Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ активационного статуса тимоцитов человека

4% ^

\ МННМПТР

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ '• '

На правах рукописи

СИРИНА Елена Георгиевна АНАЛИЗ АКТИВАДИОННОГО СТАТУСА 7ИМОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА 14.00.36. - Аллергология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1994

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздравмедпрома Российской Федерации.

Научный руководитель академик АЕН России, профессор, доктор медицинских наук Ярилин А.А

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Лесков В. П.,

член-корреспондент АЕН России, профессор, доктор медицинских наук Ковальчук Л. В.

Ведущая организация - МШШ та. Г.Н.Габричевского

Защита состоится "..."............ 1994 г. в..... часов на

заседании 'специализированного совета Д.084.66.02 при НИИ Физико-химической медицины Минздравмедпрома РФ по адресу. Москва» ул. И. Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физико-химической медицины Минздравмедпрома РФ.

Автореферат разослан "..." ............... 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Васильева Л. Л.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проблема активации лимфоцитов, в особенности Т-клеток. занимает одно из центральных мест в современной иммунологии. Это связано прежде всего с тем, что активация лимфоидных клеток лежит в основе любой формы иммунного ответа,' и. умение регулировать активацию лимфоцитов означает овладение основами контроля над иммунным ответом.

Хотя основным аспектом изучения активации Т-лимфоцлтов остается исследование процессов, включаемых антигенами, их взаимодействием с Т-клеточным рецептором [классической активации по терминологии КеШйегг Е. Ь.. 1985], все большее внимание в настоят щее время уделяется так называемой альтернативной активации. Она осуществляется в результате действия сигналов (как,правило, комплексных) на мембранные структуры Т-клеток, не связанные непосредственно с рецептором для антигена. Большей частью это - адгезивные молекулы [Ата12-Ш1епа е1 а1., 1992]. Очевидно, именно адгезивные взаимодействия между клетками, а также между клетками и межклеточным матршгом являются причиной эндогенной "спонтан-» ной" активации лимфоцитов, ■ которая, в свою очередь, может стать основой развития лимфопролиферативных процессов. Условия формирования этого типа активации и комбинации сигналов, необходимые для развития активационногз процесса, завершающегося секрецией цито-кинов и пролиферацией клеток, практически не изучены.

Тимус - орган, в котором осуществляются основные этапы развития тимоцитов, - является тем местом в оргаиизм.е, в котором эндогенная активация является обязательным условием осуществления важнейших процессов, таких как положительная и отрицательная селекция клонов тимоцитов [БсоИау й. е1 а1..1988, Ярилин А.А. и др.,1991]. В связи с этим тимоциты являются удобной модельв для изучения процессов эндогенной активации и анализа структуры комплексных активационных сигналов. Особый интерес представляет вопрос о формировании способности к активации и требованиях к набору активационных сигналов в процессе дифференцировки клеток Т-ряда.

В настоящее время место основного объекта иммунологии все более уверенно занимает иммунная система человека. В связи с этим специальный интерес представляет изучение обозначенных выше проблем на клетках и органах человека, в частности, на клетках человеческого тимуса. Помимо анализа чисто познавательных задач это существенно з связи с возможностью приблизиться к решению прик-

ладных вопросов, имеющих отношение к контролю активации Т-лимфоцитов человека, в частности, в условиях патологии.

Исходя из вышесказанного, можно заключить, что актуальность исследования активации тимоцитов человека обусловлена как важностью для фундаментальной иммунологии анализа условий и проявлений активации Т-лимфоцитов, в частности, эндогенной активации тимоцитов, так и практической перспективностью изучения этого вопроса в связи с необходимостью разработки методов контроля активации Т-лимфоцитов в рамках проблем иммунорегуляции и онкогенеза.

Целью данного диссертационного исследования было изучение проявлений эндогенной активации тимоцитов, особенностей индукции пролиферативной реакции фракционированных клеток тимуса, а также характеристика некоторых биологически активных продуктов этих клеток.

Для реализации этой цели нами решались следующие задачи.

1. Фракционирование тимоцитов на основе различий по плотности и адгезии к эритроцитам.

2. Характеристика морфологических особенностей, антигенного и ферментативного фенотипа фракционированных клеток.

3. Изучение особенностей действия митогенов, их кофакторов, цитонинов и пептидов тимуса на фракционированные тимоциты.

4. Анализ особенностей активации фракционированных тимоцитов по классическому и альтернативному путям.

5. Изучение биологической активности (ростстимулирующей и регулирующей гемопоэз) продуктов тимоцитов.

Новизна и научная значимость результатов. В работе впервые представлена развернутая характеристика мембранных антигенов и ферментативного спектра тимоцитов человека. Фракционированных по плотности и адгезии к эритроцитам.

Хотя в литературе имеются сведения сб ответе тимоцитов и их фракций на штогены и цитокины, комплексная картина реактивности клеток тимуса человека, разделенных по плотности и адгезии к эритроцитам, представлена в данной работе впервые. Новыми являются данные о митогенном действии на тимоциты человека и их фракции препаратов пептидов тимуса, а также контактов с гомологичными эритроцитами.

Нами впервые получены сведения о выработке тимоцитами человека факторов, оказывающих усиливающее и угнетающее влияние на реакции гемопоэза, по-видимому, аналогичных факторам со сходным

действием, вырабатываемым предшественниками Т-лимфоцнтов мышей...

В целом в работе впервые охарактеризованы условия индукции 1 пролиферативных реакций Фракционированных тимоцитов человека, отличающихся по уровню эндогенной активации., что и определяет научную значимость данного исследования.

Практическая значимость работы. Несмотря на фундаментально-научную ориентацию исследования, работа имеет перспективы практического применения. Они связаны, в первую очередь, с принципиальной возможностью использования обнаруженных нами гумораль-. ных продуктов тимоцитов человека, стимулирующих и ингнбирующих \ селезеночное колониеобразование, для контроля гемопоэза.

Разработанные и модифицированные методы Фракционирования ти^ . моцитов человека, а также их активации (в частности, классической ■ и альтернативной, использование для стимуляции тимоцитов человека пептидов тимуса) могут быть использованы в лабораторной практике.

Положения, выносимые на защиту.

1. При фракционировании тимоцитов человека в градиенте плотности перколла происходит разделение клеток, отличающихся как по' степени активации, так и по стадии развития; при этом легкая фракция обогащается эндогенно активированными и наиболее юными формами тимоцитов, включая предшественники Т-лимфоцитов.•При ос- . во вождении от Е-розегкообразущих клеток происходит обогащение юными, но не активированными клетками.

2. Спектр и уровень активности гликозидаз и протеиназ монет служить харатеристикой степени зрелости и активации тимоцитов.

3. Для тимоцитов человека характерен слабый уровень ответа на стимуляторы Т-клегок, несколько повышающийся при добавлении интерлейкина-2. Клетки легкой фракции отвечают пролиферацией, на прямое действие интерлейкина-2, тимусных пептидов и на взаимодействие с эритроцитами человека.

4. Тимоциты легкой фракции спонтанно продуцируют факторы, влияющие на колониеобразующую активность клеток костного мозга мыши и пролиферацию тимоцитов человека.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на XI научную конференцию "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояни7 ях" (г. Челябинск, 1992), апробированы на заседаниях секции N 2 Ученого Совета Института иммунологии и научных семинарах лаборатории "Дифференцировки тимоцитов".

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы: журнальная статья и 1 тезисы доклада; 2 статьи приняты к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на QL страницах машинописного текста . состоит из введения, обзора литературы. главы материалов и методов, двух глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 132 источника, в том числе 30 отечественных авторов. Диссертация документирована 14 таблицами и иллюстрирована 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовались кусочки "тимуса человека, которые удалялись в ходе операции у детей для обеспечения доступа к сердцу (Институт сердечно-сосудистой хирургии им. Бакулева), а также маши (CBAxC57BL/6J)Fl, самцы, массой 18-20 г, полученные из питомников "Центральный" РАН и "Столбовая" РАМН.

Разделение суспензии тимоцитов человека в трехступенчатом градиенте плотности перколла проводили методом центрифугирования (80Og, 15 мин) с использованием 40, 50 и бОЖ-ных растворов изотонического перколла ("Pharmacia") на 10% полной питательной среде, удельная плотность которых равна 1.05В, 1.064 и 1.077 г/л соответственно. Содержание в полученных фракциях бластных клеток, больших, средних л малих лимфоцитов оценивали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Освобождение тимоцитов от клеток, образующих розетки с эритроцитами барана (Е-РОК). достигалось (с равным успехом) двумя путями : а) с помощью пеннинга на чашках Петри, нагруженных фиксированными на них эритроцитами барана; в надосадочной жидкости при этом оставались Е-РОК- -тимоциты: б) осаждением предобразованных розеток путем центрифугирования над слоем фиколла-пака (р= 1.077 г/л): в этих условиях Е-РОК оказывались в донной фракции, увлекаемые прилипшими эритроцитами, а в интерфазе оставались Е-РОК--тимоциты. ^ .

Мембранные маркеры клеток (CD1, CD2, CD3, CD4. CD8) определяли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием монок-лональных антител (ИК044, ЛТ2. ИК090, ЛТ4, ЛТд) на проточном.ци-тофлуориметре Eplcs-C.

• В тимоцитах и их фракциях оценивали активности гликозидаз

ft ■s

S

итэхнэиииУгэв ммн нэ пыгяо

t31 OJ/Э V "Я "S

Vs ■p

V £ b- <j)

§ I

f

^ ¿ ti

L+.

o TI

CÇ a> СО

,0-

X

■X

o

5

<8

o —'

>

0

s

iO ÛJ

c;

QJ d

fc

1

i

<U

H

и

Ú S O-

(шести кислых лизосомных и одной нейтральной цитозольной) по гидролизу соответствугаих 4-мегилумбеллиферилгликозидов ("KochLight", "Serva") [Преображенская М. Е. и др. ,1991] и пептидаз (ди-пептидиламинопептидазы IV, активатора плазминогена. катепсинов В и L, лейцинаминопептидазы) по гидролизу специфических флуороген-ных субстратов 7-амино-4-иетил-кумариламидов [Локшяка Л. А. и др., 1993]. Активность ферментов выражали в нмоль/мин на 1СГ8 клеток.

Основой оценки активации тимоцитов и их фракций биостимуляторами служила реакция Оластной трансформации клеток тимуса, определяемая по включению ЗлН-тамидина. Клетки культивировали в количестве 1x1О^б на лунку в 10% полной питательной среде. В качестве стимуляторов и костимуляторов использовали фитогемагглюти-нин (ФГА, форма Р, "Dlfco") -1,5. 10 мкг/мл; форбол-12-мирис-тат-13-ацетат (ФМА. "Sigma") - 1. 10, 25 нг/мл; кальциевый ионо-фор А23187 ("Signa") - 1 мкг/мл, рекомбинантньй интерлейкин 2 (рИЛ-2; "Calblochem"! - 1.6 ед/мкл, МАТ к CD3 (ИК0-90) в разведении 1:1200, эритроциты человека (ЧелЭр) в соотношении к тимоцитам 10:1. тикалин (Ленагропром) - 1, 10, 50 икг/мл. тактивин (НИИ ФХИ НЗ РФ) - 0.1. 1,10 мкг/мл. В случае стимуляции тималмном и так-тивином время культивирования составляло 24 часа, в остальных случаях - 72 часа. За 18 часов (за 4 часа - для гормонов тимуса) до окончания культивирования в лунки вносили 37 мБк (1 мкКи) ЗлН-тимидина. Клетки собирали с помощью харвестера ("Tltertek") на стекловолокнистые фильтры ("Flow Labs"). Включение 3~Н-тимиди-на измеряли на ß-счетчике "ß -Trac".

Изучение биологической активности, регулирующей гемопоэз, в надосадках легкой фракции и нефракционированлых тимоцитов определяли в тесте селезеночного колониеобразования (КОЕс) по методу Till J.E. и McCulloch Е.А., 1961. Принципиальная схема опыта представлена на рис. 1. Мишам-реципиентам, оСлученным в летальной дозе, вводили раздельно или совместно клетки фракций костного мозга, обогащенных стволовыми элементами (SCI- Thyl- -фенотипа) или ПТЛ (клетки SC1+ -фенотипа) в сочетании с надосадками тимоцитов человека. Клетки костного мозга вводились в дозах, соответствующих их выходу в процессе фракционирования 10"5 клеток. Надо-садки добавляли в концентрации 50, 5. 0.5 и 0. 0535, считая за 100% надосадок от 1-2х10~5 кп/мл. На 9-й день мышей забивали и визуально подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Фракционирование титанитов и характеристика морфологических особенностей, антигенного и Ферментативного Фенотипа Фракционированных клеток.

В качестве основного подхода к разделению тимоцитов было использовано центрифугирование в градиенте плотности перколла. Распределение клеток по фракциям составляло (после вычата потерь): над слоем плотностью 1.056 - 3%, над слоем 1:064 - 3%, над слоен 1.077 - 24%, б донной фракции - 71%. Жизнеспособность наиболее легкой Фракции (над слоем плотностью 1.056) была ниже 50%, в связи с чек эти клетки были исключены из дальнейшего исследования. Жизнеспособность клеток других фракций составляла 85% и выше. В дальнейшем мы будем обозначать фракции над слоями 1.064, 1.077 и донную как.легку», среднюю (или промежуточную) и тяжелую соответственно.

Результаты оценки мембранных маркеров во Фракциях тимоцитов отражены в таблице 1. Эти данные свидетельствуют о том. что легкая фракция тимоцитов 3-кратно обогащена CD4-CC8- -клетками, т.е.' предшественниками Т-лимфоцитов. а танке клетками с низкой экспрессией антигенов CD4 и CD8. свойственной юным кортикальным CD4+CD8+ -клеткам (С04~1оС08л1о). В этой фракции снижено также содержание CD3+ и CD2+ -лимфоцитов. Во Фракции тяжелых тимоцитов содержание CD4-CD8- -клеток, наоборот, уменьшено по сравнению с нефракционирован.чой популяций; в промежуточной фракция снижено число CD4+ и CD8»- -клеток, но содержание CD4-CD8- -клеток не увеличено.

Морфологическое изучение (рис.2) показало, что бластные формы тимоцитов [2% от общего количества тимоцитов) сосредоточены в легкой (9%) и промежуточной (2%) фракциях и отсутствуют в тяжелой донной фракции. Большие и средние тимоциты составляют половину клеток в легкой и треть - в промежуточной фракции, тогда как в донной фракции на их долю приходится лишь 5% клеток. Таким образом. легкая фракция представлена по преимуществу крупными гю размерам CD4-CD8- и CD4"loCD8^1o тимоцитами, т. е. юными формами клеток Т-ряда с признаками эндогенной активации, тяжелая Фракция содержит почта исключительно малые тимоциты, в основном CD4+CD8+

Таблица 1. Характеристика фракций тимоцитов по поверхностным маркерам.

Фракция

Содержание клеток, несущих маркеры Ж, (М ± и)

СЕ4+ С08+ СБ4-8- СБЗ+ С02+ 1 С 04 С08

Нефракцио-|

нированные|

тнмоциты | 82+2 83+1 7+1 63+5 94+1 1 112+6 122+5

Легкая | 66+5* 64+3* 22+12 52+9 78±2** I 98+5 103+4

Средняя | 71+3* 67+4» 7+2 70+11 95+2 I 106+8 120+9 '

Тяжелая | 74+3 88+3 4+2 55+11 95+2 I 99+4 122+11

Е-РОК- | 73+13 75+10 16+3*** 64+6 86+6***I 75+9 85+8***

Интенсивность флуоресценции, усл. ед.

Для какдой группы представлены результаты 3-22 наблюдений.

* р<0.001, »* р<0.01. *** р<0.05 по сравнению с нефракциони-

рованнымн тимоцитами.

ш -

Рас. Я. Распределение ткиоцитов по размерам со С-ракциях тшзцитов человека, полученных при центрифугировании в градиенте плотности перкслла.

1 - нефракционнрованнае тимоциты. 2 - легкая Фракция. 3 - средняя Фракция. »- тяжелая фракция.

I - бласты. II - больше и средине лимфоциты. III - майе тгсюцюи. . .

-фенотипа, а средняя фракция занимает по своему клеточному составу промежуточное положение.

Выделение тимоцнтов. не способных формировать розетки с эритроцитами барана (Е-РОК—фракции), было предпринято с целью обогащения тимоцитов юными формами без обогащения активированными клетками. Действительно, освобождение тимоцитов от Е-розс"'^образующих клеток приводит к их обогащению СВ4-СБ8- -лимфоцитами и клетками с низкой экспрессией этих антигенов (табл.1), что сближает Е-РОК- -тимоциты с клетками легкой фракции.

Ранее при изучении клеток, выделенных от больных с различными лимфопролиферативнкми заболеваниями, было установлено [Преображенская И.Е. и др.,1991; Локшина Л.А. и др.,1993], что активность гликозидаз л пептидаз, особенно лизосомальных. максимальна в наиболее молоды?: клетках - общих лимфоидных предшественниках и самых юных формах лимфоцитов Г-ряда, соответствующих СБ4-С08~ -предшественникам Т-лимфоцитов. а также в клетках, несущих маркеры активации (например. ША-ПН). У более зрелых клеток активность ферментов была, как правило, ниже.

Изучение спектра гликозидаз во фракциях тимоцитов показало, что активность этих ферментов наиболее высока в клетках легкой фракции (рис. 3). При этом оказалось, что степень обогащения в легких клетках наиболее велика для а-О-каннозидазы и а-Ь-Фукози-дазы.

Активность ферментов в Е-РОК- -фракции существенно ниже, чей в легкзй. и отнюдь не всегда превосходит активность в нефракцио-ннрованных тимоцитах. С другой стороны, такой признак, как избирательное увеличение как в легкой, так и в Е-РОК—фракциях активности с-Э-маннозидазы и а-Ь-фукозидазы. может быть обусловлен обогащением обеих Фракций юными формами тимоцитов вне зависимости от степени их активации.

Аналогичные данные относительно пептидаз более трудны для интерпретации в связи с разнон^правленностью изменений их уровня во фракциях тимоцитов различной плотности. Тем не менее, при анализе показателей активности этих Ферментов максимальные значения получены преимущественно для клеток легкой фракции.

Таким образом, при фракционировании тимоцитов человека в градиенте плотности перколла происходит разделение клеток, отличающихся по степени активации, стадии развития и уровню активности ферментов. При этом легкая фракция обогащается наиболее юными

Рис. 3. Активность гликоэидаз во фракциях тимоцитов, выраженная в ед. активности на 10А8 клеток.

I - d-D-машозидаза; II - s-D-глшуронидаза; III - fl-D-ra-лактозидаза; IV - ü-L-фукозидаза; V - я-Б-гл^козидаза (кислая); VI - ü-Г гшжозидаза (нейтральная).

1 - нефракционированные тимсциты, 2 - легкая, 3 - средняя, 4 - ,,-:елгя (донная), 5 - Е-РОК- -франции.

Звездочкой (») отмечены достоверно отличающиеся результаты по отношению к неф рационированным тнмоцитам.

формами клеток Т-ряда с признаками эндогенной активации, для которых характерен высокий уровень активности всех изученных глико-зидаз и ряда пептидаз. При освобождении от Е-розеткообразующих клеток популяция обогащается юными, но не активированными клетками, в которых повышена активность а-О-маннозидазы и а-Ь-Фукозида-зы, что, по-видимому, характеризует молодые клетки тимуса (СВ4-С1>3- И С04л1оС08лЮ).

2. Условия и Факторы нитогенеза Фракционированных тимопитов.

Несмотря на наличие морфологических признаков активации (увеличение размеров клеток вплоть до бластной трансформации), во Фракции легких тимоцитов не наблюдается значимого усиления спонтанной пролиферации по данным оценки включения меченого тимидина при культивировании в течение 1 или 3 суток (рис. 4, табл.2 и 3). По-видимому, бласты и большие лимфоциты представляет собой клетки, вышедшие в цикл под влиянием эндогенных стимулов, но задержавшиеся в Фазе С1, возможно, в связи с отсутствием ростовых факторов. Это предположение подтверждается данными о довольно значительном стимулирующем эффекте рИЛ-2 по отношении к клеткам легкой фракции (табл.2), обусловленном, очевидно, экспрессией высокоаф-фшшых рецепторов для ИЛ-2 в результате эндогенной активации. Стимулирующее действие рИЛ-2 не проявляется в отношении Е-РОК—фракции тимоцитов. которая, как отмечено зыие, сходна с легкой фракцией по ряду признаков.

Подтверждением результатов фенотипического анализа клеток о повышенном содержании в легкой фракции предшественников т-лимфо-цитов служат данные о значительном усилении пролиферативной реакции клеток этой фракции на действие тимусных пептидов, содержащихся в препарате тималин (рис. 4). Известно, что на них реагируют лишь ранние предшественники Т-лимфоцитов [Мирошниченко И. В. и соавт., 19871Интересно, что на тималин реагируют также клетки донной фракции: по-видимому, часть пре-Т-клеток является малыми лимфоцитами.

. Гимоциты и их фракции слабо отвечают на различные концентрации ФГА, а также на активацию в обход мембранных структур комбинацией ФМА. и ионофора.кальция А23187 (табл.2). Обычно это связывают с дефицлтом выработки ИЛ-2 клетками тимуса. И действительно, е присутствии рИЛ-2 ответ тимоцитов, особенно промежуточной фракции. существенно усиливался. В то же время ответ клеток легкой фракции при этом не возрастал. Более того, при действии на них

Thoatacdt

Рис. 7 . Активация тимоцитов человека и их фракций тиналином.

1 - нефракционированные тимоциты; 2, 3, 4 - легкая, средняя и тяжелая фракции; I - спонтанное включение ЭИгимидина (контроль); II, III, IV - концентрации тималина 1. 10. 50 мкг/мл. Звездочкой (*) отмечены достоверные отличия от контролен.

Таблица 2. Активация тимоцитов и их фракций различными мито-геннымя факторами и их комбинациям!.

Стимулятор Нефракцио-нированйыз тимоциты Фракции

Легкая Средняя Тяжелая Е-РОК- I

- (контроль) 238+12 340+96 329+35 207+17 308+73 |

рИЛ-2 481+113* 3258+1070* 944+288* 478+64* 451+1121

(2.0) (9.6) (2.9) (2.3) (1.5) ¡

ФГк (1 ыкг/ыл) 535+6Х* 776+36 654+90* '353+58* 961+2391

(2.3) (2.3) (2.0) (1.7) (3.1) |

ФГА (5 МКГ/МЛ) 511+74* 446+115 5Э1+117 429+76* 426+59 |

(2.1) (1.3) (1.8) (2.1) (1.4) I

ФГА(5 мкг/мл) 1568+499* 714+95 8260+3172* 540+167* 904+2831

+ рЙЛ-2 (6.6) (2.1) (25.1) (2.6) (2.9) I

4МА (Юнг/мл) 382+48 767+335 516+89 414+12 743+145!

(1.6) (2.3) (1.6) (2.0) (2.4) |

ФМА + рИЛ-2 524+82* " 665+252 892+165* 698+176* 374+78 |

(2.2) . (2.0). (2.7) ' (3.4) (1.2) |

ФМА + А23187 734+242* 223+67 310+73 567+173* Н.Д. 1

(3.1) ; (0. 7) (0.9) (2.7)

Здесь и в табл.3 представлены данные по включению 3ЛН-тими-дшш и ИС (в скобках) для 3-12 повторностей. * р < 0,01; н.д. - нет данных.

ИЛ-2 в сочетании с ФГА или ФМА ослабляется стимулирующий эффект рИЛ-2. Таким образом, легкие тимоциты. включающие, по-видимому, эндогенно активированные клетки, слабо реагируют на действие классических митогенов Т-клеток. причем низкий уровень ответа определяется не дефицитом выработки ИЛ-2 (хотя он и имеет место). Примерно те же черты характеризуют ответ на ФГА Е-РОК- -фракции тимоцитов.

Полагают, что ответ Т-лимфоцитов на ФГА реализуется с вовлечением по преимуществу классического пути активации. Это согласуется с данными о слабой выраженности ответа тимоцитов и всех его фракций на МАТ к СОЗ (табл.3). ФМА несколько усиливает ответ суммарной, но не легкой и Е-РОК—фракций тимоцитов.

Как было показано ранее [Никонова М.Ф. и др. ,1992), альтернативная активация Т-клеток происходит при сочетанном, но не раздельном воздействии эритроцитов человека и ФМА. То же наблюдается при оценке реакции на эти стимулы нефракционированных тимоцитов, клеток тяжелой и промежуточной фракций. Во всех случаях интенсивность реакции несколько возрастала при добавлении рИЛ-2 к смеси эритроцитов и ФМА (табл. 3). В целом ответ тимоцитов на альтернативные стимулы был не ни;ке, чем на МАТ к СЭЗ и ФГА. что резко контрастирует с ответом периферических. Т-клеток, значительно более выраженном при классической, чем при альтернативной стимуляции [Никонова М.Ф. и др., 1992).

Совершенно по-особому реагировали на альтернативную стимуляцию тимоциты легкой фракции: они давали достаточно интенсивный ответ на действие одних эритроцитов, причем добавление ФМА не усиливало, а подавляло ответ (табл.3). Эти данные можно расценить как свидетельство того, что легкие тимоциты получили эндогенно один из необходимых сигналов, и действие эритроцитов завершает формирование эффективного набора сигналов, необходимого для активации клетки.

Аналогичная способность к активации гомологичными эритроци-' тами, хотя и выраженная в меньшей степени, чем у тимоцитов легкой Фракции, свойственна Е-РОК- -клеткам тимуса (табл.3). Наиболее сильно эти клетки реагируют на комбинацию гомологичных эритроцитов с ФйА и ИЛ-2. Особенности реактивности Е-РОК- -фракции вообще сходны • с таковыми легких тимоцитов (табл. 2,3) за одним важным исключением: они не реагируют пролиферацией на действие ИЛ-2. Очевидно, черты сходства в реакции двух фракций тимоцитов обус-

Таблица 3. Показатели классической и альтерантивной активации тимоциюв и их Фракций.

Стимулятор Нефракцио-нированные тимоциты Фракции

Легкая Средняя Тяжелая Е-РОК-

- (контроль) 238+12 340+96 329+35 207+17 308+73

HAT к CD3 500+126* 1085+225* .650+93* 416+96* 286+50

(2.1) (3.2) (2.0) (2.0) (0.9)

HAT к CD3+ 1008+282* 689+133 912+196* 527+122* 321+57

+ ФМА . (4.2) (2.0) (2.8) (2.6) (1.0)

ЧелЭр 427+94* 2848+11751 671+73* 575+144* 737+234

(1.8) (8.4) (2.0) (2.8) (2.4)

ЧелЭрк»!А . 631+95* 1323+244* 596+61* 488+131* 837+324

(2.7) (3.9) (1-8) (2.4) (2.7)

ЧелЭр+рИЛ-2 866+210* 2540+536* 1551+279* 835+184* 1184+460

(3.6) (7.5) (4.7) (4.0) . (3.8)

ЧелЗр+ФМА+ 722+126* 2084+139* 1303+329* 1169+193* 2122+66*

+рИЛ-2 (3.0) ' (6.1) ■ (4.0) (5.7) (6.9)

лсвлены сходной степенью их обогащения иными формами тимоцитов, а указанное различие - разным содержанием в них эндогенно активированных клеток.

Представленные результаты не только подтверждают общеизвестные данные о слабости ответа тимоцитов на митогеиы, обусловленной дефектом выработки ИЛ-2 и экспрессии рецепторов для него. Сии содержат новые сведения об особенностях активации легких тимоцитов. Отчасти эта особенности обусловлены присутствием в этой Арзкцнн юных форм предшественников Т-лимфоцитов, способных к кратковременной пролиферативной реакции на тимуснуе пептиды. С другой стороны. своеобразие реакции легких тимоцитов (максимальный ответ которых наблюдается при стимуляции рИЛ-2 или эритроцитами человека, неиитогенннии для зрелых Т-клэток) говорит о том, что эти клетки получили некие эндогенные активационные сигналы, однако не в полной наборе, необходимом для индукции пролиферации; р'ЛЛ-2 и эритроциты и служат тем- последним компонентом, который завершает Формирование митогенного стимула. При всем сходстве реакций легких тимоцитов и Е-РОК- -Фракции между ними определяются и некоторые различия (прежде всего более слабый ответ на рИЛ-2 и эритроциты), обусловленные разным содержанием в них эндогенно активированных клеток. Поскольку эти фракции сходны по фенотипической характеристике клеток, можно предположить, что увеличение размера тимоцитов как раз и отражает "собирание" клеткой субмитогенных сигналов активации. Оно свойственно крупным легким тимоцитам, которым остается испытать действие рИЛ-2 или адгезивного сигнала, чтобы вступить в Б-фазу цикла, и в значительно меньшей степени -Е-РОК- -тимоцитам.

3. Выработка тимонитами биологически активных веществ.

Ранее в экспериментах на мышах было показано, что предшественники Т-лимфоцитов, в том числе внутритимусныэ, обладают хел-, пернкм действием в тесте селезеночного кологшеобразованил: в их отсутствие БС-1—клетки костного мозга не формируют селезеночных экзоколоний, тогда как добавление ЭС-1+ ПТЛ или их надосадков частично или полностью восстанавливает колониеобразование [Ярилин А. V и др.. 19851.

Хотя хелперный фактор колониеобразования у мышей ^22) ви-доспецифичен, мы проверили надосадки тимоцитов человека и клеток легкой фракции, обогащенной ПТЛ, на хелперную активность в отношении колониеобразующих клеток костного мозга мыией. ,3 таблице 4

Таблица 4. . Влияние надосадков легкой фракции тимоцитов и нефракционированных тимоцитов человека на КОЕс.

Вводимые Условия выработки надосадков

клетки Количество

костного Фракции Концент- КОЕС Р 1

мозга тимоцитов рация в %. (М + м)

- (контроль - - 0

облучения)

ЗС-(коктролЫ) - - 0 4 + 0.2

ЭС- Нефракциони- 50 0 5 + 0.2

рованные 5 0.4 + 0.1

тимоциты 0.5 0 4 + 0. 1

0.05 0 4 + 0.2

БС- Легкая фракция 50 1 1 + 0.3

тимоцитов , . .5 0 6 + 0.2

(р=1.064) , 0.5 2 3 + 0.6 <0.05* |

0.05 2 2 + 0.6 <0.05* I

ЗС+(контроль2) - ■ - 1 3 + 0.4

БС- + БС+ ■ - - - 5 3 + 0.4 * I

(контроль 3) <0.001** |

БС- + БС+. Легкая фракция 50 0 8 + 0.3 <0.001***1

тимоцитов 5 0 3 + 0.2 <0.001***1

(р=1. 064) 0.5 0 5 + 0. 3 <0.001***1

0.05 0 3 0.2 <0.001***1

Для кавдой группы представлены результаты 4-16 первичных наблюдений. *,«*,**» - достоверности, по отношению к контролю 1,2,3 соответственно.

представлены данные, иллюстрирующие проявление хелперной активности клеток легкой фракции (но не тимоцитов в целом). Хотя она и не достигала уровня активности мышиных БС1+ -клеток, эффект был значим и воспроизводим. Однако в отличие от продукта мышиных ПТЛ gp22, исследуемые продукты легкой фракции тимоцитов человека не обладали аутокринным ростовым действием. Хелперное действие проявлялось при тестировании сильно разбавленных надосадков (0.5 и 0.05%), тогда как более концентрированные препараты не влияли на колониеобразование или даже подавляли его. Аналогичная ситуация обнаруживалась при исследовании продуктов ПТЛ мышей и свидетельствовала о присутствии наряду со стимулирующим ингибирующего фактора [Мирошниченко И. В., 1989). Ингибирующий эффект особенно четко проявлялся на фоне колониеобразующей активности цельной популяции клеток костного мозга или комбинации ее 8С-1- и 8С-1+ -Фракций. Мы испытывали действие надосадков легкой фракции тимоцитов на фоне сочетания БС-!- и БС1+ -клеток мыши и наблюдали выраженный ингибирующий эффект - полную отмену хелперного действия ЭС-1+- -клеток (табл. 4).

Таким образом, клетки легкой фракции тимоцитов человека спонтанно выделяют факторы, оказывающие хелперное и супрессорное действие в системе селезеночного колониеобразования у мышей; в отличие от аналогичных факторов мыши они лишены видовой специфичности и не стимулируют пролиферации тимоцитов. Выделение биологически активных субстанций служит еще одним свидетельством эндогенной активации части тимоцитов. попадающих в легкую фракцию при центрифугировании в граденте плотности перколла.

ВЫВОДЫ.

I

1. При фракционировании тимоцитов человека в градиенте плот-ноти перколла в легкой Фракции (р<1.064 г/л) происходит обогащение бластами и большими лимфоцитами с мембранным фенотипом, свойственным юным клеткам Т-ряда (С04-С08-, (Л)4"1сС08л1о), в тяжелой фракции (р>1.077 г/л) преобладают малые тимоциты Фенотипа СБ4+СГ)8+, средняя фракция имеет промежуточный клеточный состав. Освобождение тимоцитов от клеток, образующих розетки с эритроцитам барана, приводит к обогащению популяции СдА-Сд8- и СБ4"1оС08л1о -клетками.

2. Активность гликозидаз максимальна в клетках легкой фрак-

ции и минимальна в клетках тяжелой фракции тимоцитов человека. Клетки легкой и Е-РОК- -фракций в наибольшей степени обогащены а-р-маннозидазой и a-L-фукозидазой. Легкие тимоциты обладают более высокой активностью ряда пептидаз (катепсинов. активатора плазминогена, лейцинаминопетидазы), чем клетки более тяжелых фракций.

3. Тималин и тактивин оказывает слабое митогенное действие •на тимоциты в 1-суточной культуре; особенно сильно их эффект про. является в отношении легких тимоцитов, что свидетельствует об ' -обогащении этой фракции предшественниками Т-лимфоцитов.

■.. 4.. Тимоциты слабо отвечают на митогены и комбинацию форболо-вого эфира с кальциевым ионофором; ответ на фитогеммаглютинин усиливается (особенно при тестировании клеток средней Фракции) при добавлении интерлейкина 2. Клетки легкой фракции дают выраженный пролиферативный ответ на прямое действие интерлейкина 2, что свидетельствует об их эндогенной активации.

5. Тимоциты слабо реагируют как на классическую, так и на альтернативную активацию. Особенность легких тимоцитов состоит в выраженном пролиферативном ответе на действие эритроцитов человека без костимуляторов.

6. Культуральный Надосадок тимоцитов легкой фракции человека содержит фактор, стимулирующий образование селезеночных экзоколо-

. чий клетками костного мозга мышей, .освобожденными от предшественников Т-лимфоцитов, и факторы, подавляющие образование экзоколо-■ ний смесью стволовых клеток и ПТЛ костного мозга мышей, а также пролиферации тимоцитов .человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сирина Е.Г., Былинкина В.С., Преображенская М.Е., Ушакова А., Лубкова О.Н.. Ярилин A.A. Активность гликозидаз и пептидаз

■:во фракциях тимоцитов человека //Тез. докл. к XI науч. кокф. "факторы клеточ. и гуморального иммунитета при различ. физиоло-гич.и.патологич. состояниях".-Челябинск.-1992.-С. 122.

2. Сирина Е.Г... Литвина М.М., Никонова М. Ф.. Ярилин A.A. Особенности активации тимоцитов и их фракций по классическому и альтернативному путям //Иммунология.-1994.-N3.-С.18-22.