Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Об иммунобиологических свойствах молокина

На правах рукописи КАЗЬЯНИН АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

ОБ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВАХ МОЛОКИНА

14.00.36 - АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на сонскаиие ученой степени кандидата медицинских наук

\

Пермь -1998

Работа выполнена в Пермском НПО "Биомед"

Научные руководители: академик РАЕН,

доктор медицинских наук,

профессор

В.Ф. Петров

чл.-корр. МАНЭБ,

доктор медицинских наук, профессор В.В. Юшков

Официальные оппоненты:

академик МАНЭБ, доктор медицинских паук, профессор С.Н.Теплова кандидат медицинских наук, доцепт Ю.И.Шилов

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт вакцин и сыворотк им. И.И.Мечникова

Защита состоится МО^ 1998 г<) вчасов

на заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г.Пермь, ул. ГолеваДЗ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических паук

И.Б.Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Интенсивное изучение в последние годы функционального состояния иммунной системы при заболеваниях различной природы (Ершов Ф.И. с соавт.,1990; Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1990; Арци-мович Н.Г. с соавт.,1994; Герасун Б.А., Данилейченко И.В.,1994; Петров Р.В. с соавт.,1994), выявило неоспоримую связь между особенностями клинического проявления того или иного заболевания с дефектами клеточного и гуморальных звеньев иммунитета. Это оказало существенное влияние на формирование научных и практических основ иммунофармакологии (Утешев Б.С., Коро-стылев С.А.,1990; Земсков В.М., Земсков 'А.МД996;' Юшков В.В. с со-авт.,1996), а так же на принципы, тактику и методы фармакотерапии патологических процессов и заболеваний (Ганова Л.А.,1995; Земсков А.М., с со-авт.,1997).

Одной из актуальных задач современной медицины является расширение арсенала средств, используемых для иммунореабилитации больных. В этой связи поиск иммунокорректоров, обладающих различной иммунотроп-ностью и позволяющих управлять лечебным процессом в зависимости от особенностей этиологии и патогенеза заболеваний (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х.,1989;1996; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В.,1996) представляется важным и необходимым. . • , -

Определенные перспективы в плане создания иммунокорректоров открывают исследования Морозова В.Г., Хавинсона В.Х.(1987-1996), Эпштейна Л.М. (1992), ПетроваВ.Ф., Юшкова В.В.(1993), показавшие возможность использования органов и тканей, включая продукты переработки рыб (Хавинсон В.Х., Эпштейн Л.М., Петров В.Ф., 1989-1996) для получения природных иммуностимуляторов.

Исходя из вышеперечисленных предпосылок, представлялось актуальным и обоснованным получить из семенников лососевых рыб биологические активные вещества и изучить их свойства.

Решение задачи создания новых иммунокорректоров тесно сопряжено не только с их получением, характеристикой специфических иммунофарма-кологических свойств, но и разработкой экологически чистых технологий промышлешгаго производства препаратов этого класса.

Цель работы. Разработка технологии получения иммунокорректора из семенников лососевых рыб, характеристика иммунобиологических свойств препарата.

Задачи исследования:

1. Разработать и масштабировать экологически чистую технологию промышленного производства молокина.

2. Выявить и изучить иммунотропные свойства молокина.

3. Охарактеризовать аллергенные и мутагенные свойства молокина.

4. Выявить анальгетические и противовоспалительные свойства молокина.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые выявлена и изучена иммунотропная активность молокина, охарактеризованы его аллергенные, мутагенные, анальгетические и противовоспалительные свойства.

Теоретическая значимость работы заключается в том, что в ходе проведенного исследования подтверждена принципиальная возможность использования продуктов рыбопереработки в качестве перспективного сырьевого источника для получения иммунокорректоров, существенно расширены представления о биологической и иммунофармакологической активности цитоме-динов.

Практическая значимость работы определяется тем, что разработана экологически чистая технология промышленного производства иммунокор-

ректора (молокина) из семенников лососевых рыб. Приоритетность способа : выделения и очистки защищена патентом на изобретение (КГ 2091073) «Способ получения иммуностимулятора».

Разработанный способ выделения и очистки полипептидов, в том числе из семенников рыб, позволяет создавать промышленные экологически чистые технологии для получения препаратов этого класса.

Создан новый иммунокорректор, применение которого после проведения клинических испытаний может быть показано для повышения сниженной инфекционной патологией резистентности организма, коррекции иммунодефицитных состояний и обеспечения эффективности вакцинации.

Результаты исследований:

О легли в основу создания НТД (регламента, ВФС и инструкции по применению) на молокин для его промышленного производства на Пермском НПО "Биомед";

П использованы при чтении лекций для студентов и слушателей факультета повышения квалификации по курсу биотехнологии и иммунологии в Пермской фармацевтической академии.

Положения, выносимые на защиту.

¡.Пептид, выделенный из семенников лососевых рыб, обладает высокой биологической активностью, проявляющейся иммунотропным, анальге-гическим и противовоспалительным действием.

2.Иммунотропная активность молокина характеризуется активацией фагоцитоза, повышением пролиферативного ответа лимфоцитов на митогены, увеличением количества антителообразующих клеток, усилением синтеза антител, восстановлением показателей иммунитета при лекарственном иммунодефиците. „-

3.Молокин не обладает аллергенными и мутагенными свойствами.

4.Молокин повышает порог болевой чувствительности у лабораторных животных в тесте "уксусных корчей", тормозит развитие агарового воспаления, механизм угнетения последнего связан с активацией синтеза антител к медиаторам воспаления (гистамину и серотонину).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научной конференции «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии»,(Томск,1991); Всероссийской научной конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики»,(Пермь, 1993); научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», (Пермь, 1994); 50-й научно-практической конференции Пермской фармацевтической академии, (Пермь, 1994); 4 и 5 Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1997; 1998); на Всероссийской конференции «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (Челябинск, 1997).

Диссертационная работа прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета НПО «Биомед» (Пермь,1998); на заседании лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (15 октября 1998 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 разделов результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (121 отечественных и 25 иностранных источников). Диссертация изложена на 128 страницах, включает 23 таблицы и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

Анализ физико-химических свойств препарата осуществлен в соответствии с требованиями Государственной XI Фармакопеи (1987). Подлинность молокина определялась спектрофотометр ически. Анализ осуществлен на спектрофотометре СФ-46. Молекулярная масса препарата изучена методом гельхроматографии на автоматической системе «LKB»,(Швеция). Использовали колонку размером 60 х 1,6 см, заполненную сефадексом G-75(«Pharmacia»,Швеция). Фракции собирали с помощью автоматического коллектора с проточным УФ-детектором при длине волны 206 нм. Для калибровки колонки применяли стандарты белков и пептидов, имеющих молекулярную массу от 461Д до 43000Д («Pharmacia»,Швеция, «Serva»,ФРГ).

Количественное определение пептидов в исследуемом препарате проводили на фйтоэлектроколориметре с использованием зеленого светофильтра (длина волны 540+10 нм).

Биологическая активность молокина исследована на 790 мышах линий СВА и С57В1 массой 18-20 г, 50 крысах массой 120-140 г и 30 морских свинках массой 250-300 г.

Экспериментальное изучение иммунотропной активности молокина проведено в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке: ¡и изучению иммуномодулирующего действия лекарственных средств» (Москва,1984.) и «Методическими рекомендациями по оценке иммунотокси-ческих свойств фармакологических средств» (Москва,1992.)

Об иммунотропном эффекте молокина судили по изменению числа ан-гителообразующих клеток (АОК) (Jeme К, Nordin А., 1963), титра гемагглю-гининов, массы и клеточности тимуса, селезенки, жизнеспособности клеток органов иммунитета, выраженности реакции гиперчувствительности замед-

ленного типа (ГЗТ), макрофагального и нейтрофильного фагоцитоза, реакции бласггрансформации лимфоцитов на Т- и В- клеточные митогены, способности восстанавливать рецепторы в реакции активного розеткообразования (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х.,1989).

Животных иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой корпускулярного тимусзависимого антигена - эритроцитами барана (5106 эритроцитов). Молокин в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг вводили парентерально за 1 час до иммунизаци. Контрольным мышам инъецировали внутрибрюшинно то же количество изотонического раствора натрия хлорида.

В опытах на мышах была осуществлена первичная сравнительная оценка цитомединов: тималина молокина на модели экспериментального иммунодефицита. Дефект иммунной системы моделировали внутрибрюшинным введением пиклофосфана в дозе 100 мг/кг. Об иммунотропном эффекте цитомединов в этой модели судили по изменению массы и клеточности тимуса и селезенки, жизнеспособности их клеток, количества ранних и поздних розет-кообразующих лимфоцитов (Порядин Г.В. с соавт.,1984; Лозовой В.П. с со-авт.,1986), числа АОК и титра гемагглютининов.

Изучение аллергенных свойств молокина проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» (1988).

Анафилактогенные свойства молокина изучены на пестрых морских свинках, которых сенсибилизировали препаратом в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/кг. Первая инъекция цитомедина делалась подкожно, а две последующие внутримышечно в область бедра через день. Анафилактический шок вызывали на 14 день. Разрешающую дозу молокина вводили внутривенно опытным и контрольным животным. Контролем служили морские свинки, которым вводили то же количество изотонического раствора натрия хлорида сразу же после

инъекции им нормальной лошадиной сыворотки. На 14 сутки всем животным вводили внутрисердечно разрешающую дозу антигена - 0,5 мл лошадиной сыворотки, разведенной 1 : 10. Интенсивность реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) оценивали по 4-х бальной шкале, индекс синдрома анафилаксии (ИСА) определяли по формуле:

(4а+Зв+2с+Ы+0е)

ИСА=- ,

а+в+с+(3+е

где а,в,с,(1,е - число животных с интенсивностью реакции 4,3,2,1,0 - интенсивность реакции ГНТ от легкого почесывания, чихания до спазмов и немедленного летального исхода.

Аллергенные свойства также изучены на 10 белых беспородных крысах-самцах 180-200 г. и белых мышах массой 18-20 г. в реакции гиперчувствительности замедленного типа и в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток, реакции иммунных комплексов.

Изучение влияния молокина на гиперчувствительность замедленного г типа проводили в опытах на нелинейных мышах. Мышей сенсибилизировали однократно, внутрикожно в основание хвоста 60 мкл эмульсии препарата, предварительно растворенного в растворе Хенкса, рВ= 7,5,в полном адыован-те Фрейнда (ПАФ), дозой, эквивалентной 10 мМ раствору в ПАФ в соотношении 1:1. На 5 сутки мышам субплантарно в заднюю лапу вводили 40 мкл 10 мМ молокина в растворе Хенкса. Через 6-24 часа измеряли величину отека лапы с помощью инженерного микрометра. Разница в толщине обеих лапок и характеризовала величину отека, по которой судили об интенсивности реакции ГЗТ. Контрольным животным вводили эмульсию раствора Хенкса в ПАФ по той же схеме, что и в опыте.

Изучение способности молокина вызывать дегрануляцию тучных клеток проводили в опытах на 10 белых крысах-самцах массой 180-200г, которым внутрибрюшинно вводили 5-6 мл подогретого до +37°С раствора Тироде без глюкозы и после легкого массажа брюшной стенки в течение 1-1,5 минут под эфирным наркозом делали разрез длиной 1,5-2 см и собирали перитоне-алышй экссудат в смоченную гепарином пробирку.

Препараты готовили на обезжиренных предметных стеклах, окрашенных 0,3%-ным спиртовым растворам нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре. На стекло наносили 0,03мл тучных клеток и 0,03мл раствора молокина. Препарат покрывали покровным стеклом, края которого смазывали вазелином, и инкубировали при температуре +37°С в течение 15 минут. Микроскопировали под иммерсией, учитывая процент деграну-лированных тучных клеток. Молокин использовали в концентрации 1:100; 1:10; 1:5 и 1:1, в качестве отрицательного контроля - изотонический раствор натрия хлорида, а положительного контроля - раствор гистамина в концентрации 1:10"6.

Количество иммунных комплексов определяли у мышей с ГЗТ по методике Гриневича Ю. А., Алферова А.Н. (1981), основанной на осаждении комплексов антиген-антитело 3,75% полиэтиленгликолем.

Изучение мутагенных свойств молокина проводили согласно «Методическим рекомендациям по изучению новых лекарственных препаратов» (М.,1992).

Препарат исследовали в тестах на Salmonella методом прямого контакта и с метаболической активацией с использованием индикаторных бактерий Salmonella typhimurium штаммов ТА 98 и ТА 100 в условиях in vitro. Молокин использовали в концентрациях 0,1-1000 мкг/мл. Исследования мутагенных свойств молокина выполнено на базе Института экологии и генетики микро-

организмов УрО РАН при участии кандидата биологических наук, Ереминой A.A.

Анальгетаческую активность молокина оценивали по изменению количества «уксусных корчей» у мышеЩШварц Г.Я.,1988). Молокин вводили подкожно за 30 мнут до внутрибрюшинного введения 0,25 мл 0,75% раствора уксусной кислоты. Дополнительно изучена выраженность анальгетическо-го эффекта молокина на фоне иммунодефицита. Иммунодефицит моделировали путем однократного введения циклофосфана в дозе 100 мг/кг (Фонталин JI.H. с соавт.,1988).

Противовоспалительное действие молокина было изучено на моделях агарового (Суслина С.Л.,1975), серотонинового и гистаминового (Чукичев Е.М. с соавт.,1981) воспаления. Агаровое воспаление моделировали трижды: через 1, 120 и 168 часов после введения молокина и вещества-эталона (Юшков В.В., Хавинсон В.Х.,1993). После третьего воспроизведения экспериментального воспалительного процесса забирали кровь у животных и определяли в реакции прямой гемагглютинации (РПГА) антитела к гистамину и серотонину (Закс A.C., Быкова A.A., Пономарева С.И.,1976). Выраженность воспаления учитывали онкометрически.

Данные исследований обработаны статистически с определением критерия Стьюдента и путем математической обработки на компьютере с помощью пакета программ «DIASTA» (Тюрин Ю.Н., Макаров A.A., 1995).

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований отработана технологическая схема получения иммуномодулятора го молок лососевых рыб.

Принципиальная схема получения молокина показана на рис. 1.

С"/: . .¿е^^Л^рсев^рыб ' ^

:.....Экстрапдоадще Ч. ;

Осадок в отходы

">' ? й*»; Г;« I ^ < * >

Г .ч^",' - Удь^афЙмуйЦия!" ;

Концентрат в отходы

/

Ультрафильтрат (Фракция от1000 до 10000 Д)

** ГР?" ФЪГГ^&РР ' и очистка ь ,

-1,,д4=|»^1 |Г ? " -цаЬ I г ■ ¡"У гУггУ-1 -г -^'4-. г и-

Ультрафильтрат в отходы

Концентрированный раствор (Фракция до 1000 до 10000Д)

' ""'" |иа5 ^Шая^Ёш^гр

. .. ииидеищиЬ шмиуя

1чрк" ; ч?™"?;

к -мб'д окду^ ^

Рис. 1 Принципиальная схема получения молокина

В процессе отработки технологии получения препарата важным обстоятельством явилось то, что для его выделения и очистки не потребовалось дополнительного дорогостоящего технологического оборудования. Кроме того, используя улырафильтрацию, мы полностью отказались от органического растворителя - ацетона, применяемого ранее для получения лекарственных средств из других видов сырья (лидаза, ганглиин, тималин)и препаратов хо-линэстеразы.

Исключение из технологии стадий ацетонового экстрагирования позволяет сократить длительность технологического цикла более чем на 70 часов, отменить операции, связанные с регенерацией ацетона (Технологический регламент производства лидазы,1981; Технологический регламент производ-, ства ганглиина,1991), улучшить экологическую обстановку на производстве и устранить вредное воздействие ацетона на организм работающих.

При анализе _физико-химических свойств установлено, что молокин в лиофилизированном виде представляет собой порошок белого с желтовато-кремовым оттенком цвета. Он хорошо растворим в воде, рН препарата соответствует физиологическим параметрам. Содержание пептидов составляет не менее 20 мг во флаконе.

Подлинность молокина соответствует максимуму; поглощения при длине волны 272 нм. Он состоит из пептидов, молекулярная масса которых составляет от 1,0 до 10,0 кД т.е. она близка к той, которая определяется у тималина (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х.,1989), ганглиина (Гажа'А.К.,1994) и других ци-томединов (МорозоаВ.Г. ,Хавинсон В.Х.,1996), обладающих иммунотропной активностью. Так,.Гажа А.К. (1994) приводит данные,.что ганглиин представляет собой смесь 45 пептидных фракций. В основном этот препарат состоит из пептидов с молекулярной массой от 1,0 до 12,5 кД.

По биологической активности препарат относится к малотоксичным веществам.

Изучение иммунобиологических свойств показало, что молокину присуще самостоятельное иммуностимулирующее действие(рис. 2;3).Оно выявлено на

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

108,1+4,0

Число АОК на 10 яск

128,7+3,2***

189,3+6,8***

Контроль

Молоки н 0,01

Молокин 0,1

Молокин 1.0

Рис.2 Влияние молокина на число АОК клеток у мышей СВА

6

104,7+4,1***

120 100 80 60 40 20 0

Число АОК на 10 яск

88,3+3,2*"

79,9+4,8

59,6+3,1

-I-

Контроль

Молокин 0,01

Молокин 0,1

Молокин 1,0

Рис.3 Влияние молокина на число АОК у мышей С57В1.

моделях первичного иммунного ответа, которые обычно широко используются при скршшнговых исследованиях, целью которых является поиск иммуно-корректоров.

Иммуностимулирующее действие молокина проявилось активацией гуморального звена иммунитета. Об этом свидетельствует стимуляция апробированным препаратом образования антителообразующих клеток при иммунизации мышей тимусзависимым антигеном и повышение титра гемагглюти-тининов (табл.1). Принципиально важным является то, что иммуностимули-

Таблица 1

Влияние молокина на образование гемагглютининов к эритроцитам барана у мышей различных линий _

Серии Количество Линия Доза Титр

опытов животных мышей мг/кг гемагглю-

в опыте тининов,

1од2

Контроль 10 СБА - 9,1+0,2

Молокин 10 СБА 0, 01 9,8+0,1

10 0,1 10,3+0,2

10 1,0 10,9+0,2***

Контроль 10 С57В1 - 6,7+0,2

Молокин 10 С57В1 0, 01 7,8+0,2***

10 0,1 8,0+0,2***

10 1,0 8,6+0,1***

Примечание:*** = Р < 0Г001

рующий эффект носит дозозависимый характер и выявляется как у мышей линии СБА, так и С57В1, которые генетически отличаются между собой по степени их чувствительности к антигенам, что в конечном итоге проявляется разной интенсивностью иммунного ответа на эритроциты барана.

Реализация иммуностимулирующего эффекта молокина не вызывает изменения массы центральных (тимуса, костного мозга) и периферических органов (селезенки, лимфатических узлов) иммунитета. Молокин не влияет на их клеточность, жизнеспособность иммунокомпетентных клеток. Последнее выявлено как in vivo, так и in vitro.

Иммунотропные свойства молокина включают и его восстанавливающее влияние на Т-лимфоциты, их способность участвовать в реакции активного розеткообразования (рис.4). Это, по-видимому, связано с восстановлением специфических рецепторов Т-лимфоцитов.

Контроль Контроль- Молокин

трипсин

Рис.4 Влияние молокина на Еа-розеткообразование

Влияние молокина на Т-клеточное звено иммунитета проявилось, в частности, угнетением реакции гиперчувстительности земедленного типа.

Иммуностимулирующее действие молокина, по видимому, связано с его способностью влиять на антигенпрезентирующие процессы. Определенные подтверждения этому найдены при исследовании функциональной активности макрофагов (рис.5). Принципиально важным является то, что молокин активировал фагоцитоз перитонеальных макрофагов и нейтрофилов крови. Фагоцитозстимулирующее действие молокина носит дозозависимый характер.

Механизм иммуностимулирующего эффекта молокина включает активацию пролиферации л имфоцитов. Этот факт подтвержден в реакции бластгрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Фагоцитарная активность, %

90 -г 80 -70 60 50 40 30 + 20 10 О

40,3+3,1

61,1+2,3*

±

64,1+1,8***

¿я

79,4+1,3*"

X

Контроль

М-0,01

М-0,1

М-1,0

Рис. 5. Влияние молокина на фагоцитарную активность макрофагов

73,310.6 —1

2.3+0,1

ФГА

3,6±1.1Г*1 *"2

фга+молокин

14,0+1,2***1

ХГ1

30.7+1.4—1 —2

ЛПС+Мошкин

Примечание: ***= Р<0,001

1- по сравнению с контролем

2- по сравнению с митогеном

Рис.6. Влияние молокина на пролиферацию лимфоцитов

Молокин повышал митогенный эффект фитогемагопотинина (ФГА) и липополисахарида (ЛПС)(рис.6). Как показали наши опыты молокин в большей степени повышал индекс стимуляции на В- , чем на Т-клеточный мито-ген. .

Проведенные нами исследования свидетельствовали, что сам молокин митогсгашм эффектом не обладает. ■

Первичный сравнительный анализ иммунотрошшх свойств молокина и тималина на модели экспериментального иммунодефицита, вызываемого цшслофосфаном, выявил, что в апробированных дозах цитомедин, полученный из семенников лососевых рыб, проявил большую активность в плане им-мунокорригирующего действия, чем .препарат эталон, Об этом свидетельствуют изменения количества ранних и поздних розеткообразующих лимфоцитов, числа антителообразующих клеток и титры гемагглютининов. Аналогичная закономерность выявлена и в реакции восстановления цитомединами Еа-розеткообразования. По способности восстанавливать лимфоцитами Е-рецепторы все испытанные цитомедйны располагаются следующим образом: молокин > тималин.

При выявлении и характеристике аллергенных свойств молокина нами было показано, что препарат, полученный из семенников лососевых рыб, не модулирует аллергических реакций. Об этом свидетельствовало отсутствие различий между контролем и опытом во всех использованных тестах, которые рекомендованы для оценки аллергенных свойств препаратов. Молокин не вызывал аллергического шока, не способствовал образованию иммунных комплексов, не увеличивал дегрануляцию тучных клеток,.

Это свидетельствует о том, что молокин относится к безопасным средствам. По-видимому, это присуще всем цитомединам, являющимся естественными биорегуляторами клеток организма и, естественно, не вызывающими побочных реакций. Вероятно, отсутствие аллергенных свойств цитомединов

Таблица 2

Сравнительная характеристика влияния цитомединов

на иммунодефицит

Серии опытов Доза в мг/кг Число АОК на 106 яск селезен ки Число РОК, % Титр гемаг-глютини нов, 1од 2

ранних поздних

Контроль 108, 0 + 4, 0 36, 0 +0,7 20,5 +0,7 V 6,7 +0,16

Иммунодефицит 54, 6 +3, 9 ***! 13,7 +0, б 10,0 + 0,5 ■А:**1 3,5 +0,16

Иммунодефицит 4- мол о-кин 0,01 195, 0 +3, 9 + + *1 24,0 I1'1 * * ■к -к -к2 39, 7 + 0, 5 4-4-4-1 ■к -к *2 6, 5 + 0,16

0,1 261,3 + 8,7 * * Уг1 27,3 + 1,1 * * 43,7 + 1,0 * * *1 7,8 +0,16

1.0 307,1 + 3,1 * * *! * * *2 32, 0 +0,3 * * *2 53,0 +0,5 ■к-к* 1 : * * *2;" 8,8 + 0,16 * * * * *2

Иммунодефицит + тима-лин 0,1 113, 0 + 3, 9 ***2 32, 8 +1,1 * * 29,1 +1, 6 ***2 7,6 + 0,22 * * *2

Примечание: ***= Р<0,001;**= Р<0,01

1- по сравнению с контролем

2- по сравнению с иммунодефицитом

связано с наличием в организме систем, метаболизиругощих данный класс биологически активных веществ и способствующих их полной утилизации. Подобная рабочая гипотеза также подтверждается и результатами изучения мутагенных свойств молокина, которые были исследованы в тестах, широко

применяемых при анализе биологических свойств вновь создаваемых профилактических и лечебных препаратов.

В настоящее время установлено, что иммуномодуляторы полипептидной природы обладают широким спектром биологической активности (Петров В.Ф., Юшков В.В.,1993): иммуномодулирующей (Юшкова Т.А. с со-авт.,1989;Крылова Е.Ф. с соавт.,1990), нейротропной (Арион В.Я. с со-авт.,1989; Юшков В.В.,1990), анальгетической (Юшков В.В.,1991; Юшков В.В., Серый С.В.,1992), противовоспалительной (Юшков В.В., Хавинсон В.Х., 1991; 1993). В связи с этим представляет существенный интерес выявление анальгетических и противовоспалительных свойств у полученного цитомеди-на. Проведенные исследования показали, что молокину присуще самостоятельное анальгетическое действие (рис.7;8). Оно выявлено на модели «уксус-

Процент торможения боли

Процент торможения

Молокин Ганглшш Тималин Молокин Гаягяиин Тималин

Примечание: **= Р<0,01;***= Р<0,001

Рис.7 Анальгетическая активность цитомединов у интактных мышей

Рис. 8 Анальгетическая ак-

тивность цитомединов у мышей на фоне иммунодефицита

ных корчей", которая обычно используется для скрининга ненаркотических анальгетиков. По-видимому, молокин влияет на моносинаптические пути передачи болевого импульса, однако это нуждается в дальнейшем изучении. Реализация анальгетического действия молокина может быть связана со способностью цитомедияов, в том числе и молокина, увеличивать количество эндогенного интерферона. Об этом свидетельствуют литературные данные (Ершов Ф .И..1996). Интерферон способен ослаблять восприятие боли благодаря взаимодействию с опиатными рецепторами.

При сравнении анальгетической активности молокина и цитомединов-эталонов существенных отличий не выявлено у.иитактиых животных. Вместе с тем, у лабораторных животных с иммунодефицитом исследуемый препарат уступал препаратам-эталонам. По степени проявления анальгетического эффекта в этом случае они располагались следующим образом: тималин > ганг-лиин > молокин. По-видимому, эти отличия обусловлены различием механизмов взаимодействия использованных иммуномодуляторов с медиаторами и рецепторами ноцицептивной и антиноцицептивной систем. В опытах на крысах на модели агарового отека молокин проявил противовоспалительный эффект. Об этом свидетельствует уменьшение прироста объема воспаленных лап у животных, которым вводили молокин. По выраженности противовоспалительного действия молокин уступает ганглиину и тима-лину (Юшков В.В.,ХавинсонВ.Х., 1991; 1993).

Считается, что механизм противовоспалительного действия цитомединов связан как с прямым антагонизмом с гистамином и серотонином, так и с их способностью активировать синтез специфических медиаторам воспаления антител, блокирующих эффекты аутокоидов (Юшков В.В., Хавинсон В.Х., 1991; 1993).

2'j

Примечание: ***= P<0,01;***= P<0,001 АС-ат - ангисеротониновые антитела АГ-ат - антигистаминовые антитела

Рис. 9 Противовоспалительная активность молокина

Наши опыты показали (рис.9), что молокин также стимулирует выработку антисеротониновых и антигистаминовых антител и лишь на этом фоне тормозит развитие агаровго воспаления в генезе которого, а именно в первой фазе - несомненно участие гистамина и серотонина (Суслина М.Л.,1975). Наши данные согласуются с результатами исследований Закса A.C., Быковой А.А.(197б), Закса A.C. с соавт.(1976) о гомеостатической роли антител к медиаторам воспаления в развитии экссудации.

ВЫВОДЫ.

1 .Молокин обладает самостоятельным иммунотропным действием.

2.Молокин стимулирует фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, увеличивает количество антителообразуюгцих клеток в селезенке, повышает пролиферацию лимфоцитов, восстанавливает рецепторы иммунокомпетентных клеток.

3.Молокин устраняет экспериментально вызванный иммунодефицит.

4.Молокин не обладает аллергешшми и мутагенными свойствами.

5.Молокину присуще анальгетическое и противовоспалительное действие.

6.Механизм противовоспалительного эффекта молокина связан с его способностью стимулировать синтез антигистаминовых и антисеротониновых антител.

7.Разработана экологически безопасная промышленная технология получения иммуноактивного пептида из семенников лососевых рыб с использованием мембранных методов разделения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Характеристика иммуномодулирующих и аллергенных свойств молокина //Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: Мат.. науч. конф. -Томск,1991. -4.2. - С.101 -103 (Соавт. Юшкова Т.А., Петров В.Ф., Фарцей-гер А.Г.)

2.Влияние молокина на первичный иммунный ответ // Мат. докл. Всерос. на-уч.-практ. конф. - Пермь, 1993. -С.48-49(Соавт.Петров В.Ф., Юшкова Т.А.)

3.Сравнительная характеристика влияния тималина и молокина на иммунодефицит // Мат. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Пермь,1993. - С.49-50 (Соавт. Петров В.Ф., Юшков В.В., Юшкова Т.А., Фарцейгер А.Г.)

4.Технологические подходы к получению полипептидов из гидробионтов и их биологическая активность // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии: Мат.докл.науч.-практ. конф. - Пермь,1994. - С.20-21 (Соавт.Петров В.Ф., Сафонова Г.М.)

5.0ценка мутагенных свойств молокина // Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии: Мат. докл.науч.-практ. конф. -Пермь,1994. - С.22-23 (СоавтЛетров В.Ф., Сафонова ГМ., Еремина A.A.)

6.Сравнительная характеристика аллергенных свойств цитомединов // Мат. докл. 50-й науч.-практ.конф. проф.-препод.состава фармакадемии. -Пермь, 1994. - С.ЗЗ (соавт.Юшкова Т.А.)

7.06 иммуномодулирующей активности цитомединов // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Челябинск,1997. - С.188 (Соавт.Юшков В.В.)

8.Цитомедины как адъюванты антифяавивирусных вакцин //Тез.докл. 1Y Российского национального конгресса. - Москва, 1997. - С.305-306 (Соавт. Юшков В.В.,Юшкова Т.А.)

9.Иммунотропные эффекты молокина // Журн. микробиол. - 1998. - №2. -С.97-98 (Соавт. Юшков В.В.)

Ю.Об иммунотропной активности молокина//Тез.докл. Y Российского национального конгресса. - Москва,1998. - С.570-571 (Соавт. Петров В.Ф.)

11 .Об иммунофармакологических свойствах молокина //80 лет фармацевтическому образованию и науке на Урале. Итоги и перспективы: Мат. Межвуз. Юбилейной науч.-практ. Конф., посвященной 275-летию г,Перми и 80 летию фармацевтического образования на Урале. - Пермь, 1998.-С.92-94 (Соавт. Юшков В.В.)

Изобретения

1.Способ получения иммуностимулятора / Патент №2091073 от 20.09.97 (Соавт. Петров В.Ф., Сафонова Г.М., Колчанова H.A.)