Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИЗОНИАЗИД И РИФАМПИЦИН

ИЗРАИЛОВА ГУЛЬНАРА ГРИГОРЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИЗОНИАЗИД И РИФАМПИЦИН

14.04.02 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ПЯТИГОРСК 2011

1 с [¡юн 2011

4850162

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Компанцева Евгения Владимировна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Денисенко Олег Николаевич

доктор фармацевтических наук Новиков Михаил Станиславович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г.Уфа

Защита состоится 30 июня 2011г. в 900 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.069.01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) ^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Автореферат разослан^-? 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Проблема лечения больных туберкулезом в настоящее время не снижается, несмотря на получение все новых противотуберкулезных лекарственных средств. Основным противотуберкулезным лекарственным средством продолжает оставаться изониазид, обладающий рядом побочных действий в том числе и гепатотоксичностью. По литературным данным более эффективным является лечение комбинированными средствами, содержащими несколько противотуберкулезных средств. Преимущество такой терапии заключается в снижении дозировок каждого препарата, а, следовательно, в снижении гепатотоксичности изониазида. Необходимо отметить, что наиболее часто встречаются комбинации изониазида с другими противотуберкулезными веществами, чаще всего с этамбутолом, рифампицином, пиридоксином и др. Однако, в Российской Федерации комбинированный препарат на основе изониазида и рифампицина пока не выпускается. Создание таких препаратов требует решения многих вопросов, в т. ч. обоснование состава вспомогательных веществ, позволяющих оптимизировать скорость высвобождения лекарственных веществ и обеспечить терапевтическую концентрацию в сыворотке крови достаточно длительное время с одной стороны и уменьшить токсичность с другой стороны. Кроме того, решение вопроса получения отечественного комбинированного ротивотуберкулезного препарата, содержащего изониазид и рифампицин, позволит аряду с улучшением терапии больных туберкулезом снизить и стоимость этого ¡екарствениого средства. Поэтому, разработка отечественного комбинированного, одержащего изониазид и рифампицин, противотуберкулезного препарата является ктуальной задачей.

Цель и задачи исследовании

Целью настоящего исследования является обоснование состава и стандартизация омбинированного лекарственного препарата, включающего два лекарственных ещества, обладающих туберкулостатической активностью.

Для достижения постановленной цели необходимо было решить следующие тачи:

обосновать выбор вспомогательных веществ для оптимизации скорости высвобождения изониазида и рифампицина;

- изучить возможность использования химических и физико-химических методов анализа для идентификации и количественного определения изониазида и рифампицина при совместном присутствии;

- изучить стабильность изониазида и рифампицина при совместном присутствии и установить сроки годности предлагаемого лекарственного препарата;

- подготовить проект ФСП на предлагаемый лекарственный препарат и апробировать в условиях фармацевтического производства;

- изучить токсичность предлагаемого лекарственного препарата;

- провести сравнительную оценку некоторых фармакокинетических характеристик изониазида и рифампицина в предлагаемом лекарственном препарате.

Научная новизна

На основании изучения влияния высокомолекулярных соединений на некоторые

биофармацевтические характеристики изониазида и рифампицина обоснован выбор

вспомогательных веществ для создания лекарственного препарата в форме гранул для

внутреннего применения. Методом диализа через целлофановую мембрану показано,

что среди исследуемых ВМС пектин оптимально изменяет скорость высвобождения

рифампицина и изониазида и позволяет создавать терапевтическую концентрацию в

крови. В связи с чем, данное высокомолекулярное соединение выбрано в качестве

вспомогательного вещества, позволяющего пролонгировать высвобождение изониазида

и увеличить биодоступность рифампицина.

На основании изучения спектральных характеристик лекарственных и

вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственного препарата, предложено

использование непосредственной спектрофотометрии для количественного

определения изониазида и рифампицина при их совместном присутствии. Для

количественного определения изониазида и рифампицина обосновано использование

также метода капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). В результате валидационной

оценки показано, что выбранные методики количественного определения изониазида и

4

рифампицина в гранулах позволят определять их при совместном присутствии, а методика КЗЭ - и в присутствии продуктов деструкции.

Методом ТСХ изучена хроматофафическая подвижность рифампицина, изониазида и их основных продуктов деструкции в некоторых системах, содержащих растворители различной поляриости, на основании проведенных исследований обоснован выбор системы раствори!слей, позволяющий разделить как ингредиенты лекарственного препарата, так и возможные продукты деструкции.

Изучение скорости деструкции изониазида и рифампицина в гранулах показало, что рифампицин подвергается деструкции раньше, чем изониазид. В связи с этим, изучение сроков годности предлагаемого лекарственного препарата проведено по продуктам деструкции рифампицина.

Выбраны оптимальные условия и разработана методика спектрофотометрического определения рифампицина в крови. На основании изучения фармакокинетических параметров изониазида и рифампицина в гранулах в сравнении с таблетками изониазида и рифампицина в капсулах, показано, что предлагаемый состав гранул значительно увеличивают время нахождения лекарственных веществ в системном кровотоке. Практическая значимость результатов исследования

Разработаны состав, технология и нормы качества гранул изониазида с ифампицином. Уст ановлено снижение токсичности и пролонгирование действия гранул а счет введения пектина.

В результате исследования разработаны и валидированы методики идентификации, пределения посторонних примесей и количественного определения изониазида и ифампицина физико-химическими методами. Методики характеризуются простотой ыполнения, высокой чувствительностью и позволяют достоверно оценивать качество |Зониазида и рифампицина при совместном присутствии. Результаты эксперимен-альных исследований использованы в подготовке нормативной документации на анный лекарственный препарат. Внедрение результатов исследования в практику

По результатам исследований разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка на «Изониазид с рифампицином, гранулы», получены акты апробации от ОАО «Тюменский химфармзавод». Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения влияния высокомолекулярных соединений на некоторые характеристики лекарственных веществ (изониазида и рифампицина) в растворе и в твердом состоянии. Итоги исследований по обоснованию состава гранул.

2. Выбор методов количественного анализа изониазида и рифампицина и результаты их применения при совместном присутствии.

3. Результаты использования тонкослойной хроматографии для определения изониазида, рифампицина и продуктов деструкции при совместном присутствии.

4. Результаты доклинических исследований гранул, содержащих изониазид и рифампицин.

Апробация и публикация результатов исследования

Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научных конференциях (г. Пятигорск, 2005-2009 гг.). По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе в журналах, рекомендуемых ВАК - 2. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия (номер государственной регистрации 01.2.00101060) Объем и структура диссертации

Работа итожена на 155"страницах машинописного текста, содержит 48 таблиц^ . 23 рисунка, состоит из "Введения", "Обзора литературы", 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 23 иностранных, и приложения.

Основное содержание работы Выбор ВМС для получения гранул с изониазидом и рифампицином

Для выбора вспомогательного вещества, обеспечивающего как постепенное высвобождение изониазида, так и повышение биодоступности рифампицина, были изучены наиболее часто применяемые ВМС в технологической практике: пектин цитрусовый - производства Германии, ß-циклодекстрин (БЦД) - Венгрии, метилцеллюлоза (МЦ), натрий карбоксимстилцеллюлоза (NaKMUQ - Югославии, крахмал, комплексный полимерный носитель (КПН-1), поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП) - России.

Влияние ВМС на скорость высвобождения лекарственных веществ изучали методом диализа через полупроницаемую мембрану. Для этого были приготовлены композиции, содержащие лекарственные вещества и ВМС в массовых соотношениях 1:0,2; 1:0,5; 1:1; 1:2. Широкий диапазон концентраций обусловлен возможностью использования ВМС как в больших, так и в малых количествах при изготовлении лекарственных препаратов.

9

Соотношение 1 :0.5

30 60 90 120 150

--Рифампицин -----Риф. * БЦД

......— Риф. + кр.Э*мал---Риф. + КПН

---Риф. + ГШМЦ -Риф.»пектин

30 60 90 120 150

--Рифампицин -----Риф. 4 БЦД

.........Риф. + крахмал---Риф. + КПН

-•- Риф.tNaKMU -Риф. + пектин

20 i Соотношение 1 : 1

25 -

Соотношение 1 : 2

f 20

30

60

90

. ■ - Л, мни.

120 150

О

Рифампицин Риф. + крахмал — Риф. + NaKMU —

Риф. + БЦД Риф.^КПН Риф. + пектин

30 60 90 120 ISO

Рифампицин —--- Риф. +■ БЦД Риф. ■+ крахмал — — — Риф. -*■ КПН Риф. + NaKMl4 ' Риф. -*- пектин

Рисунок 1 - Графики зависимости степени высвобождения рнфампнцина из модельных смесей с ВМС в различных соотношениях-фармацевтическая субстанция : ВМС

По данным Овчаренко Л.П. и Ушаковой В.А. (2005 г.) изониазид высвобождается из субстанции на 80% за первые 30-40 минут эксперимента, а полное его высвобождение наблюдается в течение 1 часа. Рифампицин, по нашим данным (рис.1), высвобождается из субстанции только на 5% за 150 минут. При исследовании модельных смесей с ТЧаКМЦ, крахмалом, КПН-1 и БЦД через 120 минут при всех исследуемых соотношениях наблюдалось высвобождение рифампицина на 3,7,8,15% соответственно. Следовательно, можно предположить, что эти ВМС недостаточно повышают биодоступность рифампицина. В смесях с пектином высвобождение рифампицина достигло наибольшего значения - до 20% за 120 минут в соотношении 1:1, а высвободившийся изониазид, по данным Овчаренко Л.П. с соавторами (2005 г.), за тот же период времени, в соотношениях 1:0,5 и 1:1 достигал около 50%. Т.е. пектин является оптимальным ВМС для регулирования высвобождения как изониазида, так и рифампицина.

Для выбора оптимального соотношения «лекарственное вещество-пектин», используя полученные результаты, нами была изучена на модельных смесях степень высвобождения как изониазида, так и рифампицина (табл.1).

Таблица 1 - Составы модельных смесей и степень высвобождения кзониазнда и рвфампнцива из них через 2 часа диализа

№ смеси состав Степень высвобождения изониазида и рифампицина

изониазид рифампицин

1 Рифампицин 0,15, Изониазид 0,10, Пектин 0,03 41,3 ±1,8 7,4 ±1,2

2 Рифампицин 0,15, Изониазид 0,10, Пектин 0,075 46,5 ±2,0 8,8±1,3

3 Рифампицин 0,15, Изониазид 0,! 0, Пектин 0,15 48,0 ±1,9 18,6 ± 1,2

4 Рифампицин 0,15, Изониазид 0,30, Пектин 0,20 45,0 ±2,1 17,2 ±1,5

Как следует из таблицы 1, степень высвобождения обоих компонентов, зависит от количества пектина в композициях и оптимальной, на наш взгляд, является пропись №3, в которой наблюдается наибольшее высвобождение рифампицина при замедленном высвобождении изониазида.

Таким образом, использование пектина в качестве вспомогательного вещества в соотношении 1:1 с рифампицином и в соотношении 1:1,5 с изониазидом в лекарственном препарате может обеспечить повышение биодоступности рифампицина при снижении скорости высвобождения изониазида.

В рамках настоящего исследования на примере рифампицина нами показана возможность использования метода вискозиметрии для определения степени влияния фармацевтической субстанции на вязкость растворов ВМС.

Для этого готовили растворы ВМС в концентрациях от 0,02 до 2,00 г/л и растворы ВМС в тех же концентрациях, содержащих рифампицин в количестве 10 мг на 50 мг. С помощью вискозиметра Оствальда определяли время истечения полученных растворов и рассчитывали величину относительной вязкости. Экспериментально установлено, что относительная вязкость анализируемых образцов растворов ВМС с рифампицином может отличаться от относительной вязкости раствора ВМС.

/

Для объективной оценки нами были рассчитаны величины разности относительной вязкости (Д?1= г], - т]2) растворов ВМС с рифампицином (г|]) и растворов ВМС без лекарственного вещества (г)2).

По данным В.А.Ушаковой (2005 г.), изониазид наиболее активно изменяет вязкость растворов пектина, ЫаКМЦ, КПН, МЦ, при этом наблюдается увеличение Дт) во всем диапазоне концентраций, что позволяет прогнозировать влияние полимеров на скорость высвобождения изониазида из твердых лекарственных препаратов, а именно обеспечение пролонгированного высвобождения лекарственного вещества.

Сложность химического строения рифампицина влияет на относительную вязкость растворов иначе. При увеличении содержания ПВС, БЦД и крахмала в растворах с рифампицином до 0,2-0,4 г/л Дт) резко увеличивается. При дальнейшем увеличении количества ВМС в растворах Дг] постепенно уменьшается. Для растворов КПН Дг| растет с увеличением концентрации полимера до 0,1 г/л, при последующем увеличении концентрации полимера - падает почти вдвое. Дг\ растворов МЦ в присутствии рифампицина увеличивается во всем диапазоне концентраций. На вязкость растворов пектина с концентрацией до 0,2 г/л рифампицин влияет слабо, Дт] изменяется незначительно, но в дальнейшем наблюдается рост изменения вязкости.

Приведенные исследования подтверждают наше предположение о возможном влиянии изменения вязкости на скорость высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм и позволяют косвенно использовать этот метод для выбора ВМС.

Для подтверждения нашего предположения о возможном взаимодействии между лекарственным средством (ЛС) и ВМС были изучены ИК-спектры изониазида, рифампицина, пектина и их смесей: изониазид-пектин и рифампицин-пектин, которые готовили путем длительного диспергирования. На ИК-спектрах смесей пектина и лекарственных веществ наблюдались сдвиги полос поглощения в областях 913-1032см"' и 1689-1723 см"1, что может свидетельствовать об образовании донорно-акцепторных связей аминогруппы ЛС с атомами кислорода пектина, что возможно при образовании связи лекарственных веществ с оксигруппами пектина, а также слабых водородных связей.

Таким образом, полученные нами результаты и данные В.А. Ушаковой (2005 г.) свидетельствуют о том, что наиболее перспективным ВМС, позволяющим замедлить высвобождение изониазида и увеличить биодоступность рифампицина, является пектин.

С ведущими специалистами НИИ фтизиопульмонологии при 1-й ММА им. И.М. Сеченова проф. Г.Б. Соколовой была обсуждена дозировка изониазида и рифампицина. Предложено использовать для однократного приема изониазида - 0,1 г, а рифампицина-0,15г.

Оптимальным соотношением, обеспечивающим постепенное высвобождение лекарственных веществ, является соотношение - изониазид : рифампицин : пектин -1:1,5:1,5, доза на один прием составит 0,4г. Таблетированная лекарственная форма в данном случае невозможна, т.к. имеет место высокое содержание пектина. Как известно, из литературных данных оптимальной лекарственной формой для смесей с пектином, являются гранулы, удобные также для хранения и употребления.

При консультативной помощи доцента кафедры технологии Кузнецовой Л.С. была предложена технологическая схема получения гранул с рифампиципом и изониазидом.

Полученные гранулы отвечали требованиям НД по фракционному составу, истираемости, распадаемости, облазали хорошей сыпучестью, средней насыпной плотностью (табл. 2).

Таблица 2 - Основные технологические характеристики гранул

Потеря а массе при высушивании, % Фракционный состав Истираемость,% Распадаемость, мин Насыпная плотность, г/см"1 Сыпучесть, г/сек

мм %

3,62 ±0,20 > 1,0 98 4,0 ±0,11 6,63 ±0,19 0,65 ±0,09 8,50 ±0,22

0,5-1,0 2

<0,5 18

При упаковке гранул необходимо учитывать влияние на стабильность факторов внешней среды. Поэтому было предложено два вида упаковки: склянки из оранжевого стекла с навинчивающейся крышкой (в комплекте с ложкой-дозатором) и упаковка в

виде пакетов из ламинированной бумаги с разовой дозой. Хранить гранулы следует в сухом, прохладном, защищенном от света месте.

Использование методов УФ-спектрофотометрии и капиллярного зонного электрофореза для разработки методик количественного определения изониазида и рифампицина в гранулах

Следующим этапом исследований была разработка НД на гранулы, включающая в себя разработку методик идентификации и количественного определения входящих компонентов при совместном присутствии. Для количественного определения изониазида и рифампицина в гранулах использовали метод УФ-спектрофотометрии.

0,8

Рисунок 2 - УФ-спектры поглощения изониазида (1), рифампицина (2) и их модельнойсмеси (3) в спирте этиловом 95%.

Количественное содержание рифампицина спектрофотометрическим методом

определяли по собственному поглощению в длинноволновой области (475нм), а

изониазида - в области совместного светопоглощения, используя аддитивность

поглощения веществ в области максимума светопоглощения изониазида (262нм)

(рис.2). Валидационная оценка проводилась на 3-х уровневом эксперименте на

модельных смесях гранул. Нами показано, что методика хорошо воспроизводима,

правильна (г расч< I та6я), линейна в области 80%-120% исследуемых концентраций от

12

декларированного содержания. Пектин не мешает определению изониазида и рифампицина, но методика не специфична, т.к. область поглощения возможных продуктов деструкции находится в области поглощения исследуемых веществ (табл. 3). Таблица 3 - Результаты валидациопнон оценки

спектрофотометрнческой методики определения рнфампнцина и нюпназпда

Показатель Норматив Результат

Изониазид Рифампнцин

Специфичность Неспецифична

Линейность, 0,0025-0,0175мг/мл 0,00375-0,02625м г/ мл

уравнение регрессии, у = 30,250х +0,0610 у = 14,471х +0,0289

коэффициент корреляции г <1 0,990 0,996

Точность (открываемость Я) (98 - 102%) для содержания веществам 10% 99,7% 100,3%

Правильность (критерий Стьюяента) <2,31 1 =1,064 расч. 1-1.36

Прецизионность (относительное стандартное отклонение 1Ш)) <3% 2,64% 2,38%

Спектрофотометрический метод использован нами при изучении степени высвобождения рифампицина и изониазида через целлофановую мембрану, а также включен как альтернативный в проект ФСП.

В виду того, что спектрофотометрический метод не позволяет определять ингредиенты гранул в присутствии продуктов их деструкции в процессе хранения, нами для этих целей был использован селективный метод капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ), который позволяет осуществлять контроль качества лекарственных средств по разделам «подлинность» и «количественное определение», а также контролировать содержание посторонних примесей.

тАи

1,0

0,9 -

0,8 -

0.7 -

0.6 -

0,5 -

0,4 -

0,3

0,2 -

0,1 -

0

Рифампицин

Изониазид

—

9 мин

Рисунок 3 - Электрофореграмма модельной смеси изониазида и рнфампицина

В выбранных условиях, на хроматограмме четко определяются как пики рнфампицина, изониазида, так и продуктов их деструкции (рис. 3). Разработанная методика, которая позволяет определять как изониазид, так и рифампицин, проста в исполнении, эффективна.

Валидационная оценка проводилась на 3-х уровневом эксперименте, на модельных смесях гранул (табл. 4).

Таблица 4 - Результаты валидационной оценки определения рнфампицина и изониазида методом КЗЭ _

Показатель Норматив Результат

Изониазид Рифампицин

Специфичность Коэффициент разделения пиков Количество теоретических тарелок 1,20 10400 1,20 190000

Линейность 5-20 мкг/в пробе 7,5-30 мкг/в пробе

уравнение регрессии у =0,08432 + 0,0017 у =0,1440+0,0029

коэффициент корреляции г <1 0,995 0,997

Точность (открываемость Я) (98-102%) для содержания вещества>10% 99,9% 100,9%

Правильность (критерийСтьюдента) <2,31 1 =1,50 рисч 1 =2,07 рисч.

Прецизионность (относительное стандартное отклонение 1^0) <3% 1,25% 2,14%

Нами показано, что методика хорошо воспроизводима, правильна < 1 „б.О, линейна в области 80%-120% исследуемых концентраций от декларированного содержания. Методика специфична.

Использование метода хроматографии в тонком слое сорбента для определения изоииазида, рифампицина и продуктов деструкции при совместном присутствии в гранулах

Для изучения стабильности и установления сроков годности, предлагаемых гранул, необходимо было установить, какой из входящих компонентов подвергается процессу деструкции в первую очередь. На предварительном этапе исследований для контроля посторонних примесей и стабильности препаратов использовали метод ТСХ, позволяющей разделять изониазид, рифампицин и продукты их деструкции. Опытным путем установлено, что оптимальные результаты получаются при использовании готовых пластинок «Сорбфил», имеющих флуоресцентный индикатор (УФ-254). Для разделения изониазида, рифампицина и продуктов их деструкции экспериментально подбирали системы, сочетая растворители с различной диэлектрической проницаемостью. Использование систем: бензол - этанол 95% - ледяная уксусная кислота (10:10:5) - 1; ацетон - вода (9:!) - 2; ледяная уксусная кислота - ацетон - этанол 95% - бензол - вода (5:5:20:70:2) - 3; метанол - вода - хлороформ (14:9:24) - 4 позволяет разделить изониазид, рифампицин и продукты их деструкции. Для выбора оптимальной системы растворителей провели расчет степени разделения изониазида и рифампицина; изониазида и гидразина сульфата; изониазида и рифампицин-хинона; рифампицина и рифампицин-хинона (табл. 5).

Таблица 5 - Степень разделения исследуемых веществ

Исследуемые вещества Система растворителей, значения Я5

1 2 3 4

Изониазид-рифампицин 0,56 1,79 2,78 0,82

Изониазид-гидразина сульфат 0,83 0,76 0,67 0,66

Изониазид- рифампицин-хинон 1,70 1,42 1,85 1,14

Рифампицин-рифампицин-хинон 2,70 0,79 0,67 1,27

Путем сравнительного анализа определили, что наиболее селективной для разделения является система растворителей 3: ледяная уксусная кислота - ацетон - этанол 95% -бензол - вода.

Для определения возможности использования выбранных условий для контроля стабильности изониазида и рифампицина в гранулах проводили хроматографирование СО изониазида и СО рифампицина, подвергнутых термическому разложению при 105°С в течение 10 суток.

На хроматограммах термостатированных образцов как изониазида, так и рифампицина, наблюдали дополнительные пятна. На хроматограмме термостатированного образца изониазида дополнительное пятно по величине Кг соответствовало гидразину. На хроматограмме термостатированного образца рифампицина появлялись 2 дополнительных пятна, окрашенных в розовый и оранжевый цвет, одно' из которых соответствовало рифампицину-хинону, другое - продуктам деструкции рифампицина, идентифицировать которые не представилось возможным.

Разработанная методика позволяет использовать ее как для идентификации изониазида и рифампицина, так и для определения их продуктов деструкции.

С помощью ТСХ метода нами установлено, что первым деструкции подвергается рифампицин, в связи с этим, срок годности препарата определяли в дальнейшем только по продуктам деструкции рифампицина.

Изучение стабильности ингредиентов гранул

Одним из этапов нашего исследования бьшо изучение деструкции изониазида и рифампицина при их совместном присутствии. Исследования проводили в изотермических условиях при значениях температуры 60 С и 90 С. С этой целью закладывали на хранение как субстанции изониазида и рифампицина, так и гранулы изониазида с рифампицином.

Используя разработанную методику определяли рифампицин и изониазид через каждые сутки хранения при 90°С или через 11 суток при 60°С .

По полученным данным строили графики зависимости содержания рифампицина и

изониазида от времени термостатирования (рис. 4 и 5).

16

в субстанциях в гранулах

Рисунок 4 - Зависимость концентрации изониазида (I) и рифампицина (2) от времена термостатироваиия при Й0°С

в суОсгаппнях в гранулах

Рисунок 5 - Зависимость концентрации изониазида (1) и рифампицвна (2) от времени термостатироваиия при 90°С

Как следует из полученных результатов рифампицин в субстанции и в гранулах подвергается при нагревании как при 60°С, так и при 90°С деструкции значительно быстрее, чем изониазид. Эти данные подтверждают наши предварительные результаты при изучении стабильности ингредиентов с помощью метода ТСХ.

Отмечено, что разложение рифампицина в гранулах, происходит значительно быстрее, чем в субстанции.

Определение сроков годности гранул Определение сроков годности гранул проводили в соответствии с Инструкцией по определению сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре. В процессе установления срока годности гранул по разработанной методике ТСХ-анализа контролировали содержание посторонних примесей рифампицина в гранулах и его количественное содержание методом КЗЭ. Установлено, что срок хранения гранул при комнатной температуре составил 4 года. На основании проведенных исследований разработан проект ФСП, который апробирован и включен в план развития ОАО «Тюменский химфармзавод», нормы и показатели которой приведены в табл. 6

Таблица 6 - Нормы качества гранул с изоииазидом и рифампипипом

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Гранулы красно-коричневого цвета в виде крупинок цилиндрической или неправильной формы

Подлинность - Изониазид - Рифампицин Метод ТСХ По соответствию пятен на хроматограмме испытуемого раствора и СО изониазида и рифампицина

Размеры гранул ГФ XI В соответствии с требованиями

Масса содержимого упаковки (саше) ОСТ 64-492-85 От 0,38 до 0,42 г

Распадаемость Визуально Не более 15 минут

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 5%

Микробиологическая чистота ОФС 42-0067-07 Обшее число аэробных бактерий не более 103 в 1 г Общее число грибов не более 102 в 1 г Отсутствие Escherichia coli в 1 г

Посторонние примеси Метод ТСХ Гидразина сульфата - не более 0,02% в препарате; рифампицин-хинона - не более 2% в препарате. Количество посторонних пятен - не более 4%

Количественное определение Спектрофотометрия В одной дозе гранул:

- Изониазид

- Рифампицин

от 0,090 до 0,110 г от 0,135 до 0,165 г

Упаковка

По 0,4 г в пакеты из полимерных материалов или из бумаги с полимерным покрытием. 30 пакетов вместе с инструкцией по применению помещают в пачку из картона_

Маркировка

В соответствии с ГОСТ 14192-96

Хранение

Список Б. В сухом, защищенном от света месте, температуре не выше-20°С___

при

Срок г одности

4 года

Результаты доклинических исследований гранул

Заключительный этап исследований был посвящен изучению острой и хронической оксичности гранул. Изучение острой токсичности гранул, содержащих изониазид и ифампиции, показало, что они относятся по токсичности и опасности по ГОСТ 12.1.0076 к 3 классу, также как таблетки изониазида и капсулы рифампицина. В то же время, доза гранул (931,2мг/кг), вызывающая смерть у 50% испытуемых мышей 2,5 раза выше, чем ЛД50 изониазида в таблетках (369,2 мг/кг) и в 1,7 раза больше, чем ифампицина в капсулах (525,0мг/кг). То есть, сочетание изониазида в комплексе с ифампицином и пектином способствует понижению токсичности ингридиентов гранул, спользуемых в виде монопрепаратов.

Для изучения хронической токсичности гранул изониазида и рифампицина щределяли некоторые биохимические и клинические показатели крови. Изучение роводили на беспородных белых крысах с массой тела 200-250 грамм в течение шести шсяцев. Были сформированы 4 группы животных по 10 крыс в каждой.

Результаты гематологических исследований крови животных, получавших гранулы зониазида и рифампицина, свидетельствуют об отсутствии грубых отклонений от ормы и от соответствующих показателей в контроле. Пониженное содержание ьбумина в крови крыс, получавших изониазид, свидетельствует о развитии печеночной едостаточности. Увеличение содержания в сыворотке крови животных, получавших аблетки изониазида и капсулы рифампицина, аспартатаминотрансферазы (ACT) и анинаминотрансферазы (АЛТ), свидетельствует о некрозе клеток печени и о развитии животных гепатита. Снижение уровня холестерина (норма 3,9-7,2 мМ/л) может

свидетельствовать о развитии острого гепатита. В сыворотке крови животных, получавших гранулы изониазида и рифампицина, эти показатели в норме, что свидетельствует о понижении токсичности как изониазида, так и рифампицина в гранулах.

При макро- и микроскопических исследованиях внутренних органов подопытных животных, получавших как изониазид, так и рифампицин отмечены грубые деструктивные изменения печени. Во внутренних органах крыс, получавших гранулы изониазида и рифампицина, деструктивные изменения отсутствуют.

Таким образом, введение изониазида в комплексе с рифампицином и пектином способствует понижению хронической токсичности ингредиентов гранул, вводимых в виде монопрепаратов.

При оценке биоэквивалентности разработанных гранул и разрешенных к применению таблеток изониазида и рифампицина в капсулах для определения изониазида использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предложенный Т. Ос1аЬшйу. Для определения рифампицина нами разработана спектрофотометрическая методика в плазме крови, относительная ошибка определения которой не превысила ±4,95%.

Фармакокинетические параметры приведены в табл. 7.

Таблица 7- Фармакокинетические параметры лекарственных веществ после однократного

пероралыюго введения

Лекарственное Фармакокинетические параметры

вещество V, мл/кг Ке1,ч-' С1,мл/ч Тщ, ч МЯТ,ч Аг)'Соо, мг-ч/мл

Изониазид в 63,75 0,95 605,6 0,73 0,33 38,86 100,0

таблетках

Изониазид в 62,84 0,20 125,7 3,47 0,66 206,1 105,0

гранулах

Рифампицин в 31,25 0,16 50,0 4,36 0,76 156,4 100,0

капсулах

Рифампицин в 37,50 0,05 18,75 13,86 1,20 248,2 112,0

гранулах

Отмечено, что константа элиминации изониазида и рифампицина из гранул ниже гаковой для изониазида в таблетках в 4,7 раза, а для рифампицина из капсул - в 3,3 раза, лощадь под фармакокинетической кривой изониазида из гранул больше таковой, чем у аблеток изониазида почти в 5 раз, а рифампицина соответственно в 1,5 раза, что видетельствует о повышении времени нахождения препаратов в системном кровотоке.

Общие выводы:

.Сравнительное изучение степени высвобождения изониазида и рифампицина в очетании с ВМС (пектин, крахмал, КПН-1, NaKMLJ, БЦД ) методом диализа in vitro, оказало, что пектин может обеспечить постепенное высвобождение изониазида, а акже повысить степень высвобождения рифампицина. Обоснован состав гранул зониазид: рифампицин: пектин 1:1,5:1,5 и изучены их технологические характеристики.

. Предложен способ спектрофотометрического определения изониазида и рифампицина гранулах. Относительная погрешность не превышала: для изониазида - ±2,39%, для ифампицина - ±1,86%. Методика хорошо воспроизводима и не отягощена истематической ошибкой.

. Предложена методика хроматографического разделения изониазида, рифампицина и фодуктов их деструкции в тонком слое сорбента, которая позволяет идентифицировать контролировать стабильность изониазида и рифампицина в гранулах.

. Предложена методика капиллярного зонного электрофореза, с помощью которого становлено, что рифампицин подвергается деструкции раньше изониазида, а в гранулах го деструкция начинается раньше, чем в субстанции. Методом «ускоренного хранения» становлен срок годности 4 года для гранул изониазида с рифампицином.

. В опытах иа животных определена острая токсичность гранул изониазида и ифампицина, доза гранул, вызывающая смерть у 50% испытуемых мышей в 2,5 раза ыше, чем ЛД50 изониазида в таблетках и в 1,7 раза больше, чем рифампицина в апсулах. Показано, что сочетание изониазида с рифампицином и пектином способствует онижению хронической токсичности как рифампицина, так и изониазида.

6. Сравнительное изучение фармакокинетических параметров изониазида в таблетках и рифампицина в капсулах и в разработанных гранулах показало, что предлагаемый состав гранул обеспечивает пролонгирование нахождения действующих веществ в крови.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Овчаренко, Л.П. Изучение взаимодействия изониазида и рифампицина с некоторыми высокомолекулярными соединениями /Л.П.Овчаренко, Е.В. Компанцева, Г.Г. Израилова // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2009. -№3(31). - С.23-25.

2. Овчаренко, Л.П. Количественное определение рифампицина в присутствии изониазида методом капиллярного электрофореза с ультрафиолетовым детектором / Л.П.Овчаренко, Е.В. Компанцева, Г.Г. Израилова // Вопросы биол., мед. и фармац. химии. - 2006. - №3,-С.27-29.

3. Компанцева, Е.В. Выбор условий хроматографического контроля чистоты и стабильности изониазида и рифампицина в смеси / Е.В. Компанцева, Л.П.Овчаренко, Г.Г. Израилова// Пути и формы совершенствования фармацевтического образования: материалы 2-й Всерос.науч. конф. - Воронеж, 2005.-С. 341-345.

4. Овчаренко, Л.П. Изучение взаимодействия изониазида с различными высокомолекулярными соединениями. / Л.П.Овчаренко, Г.Г. Израилова, В.А. Ушакова // Современные проблемы фармакологии и фармации: материалы Всерос. науч.-практ. конф. 18-19 мая 2005г.- Новосибирск, 2005.- С.326-328.

5. Израилова, Г.Г. Количественное определение изониазида и рифампицина в модельных смесях методом спектрофотометрии / Г.Г. Израилова, Л.П. Овчаренко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2005.- Вып. 60.- С. 217-218.

6. Овчаренко, Л.П.Изучение стабильности гранул изониазида и рифампицина/ Л.П.Овчаренко, Г.Г. Израилова, Л.С. Кузнецова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2006.- Вып. 61.- С. 217-218.

7. Разработка оптимального состава гранул изониазида и рифампицина / Л.С. Кузнецова, Л.П.Овчаренко, Г.Г. Израилова, Е.С. Ващенко // Разработка, исследование и маркетинг

22

новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007,- Вып. 62,- С. 178-180.

8. Овчаренко, Л.Г1. Изучение влияния способа гранулирования на стабильность изониазида и рифампицина в гранулах / Л.П.Овчаренко, Л.С. Кузнецова, Г.Г. Израилова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008.- Вып. 63.- С. 173175.

9. Разработка методики количественного определения изониазида и рифампицина в крови / Л.П.Овчаренко, Е.В. Компанцева, Е.И. Хартюнова, Г.Г. Израилова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009.- Вып. 64,- С. 217-218.

ИЗРЛИЛОВА ГУЛЬНАРА ГРИГОРЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ИЗОНИАЗИД И РИФАМПИЦИН

14.04.02 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано к печати/.Т'!7?2011. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. Печ. Л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность темы. Проблема лечения больных туберкулезом в настоящее время не снижается, несмотря на получение все новых противотуберкулезных лекарственных средств. Основным противотуберкулезным лекарственным средством продолжает оставаться изониазид, обладающий рядом побочных действий в том. числе и гепатотоксичностью. По литературным данным более эффективным является лечение комбинированными средствами, содержащими несколько противотуберкулезных средств. Преимущество такой терапии заключается в снижении дозировок каждого препарата, а, следовательно, в снижении гепатотоксичности изониазида. Необходимо отметить, что наиболее часто встречаются комбинации изониазида с другими противотуберкулезными веществами, чаще всего с этамбутолом, рифампицином, пиридоксином и др.

Однако, в Российской Федерации комбинированный препарат на основе изониазида и рифампицина пока не выпускается. Создание таких препаратов требует решения многих вопросов, в т. ч. обоснование состава вспомогательных веществ, позволяющих оптимизировать скорость высвобождения лекарственных веществ и обеспечить терапевтическую концентрацию в сыворотке крови достаточно длительное время с одной стороны и уменьшить токсичность с другой стороны.

Кроме того, решение вопроса получения отечественного комбинированного противотуберкулезного препарата, содержащего изониазид и рифампицин, позволит наряду с улучшением терапци больных туберкулезом снизить и стоимость этого лекарственного средства. Поэтому, разработка отечественного комбинированного, содержащего изониазид и рифампицин, противотуберкулезного препарата является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является обоснование состава и стандартизация комбинированного лекарственного препарата, включающего два лекарственных вещества, обладающих туберкулостатической активностью.

Для достижения постановленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- обосновать выбор вспомогательных веществ для оптимизации скорости высвобождения изониазида и рифампицина;

- изучить возможность использования химических и физико-химических методов анализа для идентификации и количественного определения изониазида и рифампицина при совместном присутствии;

- изучить стабильность изониазида и рифампицина при совместном присутствии и установить сроки годности предлагаемого лекарственного препарата; '

- подготовить проект ФСП на предлагаемый лекарственный препарат и апробировать в условиях фармацевтического производства;

- изучить токсичность предлагаемого лекарственного препарата;

- провести сравнительную оценку некоторых фармакокинетических характеристик изониазида и рифампицина в предлагаемом лекарственном препарате.

Научная новизна

На основании изучения влияния высокомолекулярных соединений на некоторые биофармацевтические характеристики изониазида и рифампицина обоснован выбор вспомогательных веществ для создания лекарственного препарата в форме гранул для внутреннего применения. Методом диализа через целлофановую мембрану показано, что среди исследуемых ВМС пектин оптимально изменяет скорость высвобождения рифампицина и изониазида и позволяет создавать терапевтическую концентрацию в крови. В связи с чем, данное высокомолекулярное соединение выбрано в качестве вспомогательного вещества, позволяющего пролонгировать высвобождение изониазида и увеличить биодоступность рифампицина.

На основании изучения спектральных характеристик лекарственных и вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственного препарата, предложено использование непосредственной спектр о фотометрии для количественного определения изониазида и рифампицина при их совместном присутствии. Для количественного определения изониазида и рифампицина обосновано использование также метода капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). В результате валидационной оценки показано, что выбранные методики количественного определения изониазида и рифампицина в гранулах позволят определять их при совместном присутствии, а методика КЗЭ - ив присутствии продуктов деструкции.

Методом ТСХ изучена хроматографическая подвижность рифампицина, изониазида и их основных продуктов деструкции в некоторых системах, содержащих растворители различной полярности, на основании проведенных исследований обоснован выбор системы растворителей, позволяющий разделить как ингредиенты лекарственного препарата, так и возможные продукты деструкции.

Изучение скорости деструкции изониазида и рифампицина в гранулах показало, что рифампицин подвергается деструкции раньше, чем изониазид. В связи с этим, изучение сроков годности предлагаемого лекарственного препарата проведено по продуктам деструкции рифампицина.

Выбраны оптимальные условия и разработана методика спектрофотометрического определения рифампицина в крови. На основании изучения фармакокинетических параметров изониазида и рифампицина в гранулах в сравнении с таблетками изониазида и рифампицина в капсулах, показано, что предлагаемый состав гранул значительно увеличивают время нахождения лекарственных веществ в системном кровотоке.

Практическая значимость результатов исследования

Разработаны состав, технология и нормы качества гранул изониазида с рифампицином. Установлено снижение токсичности и пролонгирование действия гранул за счет введения пектина.

В результате исследования разработаны и валидированы * методики идентификации, определения посторонних примесей и количественного определения изониазида и рифампицина физико-химическими методами. Методики характеризуются простотой выполнения, высокой чувствительностью и позволяют достоверно оценивать качество изониазида и рифампицина при совместном присутствии. Результаты экспериментальных исследований использованы в подготовке нормативной документации на данный лекарственный препарат.

Внедрение результатов исследования в практику

По результатам исследований разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка на «Изониазид с рифампицином, гранулы», получены акты апробации от ОАО «Тюменский химфармзавод».

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения влияния высокомолекулярных соединений на некоторые характеристики лекарственных веществ (изониазида и рифампицина) в растворе и в твердом состоянии. Итоги исследований по обоснованию состава гранул.

2. Выбор методов количественного анализа изониазида и рифампицина и результаты их применения при совместном присутствии.

3. Результаты использования тонкослойной хроматографии для ойределения изониазида, рифампицина и продуктов деструкции при совместном присутствии.

4. Результаты доклинических исследований гранул, содержащих изониазид и рифампицин.

Апробация и публикация результатов исследования

Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научных конференциях (г. Пятигорск, 2005-2009 гг.). По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе в журналах, рекомендуемых ВАК - 2.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия (номер государственной регистрации 01.2.00101060)

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 48 таблицы, 23 рисунка, состоит из "Введения", "Обзора литературы", 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 23 иностранных, и приложения.

Общие выводы: 1. Сравнительное изучение степени высвобождения изониазида и рифампицина в сочетании с ВМС (пектин, крахмал, КПН-1, ЫаКМЦ, БЦД ) методом диализа нт1хо, показало, что пектин может обеспечить постепенное высвобождение изониазида, а также повысить степень высвобождения рифампицина. Обоснован состав гранул: изониазид: рифампицин: пектин (1:1,5:1,5) и изучены их технологические характеристики.

2. Предложен способ спектрофотометрического определения изониазида и рифампицина в гранулах. Относительная погрешность не превышала: для изониазида - ±2,39%, для рифампицина - ±1,86%. Методика хорошо воспроизводима и не отягощена систематической ошибкой.

3. Предложена методика хроматографического разделения изониазида, рифампицина и продуктов их деструкции в тонком слое сорбента, которая позволяет идентифицировать и контролировать стабильность изониазида и рифампицина в гранулах.

4. Предложена методика капиллярного зонного электрофореза, с помощью которого установлено, что рифампицин подвергается деструкции раньше изониазида, а в гранулах его деструкция начинается раньше, чем в субстанции. Методом «ускоренного хранения» установлен срок годности 4 года для гранул изониазида с рифампицином.

5. В опытах на животных определена острая токсичность гранул изониазида и рифампицина, доза гранул, вызывающая смерть у 50% испытуемых мышей в 2,5 раза выше, чем ЛД50 изониазида в таблетках и в 1,7 раза больше, чем рифампицина в капсулах. Показано, что сочетание изониазида с рифампицином и пектином способствует понижению хронической токсичности как рифампицина, так и изониазида.

6. Сравнительное изучение фармакокинетических параметров изониазида в таблетках и рифампицина в капсулах и в разработанных гранулах показало, что предлагаемый состав гранул обеспечивает пролонгирование нахождения действующих веществ в крови.