Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Обоснование и разработка экспресс-методов контроля гигиенической безопасности среды обитания

На правах рукописи

СКАЧКОВ Виктор Борисович

ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ

14.00.07 — Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских, наук

Москва • 2002

Работа выполнена в Федеральном центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные консультанты:

академик МАНЭБ, член-корреспондент РАМН, профессор

Ю. П. Пивоваров

доктор медицинских наук, профессор

Г. М. Трухина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

В. В. Кор о лик А. М. Спиридонов А. И. Заиченко

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова

Защита состоится «15» апреля 2002 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.072.06 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, г.Москва, ул.Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета (117869, г.Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан «15» марта 2002 г.

"Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат медицинских наук Р. С. Волкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А1сгуалыюсть работы. Введение в действие Федерального Закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.99 г. № 52—ФЗ и других законодательных актов ставят перед Госсанэпидслужбой России новые задачи по сохранению и укреплению здоровья населения.

Учитывая сложившуюся в Российской Федерации санитарно-эпидемиологическую и социально-экономическую обстановку, продолжающиеся негативные процессы в состоянии среды обитания и здоровья населения, крайне важно сконцентрировать общие усилия на приоритетных направлениях профилактики заболеваний и выявлении основных ущербообразующих факторов окружающей среды (Оншценко Г. Г., Беляев Е. Н., Монисов А. А. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 1998 году», 1999).

В этой связи, реализация концепции гигиенической безопасности приобретает особую актуальность при выявлении реальной и потенциальной опасности для здоровья населения загрязнения среды обитания (Потапов А.И., 2000; Пивоваров 10. П., 1999; Лисицын Ю.П., 1997; Рахма-нинЮ.А., 2000; Новиков Ю. В., 2001; Подунова Л. Г., 2000; Тугельян В. А., 2001; Трухина Г. М., 2001).

В основе обеспечения биологической безопасности среды обитания, определения первоочередности и объема мер профилактики по отдельным инфекционным заболеваниям и пищевым отравлениям основная роль принадлежит совершенствованию лабораторного контроля за качеством объектов окружающей среды по показателям безопасности.

Негативные тенденции в последние годы выразились в увеличении удельного веса проб, не отвечающих требованиям гигиенических нормативов по химическим и микробиологическим показателям, соответственно: пищевых продуктов — 5,7% и 7,33% (1998 г.); воды поверхностных источников питьевого водоснабжения 27,6 % и 23,4 % (2000 г.).

Эпидемиологический риск заболеваний острыми кишечными инфекциями в Российской Федерации сохраняется. Так, в 1999 году было зарегистрировано 158 вспышек острых кишечных инфекционных заболеваний, обусловленных водным фактором, с числом заболевших 6077 человек и 433 вспышки острых кишечных инфекций с числом пострадавших 9269 человек, связанных с пищевым фактором.

В этих условиях большое значение приобретает разработка экспресс-методов диагностики для скрининговых исследований состояния естественных микробиоценозов среды обитания, факторов химического и биологического загрязнения и степенью их опасности для человека, что обеспечит в значительной степени повышение информативности и действенности Госсанэпиднадзора при решении приоритетных задач по оптимизации окружающей среды и охране здоровья населения.

Исследования выполнялись в рамках реализации «Концепции организации и развития лабораторного дела в системе Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации» и отраслевых программ Минздрава России «Эколого-гигиенические проблемы безопасности России и пути их решения (1997—2000 гг.) и «Системная разработка мероприятий по гигиенической безопасности России» (2001—2005 гг.).

Цель работы: Научно обосновать и разработать методологию экспрессной оценки гигиенической безопасности среды обитания дня здоровья населения, направленную на совершенствование форм, методов и качества лабораторного контроля в системе Госсанэпидслужбы России.

Исхода из поставленной цели были определены следующие основные задачи исследований:

1. Проанализировать состояние и динамику развития лабораторного обеспечения деятельности центров Госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации по контролю за качеством объектов окружающей среды, питьевой воды и продуктов питания по показателям безопасности, изучить возможность использования новых технологий по экспресс-диагностике за-

грязнения окружающей среды микробиологическими агентами и токсическими веществами различной природы, для обоснования путей совершенствования лабораторного контроля.

2. Доказать целесообразность и преимущества использования импе-дансных технологий для ускоренного проведешы микробиологических исследований различных объектов окружающей среды. Отработать методологию количественной оценки степени бактериального загрязнения исследуемых образцов и идентификации микроорганизмов.

3. Обосновать использование тест-биосистемы на основе инфузорий Тетрахимены пириформис, как индикаторного показателя опасного загрязнения питьевой воды и пищевых продуктов, учитывая высокую чувствительность инфузорий к токсическим химическим соединениям различной природы.

4. Показать целесообразность использования в практике Госсанэпид-службы России скрининговые экспресс-методы определения токсичности различных объектов окружающей среды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм».

5. Установить возможность определения загрязненности воды микроорганизмами и токсичными металлами с помощью хемшпоминес-ценции люминола на анализаторе ЛИК.

6. Апробировать для внедрения в практическую деятельность санитарно-гигиенических лабораторий метод инверсионной вольтамперометрии.

7. Обосновать модель лабораторного контроля гигиенической безопасности среды обитания с использованием экспресс-методов лабораторной диагностики.

Научная новизна н теоретическая значимость работы

Концептуально определены основные направления совершенствования лабораторного контроля, повышения качества и достоверности исследований, проводимых лабораторными подразделениями центров Госсанэпиднадзора Российской Федерации. Определена методология внедрения новых экспресс-

методов лабораторного контроля при осуществлении Госсанэпиднадзора, проведении санитарно-эпидемиологических оценок и экспертиз, а также сертификации соответствия пищевых продуктов, питьевой воды, парфюмерно-косметической продукции, фармацевтических препаратов и других объектов в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Научно обосновано методическое обеспечение и регламентирование микробиологического контроля гигиенической безопасности объектов окружающей среды с использованием импедансного метода, основанного на регистрации изменения проводимости питательной среды в результате жизнедеятельности микроорганизмов, что позволяет получить объективную информацию о качественном и количественном загрязнении исследуемых образцов различными видами микроорганизмов. Метод обеспечивает высокую воспроизводимость результатов, совпадающих с данными классических методов.

Показана возможность использования в качестве тест-объекта инфузорий Тетрахимены пириформис для ускоренной оценки загрязненности питьевой воды, пищевых продуктов различными токсикантами.

Обоснована методология и доказана эффективность применения скри-нингового экспресс-метода определения степени суммарной токсичности исследуемых объектов окружающей среды с помощью люминесцентного бактериального теста, основанного на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсических веществ.

Установлена способность люминола проявлять яркую хемилюминес-ценцию в щелочных растворах в присутствии пероксида водорода под воздействием инициаторов хемияюминесценции — микроорганизмов и токсичных элементов при оценке гигиенической безопасности питьевой воды и воды водоисточников.

Показана эффективность метода инверсионной вольтамлерометрии при обнаружении токсичных металлов в продуктах питапия, питьевой воде и других объектах в качестве альтернативного метода, основанного на электрохимическом концентрировании определяемого вещества на поверхности или в объеме стационарного электрода с последующим (инверсионным) растворением концентрата и фиксированием тока растворения (в некоторых случаях — потенциала).

Расширено представление о необходимости пересмотра существующей методологии и нормативно-методической базы санитарно-гигиенических, токсикологических и микробиологических исследований объектов окружающей среды с использованием современных методов экспресс-контроля при осуществлении Госсанэпиднадзора и ведении социально-гигиенического мониторинга

Практическая значимость работы

Определены условия обнаружения различных индикаторных микроорганизмов и токсикантов в питьевой воде, продуктах питания и других объектах, адаптированные к основным требованиям нормативных документов, действующих на территории Российской Федерации.

Результаты исследований позволили обосновать принципиально новые методические подходы лабораторного экспресс-контроля (метод измерения импеданса; биотестирование с помощью культуры простейших, лиофилизи-рованных культур люминесцентных бактерий; метод хемилюминесценции люминола; метод инверсионной вольтамлерометрии) ускоренного определения степени опасности для населения микробного и химического загрязнения продуктов питания, продовольственного сырья, воды различных источников водоснабжения, воздуха, почвы). Проведена их адаптация к нуждам современного санитарно-бакгериояогического мониторинга за качеством среды обитания.

Решена практическая задача по апробации и внедрению в практику экспресс-анализаторов «Бак Трак 4100», «Эколюм», «Лик», анализатора ТА-1, тест-системы на основе Тетрахимены пириформис.

Сформирована обширная информационная база калибровочных файлов для количественной оценки микробного загрязнения практически всех основных видов пищевых продуктов, питьевой воды и других объектов окружающей среды для обнаружения основных видов санитарно-показательных микроорганизмов в соответствии с действующими в России нормативно-методическими документами, регламентирующими их безопасность.

В процессе исследований система «Бак Трак 4100» прошла аттестационные испытания, была зарегистрирована и рекомендована к использованию в бактериологических лабораториях Госсанэпидсяужбы. Совместно с Госстандартом России проведены испытания системы, отработаны методики метрологической поверки, и прибор внесен в Государственный реестр средств измерений.

Результаты исследований использованы в следующих документах:

Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 1997 году». — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. — 155 с.

Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 1998 году».— М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. —222 с.

Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 1999 году».— М. : Федеральный центр гос-сашпидиадзора Минздрава России, 2000. —224 с.

Система аккредитации испытательных лабораторий (центров) государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. — М., 1997,—46 с.

Методические рекомендации «Использование инфузорий (Тетрахимена пириформис) в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер-2».— М.,1991. — 8 с.

Временные методические рекомендации по проведению бактериологических исследований с использованием микробиологического анализатора «БакТрак4100». —М., 1994. — 38 с.

Методические рекомендации по инверсионно-вольтамперометриче-скому определению токсичных элементов, витаминов в продуктах питания, продовольственном сырье, косметических изделиях и детских игрушках. — М„ 1995, —78 с.

Методические рекомендации по проведению бактериологических исследований с использованием микробиологического экспресс-анализатора <(Бак Трак 4100»,— ГКСЭН РФ № 01-19/6-23. — М, 1996. — 8 с.

Методические рекомендации по проведению бактериологических исследований питьевой воды с использованием микробиологического экспресс-анализатора ((БакТрак4100»,—ГКСЭНРФ№01-19/82-23,—М., 1996,—12 с.

Методические указания. МУК 4.2.590-96. Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора ((Бак Трак 4100». — М.: Информационно-издательский центр Минздрава России. 1997. —56 с.

Методическое пособие. Использование стандартных образцов дня контроля качества результатов количественного анализа.— М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1998. —21с.

Методическое пособие. Перечень фирм изготовителей стандартных образцов. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1998.—26 с.

Методические указания МУК 4.2-99. Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды поверхностных и подземных водоисточников. — М., 1999. — 28 с.

Сборник методический указаний. МУК 4.1.965—4.1.968.00. Определение концентраций химических веществ в воде централизованного хозяйственно-литьевого водоснабжения хемишоминесцентным методом.— М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 32 с.

Методическое пособие. Характеристика погрешностей методик выполнения измерений и нормы оперативного контроля результатов измерений.— М., 1998.—29 с.

Методическое пособие. Характеристика погрешностей и нормативы их оперативного контроля для методик выполнения измерений показателей состава и физико-химических свойств объектов санитарно-гигиенического контроля результатов измерений. — М., 2000. —21 с.

Методическое пособие. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсшсолого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды.— М., 1999. — 107 с.

Методические рекомендации. Оценка токсичности воздушной среды по интенсивности биолюминесценции бактерий.— М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 19 с.

Методические рекомендаций. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 18 с.

Методические рекомендации. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий.— М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 21 с.

Методические рекомендации. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эко-люм». — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000, —19 с.

Методические рекомендации по организации и проведению межлабораторных сравнительных испытаний. — М.: Федеральный центр госсашпид-надзора Минздрава России, 2001. — 30 с.

Методические рекомендации. Оценка токсичности спиртов и водок. Экспресс-метод с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. —12 с.

Методические рекомендации. Экспресс-метод оценки токсичности спиртов и водок с использованием люминесцентных микроорганизмов. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. — 14 с.

Методическое пособие. Методики испытаний пищевой продукции, допускаемые для целей подтверждения соответствия, характеристики погрешности результатов испытаний (измерений) и нормативы контроля их воспроизводимости, сходимости. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. — 91 с.

Результаты исследований внедрены в практическую деятельность лабораторных подразделений органов и учреждений Госсашпидслужбы Российской Федерации и используются для чтения лекций и проведения тематических и сертификационных циклов повышения квалификации специалистов государственной санэпидслужбы на кафедре социального гигиены и организации госсашпидслужбы с курсом основ лабораторного дела МПФ ППО ММА им. И.М. Сеченова.

Результаты исследований доложены и обсуждены на:

Международном семинаре для пользователей микробиологическими анализаторами (Москва, ФЦ ГСЭН, октябрь 1995 г.); Международном симпозиуме по пищевым зоонозам (Москва, 1995 г.); 2-м Международном Конгрессе «Вода: экология и технология» (Москва, 1996 г.); VIII Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, 1996 г.); VU съезде Всероссийского общества эпидемиологов (Москва, 1997 г.); Пленуме Лаборатор-

ного Совета Госсанэпидслужбы России (Москва, 1999 г.); Всероссийском семинаре-совещании по теме: «О совершенствовании деятельности санитарно-гигиенических лабораторий госсанэпидслужбы» (Москва, 2000 г.); Межрегиональной научно-практической конференции «Гигиена на рубеже XXI века» (Воронеж, 2000 г.); V Всероссийской научно-практической конференции «Метрологическое обеспечение сертификационных испытаний пищевой продукции» (Екатеринбург, 2001 г.) и заседаниях секций и секторов Лабораторного Совета Госсанэпидслужбы России.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Система лабораторного контроля в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия населения. Соответствие существующих методов санитарно-гигиенического, токсикологического и санитарно-микробиологического контроля безопасности объектов внешней среды требованиям оперативности проведения санитарно-противоэпидемических мероприятий.

2. Экспресс-методы контроля гигиенической безопасности объектов окружающей среды при скрининговых исследованиях (питьевой воды, пищевых продуктов, почвы, воздуха) с использованием:

- импедансной технологии (автоматизированная микробиологическая система «БакТрак 4100»);

- биологической тест-системы (инфузории Тетрахимена пириформис);

- люминесцентный бактериальный тест определения степени суммарной токсичности на приборе «Биотоке»;

- хемшноминесценции люминола на анализаторе «Лик»;

- инверсионной вольтамперометрии (прибор ТА-1).

3. Модель оптимизации системы Госсанэпиднадзора за безопасностью среды обитания на основе экспресс-методов лабораторного контроля, данных социально-гигиенического мониторинга и оценки факторов риска в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения,.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 научных

работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 268 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвящештой объектам и методам исследований, 7 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Список используемой литературы включает 332 работы, в том числе 155 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 31 таблицей, имеет 10 приложений.

ОБЪЕКТЫ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

С целью изучения состояния и динамики развития лабораторной деятельности органов и учреждений Госсанэпидслужбы России были проанализированы обобщенны данные центров Госсанэпиднадзора в субъектах

I

Российской Федерации: по совершенствовшшю организационной структуры лабораторного звена, по внедрению в практическую деятельность лабораторий новых, в том числе экспрессных методов лабораторного контроля, по повышению качества и достоверности лабораторных исследовшшй, по вопросам аккредитации испытательных лабораторий и лицензирования, по развитию методической и метрологической поддержки лабораторных исследований, а также по использованию современных санитарно-гигиенических, физико-химических, токсиколого-гигиенических и микробиологических методов исследования различных объектов окружающей среды по показателям безопасности для здоровья населения (без учета вклада вирусологических, паразитологических исследований, измерений физических факторов, ионизирующего и неионизирукяцего излучения). В работе использовались материалы представленные в сводных годовых статистических отчетах центров Госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации и соответствующих учетно-отчетных формах.

Для решения комплекса поставленных задач в работе были использованы современные микробиологические, токсикологические, химические и

статистические методы исследований. Экспресс-методики определения различных токсических веществ, патогенных и условно патогенных микроорганизмов отрабатывались с учетом действующих в Российской Федерации нормативно-методических документов регламентирующих безопасность для здоровья населения продукции, товаров, работ и услуг (табл. 1).

Таблица 1

Основные направления, объекты, методы и объем исследований

№ Направления Исследуемые Методы Объем

исследований, объекты показатели исследования исследований

1. Разработка методик Определение Импедансный ме-

экспресс-контроля за санитарно-показа- тод с помощью

микробным загряз- тельных, потен- анализатора

нением объектов циально патоген- «Бак Трак 4100», 2944

внешней среды: ных и патогенных классические ме- 297

- продуктов питания; микроорганизмов, тоды

- парфюмерно- КОЕ, 296

косметической коли-индекс 2652

- продукции;

- промышленной сте-

рильности;

- питьевой воды.

2 Исследование безопас- Определение ток- Биотестирование с 120

ности продуктов сичности помощью тест-

питания и питьевой системы культуры

воды с использованием простейших

тест-системы на основе

Тетрахимены пири-

формис

3 Отработка методик оп- Определение ин- Биотестирование с

ределения общей ток- тегральной ток- использованием в

сичности объектов ок- сичности качестве био-

ружающей среды с по- сенсора лиофили-

мощью люминесцент- зированных куль-

ного бактериального тур люминес- 27

теста: центных бактерий 36

- токсичных металлов; «Эколюм»

- органических и неор- 24

ганических 15

соединений; 45

- почвы; 33

№ Направления исследований, объекты Исследуемые показатели Методы исследования Объем исследований

- воздуха; - воды и донных отложений; - микогоксинов; - пестицидов 69

4 Обнаружение бактериального и химического загрязнения питьевой воды с использованием метода хемилюминес-ценции люминола Микробиологические показатели токсичные элементы Регистрация интенсивности хе-милюминесценции анализатором ЛИК 70 28

5 Использование метода инверсионной вольтам-перометрии для определения токсичных металлов в исследуемых объектах Токсичные элементы продукты питаиия Вольтамперо-мет-рический анализатор ТА-1 56

Для отработки методик ускоренного обнаружения и идентификации микроорганизмов с помощью импедансных технологий нами, впервые в России, был апробирован прибор «Бак Трак 4100» австрийской фирмы («У-ЬАВ».

В ходе экспериментов в качестве объектов внешней среды исследовались вода из р. Москва на разных этапах водоочистки, вода из артезианских скважин, колодцев, родников и вода питьевая из водопроводной сети, различные продукты питания, смывы с оборудования, парфюмерно-косметическая продукция и другие.

Исследования воды на микробиологическом анализаторе «Бак Трак 4100» проводились параллельно с классическими методами в соответствии с ГОСТ 18963—73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бакгериологического анализа». При этом использовались два классических метода исследования: мембранный и титрационный.

Исследования пищевых продуктов на приборе «Бак Трак 4100» осуществлялись по микробиологическим показателям в соответствии с «Медико-

биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов» (МЗ СССР, № 5061—89 от 01.08.89), СанПиНом 2.3.2.560—96. «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов», ГОСТами и другими нормативно-техническими документами. Параллельно образцы продуктов питания и продовольственного сырья исследовали классическими методами. Подготовка проб для исследования осуществлялась в соответствии с требованиями нормативно-методической документации, регламентирующей данный этап проведения микробиологических анализов.

Проводились экспериментальные исследования по обоснованию экспресс-методик обнаружения и оценки количественного и качественного загрязнения микроорганизмами исследуемых образцов продукции и адаптация их к требованиям нормативно-методической документации.

Построение калибровочных кривых проводилось с использованием компьютерной программы (Main Menu / Data Functions / Correlation) и выражалось уравнением корреляционной зависимости:

Log (CFU)= (Sloup) х (t) + (Constant), где: CFU - количество микроорганизмов в объеме исследуемого образца, Sloup - угол наклона, t - время детектирования, Constant - постоянная.

Для экспресс-обнаружения загрязнения пищевых продуктов, воды токсикантами различной природы нами была апробирована тест-система на основе культуры инфузорий Тетрахимены пириформис с использованием прибора «Биотестер-2».

При биотестировании воды контролем служила обычная водопроводная вода, соответствующая требованиям санитарных норм. При исследовании водных вытяжек из продуктов в качестве контроля готовились водные вытяжки из заведомо нетоксичных аналогичных продуктов, если такие отсугст-

вовали, то контролем служил 0,1 % раствор морской соли или хлористого натрия, приготовленных на дистиллированной воде, рН тестируемых растворов была в пределах 7—7,5, при температуре 20—28 °С и концентрации солей в пределах 0,5—1 %. Для получения токсичных проб в исследуемые образы воды или водных вытяжек из пищевых продуктов вносили различные концентрации токсоагентов (пестициды и т.д.).

При отработке процедур ускоренного метода определения токсичности различных объектов окружающей среды с помощью люминесцентного бактериального теста использовался биосенсор «Эколюм» (производящийся согласно ТУ 6-09-20-236-93). Исследовались пробы воздуха, почвы, питьевой воды, воды открытых водоисточников, пестициды различных групп.

В качестве анализатора использовался специализированный люмино-метр серии «Биотоке», предназначенный для проведения мониторинга за объектами окружающей среды. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Острое токсическое действие исследуемых образцов на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-минушый (в экспрессном варианте — 5 мин.) период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины — индекса токсичности «Т», равной отношению:

Т- 100 (1о-1)/1о, где 1о и 1 соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.

Оценка результатов проводилась по трем пороговым уровням индекса токсичности:

- допустимая стелет токсичности: индекс токсичности Т меньше 20;

- образец токсичен: индекс Т равен или больше 20 и меньше 50;

- образец сильно токсичен: индекс токсичности Т равен или более 50.

В качестве экспресс-метода обнаружения бактериального и химического загрязнения питьевой воды и воды поверхностных водоисточников был использован метод обнаружения микроорганизмов и токсических соединений на основе хемилюминесценции люминола с помощью анализатора «Лик». Были отработаны параметры люминольной реакции (интенсивность хемилюминесценции) в зависимости от концентрации анализируемых веществ.

Для обнаружения токсичных металлов в продуктах питания, питьевой воде и других объектах был апробирован метод инверсионной вольтамеро-метрии, с помощью анализатора ТА—1. В эксперименте отрабатывалась точность определения различных концентраций токсичных элементов', цинка, кадмия, свинца и меди.

Гигиенические исследования проводились совместно с д. м. н., профессором Подуновой Л. Г., Кривопаловой Н. С., Братиной И. В., Двоскиным Я. Г. — Федеральный центр Госсанэпиднадзора, при участии д. б. н., профессора Данилова В. С. — МГУ им. М. В. Ломоносова, д. б. н., профессора Ревазо-войЮ. А. — НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, д. т. н. Ишутина В А. — Военная академия химической защиты, специалистов Томского политехнического университета и ООО «НЛП Техноаналш», при непосредственном участии автора. Вклад автора в обобщение и анализ материалов — 100 %. Работа проведена с использованием традиционных методов и приемов санитарной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный анализ развития и совершенствования лабораторного обеспечения деятельности органов и учреждений Госсанэпидслужбы Российской Федерации показал, что одним из основных элементов оценки санитарно-эпидемиологической обстановки в Российской Федерации является получение органами и учреждениями Госсанэпидслужбы России объективной и достоверной информации о состоянии окружающей природной и производственной среды, о качестве проводимых гигиенических и противоэпидемиче-

ских мероприятий путем проведения лабораторного контроля.

Инструментом лабораторного контроля при оценке состояния окружающей природной, производственной среды является определение опасных и потенциально опасных доя здоровья человека факторов среды с использованием традиционных и современных методов исследования.

За период с 1995 г. по 2000 г. произошли существешше изменения в структуре лабораторных подразделений центров Госсанэпиднадзора (табл. 2.).

Таблица 2

Динамика структурных изменений лабораторных подразделений центров Госсанэпиднадзора в 1995—2000 гг.

№ Наименование подразделения 1995 1996 1997 1998 1999 2000 ±к 1995

1. Отделы (отделения, группы) по стандартизации и метрологии 92 92 91 100 100 106 + 14

2. Лаборатории санитарно-гигиенических отделов всего, из них: 773 840 904 924 948 953 +180

3. в центрах сельских районов 341 403 445 473 500 498 + 157

4. втч. межрайонные на базе сельских районов 156 148 154 169 178 178 +22

5. в т. ч. централизованные на базе республиканских, краевых, областных, окружных, городских центров 101 104 97 98 111 121 +20

6. Лабораторные группы в составе санитарно-гигиенических отделов всего, из них 1063 998 980 974 906 874 -189

7. в центрах сельских районов 954 879 856 848 784 767 -187

8. Отделения по определению остаточных количеств ядохимикатов всего, из них 300 284 295 304 319 314 +30

9. межрайонные на базе городских и районных центров 120 121 117 111 116 117 -3

10. Токсикологические отделения 68 73 70 67 65 65 -3

11. Отделения физико-химических методов исследования 120 133 132 125 143 158 +38

12. Бактериологические лаборатории всего, из них 2246 2250 2250 2210 2190 2209 -37

13. в центрах сельских районов 1656 1661 1653 1619 1610 1623 -33

14. централизованные лаборатории 76 77 90 80 98 102 +26

Так, количество лабораторий санитарно-гигиенических отделов возросло с 773 в 1995 году до 953 в 2000 году (прирост +180) за счет их образования на базе центров в сельских районах, число которых увеличилось с 341 до 498 в 2000 году (прирост +157). Количество лабораторных групп в составе санитарно-гигиенических отделов (в основном в центрах сельских районов) за это время сократилось и составило 874 против 1063 в 1995 году за счет их ликвидации (сокращение -189) и создания укрупненных межрайонных лабораторий, число которых возросло до 178.

Количество отделений по определению остаточных количеств пестицидов возросло до 314 при 300 в 1995 г., в то же время число токсикологических отделений сократилось с 68 в 1995 до 65 в 2000 году.

Общее количество бактериологических лабораторий в учреждениях службы за этот период снизилось с 2246 до 2209 за счет укрупнения лабораторий в центрах сельских районов.

Возрос объем исследований, проводимых лабораторными подразделениями центров Госсанэпиднадзора: в 2000 году санитарно-гигиеническими лабораториями центров Госсанэпиднадзора исследовано 5840629 образцов продукции (на 30,0 % больше исследований, чем в 1996 году); удельный вес современных сложных физико-химических методов увеличился на 21,1 % по сравнению с 1992 г.

За период с 1992 г. по 2000 г. произошло изменение структуры физико-химических методов исследований: увеличился удельный вес исследований, выполненных атомно-абсорбционным методом (более чем в 24 раза), хрома-тографичееким (более чем в 3,5 раза), а также инверсионно-вольтамперомег-рическим — на 17,7 % (за счет снижения полярографических исследований).

Токсиколого-гигаенические исследования проводились 54 центрами ГСЭН, при этом объем исследований увеличился с 50854 в 1995 году до 74818 в 2000 году. Помимо классических методов, в практическую деятельность токсикологических подразделений все шире внедряются альтернативные методы, такие, как определение индекса токсичности на

сперме крупного рогатого скота и метод люминесценции с использованием светящихся бактерий.

В настоящий момент бактериологические исследования выполняют 2209 лабораторий ЦГСЭН Российской Федерации: тенденция уменьшения количества лабораторий, наметившаяся несколько лет тому назад, прекратилась, и по сравнению с 1999 годом число лабораторий увеличилось на 19.

Количество бактериологических исследований по сравнению с 1996 годом существенно не изменилось (63604676 — 1996 г., 62876074 — 2000 г.), в то же время произошли изменения в структуре: в 1,15 раза возросло количество санитарно-бактериологических исследований (в 1,25 — исследований воды ив 1,35 раза — пищевых продуктов) за счет сокращения бактериологических исследований на патогенную флору и серологических (рис. 1).

70000000 «0000000 50000000 40000000 ■ 30000000 20000000 10000000

1996 1997 1998 1999 2000

•"■■— исследований всего 636М«7« 59273582 61248715 62079527 62876074

• бактериологические всего 26668502 22741974 22163453 21521766 21189716

—А~"сагатрко-бакгерналогнческие всего 34907266 34594150 37303447 38862374 39970395

• Серологические 2028908 1937456 1781815 1695387 1715963

Рис. 1. Структура исследований, выполненных бактериологическими лабораториями ЦГСЭН в 1996—2000 гг.

Действенным механизмом повышения качества и достоверности проводимых исследований является аккредитация лабораторий в «Системе аккредитации лабораторий Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации», внедрение нормативно-методических документов по контролю качества результатов измерений и проведение межлабораторных сравнительных испытаний, а также лицензирование деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

Центральным и Территориальными органами было аккредитовано на 01.01.2001 года и внесено в Реестр «Системы...» и Госреестр 947 Испытательных лабораторий и Испытательных лабораторных центра, в том числе ЦГСЭН в субъектах Российской Федерации — 681, научно-исследовательских и учебных медицинских институтов — 32, учреждений госсанэпид-службы министерств и ведомств — 91, ЦГСЭН на водном и воздушном транспорте — 31, ИЛЦ и ИЛ других ведомств — 61 (рис. 2).

□ИЛЦ ЦГСЭН субъектов Российской Федерации щИЛЦ ЦГСЭН на водном и возданном транспорте

□ИЛЦ научно-исследовательских н образовательных медицинских институтов

ЕЭНЛЦ госсанэпнделухбы ФУ «Медбноэкстреы», системы МПС к Министерства обороны

□ИЛЦ других ведомств

Рис. 2 . ИЛЦ субъектов Российской Федерации, аккредитованные на 01.01.2001 г.

За период функционирования «Системы аккредитации...» ЦОА подготовлено и переподготовлено более 2000 экспертов.

Анализ деятельности Центров Госсанэпиднадзора по развитию и совершенствованию лабораторного обеспечения на территории Российской Федерации показал, что лабораторный контроль проводится центрами Госсанэпиднадзора как при осуществлении ими функций государственного санитарно-эпидемиологического надзора, так и при проведении санитарно-эпидемиологической оценки продукции по показателям безопасности дня здоровья населения, при проведении сертификационных испытаний, а также при изучении влияния факторов среды на здоровье населения при ведении социально-гигиенического мониторинга.

Лабораторный контроль, осуществляемый в настоящее время подразделениями Центров Госсанэпиднадзора, включает в себя испытания и исследования продукции производственно-технического и бытового назначения, товаров, продуктов, в том числе пищевых, продовольственного и непродовольственного сырья, парфюмерно-косметических средств, иммунобиологических препаратов, а также природных и производственных (вода, почва, воздух) и биологических сред с использованием современных физико-химических, микробиологических и токсиколого-гигиенических методов исследования.

В то же время используемые в практике Госсанэпидслужбы России методы санитарно-гигиенического, токсикологического и санитарно-микробио-логического контроля за безопасностью объектов внешней среды для здоровья населения не в полной мере обеспечивают оперативность принятия решений при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий.

Классические методы оценки бактериальной загрязненности объектов окружающей среды сложны и трудоемки и занимают много времени: от 3 и более суток. В соответствии с действующей нормативной документацией определение общей микробной обремененности молочных продуктов и колбасных изделий составляет 72 часа, определение бактерий группы кишечной палочки в воде и молочных продуктах - 48 часов, исследования на промышленную стерильность - 5 суток, обнаружение коли-фагов в воде — 18 часов.

Для совершенствования качества и оперативности системы лабораторного контроля нами внедрены в практическую деятельность лабораторных подразделений Госсанэпидслужбы России экспресс-методы контроля за объектами окружающей среды как элемента охраны здоровья населения, профилактики пищевых токсикоинфекций и заболеваний, в связи с антропогенным загрязнением объектов окружающей среды (пищевых продуктов, продовольственного сырья, питьевой воды, атмосферного воздуха и др.).

С этой целью был апробирован и внедрен в практику импедансный метод качественного и количественного обнаружения и идентификации микроорганизмов в различных объектах окружающей среды с использованием наиболее распространенного прибора данного типа — анализатора «Бак Трак 4100» производства австрийской фирмы «ЗУ-ЬАВ».

Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов, в основе которого лежит изменение электропроводимости (импеданса) питательной среды за счет изменения ее химического состава, происходящего в процессе роста и метаболической активности микроорганизмов.

Электрические кривые, описывающие динамику роста микроорганизмов (изменение импеданса), имеют характеристические признаки, присущие отдельным видам микроорганизмов в определенной питательной среде и температуре термостатирования, что было положено в основу принципа идентификации микроорганизмов.

Главной отличительной особенностью микробиологического анализатора «Бак Трак 4100» является одновременная регистрация двух параметров: М-параметр — относительное измерение полного электрического импеданса (сопротивления + емкость) питательной среды и дополнительный электродный импеданс — Е-лараметр, показывающий относительное изменение импеданса в зоне двойного электрического слоя между электродами. Оба электрических параметра показывают высокую степень корреляции с кривой роста, однако сдвиги в концентрации ионов, происходящие в процессе жиз-

недеятельности микроорганизмов, сильнее влияют на Е-параметр, чем на М-параметр, который описывает весь объем образца, что существенно дополняет идентификацию микроорганизмов.

Для использования прибора на территории России были решены следующие задачи: адаптирован формат представления данных и расширен перечень определяемых микробиологических показателей в соответствии требованиям отечественных нормативно-методических документов; проведены сравнительные испытания для оценки воспроизводимости и точности результатов. Для оценки микробного загрязнения различных видов исследуемых продуктов были построены калибровочные кривые на разные виды микроорганизмов. В основу построения калибровочных графиков (файлов) положено измерение времени изменения импеданса пробы в зависимости от концентрации в ней микроорганизмов. При этом, чем выше степень загрязнения образца, тем меньше время изменения импеданса.

На этапе создания калибровочного файла проводили не менее 80 параллельных исследований каждого вида продукции, как классическим методом, так и автоматическим — с помощью прибора «Бак Трак 4100».

По окончании анализов результаты высева (КОЕ в 1 мл жидкого или в 0,1 г твердого продукта), полученные на чашках Петри, заносили в соответствующий файл программы.

Построение калибровочной кривой проводили в основном по М-пара-метру, численное значение которого составляло 5 %.

Статистическая обработка данных при построении калибровочных кривых проводилась автоматически в соответствии с программой калибровки.

Исследования проводились до получения коэффициента корреляции калибровочной кривой (г) не менее -0,92, что показывало высокую степень сходимости данных, полученных импедансным методом с классическими. Параллельно оценивалась зона дисперсии точек (величина 8ух не более 0,5), также характеризующая степень достоверности кривой (рис. 3).

File: RKTHA Teat: Rw MilMiMe<i.0aiA,M5*,ZlC Threshold M: 5 * Threstioid E: 10 * In Use: M-V-sIue No Limits

Correlation: lojfCFV) » -0.Z«1 * t + 8.8301 corrjlationfactor: r » -0.9152 Dispersion; 5yx « 0.4087

170 files used for correlation

о 2.5 s 7.5 12.5 17.5 22.s

0 2.s 5 7.5 12.5 17.5 22.5

1С«

7 i.S 6 5.5

г

Ч.Е 1

3.5 3 2.5 2 1.5 I

O.S 0

-0.5

СГЬ. „4

-лч. n •

• 4 « "4

N V 4

0 2 Л 6 8 10 12 H lo 18 20

21

hrs

Рис. 3 Корреляция между логарифмом численности микроорганизмов -log КОЕ (CFU) и временем определения импеданса -1 для 170 образцов молока с использованием среды BiMedia 001 А.

В полученное уравнение регрессии (уравнение калибровочной кривой) вводили максимально допустимое значение КОЕ (CFU) в 1 мл доя жидкого или в 0,1 г для твердого продукта, установленное соответствующим нормативным документом. Далее вычисляли логарифм КОЕ (CFU) и определяли из

уравнения значение времени (Ч), что позволило наглядно и оперативно определять уровень загрязнения образца.

Для отработки методики экспресс-контроля за качеством и безопасностью питьевой воды с помощью импедансного метода было выполнено 548 исследований: для определения ОМЧ — 143, колиформных бактерий — 143, бродильным методом — 251.

При определении ОМЧ импедансным методом пробы в объеме 1 мл засевали в измерительные ячейки прибора со средой В1МесНа 001 А, исследования проводили при температура — 37 °С, время наблюдения — 24 часа и пороговом значении М-параметра — 5 %. Учет результатов определения времени импеданса ЮТ проводили по М-параметру.

Параллельно эти же пробы исследовались классическим методом в соответствии с ГОСТ 18963—73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

При определении коли-индекса мембранным методом проводили концентрирование бактерий из определенного объема анализируемой пробы воды на мембранный фильтр. После фильтрации один фильтр переносили на чашку Петри со средой Эндо-С, а второй — в измерительную ячейку прибора со средой В1Ме&а 160В и проводили измерения при тех же параметрах прибора.

При определении коли-индекса бродильным методом проводили посев определенных объемов анализируемой воды в среды накопления (глюкозо-пептонная среда) с последующей 24-часовой инкубацией при 37 °С и высевом из объемов с признаками роста на дифференциальную среду Эндо-С и в измерительную ячейку прибора со средой В1Мес1ш 160 В.

В течение от 1 до 3 часов получали результаты на приборе, которые совпадали с результатами классического метода. При этом срок исследования при использовании прибора сокращался на 24 часа при отрицательных результатах и на 48 часов при обнаружении в засеваемых объемах бактерий группы кишечной палочки.

На основании полученных данных были построены калибровочные кривые доя подсчета ОМЧ и определения коли-индекса.

Для построения калибровочной кривой для подсчета ОМЧ были отобраны 79 файлов. Полученная калибровочная кривая имеет коэффициент корреляции г = - 0,8529 и время изменения импеданса t = 6,14 часа.

Калибровочная кривая дня определения коли-индекса была построена с использованием 52 файлов и имеет коэффициент корреляции г = - 0,8501, при времени изменения импеданса t = 11,43 часа.

При этом время необходимое для определения ОМЧ на приборе составило 6,1 часа, коли-титра методом мембранных фильтров — 11,4 часа, бродильным методом от 1 до 3 часов, а время определения этих показателей по ГОСТ 18963-73 составляет не менее 24 часов.

На рис. 4, 5 представлены типичные кривые импедансного сигнала при определении общего количества микроорганизмов (TVC) и при определении бактерий группы кишечной палочки методом мембранных фильтров.

File #: 1120-012 Position: 1 /13 Start: 20.11.1995 14:57:2 Finished

Threshold M: 10.36 hrs Threshold E: 8.8&hrs CFU: ------

Text: pr75 drinking water 1ml OMCH OOIA

Рис. 4. Типичная кривая импедансного сигнала при определении общего количества микроорганизмов (ТУС) с использованием питательной среды ЬШе&а 001А

File 0429-000 Position: 1/1 Start: 29.4.1996 12:38:43 Contaminated Threshold M: 9.32 hrs Threshold E: 6.66 hrs CFU: 1.1E+01 Text: prl52 drinking water 300ml filter Coliform 160B

Рис. 5. Типичная кривая импедансного сигнала при определении бактерий группы кишечной палочки методом мембранных фильтров с использованием питательной среды BiMedia 160 В

При проведении микробиологических исследований пищевых продуктов на приборе «Бак Трак 4100» нами были отработаны процедуры определения мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов с помощью среды BiMedia 001А, в условиях термостатирования — 30 °С и масштабе измерений М- и Е-параметров — 0—50 %. Результат определения КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого продукта. При исследовании твердых продуктов результат определения КОЕ (CFU) умножали ira степень разведения (х 10) для получения КОЕ в 1 г продукта.

Выявление бактерий группы кишечных палочек проводили на среде BiMedia 160 В при температуре 37 °С. Проба считалась контаминированной колиформами, если изменение импеданса превышало 5 % пороговое значение по М-параметру и 10 % пороговое значение по Е-параметру в течение 12 ч.

Определение сальмонелл проводили на среде BiMedia 201В с предварительным обогащением путем смешивания необходимого количества продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1 %

пептонной водой в течение 16—18 ч при 37 °С. Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса по Е-параметру превышало 15 % пороговое значение в течение 12 ч 30 мин.

Сальмонеллы на среде BiMedia 205А с предварительным обогащением выявляли путем смешивания необходимого количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1 % пептонной воды или средой Pre-Media 205А в соотношении 1:10 и инкубированием в течение 16-18 ч при 37 °С. Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса превышало 10 % пороговое значение по Е-параметру и 5% пороговое значение по М-параметру в течение 23 ч.

В случае положительного ответа на сальмонеллы проводилось обязательное подтверждение с высевом непосредственно из измерительной ячейки на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Типичная кривая импедансного сигнала при определении сальмонелл с использованием питательной среды BiMedia 205А представлена на рис. 6.

File i- 1031-031 Eositioa: 2/32 Start: 31.10.1996 13:40:58 Finished Threshold M: 7.55 hrs Threshold E: 12.36 hrs CTU: 8.0E+06 Text: Salmonella typhieuriuni 8.5E «37

4 к.

25 20 15 10

Gel

J

V.

25 %

15 10 5 0

/

v*

_t

0 2 i 6 8 10 12 И 16 18 20 hrs 0 2^68 10 12 H 16 18 20 hrs

Thresholds H( 52)= 7.38 hrs E ( 10%) = 12119 hrs

Рис. 6. Типичная кривая импедансного сигнала при определении сальмонелл с использованием питательной среды BiMedia 205А

Определение энтерококков проводили при помощи среды BiMedia 301А, при температуре 37 °С. Образец загрязнен энтерококками, если изменение импеданса превышало 5 % пороговое значение по М-параметру и 10 % по Е-параметру в течение 23 ч. Типичная кривая импедансного сигнала при определении энтерококков на среде BiMedia 301А представлена на рис. 7.

File 5: 0710-000 Position: 1/15 Start: 10.7.1995 17:19:44 Measureoent on

Threshold M:II.49 hrs Threshold E: 8.40 hrs CFTJ:---

Text:

Zgfl 10

30

20

!0

0

llZ <10

30

20

10

_t -r-O

0,

'6 2 1 6 S 10 12 H 16 «8 20 hrs "02168 10 12 14 16 13 '20 Ьгг Thresholds M ( 52) = I ( 10%) = 8..40

Рис. 7. Типичная кривая импедансного сигнала при определении энтерококков с использованием питательной среды BiMedia 301А

Экспериментальным путем нами были отработаны методические подходы определения и количественной оценки загрязнения пищевых продуктов следующими микроорганизмами: Staphylococcus aureus (среда BiMedia 350А), листериями (среда BiMedia 403А), дрожжей и плесеней с использованием непрямого метода определения изменения импеданса среды, сульфитредуци-рующих клостридий с использованием измерительных ячеек для анаэробов и питательной среды BiMedia 660-TEST, лактобацилл на среде BiMedia 620А, Bacillus cereus на модифицированной среде Мозеля, индикаторных показателей оценки парфюмерно-косметической продукции и определения ингиби-руюгцих в ещесгв.

Результаты проведенных исследований показали существенное сокращение в ремам микробиологических исследований анализируемых объектов с помощью анализатора «Бак Трак 4100» по сравнению с классическими. Так, при определении ОМЧ время анализа сократилось с 72 до 6—13 часов (в зависимости от степени обсемененности образцов), при определении БГКП с 48 до 5—10 часов, при обнаружении сальмонелл с 72 до 16 часов, плесени и дрожжей с 5 суток до 40 часов, лактобацилл — до 35 часов, консервов на промышленную стерильность до 12—14 часов и так далее. Наши исследования подтвердили высокую эффективность импедансного метода и показали, что систему «Бак Трак 4100» отличает высокая воспроизводимость результатов и их сходимость с данными классических методов до 96—98 %.

Внедрение в практическую деятельность 55 бактериологических лабораторий учреждений Госсаюпидслужбы России автоматизированной микробиологической системы «Бак Трак 4100» позволило обеспечить высокую точность и оперативность при скрининговых исследованиях большого числа проб.

Для экспресс-обнаружения загрязнения пищевых продуктов, воды токсикантами различной природы нами была апробирована и внедрена в практику тест-система на основе культуры инфузорий Тетрахимены пириформис.

Преимуществом использования инфузорий тетрахимена пириформис по сравнению с другими простейшими (парамециями, стилонихиями и др.) является большое сходство их биологической реакции с аналогичной реакцией высших организмов: наличие системы транспорта электронов, ферменты цикла Кребса, гемоглобин, высокая интенсивность обмена веществ, их быстрый рост, а также возможность работы со стерильной культурой и стандартным штаммом. Кроме того, у них лучше различимы фазы роста культуры, что позволяет использовать инфузории при оценке результатов.

В качестве тест-реакции использовался хемотаксис инфузорий, т.е. их уход из зоны, содержащей вредные вещества.

Измерение величины хемотаксической реакции проводили через 30, 45,

60 минут после помещения культуры в кювету и наслоения анализируемой пробы.

Поведенческая (хемотаксическая) реакция инфузорий, в отличие от других показателей ее жизнедеятельности, проявляется в первые минуты после контакта простейших с испытуемым веществом, и поэтому может служить критерием его безвредности.

Использование данного показателя особенно продуктивно на начальном этапе анализа и при большом количестве опытных образцов, что позволяет определить целесообразность дальнейших исследований, их направленность и объем. Примеры биотестирования приведены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты биотсстирования проб молочных продуктов

Пробы Время Экспозиция Среднее Среднее В%к Степень ток-

начала в мин. значение значение 3 контролю сичности

реакции 30 45 60 3 измерений проб

Контроль 10.00 200 184 213 199,0

10.02 178 200 206 194,0 195,1

10.04 208 164 203 191,7

Опыт 1 10.06 64 72 53 63,0

10.08 81 62 60 67,7 60,9 31,2 Токсична

10.10 61 52 43 52,0

Опыт 2 10.12 187 192 195 191,3

10.14 190 178 199 189,0 192,6 98,7 Нетоксична

10.16 203 194 196 197.6

Опыт 3 10.18 152 147 123 140,6

10.20 135 112 120 122,3 139,3 71,4 Малотоксична

10.22 166 171 128 155,0

Опыт 4 10.24 126 149 152 142.3

10.26 143 158 130 143,6 145,2 74,4 Малотоксична

10.28 132 157 160 149,6

Опыт 5 10.30 192 209 201 200,6

10.32 172 199 185 185,3 193,7 99,3 Нетоксична

10.34 207 186 193 195,3

Проявлением эффекта считали статистически достоверное различие в величине тест-реакции между контрольной (заведомо нетоксичной) и опытными пробами. Проведенные исследования позволили разработать критерии

оценки результатов. Предложена оценочная шкала степени токсичности объекта. Так если различие между опытной и контрольной пробой было статистически недостоверно, то испытуемая проба считалась нетоксичной, если различие не превышало 50 % — слаботоксичной, если различие превышало 50 % —токсичной.

Данный метод оценки продуктов питания, питьевой воды и других объектов был использован в ряде санитарно-гигиенических и токсикологических лабораторий.

В качестве экспресс-метода обнаружения токсических веществ различной природы нами было предложено и внедрено определение токсичности различных объектов окружающей среды с помощью люминесцентного бактериального теста. Метод основан на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения. Типичный отклик биосенсора на действие токсического соединения или их смеси представлен на рис. 8.

Введение поплютанта

время, МИН

Рис. 8. Типичный отклик люминесцентного бактериального биосенсора на действие токсического соединения

Основными параметрами тест-системы являются величины ЕС50 — концентрация известного вещества или объем пробы, вызывающие 50 % тушение свечение бактерий по сравнению с контролем; ЕС20 — концентрация известного вещества или объем пробы, вызывающие 20 % тушение свечение бактерий по сравнению с контролем, а также величина ЕС 10, определяющая порог чувствительности тест-системы.

В ходе проведенных исследований были отработаны условия и процедура проведения анализа, условия подготовки и использования биосенсора «Эколюм», а также методику оценки результатов измерений.

Отработаны в стендовых опытах определены величины ЕС50 для 9 токсичных металлов, наиболее часто встречающиеся как загрязнители окружающей среды, а также образцы водных растворов различных химических соединений.

Исследования по определению суммарной токсичности образцов проб почвы, отобранных в различных регионах Воронежской области в рамках решения проблемы определения причин массовых отравлений грибами населения Воронежской области, позволили установить, что более 60 % образцов почвы содержали водонерастворимые токсические вещества (тушение люминесценции колебалось от 16 % до 76 %).

Оценка суммарной токсичности воздуха, отобранного в различных районах г. Москвы, показала наличие воздухе Центрального административного округа водорастворимых токсических соединений, в воздухе Южного административного округа — наличие органических водонерастворимых токсических соединений. При этом снижение свечения биосенсора составляло от 29 до 40 %.

Изучение интегральной токсичности проб воды и донных отложений проводилось в Мытищинском районе Московской области. Исследования показали, что 57 % проб воды и донных отложений содержали токсичные соединения, при этом наблюдали значимые различия с контролем — р<0,05, индекс токсичности составлял от 52,0 до 95,0 %.

При исследовании зерна, зараженного грибами Fusarium, было показано, что действие токсиканта обнаруживается уже через 5 минут экспозиции

биосенсора с препаратом. При этом порогом достоверной чувствительности теста к дизоксиниваленолу (ДОН) является концентрация 0,5 мкг/мл (ЕС 10) (табл. 4).

Таблица 4

Динамика токсического действия препаратов микотоксина ДОН

Концентрация ДОН, мкг/мл Время экспозиции экстракта с биосенсером, мин

5 15 30

0,5 2,1 ±0,11 ±0,07 0

1,0 7,9+0,41 5,1 ±0,13 3,8 ±0,23

5,0 30,6 + 1,45 25,7 ± 1,02 23,7 ±0,98

7,5 40 Д ± 1,20 35,3 ± 1,54 32,8 ± 1,25

10,0 51,1 ±1,34 46,5 ±1,62 43,5 ±2,53

15,0 65,5 ±2,10 61,8 ±2,02 58,7 ±3,21

30,0 92,4 ±3,12 91,9 ±4,32 91,4 ±4,65

Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и экспрессности бактериального теста при анализе микотоксинов.

Тест-система «Эколюм» была использована при исследовании токсичности пестицидов, из них карборил и тетрахпорвинфос, а также гербицид мо-линат оказались наиболее токсичными: величина ЕС50 составила менее 5,35 мкг/мл; катионовые гербициды — наименее токсичными для бактерий: величины ЕС50 были выше 3000 мкг/мл; для карборила, карбофурана, диазинона и малатиона величины токсичности были близки к встречающимися в лите-ратуре,в то же время паракуат определен как менее токсичный.

В результате проведенных исследований нами определены основные преимущества люминесцентного бактериального теста: быстродействие — время анализа до 5 минут, точность и воспроизводимость результатов — ошибка эксперимента менее 5%; небольшие объемы исследуемого образца — от 0,01 до 1,0 мл; простота и экономичность — небольшое число вспомогательных операций, автоматическое определение индекса токсичности; стабильность биореагента — хранится без потери активности в течение 6

месяцев; высокая корреляция с действием на высшие организмы — 50 %-ное тушение свечения (ЕС50) коррелирует с ЛД50 для высших животных; автоматизированная малогабаритная регистрирующая аппаратура — люминометр позволяет проводить биотесгирование в лабораторных и полевых условиях, в режиме единичных измерений и непрерывного мониторинга с автоматической регистрации индекса токсичности; безвредность технологии.

Для оценки бактериального и химического загрязнения питьевой воды и воды поверхностных водоисточшжов был использован экспресс-метод на основе хемилюминесценции люминола. Минимальное количество бактериальных клеток в вегетативной форме, которое может быть обнаружено хеми-люминесцешным методом, составляет 2 КОЕ/см3. Определение проводят на хемилюминометре ЛИК. Время исследований — до 4—5 часов в зависимости от измеряемого показателя.

Наиболее удобным параметром для оценки люминольной реакции является интенсивность хемилюминесценции, которая имеет линейный характер зависимости от концентрации анализируемого вещества. Текущая интенсивность пропорциональна скорости реакции и зависит от морфологии, динамики роста микроорганизмов и количественного содержания в их клетках оксидоредуктаз.

1(мА)

120-

80 -■

40-

0

102

104 108

108 клетки/мл

Рис. 13. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации клеток в пробе

На основании проведенных экспериментальных исследований были разработаны методические подходы экспресс-определения санитарно-показа-тельных микроорганизмов: общего микробного числа, коли-фагов, лактозо-положительных кишечных палочек в воде поверхностных водоисточников, термотолерантных колиформных бактерий и общих колиформных бактерий в питьевой воде, коли-индекса воды подземных водоисточников с помощью реакции хемилюминесценции люминола в соответствии с действующими нормативными документами.

Наряду с этим были разработаны методические подходы по определению концентраций таких химических веществ, как железо, медь, хром и свободного хлора в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения хемилюминесцентным методом которые позволяют определять содержание этих веществ на уровне или ниже их предельно допустимых концентраций в воде.

При этом содержание ионов общего железа в литьевой и пресной воде определялось диапазоне концентрацией от 0,03 до 1,2 мг/дм 3. Чувствительность метода составляет 0,003 мкг. Ионов меди (П) в диапазоне концентрацией от ОД до 3,0 мг/дм 3. Чувствительность метода составляет В,0-Ю'3 мкг. Ионов общего хрома в питьевой и пресной природной воде хемилюминесцентным методом в диапазоне концентрацией от 0,05 до 1 мг/дм3 и остаточного свободного хлора в диапазоне концентраций от 0,01—2,0 мг/дм3 .

Так, исследования воды из чаши бассейна на наличие свободного хлора позволили определять его содержание на уровне 0,02—0,4 мг/л.

Разработана методика метрологической поверки основных характеристик прибора с помощью стандартного разведения красной кровяной соли (Кзр^аод.

Одним из направлений наших исследований явилось определение токсичных металлов в различных объектах внешней среды с использованием метода инверсионной вольтамперометрии, который апробирован и внедрен в практику учреждений госсанэпидслужбы. Метод был распространен на опре-

деление цинка, кадмия, свища, меди, ртути, мышьяка, олова, витаминов С, В1 и В2 в пищевом сырье, воде, пищевых продуктах и косметической продукции. Экспериментальные данные показали высокую чувствительность метода, предел обнаружения составил 0,00001—0,000001 мг/л(табл. 10).

Таблица 10

Результаты анализа проб на содержание микроколичеств цинка, кадмия, свинца и меди методом инверсионной вольтамперометрии

Анализируемая проба Средний результат анализа, мг/кг

1п са РЬ Си

Сухой сок «2ико» 0,97*0,32 0,0025*0,0009 0,0085* 0,002 0,055* 0,017

Сухой сок «2ико» с доб. Za 10,0; Са 0,003; РЬ 0,07; Си 0,4 мг/кг 9,78*2,89 0,0057±0,0019 0,072* 0,018 0,51*0,16

Лук репчатый 2,93*0,92 0,0093±0,0031 0,080* 0,020 0,96* 0,32

Лук с доб. Ъп 20,0; Сс10,02; РЬ 0,4; Си 3,0 мг/кг 20,70*5,90 0,031*0,010 0,54*0,16 4,88*1,75

Какао порошок 31,36*8,76 0,045±0,014 0,42*0,12 8,70*3,19

Какао с доб. '/л 30,0; Сс1 0,05; РЬ 0,7; Си 7,0 мг/кг 69,7*18,7 0,092*0,03 0,92*0,27 13,48*5,03

Мясо говядина 18,60*5,33 0,011*0,004 0,12*0,03 1,60*0,55

Мясо говядина с доб. Ъл. 20,0; Са 0,4 РЬ 3,0; Си 3,0 мг/кг 43,8± 12,0 0,47*0,14 2,63*0,85 4,07*1,45

Свекла 4,023*1,24 0,021*0,007 0,25±0,07 0,72*0,24

Свекла с доб. '¿п 70,0;Сс) 0,8; РЬ 5,0; Си 15,0 мг/кг 66,37* 17,86 0,73*0,21 6,13*2,09 17,11*6,45

Таким образом, на основании проведенных исследований было показано, что альтернативой классическим методам оценки гигиенической безопасности среды обитания могут бьггь методы экспрессной оценки, основанные на измерении импеданса, биотестировании с помощью культуры простейших, использовании лиофилизированных культур люминесцйггных бактерий, эффекте хемшпоминесценции люминола, инверсионной вольтамперометрии, характеризующиеся высокой чувствительностью,

точностью и обеспечивающие оперативность представления, информации дня управления качеством среды обитания.

Предложенная нами модель лабораторного экспресс-контроля гигиенической безопасности окружающей среды основана на двухэтапной оценке степени опасности исследуемых объектов: получении оперативной информации с помощью методов экспресс-контроля и идентификации биологических агентов и экотоксикантов для обоснования комплекса санитарно-противоэпидемических мероприятий (рис. 9).

Рис. 9. Модель совершенствования лабораторного контроля гигиенической безопасности окружающей среды

Модель может быть использована при осуществлении Госсанэпиднадзора, проведении санитарно-эпидемиологических экспертиз, производственного контроля, ведении социально-гигиенического мониторинга и в случаях возникновения чрезвычайных ситуаций и направлена на обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Материалы исследований использованы при разработке «Концепции организации и развитая лабораторного обеспечения в системе государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации».

ВЫВОДЫ

1. Данные о состоянии и динамике развития лабораторного контроля в системе Госсанэпидслужбы России позволяют констатировать изменения организационной структуры лабораторного звена, увеличение объема выполняемых исследований, повышение качества лабораторных исследований путем внедрения экспресс-методов оценки гигиенической безопасности среды обитания, позволяющих повысить оперативность и действенность государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

2. Разработана методическая основа и подтвержден принцип импедансной экспресс-технологии для количественной оценки микробного загрязнения продуктов питания и продовольственного сырья, питьевой воды, парфюмерно-косметической продукции в соответствии с действующими на территории Российской Федерации нормативно-методическими документами.

Экспериментальным путем обоснованы и созданы калибровочные стандарты критериальной оценки индикаторных микробиологических показателей (энтеробактерий, колиформных бактерий, кишечной палочки, сальмонелл, дрожжей и плесеней, энтерококков, псевдомонад, цереус, клостри-диум перфрингенс, листерий, золотистого стафилококка), определяющие степень опасности для здоровья населения загрязнения объектов окружающей среды. Результаты, полученные с применением импедансной технологии, показали совпадение с данными классических методов в 96—98 % случаев.

3. Обоснована принципиально новая технология оценки безопасности воды и пищевых продуктов в санитарно-токсикопогической практике с помощью биотест-системы простейших (инфузорий Тетрахимены пириформис). Разработана шкала степени токсичности проб на основе чувствительности инфузорий к изменению среды обитания, активной реакции на токсичные соединения и продукты роста и метаболизма микроорганизмов.

4. Научно обосновано применение метода определения степени суммарной токсичности исследуемых объектов окружающей среды с помощью люминесцентного бактериального теста для скрининговых исследований и мониторинга за загрязнением почвы, атмосферного воздуха, воды, продовольственного сырья микотоксинами, пестицидами и другими токсическими соединениями различной природы. Сходимость и воспроизводимость результатов определения тест-параметров составляет более 95 %.

5. Внедрен экспрессный метод обнаружения токсичных соединений и микроорганизмов в питьевой воде и воде природных источников с помощью прибора ЛИК на основе хемишоминесценции люминола, разработаны методические приемы определения количественных микробиологических показателей качества воды и определения содержания в ней токсичных соединений.

6. Показана высокая чувствительность метода инверсионной вольтаме-рометрии при обнаружении токсичных металлов в продуктах питания, питьевой воде и других объектах, позволяющая его использование в центрах Госсанэпиднадзора 1—2 уровня организационного построения в качестве метода, альтернативного полярографии.

7. Разработана модель оптимизации лабораторного контроля за гигиенической безопасностью среды обитания на основе использования комплекса экспресс-методов, позволяющих повысить оперативность Госсанэпиднадзора за качеством выпускаемой и реализуемой населению продукции по показателям безопасности. Эффективность разработанных методических приемов подтверждена результатами внедрения экспресс-методов контроля на территориях субъектов Российской Федерации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ЛапаевВ. Э., Скачков В. Б. Значение метода биопроб в токсикологической практике //В кн.: Актуальные вопросы гигиены и эпидемиологии. Сборник научных трудов 4 ГУ при МЗ СССР. — М., 1989. — С.45—47

2. Подунова Л. Г., КривопаповаН. С., Колпакова И. Д. и др. Микро-био-логический экспресс-анализатор «Бак Трак 4100» и возможность его использования в практике бактериологических лабораторий центров Госсанэпиднадзора// Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО). —М.,1994. — № 5 (14). — С.16—17.

3. Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Колпакова И. Д. и др. Опыт проведения бактериологических исследований с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100» // В кн.: Пищевые зоонозы. Материалы Международного Симпозиума. —- М., 1995. — С. 25—26.

4. Подунова Л.Г., Колпакова И. Д., Сорокина Р. С. и др. Опыт проведения бактериологических исследований с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100»// Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО). —М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1996. —№2(35). —С. 5-6.

5. Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Сорокина Р. С и др. Ускоренный метод оценки микробного загрязнения объектов окружающей среды при проведении социально-гигиенического мониторинга 11 Материалы У111—Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. Сборник научных трудов. — Т.2. —М., 1996. — С. 266—268.

6. Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Сорокина Р. С и др. Использование ускоренного метода обнаружения и идентификации микроорганизмов при проведении лабораторных исследований за безопасностью пищевых продуктов и продовольственного сырья // «Эпидемиология и инфекционные болезни». — М.,1996. — № 1. — С. 55—57.

7. Беляев Е. Н., Подунова Л. Г., Скачков В. Б. и др. Система аккредитации испытательных лабораторий (центров) государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. — М.: Минздрав России. — 1997. — 46 с.

8. Ишутин В. А., Стехин А. А., Яковлева Г. В. и др. Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды поверхностных и подземных водоисточников //Экологический вестник России. — М., 1999,— №5, — С.55—60.

9. Ишутин В. А., Стехин А. А., Яковлева Г. В. и др. Экспресс-метод определения микробиологических показателей качества питьевой воды, воды по-

верхностных и подземных водоисточников //Экологический вестник России. — М, 1999. — № 6,— С.54—58.

10. Беляев E.H., Барсуков Е. И., Братина И. В. и др. Межлабораторные сличительные испытания и достоверность результатов исследований // Партнеры и конкуренты. М.—1999 г.—№ 3,—С. 15—20.

11. Беляев Е. Н., Подунова JI. Г., Азевич 3. Ф. и др. Реализация «Концепции организации и развития лабораторного дела в системе государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. Сборник. —М.,

1999, —63 с.

12. Скачков В. Б. Люминесцентный бактериальный тест в мониторинге токсичности объектов окружающей среды. // Здоровье населения и среда обитания (ЗНиСО). —М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России,

2000,—№ 12 (35).- С, - 14-16.

13. Подунова Л. Г., Скачков В. Б., Барсуков Е. И. и др. Сборник материалов по аккредитации в «Системе аккредитации испытательных лабораторий (центров) государственной санитарно-эпидемиологической службы». Вып. 2-М.: Федеральный центр госсанэпиднадзораМинздраваРоссии,2001. — 156 с.

14. Подунова Л. Г., Скачков В. Б. Смирнов В. Н. Значение лабораторных исследований при осуществлении Госсанэпиднадзора по обеспечению санэпид-благополучия населения России // Среда обитания и здоровье населения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. — Т. 2. Оренбург,

2001, —С. 87— 89.

15. Скачков В. Б. Использование методов экспресс-контроля при проведении социально-гигиенического мониторинга // Гигиена: прошлое, настоящее, будущее: Научные труды Федерального научного центра гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана. — Выпуск 1. — М., 2001. — С. 209—211.

Список документов висдрения, опубликованных по теме диссертации

1. Долгов В.А., ЛапаевВ.Э., Скачков В. Б. Методические рекомендации «Использование инфузорий (Тетрахимена пириформис) в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер—2».— М., 1991.—8 с.

2. Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Колпакова И. Д. и др. Временные методические рекомендации по проведению бактериологических исследований с использованием микробиологического анализатора «Бак Трак 4100».— ГКСЭН РФ,—М.,1994, —38 с.

3. Иванов Ю. А., Слепченко Г. Б., Пикула Н. П., и др. Методические рекомендации по инверсионно-вольтамперометрическому определению токсичных элементов, витаминов в продуктах питания, продовольственном сырье, космети-

ческих изделиях и детских игрушках. МР №1-19/137-17. ГСКЭН РФ. — М., 1995, — 67 с.

4. Кривопалова Н. С., Колпакова И. Д., Сорокина Р. С. и др. Методические рекомендации по проведению бактериологических исследований с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100». ГКСЭН РФ №01-19/6-23. —М., 1996. — 8 с.

5. Подунова Л. Г., Кривопалова Н.С., Колпакова И. Д. и др. Методические рекомендации по проведению бактериологических исследований питьевой воды с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100». ГКСЭН РФ № 01-19/82-23. — М„ 1996. — 12 с.

6. Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Колпакова И. Д. и др. Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак4100». Методические указания. МУК 4.2.590-96. — М.: МЗ РФ. — 1997,— 56 с.

7. Брагина И.В., Ермаченко Л. А., Подунова Л. Г., Скачков В. Б. Использование стандартных образцов для контроля качества результатов количественного химического анализа. Методическое пособие. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1998. — 21 с.

8. Скачков В. Б., АзевичЗ.Ф., АзевичА. А. и др. Характеристика погрешностей методик выполнения измерений и нормы оперативного контроля результатов измерений. Методическое пособие. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1998. — 29 с.

9. Скачков В. Б., Брагина И. В., Королева Н. В. и др. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. Методические указания. МУК 4.1.787-99,—М.: Минздрав России, 1999. — 30 с.

10. Долгов В. А., Лапаев В. Э., Скачков В. Б. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколо-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. Методическое пособие. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. — С. 22—29.

11. Ластенко Н. С., Брагина И. В., Скачков В. Б. и др. Определение концентраций химических веществ в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения хемилюминесцентным методом. Сборник методический указаний. МУК 4.1.965-4.1.968.00. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. —32 с.

12. Беляев Е. Н., Подунова Л.Г., Скачков В. Б. и др. Характеристика погрешностей и нормативы их оперативного контроля для методик выполнения измерений показателей состава и физико-химических свойств объектов сани-

тарно-гигиенического контроля результатов измерений. Методическое пособие. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 21с.

13. Скачков В. Б., Брагина И. В., Ластенко Н. С. и др. Оценка токсичности воздушной среды по интенсивности биолюминесценции бактерий: Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000,—19 с.

14. Скачков В. Б., Брагина И. В., Ластенко Н. С. и др. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 18 с.

15. Скачков В. Б., Брагина И. В., Ластенко Н. С. и др. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий: Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 21с.

16. Скачков В. Б., Брагина И. В., Ластенко Н. С. и др. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального геста «Эколюм»: Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. — 19 с.

17. Брагина И. В., Ермаченко Л. А., ЕрохинаС. И., Скачков В. Б. Методические рекомендации по организации и проведению межлабораторных сравнительных испытаний. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001, —30 с.

18. Нужный В. П., Завьялов Н. В., Еськов А. П. и др. Оценка токсичности спиртов и водок. Экспресс-метод с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота. Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. — 12 с.

19. Ревазова Ю. А., ХрипачЛ. В., Нужный В. П. и др. Экспресс-метод оценки токсичности спиртов и водок с использованием люминесцентных микроорганизмов. Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. — 14 с.

20 ПаневаВ. И., ЗеньковаЕ. М., Пономарева О. Б. и др. Методики испытаний пищевой продукции, допускаемые для целей подтверждения соответствия, характеристики погрешности результатов испытаний (измерений) и нормативы контроля их воспроизводимости, сходимости. Методическое пособие. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. — 91 с.