в дозах 10 и 0,1 /мл . Эта дозы а -таюзлна практически полностаю отменяют цуцированную КСН пролиферацию тимоцятов но лишь частично заают ответ на КСН сплэноцитов ж клеток лимфатических пов. Эти дшшые свидетельствует о наличии в селезенке п «5. узлах наряду с с^-ттатин-чуствительннии мишенями для й иных , отличных от прэдаествёнников Т-лшфоцитов эток-кишеней. Действительно, после разделения с помощью ннищ'а пленоцитов на и 12- популяции , обе группы эток способны отвечать шрагешоЗ пролиферацией на КСН.

Освобождение спленоцитов ( как неразделенных , так и пуляцнп ) от пршшпавдих клеток не влияло на уровень ответа КСН.

Итак , КСН-, используемый в данной работе для очистки Т, обладал ростовым действием на тимоциты, тимическпе Т4 Ьу12- предшественншш Т-лимфоцитов , трансформированную

8

линию предав ственныков Т-лшфоцитов, 1&- и 1&- ваифл селезенки и клетки лимфатических узлов. Обработка спленощ: в клеток лимф, узлов ад-тимозшюы частично отменяла росто! оффект КСН.Содэрзащий ИЛ-2 СН, цитогены п их сочетания практически не оказывали действия на индуцированную КСН I ЛЕферацию нэтршсфоршровашшх клэток-мшпеней.

2. Устойчивость КСН к хранению , нагревании и химическим агентам.

КСН хранили заыорогешшы при -70°и -20* С. Дктывшй эд риал , полученный на различных этапах очистки , храшиш зг ровенным с добавленной полиетиленгликоля 6000 или лиофсш рованньш. Замороженный КСН сохранял активность'в течении шсяцев , хранящийся при +4°С - в течение 2 недель.

КСН не терял активности при температуре +56 °С в течез 30 шш , прогревание при 56° С в течении 1часа списало рос вуо активность КСН", а нагревание до 100°С в течении 2 и полностью отменяло ФРГ-активность КСН .

ФРГ-активность не отменялась при закислении КСН до рН 3,0 и защэлачиванш до рН 11,0. Инкубация КСН с ацетош рилом и изопропенолом с последующей лисфишзацией шзива: резкое падение ростовой активности. Дополнительное снисеш активности вызывало добавление к органическим растворител! ТФУ до конечной концентрации 0.1 % ; добавление бикарбона-аммония до концентрации 30 ¡¿! на вызывало дополнительных ] терь активности .

Для определения устойчивости ФРТ-активности к обрабо' додецчлсульфатоы натрия КСН инкубировали с I Ж детергента

о о

течении 2 часов при +37 и 30 иин при 56 С . Затем из<

и

ясь от детергента ультрацэнтрифугировапием при о"о и ЗБ000 i точениэ I- часа , надосадок днализовали и , после сторили-дав , тестировали ростовую активность. Обработка додецпл-пьфатом Wa при 37' О снпнала ростовую активность в чэтнро isa, а обработка при 56 С полностью отменяла активность ФРТ [ .

Обработка трипсином при 37*С, рН 8,0 в течении 4 часов шостыо отменяла ростовую активность КСН : ковдицпоннрован-t суперпатант , вызывающий при разведении в 8 раз макси-гьный уровень пролиферации - 6621,3 ± 677,1 инпЛшн после )аботкп трипсином дает лишь 381,3 * 164,Г иш/мин при отри-•ельном контроле ( пролиферация в ответ на НПО , инкубиро-шую как п образцы КСН , с трипсином и , затем , с соевым т!битором трипсина ) - 225,0 * 80,6 иш/мин.

КонА способен связывать ростовой фактор из КСН : после субации 10 мл КСН с О,Б мл плотного осадка КонА-сефарозы в гение 30 мин при +4°С кидкая фаза лишалась ростовой актив-)ти - активность КСН до инкубации составляла 6621,3 *577,1 х/мин , а после инкубации лишь 187,7 - Б4,8 ими/мин т.е. не шчалась по ростовой активности от НПО.

Итак, до начала очистки было установлено , что носителем Г-активности является относительно устойчивая к нагреванию и ре щи среда , переносящая действие додецилсульфата натрия, ор-шческих растворителей.и лиофилизацию молекула ( молекулы ). чуствительности к трипсину было установлено, что ФРГ - по-тептид ( или полипептиды } , содержащий доступные ферменту гатки лизина и/или аргинина. Судя по связывании с КонА мо-

гула содержит углеводный компонент

■"

3. Очистка ©РТ. Высаливание , гель-©ш>трация.

В качестве начального стала очистки ш нспользо! высаливание сульфатом амшния. СРГ-активность определяла« црецшитате белков , выпадавшем в интервалэ концонтрг сульфата аммония 40-80 5 от насыщения. Получег высаляваннои катериал содержал 55 % исходной активности ; каждого литра КСН , содержащего 360 мг белка , ш получг активный препарат малого объема содержащий 2,65 иг бела Полученной высаливанием препарат разделяли гелы|ылы даей на колошсе размерам 0,7 на 85 см с Ш1;го£е1 ДсА54. в геоео буфере рН 7,2 о 0,15 I! ЫаС1 ; скорость потока -ид/час.

Биологическая активность выходила с колонки двумя бс шши пиками „ кроме того слабая активность определялась в ке белка , выходящего после свободного объема колонки. празентатнБная хроматогракма с графиком активности фракци определенной в стандартной пятисуточнозл тесте птетфэраи ткиоцитов , представлена на рис.1.

Цра разделении гель-фильтрацией материала из I л КСН дерващего 860 иг белке , фракции пика I ( сы. рис.1 ) сод вали ЗЗОмсг белка , а фракция пика 2 - 210«о1.

4. Ростовые свойства полученных гель-фольтрацлей активных фракций.

Наш исследовалась динамика включения ЗНГ тимоцитаьш ответ на материал активных фракций, ростовой вффект фракц на клетки селезенки н лимфатических узлов , действие актив фракций на различные клетки-мишени в присутствии ИЛ-2-СН

?ио.1. Гель-фильтрация <1РГ~содераащего препарата. На рис, -ттическая плотность элюага (1) и ростовая активность фракций. 1о оси абоцисс - номера фракций, по оси ординат - вклвчение ¡ечзнного тимвдина тимоцитаки и оптическая плотность*

'ис.2. ВЭЮС ФРГ-содержащего препарата. Кривая - оптическая ¡лотность при 210 нм, пунктирная линия - концентрация ацето» штрила , гистограмма - ФРТ-активность фракций.

У

возможность сшергичного действия материала двух rpyi активных фракций на тимоциты.

Для исследования динамики ростового действия получений] гель-фальтрациёй активного материала тимоциты культивировав с сериями разведений стерильных проб активных фракци! Меченный тимидин добавляли на 20 часов через 72 , 96 , 120 , 144 и 168 часов после начала культивирования. Проведенш исследования показали, что активность материала двух , разд( ленных гельфильграцией пиков , характеризуется различие динамикой действия на клетки тимуса : добавление материал пика I вызывает максимальное включение метки спустя трс суток после начала эксперимента , а при стимуляции материале гака 2 - спустя 6 суток.

Субоптимальные дозы КонА , а также <ША не вызывали достоверных изменений пролиферации , индуцированной материалом обоих пиков активности.

При совместной стимуляции тимоцитов материалом o6ei групп активных фракций результат ( включение ЗНТ ) равнял; уровню суммации ответов на соответствующие концентрации прс материала пиков 1,2.

Для изучения совместного действия ИЛ-2 и материала актш ных фракций, разделенных гель-фильтрацией , тимоциты 3aceBaj в лунки 96-луночных шейтов с ИЛ-2-содержащим СН ( 25 , 17 j 12 % ШГ-2-СН в лунке ), с 0,5 мкг/мл КонА и с различными ко. чествами материала обоих пиков. Радиоактивную метку дoбaвляJ после 72 , 96 и 144 часов культивирования.

Поставленные эксперименты показали , что материал полученный с. помощью ;;тёль-фильтрации; ;и- ИЛ-2 • синергич! стимулирует. • ¡ .'(- ИЬ-Й

•s»M л Hoi\-) превышав * уровень--суммации 'отделы

пета стимуляторов пролиферации для материала шка I - в 7,2 за , для шка 2 - в 10,6 раз ). Максимум пролзЕератлвгого сэта тпмоцитов па материал пика I п 11Л-2 + КонА проходится пятые сутки культивирования , а для материала щпса 2 - па дылыо сутотц^. Суперпатвнт гнбрадомн 7В4 , секретпрувщей титела бжкирущиз ¡1/Т-2-рэцоптор , полпосты) оп'эпял аффект пэргсгшого действия 11Л-2-содэр=ацэго СН илатерпала пиков I 2.

Носгсядуларованпыэ влекся селезенки отвечает пролЕфэраца-па материал обоих шпюв еоташюстп. Шьдашшэ ЗНГ определи па 5 сутки культивирования. Материал первого пшса ока-лся сффонтпвноэ в стимуляции пролиферации неразделенных еэ-Е.5улпровашшх степощпго .

Ростовое дойстеиэ полученных гэль-фш.трацп9й пшсов ая-ппостп тестировали такгэ на разделенных понншгои п осво-эдеппых от пршшпащнх к пластшсу клеток сплепоцитах. До-влеше зни проводили прз тестировании пшса I па 4 сутки льтншрованпя, а для пшса 2 — на 6 сутки. Материал пшса I пивал выраженную продпфэрацшо как 1д- , тшс и сигош-тов .

Действие материала шка 2 было ограничено 1&- популяцией лэноцотов . Дозы материала пшса 2 , шзыващпе слабую шуляцшо пролиферации неразделенных л 12- спленоцитов , вместно с ШГ-2-СН эффективно стимулируют рост этих клеток, овепь ответа на сочетайте действие материала пшса 2 и -2-СН превышает уровень суммациа аффектов эткх стимуляторов ста. Материал пика 2 ш самостоятельно , ни в сочетании о -2-СИ не способен стимулировать рост I®- популяции сплэ-цитов.

Материал пика I вызывал усиление пролиферации нестнмули-

(V

реванша клеток лимфатических узлов , добавление ИЛ-2-СН зв чительно усиливало ответ лимфоцитов на материал пика Материал пика 2 оказался неэффективен при стимуляции рос не активированных клеток лимфатических узлов.В экспериментах ИЛ-2-содертщгш СН материал пика 2 вызывал увеличение ответ лимфоцитов на ИЛ-2-СН .

Таким образом ш установили , что материал двух пиков активности , разделенных гель-фильтрацией , обладает равл ными биологическими свойствами. Материал шка I стшулиру пролиферацию не активированных паюцитов , клеток лимфатич них узлов , 1&- и спленоцптов ; ростовое действие это: материала было сиыергично с ИЛ-2 , максимум цролифератнвно: ответа приходился на 4 сутки после стимуляции. Материал шг 2 сталирует включение ЗНГ нэсти^улированйшп тимоцитата спленоцнташ , действие его также ешэргкчно с ИЛ-2 ( ц этом стимулируются и клетки лимфатических узлов , максим; ответа приходится на 7 сутки ( 144 часа ) после стшулящ В ходе биологических исследований разделенного материала было установлено , что очистка еппеноцитов от щешпышф клетск значительно увеличивает ростовой эффект пика I. П] тестировании негодного КСН и фракций после гель-фильтрации ) спленоцитах лишенных прнлшагщих к пластику клэток выход I тиеносте составляет 35 % . При этом подавлящзе количеств ростовой активности сосредоточено в пике I. Для дальней® очистки ш использовали объединенные фракции пика I I только из-за большей активности этого материала , но из-за того , что бго биологические свойства , как нам кагет< более соответствуют активности исходного КСН (ФРГ).

5. О^пстгл $РТ. ЕЭГИ.

Поснгз голь-фмьтрацап фракции первого шка актпЕностп йштогра(£зрозапа ка обратвофазовой ВЗЯХ колонке Synchropacli I длкпоа 25 и дижэтрои 0,4 c:i с р2к:.:зрс!Л гранул Бг-хл п ;:;этро:з гор ЕО ¿. Хроматогрефзгэ проводила в щелочной буфэр-t снстсга» оцотоштрзл - SO iüJ бикарбонат натрпя.

Бал проведан ряд пробшг аналитических хроматографа!! о iвз количеством активного затерзала. Фракция собирали вруч-I , лпофялзззровали , а тестировала на ФРТ-еютхвность. одэ пробных хроглатсгсргфзЭ бал вдентефацирован пик оттачес-пяотаого пря К 212 ей иатерзвла ассоциированный с СРГ-ак-•тосгп , а теязэ бала оптпалзпровваа прогребла градиентной юция.

По отработанной прогрвгз било проведано нзсколыга прз-¡а-тлнвых зроглатогргфсЭ в ходе которых был разделен ФРТ-со-ишщй материал ошценннй гель-фзльтрациэй в общей слоз-!ти нз 5,5 л КСН. Во всех экспериментах (5 ВЭНХ) активность удалялась в пике оптически-плотного материала , выходящего шонки при 23,1 % ацетонитрила в элюате . В двух експерз-:тах ( 2 ЕЭНХ. материала пз одной портш КСН объемом 3,5 л ) авность <ЕРТ бала обнаружена такяэ в пике , выходящем при % ацетопитрпла. Оба пшса обладали сходной ростовой актив-тьв определяемой на тпмоцатах п спденоцитах п содержала О ( первый пак ) п 1420 ( второй пик ) единиц ФРТ ( рис.

Материал (йрвкций N 2, 3, 4 и 5 ВЭЯХ на Synchropaclt С-4 гл. ряс. 2 ) анализировали с помощью ДСН-элэктрофореза в даентном подиакриламидаш геле päst Gel 8-25 па аппарате at System. После электрофореза гель окрашивали серебром па

I ь

тоа сэ вшюрато. Элэктрофорои показал , что сосоциирозенгай активностью шк содержит балок с Ш 22кД.

С втазлз дянннмн согласуются рэзультага вксииришита щ котором посла электрофореза ®РГ частично очищенного с покое гель-фзльтрацип п ионообменной хроматогрЕфш в 12 2 поли« ршламадноа гелэ с ДСП., гель ( крота трака с марнораш ма разрезала на сепланта , содержащееся в пак. белки вллюзроввл диалпзовзлн п опродэляла их ростовую активность. Активность определялась в сегкзпте, соответствующем молекулярной массо 20 кД . Незначительное различие в 133 когно объяснить разным

о

условиями обработки образца ДСН - 37 С , 2 часа ( 20 1хД ) и 66 0 , I час ( 22 кД ).

Активный пик ВЭНХ, как иоено судить по электрофорезу, содержит 4,8 нг ©РТ. В таком случае данные по очистке ФРГ можно представить в виде следующей таблицы о"

Таблица I. Очистка ФРГ.

Этап очистки Кол. ФРТ-актив- % выхо- Удельная Факто] балка ность да ФРГ активн. очистс (иг) . (ед.) (ед/мг) *

исходный КСН

высаливание

гель-фмьтр.

ВЭКХ, электрофорез »»*

1660 9,28

280003 154000

0,98 100800 -6

4,8 »10 .13700

100 55

36** 5,9

17^9

к

6,03 10 3,28-10

.9

I

92,4 567,£

2,89 »10 1,92*1С

* Фактор очистки - отношение количества белка активных фракций к исходному количеству белка умноженное на 'долю выхода активности.

** 36 % - выход активности по тестированию на неприлипанщщ сцлоноцитах ,г

з Дпзшо оплешзазт толысо пас I ; сук.:арная сготшпость 1юв I 3 2 составляет 27900од. - 9,9 3 исходшл! колпчэст-

в. 1ЕрШ£Т0рЗССТШ росгошз ЕКГЯШОСТП очинённого препарата 0PT.

Затерзал , очпцэнный с пс::одьэ ШЖ , стгзфлпруот пролп-рацпэ взшстпЕзрованшз: тилоцатов . Дозовйя эавзспиость лвчепая 31ГГ от концентрацпп SPT п срэдо приведена па рлс. 3

fSiroreix НспА. в пспользовепенх пest дозах от 0,6 до 2 rtin а двух псстав^эншж експерзлэптах по еызнвйл усиления элкЛэраирн тгодуцпрозсвпоЗ очщвшзна СЕТ ( рпс. 4 ). CÍA в гат. Б п 10 пгЛ'л saica еэ оказывал влшшпя на SFI-шдуциро-шу?э прояЕфэргщга тамоцатов ( рпс. 4 ).

Отгг.ошшЯ с по'.гоцьз БЭШХ СГРГ в®эктнвяо сгЕДуллруе? )лг.л-эрацка иеактишроваиЕшс пораздэлзшшх сшшпощпов ; гпсгзлэсть ыипяензя 2ПТ сплзпсцзтгтгл от копцентравда оттого ОРТ подобна tekoeoü дал таацатов ( ряс. з ).

* -

Прл разделении сплэпоцэтоз па Ig- п Ig- популяции , на ? отвечает кдэтгш обоих популяций , Ig- клаткя пятепсзшео • шэтоа шишч&эт ЗЕТ в ответ па оданаковно Дозы SPT

ФРГ „ очпгрпный БЗЖ , не поддоргэвает длптельшй рост п симулирует шшнэниэ ЗКЕ клзткапа ШЕ-2/Ш1-4-завзсг>гаа лп-[ СТЫг-2 . Антитела , блокарущие функции IUI-2-P п 1Ш-4 в ¡активных концептрацплх по сжаавт пролЕферативный отеэт юцнтов п сплэвовдтов на полученный препарат ФРГ ( рас. 4 ).

Твкпы образом , очщеншй наш ФРГ обладает прямым ísito-шш действием на метки тимуса и селезенки , его ростовая двшрть очень велика - 2,8 *ю'ед/мг. Полученный ыамз 1«

ит/наи

оииоГ^

Рис, 3. Дозов^я.зависимость пролиферации тимоцигов (I) и спленоцитов (2^ от концентрации очищенного ФРГ. По оси абсциос - концентрация §РТ в пикограммах на мл, по оси ординат - включение меченного тимвдина. ГЬризонгальная лт уровень спонтанной пролиферации клеток.

т^т-

1

N

N

\

I

5

I

Рис. Ростовое действие очищенного ФРТ. (I) и .ФРТ совмбстш о .КЯ)А С2. и 3), -ФЛА \Ч), с антителами к ИД-4 (5) и ИД-2-ре-ментору (б). Заштоиховинная чисть гистограмм - пролиферации г.чаток без-ФРТ. :Ь осц о^.т-'нат - гклсчгнж'.Зн-гишмию«

¡з" '

реиарат ФРГ не обладает специфтской активностью ИЛ-2 , не одержит Ш-4 , ростовое действие ФРТ не опосредуется продук-ией и рецепцией этих лимфокинов.

Биологическая активность ФРГ отлична от активностей опи-анных цитокинов , способных симулировать рост тимоцитов и пленоцитов. Уникальным для ФРТ является не набор клеткок-шшеней, но характер ростового действия на эти мишени -[юсобность стимулировать пролиферацию не активированных итоговом или 5МА клеток . ИЛ-7 , стимулирующий рост ранних редшественников Т~ и В-лимфоцитов и зрелых Т-клеток, способен гимуларовать пролиферацию предшественников без дополнн-эльной активации (34), по , в отличив от ФРГ , присутствие иогена резко усиливает пролиферацию и , кроме того , ИЛ-7 >з митогена не способен стимулировать рост клеток селезенки: дерзание предшественников-мишеней для ИЛ-7 в этом органе »достаточно для регистрации их ответа, в то время как зрелые -клетки отвечают на ИЛ-7 лишь в присутствии митогена.

ВЫВОДЫ.

С помощь» гель~фда>трации а высокоаффэктивной гидкосной оматографиа в обращенных фазах проведена очистка фактора ста тимоцитов из безсывороточной надосадочной падкости клеток (ши ТС.БС~1.2.0.

Фактор роста тимоцитов является гликопротеидом с ивкулярной массой 22 КО.

Активность очищенного фактора роста тимоцитов

цобна. , на; ; . не' идентична ростовой активности

содной на.цисидочной жидкости .клеток линий. ТС'; БС-|. 2.0*.

адиШшй 1фк1шрат стимулирует Ш-2- л ШМ-шзавцсшуя про-

[*<рацию нишч'ишрованных тимоцитов и спленоцитов. В отли-

2й

чиэ от исходной нвдосадочной еидкости, фактор роста титлом

тов стимулирует пролиферации клеток-мишеней сшюргично с Ш

и ш содержит ИЛ-2, Как и исходная надосадочнии жидкость щ " парат не содержит ИЛ-4. 4. Мишоняш для фактора роста тимоцитов являются ЬЗТ1 Lj

предшественники Т-лшфоцитов в тимусе , тишзин-чуствталы

+

предаэствэшшки Т-лшфоцитов и Ig - и Ig -лимфоциты в салег 6. По биологическим свойствам очищенный нами фактор pot тимоцитов отличен от описанных цитокинов , способных ctem/j ровать рост тимоцитов и сшшоцитов.

Список работ , опубликованных по теые диссертаций.

1. Процак Е.А., Талаев B.D., Шчкин В.П., Яршшн A.J Биологические эффекты п физико-химическая характерися фактора роста тимоцитов. Тезисы доклада Всесоюзного совэщш "Биология клетки в культуре", Ленинград, 1987, Цитолог)

1987, т.29, И Э, с. IIGI.

2. Яршшн A.A., Шзчкин В.П., Шрошеченко И.В., Шарова Н.1 Процак Е.А., Талаев В.Ю., Продукты предшественник! Т-лшфоцитов, регулирущиегвмопоэз и лимфопоэз. Тез; доклада симпозиума с ыэвдународным участием "Структур биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной систем; Пущине, 1987, с. 37.

3. Шичкив В.П., Ярилид A.A., Процак Е.А., Талаев В. Продукция, биологические свойства и фмзико-химичес характеристика фактора роста тимоцитов, секретируемого лин внутритимусных предшественников Т-лимфоцитов. Иммунолог

1988, N 6, с. 21-26.

4. И.В. Мирошнечанко, Н.И. Шарова, A.A. Ярилии, В.Ю. Талае

'азделепш} факторов, рогулпрувдях солозвночпоо колонсеобразо-!вппа п дольЕойзая характеристика их эффэктов. Шмунодогпя, Э89, ÏI 3, С. 36-37.

. Yarllin A.A., Mlroataechanto I.V., Sharova îi.I., îalaev Л., Blablnlna I.D., Shlchkin 7 .P., Production of factor tlEulatlng aplenlo colony foimtion by Ъопе шгтоя and atrathyiaic prccrurooro of T-lymphocyta. Biomed Scl., 19«), .1, H 2, p. 112-117.

■ ShlcKfcln V.P., Yarllln A.A., Protest E.A., Talaev 7.Y., >11в of lntratbymlo T-lymptocyte precursor cell lines ïcrste gro?7t factor for unstipulated PHA+ thymocytes THCT. ir. J. 1шшпо1., submitted.

СТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ BOHU АМН СССР

П.'К ПЕЧАТИ 25.9.90 Л -

3AK.5J6 ТИРАЖУ^ОО