Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Н-2К-рестриктированный макрофагальный фактор и Н-2К-антиген. Сравнительная молекулярная и иммунобиологическая характеристика

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского

На правах рукописи УДК 612.017.1:612.112 3:612.112.94

СЕМЕНКОВА ЛИДИЯ НИКОЛАЕВНА

Н-2К-РЕ6ТРНКТИР0ВАННЫЙ МАКРОФАГАЛЬНЫЙ ФАКТОР И Н-2К-АНТЙГЕН, СРАВНИТЕЛЬНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О - ■ \ ■ Москва—1991

. Работа выполнена в Институте иммунологии Минмедпрома СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор В. Г. Галактионов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. А. Ярилин; доктор биологических наук, профессор М. С. Бляхер.

Ведущая организация — Институт медико-биологических проблем Минздрава СССР.

Защита состоится 1991 г,

в •'■ часов на заседании специализированного Совета К.084.18.02. при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан ^ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

О. В. КОТЕЛЬНИКОВА

ОБЯАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В настоящае время интерес к проблеме функциональной дифференцировки клеток, протекающей в отсутствие антигенного стимула, в значительной степени связан с изучением межмолекулярнцх взаимодействия различных антигенных структур, расположенных на мембранах иммунокомпетентных клеток.. Существенную роль в, этих взаимодействиях играет антигены I и II класса СКГ (главного комплекса гистосовместимости). Установлено, что эти антигены принимают непосредственное участие в реализации многих иммунных реакция, таких как: представление процессированного антигена, активация Т-лиыфоцитов, и играют главную роль в обеспечении эффекторных механизмов Т-клеточного звена иммунитета /Emarlch F..1966! Benacerr&i В., 1961/. Антигены ГКГ также вовлечены в процессы безантигенноя дифференцировки клеток иммунной системы. Они принимают непосредственное участие в формировании МНС-грестрикции /Miller J. et.al.,19e9/ и толерантности "к своему" /Sprent D. et.al., 1988/, в реакции смешанной аутологичноя культуры лимфоцитов /Innés J.et.al.,1909/, в регуляции процессов хоминга лимфоцитов и аллогенноя ингибции , в индукции эффекторов РТПХ (реакция "трансплантат против хозяина") /Анфалова т. и др.,1984/. Все перечисленные свойства характерны для мембраносвяэанных форм антигенов ГКГ, однако, помимо представленных на мембранах клеток существуют и свободные формы антигенов ГК.Г. Они обнаружены в межклеточной среде, в крови, лимфе и других жидких средах организма /Sing P. et.al.,1969/. Накопление растворимых антигенов ГКГ является активным регулируемым процессом. Тем не менее функциональная роль растворимых антигенов ГКГ до настоящего времени остается неопределенной.

- г~

Ранее было показано, что при совместном культивировании сингенных макрофагов и тимоцитов в культуральноя среде накапливается гуморальный Н-2К-рестриктированный фактор с молекулярной. массой 60 кДа, вызывающий функциональную дифференцировку тимоцитов в зрелые эффекторы РТПХ. Гуморальная индукция Т-эффекторов наблюдалась только при идентичности по Н-2К-локусу макрофагов, продуцентов фактора, и тимоцитов /Галактионов В. и др., 1987/. Приведенные, данные позволили предположить, что в роли Н-2К-рестриктированного фактора может выступать растворимая форма продуктов Н-2К-локуса ГКГ, что и определило направление нашей работы.

Цель исследования - провести сравнительное исследование биохимических свойств и иммунобиологической активности Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов и Н-2К-антигенов.

Основные задачи исследования:

1. Разработать схему выделения биологически активного Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов из супернатанта совместной культуры-макрофагов и сингенных тимоцитов.

2. Выделить Н-2К-антигеиы из мембран клеток селезенки мыши.

3. Провести сравнительный анализ биохимических и физико-химических параметров Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов и Н-2К-антигенов.

4. Провести сравнительное исследование влияния Н-2К-рестрик-тированного фактора макрофагов и Н-2К-антигенов на процессы функциональной дифференцировки тимоцитов.

5. Исследовать влияние Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов и Н-2К-антигенов на экспрессию фенотипических маркеров тимоцитов.

Научная новизна. Разработана схема очистки биологически активного Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов, вызывающего дифференцировку клеток тимуса. Впервые показано, что аутологичные Н-2К-антигены, полученные методой папаинового гидролиза мембран клеток селезенки мыши, и Н-2К-рестриктированный фактор макрофагов вызывают in vitro функциональную дифференцировку клеток тимуса. Установлено, что незрелые тимоциты. после инкубации с аутологичньши Н-2К-антигенами или Н-2К-рестриктированным фактором приобретают способность индуцировать РТПХ, усиливают ФГА-зависимую пролиферативную активность, продукцию ИЛ-2, лролиферативный ответ в ауто-СКЛ. Впервые показано, что Н-2К-рестриктированныя фактор макрофагов и аутологичные Н-2К-антигени не вызывают пролиферации клеток тимуса в отсутствие костимуляции. Установлено, что помимо изменения функциональных свойств клеток тимуса, под влиянием Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов и Н-2К-антигеноз наблюдается усиленно экспрессии фенотипических маркеров Lyt-2 и L3T4 , а так же Н-2К-антигенов.

Теоретическая н практическая значимость работы. Результаты исследования значительно расширяют наши представления о формах взаимодействия макрофагов и тимоцитов. Наиболее важен неизвестный ранее и вскрытый нами факт, касающийся установления новой функциональной роли антигенов I класса ГКГ, как фактора дифференцировки клеток тимуса. Вместе с тем эти данные имеют важное значение для практического здравоохранения, так как могут быть рекомендованы в качестве теоретической предпосылки для клинического изучения и разработки схем практического применения при индивидуальной иммунокоррекции вролщенны* или приобретенных

wi' '

лммунодефицитов, гиперплазии клеток тимуса и компенсаторной

-

терапии при заболевании СПИД. Результаты работы по данной теме внедрены в педагогическую практику на кафедре биохини ЦОЛИУВ с сентября 1936 года.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и ибсужцены на I Всесоюзном симпозиуме по препаративной хроматографии (Ленинград, 1987), на I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 19S9), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "Система макрофагов в норме и патологии" (Новосибирск, 1990), на совместном семинаре отделов клеточного иммунитета, биотехнологии и биологического контроля Института иммунологии Минмедпрома. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Основные полохения, выносимые ил защлту:

1. Н-2К-рестриктированный фччгор макрофагов и аутологичные Н-2К-антигены вызывают функциоьг/ьную и фенотипическую дифференцировку клеток тимуса ln vit'

2. Н-2К-рестриктиро^'^кный фактор макрофагов обладает биохимическими и им-г-нобислогическими свойствами схожими со

. свойствами аутологичных Н-2К-антигенов, получэчкых методом

папаинового гидролчэа мембран селезенок мыши.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из

■введения, обзора литературы, экспериментальной части,

обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на

132 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 1

таблицу. Библиографический указатель содержит 227 источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Материалы исследования. Супернатант культуры сингенных

макрофагов и тимоцитов, монокультуры макрофагов получали, как

описано /Анфалова и др.,1984/. Папаиновый гидролизат мембран

клеток селезенки ныши получали по методу /TragarM L. et al.,1979/, растворимые антигены I класса ГКГ выделяли по методике /Parham P.,1979/.

Неволь зовашше ihbothuq. Работу проводили на линейных мышах СБА, С57В1/6 и гибридах <СВАхС57В1/6)F .

о 1

Диализ фкзнко-хиинчаских сволств Н-гк-растриктированного Фактора накрофагев н растворимых антигенов I класса ГКГ.

Определяли злектрофоретическую подвижность образцов /Laenaali и.,1970/, спектры ультрафиолетового поглощения и кругового дихроизма.

Анализ биологической активности И-2К-рестриктнруемого {актора макрофагов и аугологичных растворимых Н-гК-антигенов.

Оценивали влияние на развитие РТПХ /Hardt F.et,al.,1971/, на пролиферации лимфоцитов /Adler W.et.al.,1970/, на пролиферации тимоцитов в ауто- и аллогенной СКЛ /Wu S. et.al..1983/, на продукцию ИЛ-2 /Gearing A. et.al.,1935/. Изменение экспрессии поверхностных антигенов под влиянием Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов или аутологичных растворимых Н-2К-антигенов определяли с использованием моноклональных AT и меченного 1125белка А, по методике /Goodenow Н. et.al.,1962/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов.

Исходным материалом для выделения Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов являлся суточный супернатант совместной культуры сингенных макрофагов и тимоцитов (СМТ), обладающий биологической активность» в тесте РТПХ. В качестве контроля использовали супернатант монокультуры макрофагов (СМ), который не обладал биологической активностью в тесте РТПХ. Супернатанты СМТ

и СМ были сконцентрированы и нанесены на колонку с ультрагелем АсА-44, уравновешенную 0,05 М трис-НС1~буфером. рН 7.2, с добавлением 0,05 М NaCl. Для дальнейшей очистки были взяты фракции, соответствующие молекулярной массе 60-70 кДа. Примеси нуклеиновых кислот удалялись на колонке с ДЭАЭ-биогелем А, уравновешенной тем же буфером. Белковые фракции, полученные из 60-70 кДа фракции СМГ и СМ, были пропущены через последовательно соединенные аффинные колонки с IgG-мыши и моноклональиыми члл поликлональныыи мышиными анти-Н-2(Ск-антителами. лимобилизов«ши(;и на BrCN-активированной сефарозе-4В. Для элглгии сорбировачпы;< на колонке белков использовали 0,01 М водный раствор бутилэшша рН 11,5. В результате очистки был получен биологически активный препарат Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов.

На электрофореграмме выделенного фактора присутствовали три белковые зоны, соответствующие молекулярным весам 73, 67 и 36 кДа. Аналогичные белковые полосы в области 75 и 67 кДа присутствовали на электрофореграмме белка, выделенного из СМ.

Сравнение электрофореграмм белков, ииделенных из СКГ и СМ показало, что они'отличаются только белковой полосой в области Г6 кДа, которая, как очевидно. обусловливает его югическув активность СМГ и Н-2К-рестрик-чгданного фактора н'.^рмфагов. На электрофореграмме биологичесю. активного Н-2К-ре<птиктированного f-Kvopa макрофагов, очисениого при покоши ионоклональных анти-Н-2Кк-антител, присутствуют два белковые полосы в области 56 и 46 к1а.

. 2.Выделение растворимых Л-2К-антигенов.

Растворимые аутологичные Н-2К-антигены выделяли из папаиноЕого гидролизата мембран клеток селезенки мышей линии СБА

по методу /Parharm P.,1979/. На рис. 1 представлена схема выделения растворимых антигенов I класса ГКГ. Как видно из рисунка, очистка осуществлялась с применением ыетодоз-ионообменной и аффинной хроматографии. На первом этапе выделения папаиновыя гидролизат клеток селезенки бил пропущен через колонку с сорбентом "DEAE Bio-Gel А" для отделения от папаина и принеси нуклеиновых кислот.^ Для дальнейшего выделения был использован белковый пик, злюироаанныя со стартовым буфером, который наносили на ряд последовательно соединенных аффинных колонок. Колонка I с сефарозой-4В предназначалась для удаления неспецифически сорбирующихся на носителе белков. Колонка II с нормальными MrG мыщи, связанными с BrCN-активированноп сефарозоя-4В, предназначалась для удаления примеси Fc-рецепторов и белков, неспецифически связывающихся с иммуноглобулинами. Колонка III с анти-Н-2Кк-антителами, связанными с сефароэоП-/!В, предназначалась для связывания рестриктированных1 по Н-2К-антигену белков. После пропускания препаратов через колонки I, II, III колонки I и II отсоединялись, и колонка III индивидуально промывалась 0,1 И диэтиламином. Все фракции, полученные на различных стадиях очистки, анализировались злектрофоретическм. Выделенные таким методой аутологичные антигены имели характерный электрофоретическия профиль и использовались нами для сравнения с Н-2К-рестриктированньш фактором макрофагов и для анализа в самостоятельных биологических тестах.

3- Сравните лышй анализ физико-химических свойств Н-2К-рестриктироватюго фактора макрофагов и аутологичных растворимых Н-2К~антигенов. На первом этапе работы мы анализировали электрофореграммы растворимых антигенов I класса ГКГ и Н-2К-рестриктированного фактора. Анализируемые белки имели

- л ■

Рис.1. Схема выделения растворимых антигенов I класса ГКГ из папаинового гидролиэата мембран клеток селезенки мыши.

- д-

сходнып злектрофоретический профиль. В образцах, полученных на сорбенте, содержащем ыоноклоналъные аити-Н-2Кк-антитела, присутствовал белок с молекулярной массой 56 кДа. На основании сравнения электрофореграмм был сделай вывод • об идентичности белкового состава анализируемых веществ.

Помимо сравнения электрофореграмм растворимых антигенов I класса ГКГ и Н-2К-рестриктированного фактора нами проводился анализ их спектров ультрафиолетового поглощения. Полученные спектры поглощения имели максимум в области 260 ни, ' что характерно для белковых молекул, и одинаковую форму пиков. Анализ спектров кругового дихроизма растворимых антигенов I класса ГКГ и [1-2К-рестриктированного фактора, свидетельствовал о том, что оба белка имеет выраженную р-структурну» организацию. Кроме того, спектры КД, полученных нами антигенов I класса ГКГ, хорошо соответствовали КД-спёктрами антигенов X класса ГКГ человека, описанными в работе /Согва .1. ег а1.,1989/. :

Использование для выделения растворимых антигенов и Н-2К-рестриктированного фактора одного. и того же аффинного сорбента свидетельствовало о наличии в составе анализируемых белков одинаковых антигенных детерминант.

Таким образом, на основании идентичности электрофореграмм, спектров ультрафиолетового поглощения, подобии спектров КД, а так же близких антигенных свойств, нами был сделай вывод о сходстве физико-химических характеристик Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов и растворимых Н-2К-антигенов.

4.Сравнительный анализ биологической активности 11-2К-рестриктнрованного фактора макрофагов и аутологичных растворимых 11-2К-антигенов. Нами была проведена серия

- ю-

экспериментов по изучению биологической активности растворимых аутологичных антигенов и Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов, и получена сравнительная характеристика их действия на клетки тимуса.

Поскольку ранее было показано, что Н-2К~рестриктированный фактор влияет на функциональную дифференцировку клеток тимуса, в работе были использованы тесты, характеризующие функциональную зрелость Т-клеток. А именно: ФГА-зависимая пролиферация тимоцитов, продукция ИЛ-2, способность отвечать на алло- и аутоантигены в реакции смешанной культуры лимфоцитов, а также экспрессия функциональных и дифференцировочных поверхностных антигенов.

Кроме того нами было проведено исследование влияния сингенных растворимых Н-2К-антигенов на функциональную активность тимоцитов, проявляемую в локальной РТПХ, а именно, была исследована способность Н-2К-антигенов вызывать функциональную трансформацию незрелых тимоцитов в зрелые эффекторы РТПХ.

5.Индукция реакции РТПХ под слиянием растворимых аутологичных Н-2К-антигенов. Для выяснения, вопроса о способности антигенов I класса ГКГ вызывать функциональную дифференцировку незрелых тимоцитов в зрелые эффекторы РТЕХ интактные нереагируюшие или крайне слабо реагирующие в РТПХ тимоциты инкубировали с растворимыми аутологичными Н-2К-антигенами. Развитие реакции оценивали после введения тимоцитов в тест-систему - гибриды первого поколения П (СБА « С57В1/6).

В качестве контроля использовались тимоциты, которые инкубировали в аналогичных условиях, но без добавления растворимых антигенов I класса ГКГ.

Показано, что тимоциты приобретают способность вызывать локальную

РТПХ (индекс реакции -2,3 ) при их введении в иммунологически инертныя организм после 24-х часовой инкубации с аутологичными растворимыми антигенами I класса ГКГ. Необходимо отметить, что функциональная активность растворимых Н-2Кк-антигенов наблюдалась при низких.концентрациях веществ (от 0,1 мкг/мл на 6x10"клеток до 1мкг/мл ) и была сравнима по уровню с реакцией, вызываемой Н-2К-рестриктированным фактором при тех я® дозах.

Таким образом, нами было показано, что .растворимые аутологичные Н-2К-антигены, полученные методом папаинового протеолиза мембран'клеток селезенки мыши и очищенные ма аффинных-сорбентах, способны вызывать функциональную дифференцировку клеток тимуса в зрелые эффекторы РТПХ.

6.Влияние растворимых аутологичных Н-2К-антигенов и

Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов на ФГЛ-зависиму»

)

пролиферацию клеток тииуса оценивали в реакции бластноп трансформации тимоцитов.

Клетки тимуса инкубировали с растворимыми' аутологичными Н-2К-антигенами (5мкг/мл) или Н-2К-рестриктированным фактором макрофагов 15мкг/мл> в течение 24-х часов, затем в систему вносили субмитогенную дозу ФГА (1,5мкг/мл). О функциональном созревании тимоцитов судили по увеличению пролиферативной активности тимоцитов под влиянием ФГА после ,их инкубации с антигенами или Н-2К-рестриктированным фактором. Нами было показано, что усиление пролиферативной активности тимоцитов под влиянием растворимых аутологичных Н-2К-антигенов или Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов наблюдается только в трисутствии ФГА и только в' аутологичноя системе. При этом :амостоятельноя митогенной активностью растворимые .аутологичные 1-2К-антигены или Н-2К-рестрмктированиьт фактор макрофагов не

-/я- -

обладали. Поскольку усиление ФГА-зависимой пролиферации характерно для зрелой популяции клеток, был сделан вывод о том, что незрелые тиыоциты подвергается функциональной дифференцировке и приобретают свойства более зрелых форм клеток под воздействием растворимых сингенных антигенов или Н-2К-рестриктированного фактора.

7.Изменение продукции ннтерлеякина-2 клетками тимуса под влиянием Н-2К-рострнктированного фактора н растворимых аутологичных Н-2К-антигенов оценивали после инкубации сингенных тимоцитов с Н-2К-рестриктированными белками. Результаты

этого исследования представлены в таблице 1.

Таблица I.

Влияние Н-2К-антигенов и Н-2К-рестриктированного Фактора на продукцию интерлеикина-2 тимоцитами.

Добавления ИЛ-2 активность Индекс

в культуру стимуляции

тимоцитов Iиьш/мин х 10 )

•5Х ФРТК а (контроль) 4,0 1.0

5% ФРТК + 5 мкг/мл Н-2К 5.3 1.3

5% фРТК. + 5 мкг/мл Н-2К- 7,1 1,7

рестриктированного фактора

а) Супернатант стимулированных Con А клеток селезенки крыс Levis.

б) Отношение радиоактивности I3 Н 1-тимидина, включенного бластш клетками, к контролю. Усреднено по всем разведениям, ошибка превышала 5í.

■ *

Видно, что инкубация тимоцитов с растворимыми аутологичными Н-2К-антигенами или Н-2К-рестриктированным фактором сопровождалась усилением продукции интерлейкина-2. Показано, что под влиянием растворимых антигенов I класса ГКГ наблюдается менее выраженная стимуляция продукции ИЛ-2 (30%), чем под влияние» Н-2К-рестриктированного фактора ( до 70S ),

Полученные данные позволили утверждать, что под влияние)

-

растворимых антигенов I класса ГКГ и Н-2К-рестриктированного фактора наблюдается усиление секреции интерлеякина-2. По-видимому, именно этот механизм лежит в основе функционального созревания тимоцитов, проявляющегося в индукции локальной РТПХ и усилении ФГА-стимулированной пролиферации.

8.Влияние . растворимых аугологичных Н-2К-антигенов и Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов на Функциональную активность тимоцитов, проявляемую в аутологичноя и аллогенноя смешанной культуре лимфоцитов. Известно, что в процессе созревания тимоцитов происходит, как их фенотипическая,■ так и Функциональная дифференцировка, появляющаяся, в частности, в способности отвечать пролиферацией на ФГА и аллоантигены в смешанной культуре лимфоцитов / Брондз Б.Л., 1907 /.

В первой серии( экспериментов мы оценивали способность тимоцитов после инкубации с сингенными макрофагами стимулировать пролиферацию аллогенных клеток селезенки в реакции СКЛ. Для этого клетки тимуса инкубировали с сингенными иЛи аллогенными макрофагами в течение 24 часов и вносили, как клетки-стимуляторы, в аллогенную СКЛ. В качестве контроля использовали свежевыделенные тимоциты СВА и тимоциты СБА, после 24-часовой инкубации в среде без макрофагов. Как видно из рис.2, инкубация тимоцитов с сингенными макрофагами усиливал^ их способность стимулировать пролиферативный ответ аллогенных клеток селезенки по сравнению с контролем. Характерно, что пролиферативный ответ клеток селезенки на свежевыделенные клетки тимуса был ниже ответа, вызываемого тимоиитами, проинкубированными с сингенными макрофагами.

Поскольку в реакции СКЛ первичный пролиферативный ответ развивается, в основном, на антигены Н-2 комплекса, можно

Отвечающие Стимуляторы Добавления

клетки тимоциты к стимуляторам селезенки

Радиоактивность [^Н] —ттшдина вмп/мин х 10 ^

С 57В1./6 С 57В1./6

С 57В1./6 СБА

макрофаги СБА

С 57В1/6

С 57ВЬ/6 С 57В1*/6

СБА ~ контроль

СБА свежие

СБА

макрофаги С 57ВЬ/6

0 10 го 30 40 50

Рис.2. Влияние сингенных макрофагов на способность тимоцитов СВА индуцировать пролиферацию аллогенных епленоцитов С57В1/6. Высота колонок соответствует среднему значению результатов 3-х независимых опытов.

было предположить, что совместное культивирование сингенных тимоцитов и макрофагов приводит к увеличении экспрессии Н-2 антигенов на поверхности тимоцитов. Описанное явление может быть объяснено пасивноя сорблциея на тимоцитах освобождающихся с поверхности макрофагов H-2-молекул.

Результаты исследования влияния антигенов I класса ГКГ и Н-2К-рестриктированного фактора на пролифаративныя ответ тимоцитов, стимулированных аллогенными и аут£логичными клетками селезенки,представлены на рис.3. Как видно из рисунка, инкубация тимоцитов с ауто'логичныии растворимыми Н-2К-антигенам^ и Н-2К-рестриктированним фактором не влияла на пролиферативный ответ, развиваемый при стимуляции аллоантигенами. Однако, пролиферация тимоцитов в ответ на сингенные клетки-стимуляторы значительно повышалась после обработки отвечающих клеток растворимыми антигенами I класса ГКГ или Н-2К-рестриктированным фактором. Вместе с тем, обработка тимоцитов растворимыми антигенами I класса или Н-2К-рестриктированнын фактором не влияла на собственную пролиферативную активность, тимоцитов в отсутствие клеток-стимуляторов.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что неэрег.ые тимоциты могут функционально дифференцироваться In vitro под влиянием растворимых аутологичных » Н-2К-антигенов и Ч-2К-рестриктированного фактора и приобретают способность пролиферировать в ответ на аутологичные антигены.

9,Влияние растворимых а/тологичных Н-2К-антигенов 1!-2К-рестриктировашюго фактора на экспрессию фенотнпических маркеров Т-клеток. Известно, что каждый этап дифференцировки Т-клоток характеризуется возникновением или количественным изменением гжспрессии определенных мембранных антигенов. В ходе

Тип Отвечающие Стимуляторы Добавления

СКЛ таыоиигы * клетки к стииу- - з

селезенки латорам Стикуляцпя включения [ Н] -ттшдина , Я

Ва1Ь/С ВгйЬ/С

СБА СВА

Алло СВА Алло СВА:

Аут о СВА Ауто СВА

~ СВА СВА

О 50 100

"Тимоциты СВА предварительно инкубировали с 5 икг/ип ТДФ или Н—2К Е 24 часа отмывали и вводили в СКЛ *ТДФ - Н-2К-реетриктировавный фактор

Рис. 3. Различная степень стимуляции аутологичной и аллогенной СКЛ при предварительной инкубации отвечающих клеток с Н-2К— антигенами или Н—2К-рестриктированным фактором.

Сч

I

созревания клеток в тимусе происходит возрастание экспрессии Функциональных маркеров Lyt-2, CD2, L3T4, а также Н-2-антигенов /Gambon F. et.al., 1900 /.

В данном экспериментальном разделе мы проводили сравнительное исследование влияния растворимых аутологичных Н-2К-антигенов или Н-2К-рестриктированного фактора на экспрессию фенотипических маркеров клетками тимуса. Мы исследовали изменение экспрессии антигенов Н-2К, I-A, а также Функциональных маркеров Lyt-2 и L3T4.

Результаты исследования представлены на рис.4. ВиднЬ, что-инкубация тимоцитов с растворимыми аутологичными Н-2К-антигенами или Н-2К-рестриктированным фактором не влияла на экспрессию тимоцитами I-A-антигенов. Однако уровень экспрессии Н-2К-антигенов заметнр увеличивался после 72 часов инкубации тимоцитов, как с растворимыми аутологичными Н-2К-антигенами так и с Н-2К-рестриктированным фактором. Причем это явление не было обусловлено пасивноя сорбцией растворимых' антигенов или Н-2К-рестриктированного фактора на поверхности тимоцитов, поскольку уровень экспрессии собственных Н-2К-антигенов после 24 часов инкубации бил сравним с контролем .

Как видно из рис.4, инкубация интактных тимоцитов с растворимыми сингенными растворимыми антигенами или Н-2К-рестриктированным фактором приводит к значительному увеличению экспрессии функциональных маркеров ЦТЛ - Lyt-2 И к несколько менее выраженному росту экспрессии маркеров Т-хелперов L3T4. Обнаружено, что растворимые сингенные антигены I класса ГКГ и Н-2К-рестриктируемый фактор оказывают одинаковое влияние на экспрессию функциональных маркеров Т-клеток.

Таким образом, нами показано, что аутологичные растворимые

Экспрессия добавления - 125 ~ 3

24 часа Связывание [ 1]белка-А . имп/минхЮ

72 часа

ТДФ

Н-2К 1-Ак Ьу1—2 1374т

Н-2К

ТДФ , Н—2К

ТДФ

н-гк*

•ТДФ

н-гк1

О 5 10 15 део

Рис 4. Влияние аут о логичных Н-2К-антигенов или Н-2К-рестриктированного фактора на экспрессию маркеров тимоцитов.

I

в«

Н-2К-антигены и Н-2К-рестриктированный фактор макрофагов вызивают функциональную и фенотипическую дифферениировку клеток тимуса in vitro. При этом аутологичные Н-2К-антигены и Н-2К-рестриктированныя фактор макрофагов вызывали одинаковые по характеру и степени выраженности изменения функциональных и фенотипических показателей клеток тимуса.

Полученные данные согласуются с результатами предыдущих экспериментов, свидетельствующих о схожести биохимических, иммунохимическия и функциональных свойств Н-2К-рестриктированного фактора и растворимых аутологичных Н-2К-антигенов .

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что растворимые сингенные антигены I класса ГКГ вызывают функциональную и фенотипическую дифферениировку интактиых тииоцитов in vitro.

2. Разработана схема выделения из супврнатанта совместной культуры сингенных макрофагов и тимоцитов Н-2К-рестриктированного макрофагального фактора, вызывающего дифферениировку тииоцитов.

3. Установлено, что Н-2К-рестриктированнып фактор дифферен-цировки тимоцитов и выделенные методом папаинового протеолиза мембран клеток селезенки мыши антигены I класса ГКГ имеют ряд схожих электрофоретических, биохимических, физико-химических и биологических свойств.

4. Показано, что растворимые антигены I класса ГКГ способны вызывать функциональную трансформацию интактных сингенных тимоцитов в зрелые эффекторы РТПХ.

, 3. Показано, что интактные тимоциты не отвечают усилением пролиферации при инкубации с Н-2К-рестриктированшм фактором макрофагов, с Н-2К-антигенами и с ФГА. Однако предварительная

инкубация клеток тимуса с Н-2К-рестриктированным фактором или аутологичными Н-2К-антигенами обеспечивает ответ тимоцитов на добавление в культуру ФГА. Таким образом, можно заключить, что Н-2К-рестриктированныя фактор макрофагов или Н-2К-антигены обладают дифференцировочными, а не ростовыми свойствами.

"6. Усиление фГА-зависимоя пролиферации тимоцитов под влиянием растворимых антигенов I класса ГКГ или Н-2К-рестриктированного фактора макрофагов наблюдается в сингенной, а не в аллогенноя системе.

7. Установлено, что инкубация клеток тимуса с растворимыми антигенами I класса ГКГ или Н-2К-рестриктированныи фактором ведет к усилению пролиферативноя активности тимоцитов в ауто-СКЛ и не влияет на ответ тимоцитов в аллогенноя С1СЛ.

8. Показано, что инкубация интактных тимоцитов с сингенными макрофагами усиливает их способность индуцировать пролиферацию аялогенных клеток селезенки.

Под влиянием растворимых антигенов I класса ГКГ или Н-21С-рестриктированного фактора увеличивается содержание ИЛ-2 в среде культивирования тимоцитов.

10. Растворимые антигены I класса. ГКГ или Н-2К-рестриктиро-ванныя фактор вызывают изменение экспрессии фенотипических маркеров Т-кле?ток: Н-2К1, Lyt-2, L3T4 И Hf влияют на экспрессию 1-Ак-антигенов..

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Семенкова Л.Н., Дудич E.H., Галактионов В.Г. Выделение биологически активного Н-2К-рестриктированного фактора дифференцировки тимоцитов.// I Всесоюзный симпозиум по препаративной хроматографии физиологически активных веществ на

полимерных сорбентах: Тезисы докладов. —Ленинград. 1988. —С. 20.

2. Сравнительная биохимическая и функциональная .характеристика Н-2К-рестрш<тировапного фактора макрофагон./' Галактионов В. Г., Се-менкова Л. Н., Дудич П. И., Дудич И. В.//1 Всесоюзный иммунологический съезд: Тезисы докладов. —Сочи, 1989. —С. 31.

3. Галактионов В. Г., Семеикова Л. Н., Дудич Е. И. Н-2К-рсстрик-тированный фактор, секретируемый макрофагами при совместном культивировании с еннгашыми тимоцнтами, вызывает функциональную диффе-реицировку тнмоцчтов.//Всесоюзный симпозиум Биохимия рецепторных систем: Тезисы докладов. —Таллинн, 1990. —С. 10.

4. Галактионов В. Г., Ссмснкова Л. Н., Дудич Е. И. Функциональная дифферепцировка незрелых тимоцитов мыши, индуцируемая растворимым Н-2К-рестриктированпым фактором макрофагов//Всесоюзиый симпозиум Система мононуклеарпых фагоцитов в норме н патологии: Тезисы докладов. —Новосибирск, 1990. —С. 42.

5. Функциональная дифферепцировка тимоцитов под воздействием растворимых Н-2К-антигенов, выделяемых макрофагами при совместном культивировании с тнмоцптамн./Семенкова Л. Н., Дудич Е. И., Дудич И. В., Галактионов В. Г.//'ДАН СССР. —1990. —Том 315, № 6. —С. 1504—1506.

6. Сравнительное исследование влияния Н-2К-рестриктп[Гованного макрофагальиого фактора и изолированных Н-2Кк-антпгенов на экспрессию фенотииических маркеров и продукцию ннтерлейкина-2 спнгеннымн тимоцитами./Семенкова Л. Н,, Дудич Е. И., Гречко Г. К. и др.//ДАН СССР. —1991. —Том 315, № 2. —С. 504—507.

Подп. в печ. 11.10.91 г. Зак. 930 Объем 1,25 п. л. Тираж 100

Типография МХТИ имени Д. И. Менделеева