Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Обнаружение прогностически значимых молекулярно-генетических маркеров для ранней высокоточной диагностики развития агрессивного пародонтита

На правах рукописи

Борискина Ольга Андреевна

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ МОЛЕКУДЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ РАННЕЙ ВЫСОКОТОЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ АГРЕССИВНОГО ПАРОДОНТИТА

14.01.14 - стоматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 о,чГ 2014

Москва-2014

005553711

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Зорина Оксана Александровна

доктор биологических наук

Ребриков Денис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Румянцев Виталий Анатольевич

профессор, заведующий

кафедрой пародонтологии ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия»

Минздрава России

академия»

доктор биологических наук,

Трубникова Елена Владимировна

заведующая

исследовательской

лабораторией

«Генетика»

научно-

ФГБОУ ВПО «Курский государственный университет»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Диссертационного совета (Д 208.040.14) в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117218, г. Москва, Нахимовский проспект, Д.Л9 и на сайте http://www.mma.ru Автореферат разослан «уД 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Басин Евгений

Михайлович

Защита состоится

2014 г. в

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия наметилась тенденция роста количества пациентов молодого возраста с диагнозом агрессивный пародонтит (АП). Тем не менее, прогресс, достигнутый производителями средств гигиены полости рта, не оказывает существенного влияния на снижение динамики распространения данного заболевания (Levin L., 2011).

Агрессивный пародонтит — воспалительно-деструктивное заболевание, возникающее у пациентов молодого возраста, для которого характерны быстрая деструкция тканей пародонтального комплекса, прогрессирующее разрушение кости альвеолярного отростка протекающее на фоне зачастую удовлетворительного уровня гигиены рта (Безрукова И.В., 2001). Точная последовательность событий, вызывающая запуск агрессивного пародонтита, остается невыясненной, но бесспорно, что деструкция тканей, стремительно прогрессирующее разрушение кости альвеолярного отростка, и, в конечном итоге, потеря зуба, у пациентов молодого возраста представляет собой результат реакции организма на инвазию пародонтопатогенов.

В результате длительных наблюдений была выявлена закономерность возникновения и развития агрессивного пародонтита у членов одной семьи (Michalowicz B.S. et al, 1991). Таким образом, вероятно, что речь идет не только об инфекционном факторе, но и о наследственной предрасположенности к этому заболеванию (Безрукова И.В., Грудянов А.И., 2002; Почтаренко В. А., 2005; Николаева E.H., 2007; Зорина O.A., 2011).

Исследования последних лет в области генетики и геномики человека в совокупности с данными биохимических и иммунологических исследований привели к накоплению огромного объема информации о взаимосвязи между наличием у индивидуума определенных аллельных вариантов генов и состоянием его здоровья. Различия между людьми на уровне отдельных генетических признаков определяют индивидуальную предрасположенность к наследственным и инфекционным заболеваниям, к развитию тех или иных

физических и умственных способностей, возможность длительной работы на вредных производствах, реакцию на фармпрепараты и т.д. (Genuis S.J. 2012). Поэтому крайне актуальным является поиск новых взаимосвязей генотипа человека и его фенотипических особенностей.

Сейчас уже ни у кого не вызывает сомнений, что знание индивидуальных особенностей ДНК позволяет предсказать вероятность развития тяжелых заболеваний. Задачей врача становится не только лечение заболевания, но и его предотвращение на основе детального изучения особенностей организма пациента и принятия адекватных профилактических мер. Быстрое накопление информации об индивидуальном полиморфизме генома человека, появление хорошо структурированных баз данных, создают предпосылки для интенсивного изучения ассоциации генетической и фенотипической компонент на индивидуальном уровне.

К настоящему моменту известен ряд генов, аллельное состояние которых предположительно влияет на вероятность развития пародонтита у данного индивида, а также на скорость прогрессии и тяжесть заболевания (Зорина O.A., 2011). Однако исследования генетических факторов пародонтита пока находятся в начальной стадии (Почтаренко В.А., 2005; Николаева E.H., 2007; Вишнягова H.A., 2009; Зорина O.A., 2011). Несмотря на высокую социальную значимость заболевания, и на фоне давнего и повышенного внимания, уделяемого профилактике стоматологических заболеваний, тематика генетической предрасположенности к агрессивным формам пародонтита остается открытым вопросом.

В этой связи крайне актуальной является задача поиска прогностически значимых молекулярно-генетических маркеров развития агрессивных форм пародонтита, а также разработка диагностических тест-систем для определения соответствующих генетических маркеров.

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики риска развития агрессивного пародонтита на основании выявленных молекулярно-генетических маркеров.

Задачи исследования

1. На основании анализа клинических и молекулярно-генетических исследований определить роль генетических факторов в развитии агрессивного пародонтита.

2. Провести клинико-лабораторное обследование пациентов для формирования группы с признаками агрессивного пародонтита и практически здоровых лиц.

3. Разработать тест-системы для определения выбранных молекулярно-генетических маркеров патогенеза агрессивного пародонтита.

4. Исследовать корреляцию индивидуального генетического профиля пациентов с развитием агрессивной формы пародонтита и определить гены, аллельное состояние которых влияет на вероятность развития агрессивного пародонтита.

5. Разработать алгоритм практического использования комплекса тест-систем для ранней высокоточной диагностики риска развития агрессивного пародонтита.

Научная новизна исследования

Впервые отработана методика отбора и последовательность участия пациентов для ранней высокоточной диагностики риска развития агрессивного пародонтита с использованием молекулярно-генетического тестирования.

Впервые на основании сопоставления клинических и молекулярно-генетических данных обследования пациентов была установлена частота встречаемости аллельных вариантов ряда генов с повышенной и пониженной вероятностью развития агрессивного пародонтита.

Впервые выявлена взаимосвязь полиморфизма гена ММР9 (вариант в в позиции ге 17576 и вариант Т позиции гя 3818242) с повышенной вероятностью развития агрессивного пародонтита.

Впервые выявлена взаимосвязь полиморфизма гена ЬЕРВ. (рецептор

лептина) в позиции ге 1137101 и гена Т№"1 (фактор ремоделирования нуклеосом) в позиции ге 13387042 в качестве генетических детерминант риска развития агрессивного пародонтита.

Практическая значимость

Разработан алгоритм комплексного обследования пациентов для оценки вклада генетической составляющей в развитие агрессивного пародонтита, который может быть рекомендован к внедрению в широкую практику клиницистов и клинико-диагностических лабораторий, а также для проведения популяционно-генетических исследований.

Создана методика практического использования новых молекулярно-генетических тест-систем для прогнозирования риска развития агрессивного пародонтита.

В процессе работы собрана коллекция геномной ДНК от пациентов с агрессивным пародонтитом европеоидной популяции г. Москвы, которая представляет самостоятельную научно-практическую ценность и может быть использована в медико-генетических исследованиях различного уровня.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Разработана система интерпретации результатов комплексного клинико-лабораторного и генетического анализа с целью прогнозирования раннего развития агрессивного пародонтита.

2. Обнаружены четыре новых генетических маркера предрасположенности к развитию агрессивного пародонтита у лиц европеоидной популяции г. Москвы. Обоснована их вовлеченность в процессы деструкции соединительной ткани пародонта при развитии агрессивного пародонтита.

3. Разработанная комплексная тест-система позволяет расширить возможности ранней высокоточной диагностики развития агрессивного пародонтита.

Внедрение результатов исследования

Разработанная комплексная тест-система на основе метода ПЦР «в реальном времени» для определения 4 генетических маркеров, ассоциированных с агрессивным пародонтитом, внедрена в серийное производство на производственных площадках ООО «НПО ДНК-Технология» (г. Протвино, Россия) и ООО «ДНК-Технология ТС» (г. Москва, Россия). Разработанные тест-системы используются в ряде клинико-диагностических лабораторий по всей территории РФ, ближнего и дальнего зарубежья.

Результаты исследования внедрены в работу кафедры Стоматологии ИПО Первого Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, в программу обучения клинических ординаторов, аспирантов, врачей-курсантов.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно и в полном объеме провел анализ литературных данных по теме исследования. С целью формирования выборок пациентов им лично разработана специализированная анкета и алгоритм отбора пациентов. Автор самостоятельно проводил обследование пациентов, анализ амбулаторных карт, данных рентгенологического обследования, разъяснял пациентам способ сдачи биоматериала. Диссертантом разработаны последовательности праймеров для создания диагностических тест-систем и выполнены эксперименты по установлению генотипа пациентов с помощью ПЦР в «реальном времени». Автором лично была проведена статистическая обработка полученных результатов и сформулированы выводы.

Апробация диссертации

Основные материалы диссертации доложены на: XIV Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2012г.); научно-практической конференции «Molecular genetics (NAT) In stomatology» (Молекулярная генетика в стоматологии) (Москва, 2012 г.).

7

Обсуждение диссертационной работы проведено на совместном заседании сотрудников кафедры Стоматологии ИПО Первого Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, отдела терапевтической стоматологии, отделения амбулаторной хирургической стоматологии, отделения клинической и экспериментальной имплантологии, отделения детской челюстно-лицевой хирургии, лаборатории биохимии, отделения ортопедической стоматологии, рентгенологического отделения, отделения профилактики стоматологических заболеваний, лаборатории микробиологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава РФ.

Публикации

По результатам исследования опубликовано 12 научных работ, в том числе 2 в зарубежных изданиях и 7 в изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав с результатами собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 14 таблиц, иллюстрирована 20 рисунками. Указатель литературы включает 152 источника, в том числе 27 отечественных и 125 зарубежных работ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту научной специальности 14.01.14 -стоматология; формуле специальности: стоматология - область науки, занимающаяся изучением этиологии, патогенеза основных стоматологических заболеваний (кариес зубов, заболевания пародонта и др.), разработкой методов их профилактики, диагностики и лечения; области исследований согласно пункту 2.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Клиническую часть исследования проводили на базе кафедры стоматологии ИПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова в отделении пародонтологии ФГБУ ЦНИИС и 4JIX Минздрава Российской Федерации.

В исследовании принимали участие 171 человек в возрасте от 18 до 45 лет без тяжелых общесоматических патологий. Из них 48 человек с диагнозом агрессивный пародонтит, 123 практически здоровых лиц, не предъявляющих никаких жалоб и без видимых клинических проявлений воспалительных заболеваний пародонта.

Перед проведением исследования была разработана анкета, отражающая необходимые для исследования параметры.

Для определения пародонтологического статуса пациентов при обследовании использовали клинические и рентгенологические методы.

Клиническое обследование пациентов начинали со сбора жалоб и составления анамнеза. На этом этапе особое внимание уделяли возрасту возникновения первых жалоб и их характеру, а также наличию или отсутствию подобных жалоб по линии ближайших родственников. Регистрировали количество зубов, наличие пломб, а также шинирующих и ортопедических конструкций.

Для оценки пародонтологического статуса измеряли глубину пародонтальных карманов при помощи градуированного зонда в области каждого зуба в 6 точках. Для максимальной объективизации и цифрового выражения уровня гигиены полости рта и степени воспаления тканей пародонта применяли стандартные методики определения индексов Silness-Loe и Muhlemann-Cowell, а для определения степени подвижности зубов индекс Miller в модификации Flezar. Степень поражения фуркации определяли по индексу Tarnow - Fletcher.

С целью уточнения диагноза и для оценки состояния костного субстрата в качестве дополнительного метода использовали цифровую ортопантомограмму.

При анализе рентгенограмм внимание уделяли наличию костных карманов, степени деструктивных изменений костной ткани, состоянию зоны межзубных перегородок, а также анатомическим особенностям строения корней моляров. Съемку проводили на аппарате ОгЙюрЬов ХС 5 («Бнопа», Германия).

Молекулярно-генетические исследования проводили на базе ФГБУН «Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова» РАН. В качестве биоматериала для проведения молекулярно-генетических исследований использовали слюну.

Все пациенты заранее были ознакомлены с условиями сдачи биоматериала. За 30 минут до процедуры сдачи слюны пациентам необходимо было воздержаться от чистки зубов, приема пищи и каких-либо жидкостей. Сбор слюны пациенты осуществляли самостоятельно в стоматологическом кабинете в специальные пробирки в количестве 1 мл. Каждой пробирке присваивали шифр, номер которого дублировался в индивидуальной анкете пациента. Таким образом, весь биоматериал в дальнейшем поступал в лабораторию в обезличенном виде. По окончании процедуры пробирку помещали на хранение в морозильную камеру с температурой минус 2°С. Транспортировку биоматериала в лабораторию осуществляли в специальных термоконтейнерах при температуре 4°С.

По результатам анализа литературных данных был проведен отбор генов-кандидатов на роль прогностически значимых молекулярно-генетических маркеров развития агрессивного пародонтита. Для исследования были разработаны тест-системы для определения полиморфизма следующих генов: стромелпзин (ММРЗ) в позиции ге3025058; металлоэластаза (фактор миграции макрофагов, ММР12) в позиции г$2276109; мембранносвязанная ММР (АБАМЗЗ) в позиции ге2280090;

ю

воспалительные хемокины CCL2 в позиции rsl024611, CCR2 в позиции rsl799864, CCR5 в позиции rs333; антивоспалительный хемокин (ЕРASI) в позиции rsl867785; рецептор лептина (LEPR) в позициях rsl 137100, rsl 137101 и rs8179183; у-ламинин, рецептор матрикса на поверхности фибробластов (LAMC1) в позиции rsl0911193; лимфоцит-специфичный рецептор эндотелиоцитов (LSP1) в позиции rs3817198; мерцательный фактор нейтрофилов (CNTF) в позиции rsl800169; лептин (LEP) -лимфокин ТН1 типа, агонист TNFa в позиции rs7799039; лимфокин смешанного ТН1/ТН2 типа IL18 в позиции rsl87238; лимфокин ТН1-типа IL12B в no3H4HHrRs3212227; лимфоцитарный рецептор интерлейкина-1 IL1R1 в позиции rs2234650; фактор ремоделирования нуклеосом (TNP1) в позиции rsl3387042.

Всего было разработано 18 тест-систем и 5 тест-систем были заимствованы из других работ и модифицированы (замена флуоресцентного красителя VIC на более яркий краситель HEX).

При конструировании тест-систем для картирования SNP использовали принцип «примыкающих зондов» (kissing probes). Принцип основан на анализе кривых зависимости интенсивности флуоресценции от температуры плавления при использовании аллель-специфичных зондов, меченых соответственно флуорофорами и гасителями. Для мечения флуорофором использовали два зонда, один из нуклеотидов которого соответствовал одному из двух возможных аллельных вариантов геномной ДНК человека. Зонд, меченый гасителем, соответствовал инвариантной последовательности, примыкающей к полиморфной позиции.

ПЦР и оценку результатов реакции осуществляли с помощью амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Использовали следующие параметры программы для ПЦР: 94°С - 10 с, 64°С - 20 с, 72°С - 10 с, реакцию проводили за 40 циклов. Измерение сигнала флуоресценции в зависимости от температуры проводили в интервале от

25°С до 80°С. Для повышения достоверности результатов каждую реакцию проводили в двух повторностях.

Таблица 1

Общее количество проведенных исследований

№ п/п Тип исследования Материал исследования Количество исследований

1 Разработка тест-системы для генотипирования по 23 образца слюны для каждой тест-системы 828 исследований

2 Клинические 48 пациентов с АП 123 здоровых лиц 171 исследование

3 Рентгенологические 48 пациентов с АП 123 здоровых лиц 171 исследование

4 Исследование полиморфизма генов цитокинов 48 пациентов с АП, 123 здоровых лиц 855 исследований

5 Исследование полиморфизма генов металлопротеиназ 48 пациентов с АП, 123 здоровых лиц 3078 исследований

Статистический анализ результатов осуществляли с помощью пакета Statistica 8.0 for Windows (Stat Soft Inc., США) и пакет программ Microsoft office 2010 (Microsoft, США). Оценку статистической достоверности различий проводили согласно критерию Пирсона у\ с поправкой Йейтса на непрерывность. Параметр OR (отношение шансов) рассчитывали с доверительным интервалом 95%.

Результаты собственных исследований и их обсуяедение Характеристика стоматологического статуса пациентов.

При обследовании пациентов диагноз «агрессивный пародонтит» устанавливали на основании характера жалоб и срока их возникновения, клинического осмотра, дополнительных методов исследования, таких как ортопантомография.

Более половины обследуемых пациентов с АП отмечали кровоточивость десны, впервые появившуюся в подростковом возрасте. Периодическое воспаление десны и гноетечение с момента возникновения заболевания, нередко с повышением температуры, отмечали все пациенты. Частота возникновения обострений со слов пациентов увеличивалась с

возрастом, а период обострения в среднем продолжался от 1 до 3 недель. При этом все пациенты отмечали резко возникающую или увеличивающуюся в этот период подвижность зубов, нередко болевые ощущения. Часть обследуемых пациентов самостоятельно проводила лечение, другая -обращалась за помощью к врачу-стоматологу. Из анамнеза было установлено, что 90% пациентов отмечали наследственную отягощенность по данному заболеванию со стороны родителей или ближайших родственников.

Основным клиническим показателем для установления диагноза АП являлось наличие пародонтального кармана, то есть потеря зубо-десневого прикрепления и объема костной ткани альвеолы. Другие анатомо-топографические особенности строения, например гиперминерализация эмали зубов, отсутствие истираемости, наличие травматического действия уздечек и тяжей, а при изучении рентгенограммы - дивергенция корней зубов, что ранее было указано в работе И.В. Безруковой (2001) как характерные признаки больных АП, также учитывались нами при постановке диагноза.

В группе с АП в 62% случаев, то есть, более чем у половины обследуемых пациентов в возрасте до 35 лет глубина пародонтальных карманов в среднем составляла от 6 до 10 мм. У 55% обследуемых отмечалось отсутствие первых моляров с обеих сторон, а у 22% отсутствие резцов нижней челюсти. Со слов пациентов, зубы были удалены по следующим причинам: высокая степень подвижности, абсцедирование, самостоятельное выпадение. Веерообразное расхождение фронтальной группы зубов верхней и нижней челюсти встречалось в 75% случаев. При изучении ортопантомограммы деструкция костной ткани - межзубных перегородок и альвеолярной ячейки в среднем была более 1/2-1/3 длины корня зуба.

Патологическая подвижность 11-111 степени выявлялась практически у всех пациентов. По степени тяжести пациентов с АП было решено не

13

разделять, так как процесс деструкции был значительным и данные о степени тяжести не имели решающего значения для нашего исследования.

Результаты рентгенологических исследований. Для максимальной объективизации данных клинического обследования прибегали к ортопантомограмме - одному из наиболее информативных и доступных методов исследования состояния зубочелюстной системы.

При обследовании с помощью ортопантомограммы у всех пациентов с АП были выявлены деструктивные изменения межзубных перегородок и альвеол. Отсутствие замыкательных пластинок, выявленное в 90% случаев, свидетельствовало об активном деструктивном процессе. Потеря высоты межзубных перегородок и костного субстрата альвеолы у всех пациентов носило генерализованный характер, тем не менее, степень деструкции отличалась на всем протяжении.

Так, наиболее выраженные деструктивные изменения выявлялись у 40% пациентов в области первых моляров и резцов. Отсутствие этих зубов, как упоминалось выше, было связано с их ранним удалением в основном по показаниям связанным с развитием патологии пародонта. Все это является характерными признаками агрессивного пародонтита - эти зубы первыми прорезываются и находятся дольше всего в полости рта, таким образом, это подтверждает концепцию возникновения и начала течения заболевания. У 25% пациентов степень деструкции костной ткани и потери межзубных перегородок составляла более 2/3 высоты.

Необходимо отметить, что в 40% случаев у пациентов с АП клиническая картина не соответствовала рентгенологической, при этом последняя регистрировалась как более неблагоприятная.

Дивергенция корней, описанная И.В. Безруковой в докторской диссертации (2001), выявлялась у 91% пациентов, что относится к отличительным признакам и косвенно подтверждает постановку диагноза АП.

Анализ взаимосвязи частот аллелей с фенотипом. Минимально

14

достоверному уровню различий при использовании критерия Пирсона соответствует величина х не менее 3,0. Из таблицы 2 видно, что при сравнении выборок пациентов выход этого параметра на значимый уровень наблюдается только для аллеля А в позиции ге17576 и аллеля С в позиции ге3918242 гена ММР9. Среди пациентов с агрессивным пародонтитом частота встречаемости аллеля А гена ММР9 в позиции ге17576 составила 55,2% по сравнению с 69,5% в группе контроля (рисунок 1). Фактор риска для аллеля А составляет 0,54 (95% С1 0,33-0,88): значение менее 1 свидетельствует о протективном действии аллеля А.

Таблица 2.

Распределение аллелей гена ММР9 в позиции «17576 и «3918242.

Ген Полиморфи зм Аллели Частоты аллелей Г(Р)

п АП п Здоро вые

ММР9 ге17576 А 48 0,552 123 0,695 6,25 (0,01)

в 0,448 0,305

ММР9 ге3918242 С 48 0,677 123 0,817 7,83 (0,005)

т 0,323 0,183

АП 45% ; ^^^^ Здоровые

Рис. 1. Частоты аллелей гена ММР9 в позиции «17576.

На рисунке 2 представлены частоты аллелей гена ММР9 позиции ге3918242 в группе здоровых и случая. Частота встречаемости аллеля С в группе случая была равна 67,7%, а в группе контроля она составила 81,7%. Фактор риска для аллеля С составляет (Ж=0,47 (95% С1 0,27-0,80), что также свидетельствует о протективном действии аллеля.

Рис. 2.Частоты аллелей гена ММР9 в позиции «3918242.

При расчете данных для остальных исследованных генов не было получено достоверной разницы, что говорит об отсутствии какой-либо взаимосвязи с развитием агрессивного пародонтита.

Анализ взаимосвязи частоты встречаемости генотипа с фенотипом.

Далее была проведена проверка гипотезы о недоминантном (рецессивном или кодоминантном) характере проявления исследуемых аллелей. Для этого анализировали частоты встречаемости не отдельных аллелей, а их комбинаций - генотипов. При этом также были выявлены достоверные различия между выборками. В таблице 4 представлены значения для гена ММР9 позиции ге17576.

Таблица 4

Распределение частот генотипов полиморфизма гена ММР9 в позиции Г817576.

Ген Полимор физм Генотипы Частоты генотипов О Р

п Случай п Контроль

ММР9 гэ17576 АА 48 0,313 123 0,488 3,62 0,06

Ав 0,479 0,415 0,35 0,55

0,208 0,098 2,86 0,09

На рисунке 3 видно, что для гомозиготного генотипа АА гена ММР9 позиции ге 17576 частота встречаемости в группе случая составила 31,3 %, а в группе здоровых пациентов была несколько выше — 48,8%. При расчете данных было установлено протективное действие данного генотипа -СЖ=0,48 (95% С1 0,22-1,02).

В выборке пациентов с агрессивным пародонтитом гомозиготный

генотип ОС того же гена встречался в 20,8% случаев, а в выборке контроля -в 2 раза реже и составлял 9,8%. Для гомозиготного генотипа (Ж составил 2,43 (95% С1 0,89-6,65), что говорит о повышенном риске развития заболевания у лиц, гомозиготных по аллелю в в указанной позиции. В обеих выборках пациентов гетерозиготный генотип Ав оказался наиболее представлен по сравнению с другими: он составил 47,9% для группы с агрессивным пародонтитом и 41,5% в группе контроля. Полученное при расчете значение (Ж=1,30 (95% С1 0,63-2,68) для гетерозиготного генотипа Ав, также как и в случае с гомозиготным генотипом Ов, позволяет говорить о негативном влиянии на возможность развития заболевания, хотя риск для гетерозигот в данном случае оказывается незначительным.

ММР 9 (г8 17576)

70% -,-

60%

Здоровые АП

Рис. З.Частоты генотипов гена ММР9 в позиции гч17^76.

Данные по генотипам ММР9 позиции гв3918242 также являются достоверными и представлены в таблице 5 и на рисунке 4. Наибольшая частота встречаемости установлена для генотипа СС: 54,2% - в выборке больных и 65,9% - в здоровой выборке соответственно. На втором месте по частоте встречаемости в обеих выборках находится генотип СТ: 27,1% -пациенты с агрессивным пародонтитом, 31,7% - группа контроля. При расчете СЖ для генотипа СС и СТ составил 0,61 (95% С1 0,29-1,28) и 0,80 (95% С1 0,36-1,78) соответственно, что указывает на их протективное

действие.

Таблица 5

Распределение частот генотипов полиморфизмов гена ММР9 в позиции «3818242.

Ген Полимор физм Генотипы Частоты генотипов Х2 2 р

п Случай п Контроль

ММР9 ге391824 2 СС 48 0,542 123 0,659 1,55 0,21

ст 0,271 0,317 0,16 0,68

ТТ 0,188 0,024 11,69 0,0014

Рис.4. Частоты генотипов гена ММР9 в позиции «3818242.

Частота встречаемости гомозиготного генотипа ТТ в выборке с агрессивным пародонтитом составила 18,8%, а в выборке здоровых пациентов была почти в 8 раз ниже и составила 2,4%. Относительный риск по гомозиготному генотипу ТТ составил 9,23 (95% С1 2,14-45,54), что говорит о выраженном влиянии этого сравнительно редкого генотипа на риск развития агрессивного пародонтита.

Подводя итог исследованию роли матриксина ММР9 в развитии пародонтита, можно констатировать, что в настоящее время с помощью самых различных методов (биохимических, физиологических и генетических) накоплен существенный массив данных, подтверждающих его важность.

В таблице 6 и на рисунке 5 представлены данные по группе контроля и

случая по гену ЬЕРЯ в позиции гэ1137101.

18

Таблица 6

Распределение частот генотипов полиморфизмов гена ЬЕРИ в позиции 137101.

Ген Полимор физм Генотипы Частоты генотипов Х2 о Р"

п Случай п Контроль

ЬЕРЯ гэ 113710 1 АА 48 0,563 123 0,715 3,00 0,08

Ав 0,417 0,228 5,21 0,02

0,021 0,057 0,36 0,54

При расчёте частоты встречаемости гомозиготного генотипа АА было установлено, что в выборке больных он составлял 56,3%, а в выборке здоровых пациентов частота встречаемость данного генотипа была выше в 1,2 раза и составляла 71,5%.

Частота встречаемости гетерозиготного генотипа Ав гена ЬЕРЯ в группе пациентов с агрессивным пародонтитом составила 41,7%, что оказалось в 2 раза больше, чем в группе контроля. Отношение шансов при расчёте по данному генотипу было 2,42 (95% С1 1,12-5,25), что говорит о его негативном влиянии на прогноз заболевания.

Для гомозиготного генотипа вв гена 1,ЕРГ< разница частоты встречаемости была невелика. Так, для группы пациентов с агрессивным пародонтитом она составляла 2,1%, а в группе здорового контроля - 5,7%.

ЬЕРИ (гв 1137101)

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Рис. 5. Частоты генотипов гена ЬЕРИ позиции гв! 137101.

Далее в таблице 7 представлены частоты встречаемости генотипов генаТЫР1 в позиции ге13387042.

"71.5

Здоровые АП

Таблица 7

Распределение частот генотипов полиморфизмов гена Т№1в позиции «13387042.

Ген Полимор физм Генотипы Частоты генотипов и 2 Р*

N Случай п Контроль

ТКР1 ге133870 42 АА 48 0,396 123 0,398 0,000 5 1,0005

Ав 0,292 0,455 3,18 0,07

0,313 0,146 5,10 0,02

Так частота встречаемости гомозиготного генотипа АА в выборке пациентов с агрессивным пародонтитом и здоровых пациентов оказалась практически одинакова и составила 39,6% и 39,8% соответственно (рисунок 6). Значение (Ж для гомозиготного генотипа АА составило 0,99 (95% С1 0,47-2,06), что не позволяет говорить о его влиянии на риск развития заболевания. Частота встречаемости гетерозиготного генотипа Ав в группе с агрессивным пародонтитом оказалась в 1,5 раза ниже по сравнению с контрольной группой и составляла 29,2%. Значение СЖ составило 0,50 (95% С1 0,23-1,06) и свидетельствовало о протективном действии гетерозиготного генотипа. Напротив, гомозиготный генотип Ой в выборке пациентов с агрессивным пародонтитом встречался в 2 раза чаще по сравнению с группой контроля, составляя 31,3% всей выборки. Расчет отношения шансов по данному генотипу также свидетельствует о его повышенном влиянии на риск развития заболевания, составив 2,65 (95% С1 1,12-6,27).

(гэ 13387042)

60%

Здоровые АП

Рис. 6. Частоты генотипов генаТ№1 в позиции «13387042.

Что касается гена фактора ремоделирования нуклеосом, то его биологическая роль в патогенезе развития АП остается неясной.

20

Выводы

1. В патогенезе агрессивного пародонтита доказана роль генетических полиморфизмов, которые могут быть использованы в качестве диагностических критериев при ранней диагностике заболевания.

2. На основании анализа данных клинико-лабораторного исследования и анкетирования разработан алгоритм идентификации повышенной вероятности развития агрессивного пародонтита у лиц с отсутствием клинических признаков заболевания.

3. Разработано 18 тест-систем для определения полиморфных генетических маркеров и собрана уникальная коллекция геномной ДНК от пациентов с агрессивным пародонтитом, представляющая европеоидную популяцию жителей г. Москвы.

4. Показана взаимосвязь между наличием аллельного варианта О в позиции ге 17576 и аллельного варианта Т в позиции ге3918242 в промоторе гена ММР9 (желатиназа 2), приводящих к суперпродукции фермента, и повышенным риском развития агрессивного пародонтита. Эффект аллельных вариантов проявляется по доминантному или кодоминантному принципу.

5. Впервые показана перспективность использования гена Т1МР1 (фактор ремоделирования нуклеосом) и гена ЬЕРЯ (рецептор лептина) в качестве генетических детерминант риска развития агрессивного пародонтита.

6. Разработанный алгоритм, включающий в себя клинические и лабораторные методы обследования в комплексе с тест-системой, позволяет провести раннюю высокоточную диагностику риска развития агрессивного пародонтита.

Практические рекомендации

1. Разработан алгоритм отбора пациентов с агрессивным пародонтитом и без признаков поражения пародонта для направления на генетическое обследование, который рекомендуется к внедрению в широкую клинико-лабораторную практику для выявления предрасположенности к развитию агрессивного пародонтита.

2. Отработанная методика определения аллельного состояния мононуклеотидных полиморфных позиций на основе ПЦР в реальном времени в варианте «стыкующихся зондов» совместима с коммерчески производимыми наборами для генотипирования, панели которых могут быть быстро пополнены. Это позволяет рекомендовать её для непосредственного использования в стоматологической практике и для популяционных медико-генетических исследований.

3. Неинвазивный метод выделения ДНК из слюны имеет широкий потенциал применения в стоматологической практике, так как удобен для пациента, экономит время и материалы по сравнению с традиционным способом выделения ДНК из крови. Он может быть рекомендован для использования стоматологами различных специальностей.

4. Подготовлены практические рекомендации для проведения профилактических мероприятий у пациентов при выявлении повышенного риска развития агрессивного пародонтита с использованием комплексной тест-системы.

5. Полученные данные клинических и молекулярно-генетических исследований могут служить эффективной моделью при создании аналогичных методов высокоточной диагностики других стоматологических заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кулаков A.A., Зорина O.A., Борискина O.A. Роль защитных факторов организма в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта.// Стоматология. - 2010. -№6. - С.72-76

2. Кулаков A.A., Зорина O.A., Борискина O.A. Генетические факторы в развитии заболеваний пародонта. // Российский стоматологический журнал,-2011.-№1.-С.48-51.

3. Зорина O.A., Кулаков A.A., Борискина O.A., Ребриков Д.В. Взаимосвязь полиморфизмов генов ММР2 и ММР9 с развитием заболеваний пародонта. // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2011. -№2. -С.49-52.

4. Зорина O.A., Борискина O.A., Ильинский В.В., Ребриков Д.В. Взаимосвязь аллелей генов некоторых цитокинов со скоростью прогрессии и тяжестью пародонтита. // Стоматология для всех. -2011. - №2. - С. 26-31.

5. Зорина O.A., Борискина O.A., Ребриков Д.В. Ассоциация аллелей генов цитокинов с воспалительными заболеваниями пародонта у человека // XVI международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии» - Санкт-Петербург, 1618 мая 2011г.-С.83-85.

6. Зорина O.A., Борискина O.A., Леонович O.A., Ребриков Д.В. Генетические факторы предрасположенности к развитию агрессивного пародонтита: белки матрикса, матриксины и их регуляторы // Стоматология. - 2013. — №1. - С.76-83.

7. Зорина O.A., Борискина O.A., Ребриков Д.В. Взаимосвязь полиморфизма генов с риском развития агрессивного пародонтита // Стоматология. - 2013 - №4. - Т. 92. - С. 28-30

8. Зорина О.А., Борискина О.А., Аймадинова Н.К., Ребриков Д.В. Цитокины и их роль в развитии агрессивного пародонтита // Фарматека. Спецвыпуск. Стоматология. - 2013. - №s3 - 13, С.39-43

9. Зорина О.А., Борискина О.А., Ребриков Д.В., Аймадинова Н.К. Анализ взаимосвязи частот аллелей с риском развития агрессивного пародонтита // Сборник научных трудов по материалам международной заочной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика». Воронеж. - 2013. - №1(1). -С.238-244.

10. Зорина О.А., Борискина О.А., Ребриков Д.В. Генетические факторы предрасположенности к развитию агрессивного пародонтита: белки матрикса, матриксины и их регуляторы // Сборник трудов X Всероссийсокй научно—практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии»// Дентал-Ревю '2013. - 11-13 февраля. - С.88-90.

И. Zorina О.А., Boriskina О.А., Aymadinova N.K., Rebrikov D.V. The relationship of genetic polymorphisms with the development of aggressive periodontites // Сборник материалов I Международной научной конференции "Global Science and Innovation". - Chicago, USA. - 2013. - p. 387-392

12. Zorina O.A., Boriskina O.A., Aymadinova N.K., Rebrikov D.V. Analysis of the relationship of allele frequencies of the risk of aggressive periodontitis // The Way of Science. -№1(1), 2014.-p. 184-189.

Подписано в печать: 26.09.2014 Тираж: 100 экз. Заказ № 1211 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.iu