Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунобиологическая характеристика препарата "Биостим-Т" на основе природных нуклеиновых кислот

На правах рукописи

СТАРЦЕВА Наталья Валерьевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА «БИОСТИМ-Т» НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

14.00.36 Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2004

Работа выполнена в лаборатории биологически активных препаратов филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Петров В.Ф.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Сафонова Г.М. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Быкова А.А кандидат медицинских наук, доцент Шилов Ю.И.

Ведущая организация:

Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита состоится на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (3422) 44-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссерта!

Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание препаратов, обладающих иммуно-корригирующей активностью, является важной задачей, стоящей перед иммунологией. Из отечественных иммуномодуляторов, уже внедренных в лечебную практику, заслуженное признание получили миелопид, полиоксидоний, иму-нофан, ликопид, рибомунил, лейкинферон, виферон и др. (Борисова и др., 1998; Кузнецов, Караулов, 1998; Лебедев и др., 1998; Малиновская, 1998; Хаитов, Пинегин, 2003). Однако необходимость дальнейшего поиска и испытаний новых иммуномодуляторов, действующих избирательно на отдельные звенья иммунной системы и являющихся безопасными лекарственными средствами, не исчезает. Это определяется ростом частоты вторичных иммунодефицитных состояний, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Практически важен поиск новых сырьевых источников для производства препаратов, регулирующих функции иммунной системы. К настоящему времени в Пермском НПО «Биомед» разработаны и прошли доклинические испытания ряд препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью: молокин и ганглиин, выделенные из речных и морских животных (Казьянин, Петров, 1994; Беседнова и др., 1998), вермин, полученный из наземных беспозвоночных (Кашина и др., 1998), олексин, выделенный из растительного сырья (сухие листья персика обыкновенного) (Перевозчиков, 1999; Сафонова и др., 2001). В связи с доказанной высокой иммуномодулирующей активностью препаратов на основе природных нуклеиновых кислот и их синтетических производных (Земсков и др., 1981, 1998; Петров, Хаитов, 1988; Хаитов, Пинегин, 2003) является актуальной разработка новых препаратов этой группы для перорального применения и оценка их иммунотропного действия.

Цель настоящего исследования - изучение иммунобиологических свойств нового препарата «Биостим-Т».

Основные задачи исследования:

1. Разработать эффективный способ выделения нуклеиновых кислот из семенников крупного рогатого скота. Создать на их основе пероральный препарат «Биостим-Т».

2. Изучить общетоксическое действие препарата «Биостим-Т».

3. Исследовать иммунобиологическую активность препарата «Биостим-Т».

4. Оценить иммуномодулирующее и эритропоэзстимулирующее действие препарата «Биостим-Т» с привлечением группы добровольцев.

Научная новизна. Разработан и запатентован оригинальный способ выделения нуклеиновых кислот из семенников крупного рогатого скота, на основе которого создан пероральный препарат «Биостим-Т». Изучены общетоксическое, эмбриотоксическое и тератогенное действие, аллергенные и мутагенные

свойства препарата «Биостим-Т». Исследовано

на гуморальный и клеточноопосредованный иммунный ответ, активность фагоцитирующих клеток, показатели клеточности органов лимфомиелоидного комплекса у животных с ненарушенными функциями иммунной системы и при экспериментальном иммунодефиците. Изучена эффективность применения препарата «Биостим-Т» в условиях экспериментальной анемии. Исследовано влияние препарата «Биостим-Т» на мышечную и силовую выносливость животных. Оценено иммуномодулирующее и эритропоэзстимулирующее действие препарата «Биостим-Т» с привлечением группы добровольцев.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представление о принципиальной возможности использования в качестве сырьевого источника семенников крупного рогатого скота для промышленного получения препаратов, содержащих нуклеиновые кислоты. Разработан патентоохраняемый способ экспериментального и промышленного получения препарата «Биостим-Т», содержащего натриевые соли ДНК-и РНК. Разработана технология, оформлена нормативная документация и получены регистрационные удостоверения на выпуск препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже. Данный препарат рекомендуется для профилактики и в комплексном лечении анемий, коррекции вторичных иммунодефицитных состояний. Качество препарата отмечено золотой медалью им. И.И. Мечникова (2002) и золотой медалью им. Пауля Эрлиха (2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новый препарат «Биостим-Т» на основе нуклеиновых кислот, выдел ен-ных из семенников крупного рогатого скота, не обладает выраженным общетоксическим, аллергенным, мутагенным, эмбриотоксическим и тератогенным действием.

2. Препарат «Биостим-Т» проявляет выраженную иммунотропную активность. Применение препарата приводит к активации гуморального иммунного ответа и фагоцитоза, а также к восстановлению нарушенных показателей иммунитета при экспериментальном иммунодефиците.

3. Препарат «Биостим-Т» характеризуется высокой эритропоэзстимули-рующей активностью, проявляющейся при его введении на фоне сниженных гематологических показателей.

4. Применение препарата «Биостим-Т» способствует повышению мышечной и силовой выносливости животных.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции молодых ученых, Пермь 1999; XIV Коми республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской научной конференции, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат», 2000; I Конференции иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001; Международ-

ной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Естественный научный институт при Пермском государственном университете, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2001; Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского научно-производственного объединения «Биомед», 2003. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»; расширенном заседании лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов, Пермь.

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ. Полученные результаты исследований защищены Патентом на изобретение РФ № 2139068.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 6 рисунков и 58 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 301 литературный источник, из них 218 отечественных и 83 зарубежных авторов, 11 приложений.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории биологически активных препаратов в соответствии с планом НИР НИИ вакцин и сывороток филиала ФГУП «НПО «Микро-ген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации 01.200.1 08832; 01.200.1 08833).

СОДЕЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Биологическую и иммуномодулирующую активность препарата «Био-стим-Т» in vivo изучали на 40 самцах линейных мышей-гибридов (СВАх C57BL/6)Fj массой 18-20 г; 35 самцах и 20 самках крыс популяции Wistar массой 180-200 г, полученных из питомника РАН «Столбовая»; 376 самцах белых беспородных мышей массой 18-22 г; 25 пёстрых беспородных морских свинках обоего пола массой 200-250 г; 24 кроликах породы шиншилла, полученных из отделения подопытных животных «Пермского НПО «Биомед». В экспериментах in vitro использованы лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 27 здоровых людей-добровольцев. В испытаниях таблеток и драже принимали участие 40 человек - работников «Пермского НПО «Биомед» в возрасте от 20 до 68 лет.

Препарат «Биостим-Т» в форме порошка получен по оригинальной технологии из семенников крупного рогатого скота. На основе препарата «Биостим-Т» разработаны таблетки и драже. Анализ физико-химических свойств и соста-

ва препарата проводили с использованием методов, изложенных в XI Государственной Фармакопее (содержание массовой доли влаги, золы, белка), Фармакопейной статье 42-344ВС-90 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (содержание нуклеиновых кислот), Фармакопейной статье 42-3843-99 «Раствор натрия дезоксирибонуклеата (деринат) 1,5% для инъекций» (гипер-хромизм). Элементный состав изучали методом рентгено-флюоресцентной спектроскопии, спектр поглощения - на спектрофотометре СФ-46 в диапазоне длин волн 230-320 нм при толщине слоя 1 см и при разведении 1,0 мг/мл в воде очищенной. Анализ фракционного состава препарата проводили методом жидкостной хроматографии низкого давления с использованием прибора ЛКБ, Швеция. Содержание тестостерона в препарате определяли методом конкурентного иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов для определения общего тестостерона в сыворотке и плазме крови (Тестостерон-ИФА) в биохимической лаборатории КМСЧ №1, Пермь, совместно с д-ром А.Н. Шварц.

Острую и хроническую токсичность препарата «Биостим-Т» исследовали в соответствии с «Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств» (Москва, 1992). Опыты по изучению острой токсичности выполняли на 54 белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г. Порошок «Биостим-Т» вводили в виде водного раствора однократно внутрижелу-дочно в дозах 2000; 5000 и 10000 мг/кг массы тела животного. Драже и таблетки вводили в виде водной взвеси в дозах 1500 и 3000 мг/кг по аналогичной схеме. Используемые дозы таблеток и драже во всех экспериментах представлены в пересчете на порошок «Биостим-Т». Контрольные животные в данном и последующих экспериментах получали воду очищенную. Наблюдение за животными осуществляли в течение 10 дней. Определение класса токсичности проводили по классификации К.К. Сидорова (1973). Хроническую токсичность препарата изучали в 6-месячном эксперименте на 24 кроликах породы шиншилла (13 - в опытной группе, И - в контрольной). Кроликам опытной группы ежедневно вводили перорально «Биостим-Т» в дозе 150 мг/кг в виде водного раствора с помощью зонда. Каждый месяц у опытных и контрольных кроликов забирали кровь из краевой вены уха для анализа, включающего определение концентраций общего белка, активности аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, диастазы, концентрации гемоглобина, количества лейкоцитов, эритроцитов, показателей лейкоформулы. По окончании эксперимента кроликов забивали путем декапитации. Сразу после забоя проводили вскрытие, осмотр внутренних органов, определение их массового коэффициента и забор проб для гистологического анализа, который выполняли совместно с к.м.н. Ю.А. Горбуновым на базе КМСЧ № 1, Пермь. Биохимические исследо-

вания осуществляли на полуавтоматическом анализаторе фирмы "Labsystems", Финляндия, в КМСЧ № 1, Пермь, совместно с д-ром А.Н. Шварц. Аллергенные свойства препарата «Биостим-Т» изучали в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» (Москва, 1988; 1999) в тестах конъюнктивальной пробы, реакциях гиперчувствительности замедленного типа, непрямой реакции дегрануляции тучных клеток. Для изучения способности препарата вызывать реакцию гиперчувствительности замедленного типа использовали мышей, сенсибилизированных препаратом в дозах 7,5 и 75 мг/кг путем однократного внутрикожного введения в основание хвоста эмульсии препарата в полном адъюванте Фрейнда. Конъ-юнктивальную пробу выполняли на морских свинках. Сенсибилизацию животных осуществляли пероральным введением препарата «Биостим-Т» в дозе 1,5 мг/кг в течение 10 дней. Для постановки пробы одну каплю водного раствора препарата (1,5; 15,0; 75,0 и 150,0 мг/мл) вводили под верхнее веко правого глаза, а в левый глаз - каплю растворителя (воды очищенной) в качестве контроля. Для изучения способности препарата вызывать дегрануляцию тучных клеток крысам-самцам вводили per os раствор порошка «Биостим-Т» в дозе 1,5 мг/кг. Тестирование сенсибилизирующих свойств проводили на 10-й день от начала введения препарата. Исследование мутагенной активности препарата «Био-стим-Т» осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке мутагенных свойств фармакологических средств» (Москва, 1994; 1999) при участии к.б.н. В.В. Горбуновой, ст. науч. сотр. лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, Пермь. Эмбриотоксическую и тератогенную активность оценивали в соответствии с «Методическими указаниями по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и их влияния на репродуктивную функцию» (Москва, 1986) совместно с сотрудником токсикологической лаборатории Пермского ЦГСЭН А.В. Вожаковой.

Исследование ммуномодулирующего действия препарата «Биостим-Т» проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке им-мунотоксических свойств фармакологических средств» (Москва, 1992) и методическими указаниями Фармакологического комитета МЗ РФ «Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов» (Москва, 1999) на моделях системного иммунного ответа, локального иммунного ответа, иммунного ответа на фоне иммуносупрессии. Порошок «Биостим-Т» использовали в дозах 0,15; 1,5 и 15,0 мг/кг, драже и таблетки - 1,5 мг/кг внутрижелудочно. В качестве препарата сравнения применяли деринат в дозе 1,5 мг/кг внутрибрюшинно. Используемые дозы препаратов во всех экспериментах вводили ежедневно однократно в течение 5 суток. Экспериментальный иммунодефицит индуцировали однократной внутрибрюшинной инъекцией циклофосфамида (ЦФ) в дозе 100 мг/кг. «Биостим-Т» начинали вводить через

сутки после введения ЦФ. Иммунизацию осуществляли внутрибрюшинно оптимальной дозой (108) эритроцитов барана через 1 ч после последнего применения препарата. Постгеморрагическую анемию моделировали путем кровопускания из сосудов хвоста мышей (0,4 мл однократно и спустя 48 ч дополнительно 0,25 мл крови). «Биостим-Т» начинали вводить сразу после первого кровопускания.

Для определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах использовали метод локального гемолиза в геле агарозы (Jeme, Nordin, 1963). Титр антител против эритроцитов барана определяли в стандартном варианте реакции активной гемагтлютинации (Зигль, 1979). Выраженность иммунного воспаления при постановке реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) оценивали через 24 ч после разрешающей инъекции антигена путём регистрации толщины и массы опытной и контрольной стопы. Оценку количества лейкоцитов, эритроцитов, ядросодержащих клеток (ЯСК) в суспензиях, показателей лейкоформулы проводили стандартными методами. Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Подсчет ретикулоцитов проводили в условиях суправитального окрашивания азуром П. Влияние препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали по модифицированному методу В.Н. Капли-на (Каплин, 1996; Шилов и др., 1998; Шилов, Гейн, 1998; Шилов, Орлова, 2000). Оценку показателей фагоцитоза в клеточных суспензиях костного мозга проводили по методу Ю.И. Шилова и СВ. Гейна (1998). Влияние препарата «Биостим-Т» на работоспособность изучали с использованием тестов О.Н. Елизаровой с соавт. (1974) на мышечную, силовую выносливость и мышечную устойчивость животных. Влияние препарата на пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали in vitro в культуре клеток крови с фитогемагтлютинином-П (Sigma, США). Донорами являлись практически здоровые мужчины-добровольцы в возрасте от 25 до 60 лет (средний возраст - 36,5 лет). Культивирование проводили в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах. Каждая культура содержала 2x105 клеток в 0,2 мл полной питательной среды на основе среды 199, включающей 10% аутоплазмы, 2мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES и 100 мкг/мл гентамицина. Интенсивность пролиферации оценивали по включению /метил-3Н/тимидина. Величину включения последнего определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Бета-2» в радиоизотопном подразделении аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН, Пермь. Для оценки влияния препарата на микробицидную активность фагоцитирующих клеток, сопряженную с кислородозависимыми механизмами бактерицидности в системе in vitro использовали микроскопический вариант теста с нитросиннм тетра-золием (Гордиенко, 1983). Исследования проведены совместно с к.м.н. И.В. Кумаланиной в ЦНИЛ ГОУ ВПО Пермской государственной медицинской

академии МЗ РФ. При оценке стимулирующих свойств препарата «Биостим-Т» в реакции мнкробиолюминесценции использовали культуру люминесцентных бактерий генно-инженерного штамма Е. coli lum+, разработанного в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь. Исследования проведены совместно с д.м.н., проф. Р.А. Пшеничновым.

Испытания препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже с участием добровольцев (с оформлением их письменного согласия) проводили амбула-торно под наблюдением врачей-терапевтов, в соответствии с программой, утвержденной главным врачом ММУЗ КБ № 7, Пермь. Ежедневно в течение месяца 22 человека одной группы получали по одной таблетке 2 раза в день, 18 человек другой группы - по 2 драже 2 раза в день. Суточная доза препарата «Биостим-Т» в обоих случаях была одинаковой и составляла 100 мг. В течение дня испытуемые находились на рабочих местах, препарат «Биостим-Т» принимали во время обеденного перерыва и в конце смены. Другие лекарственные средства во время испытаний не назначали. Все иммунологические и гематологические параметры оценивали в гепаринизированной (25 ЕД/мл) венозной крови. Забор крови производили до начала и по окончании исследований. Определяли число эритроцитов, лейкоцитов, концентрацию гемоглобина и показатели иммунограммы. Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3). Число С022+-клеток (В-лимфоциты) и СО 16+-лимфоцитов (преимущественно NK-клетки и, частично, Т-лимфоциты) определяли по оригинальной технологии, предложенной Д.К. Новиковым с сотр. (Новиков, Новикова, 1996; Новиков, Новиков, 2000). Определение изменения экспрессии Е-рецептора (CD2, представленного как на Т-лимфоцитах, так и на части NK-клеток (Nunez et al., 1997) проводили в различных вариантах реакции спонтанного Е-розеткообразования (Шилова, 1994; Бахметьев и др., 1997; Черешнева и др., 2001; Бахметьев и др., 2002). Число относительно незрелых В-лимфоцитов определяли в тесте спонтанного розеткообразования с эритроцитами мыши (М-РОК) (Gupta, Grieco, 1975). Концентрацию IgG, IgA и IgM определяли в классическом варианте метода радиальной иммунодиффузии с регистрирацией результатов в момент полного завершения диффузии (Mancini et al, 1970). При исследовании фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в качестве объектов фагоцитоза использовали формалинизированные эритроциты барана (108 эритроцитов/мл). Рассчитывали процент фагоцитоза, фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, абсолютное количество фагоцитирующих клеток и абсолютное число захваченных всеми нейтрофилами объектов. Цитокины - интерлей-кин-4 (IL-4, маркерный цитокин Th2 клеток) и фактор некроза опухоли a (TNF а) - определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением тест-систем (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) и с ис-

пользованием автоматического фотометра для микропланшетов Sanophy Pasteur PR 2100. Параметры калибровочной кривой рассчитывали с помощью регрессионного анализа.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики. Достоверность различий между группами оценивали с помощью непарного и парного t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05. Все результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Для обработки цифрового материала использовали пакеты компьютерных программ Excel для Windows, STATISTICA для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение препарата «Биостим-Т», содержащего нуклеиновые кислоты

Препарат «Биостим-Т» получали по разработанной нами оригинальной технологии из семенников крупного рогатого скота или шрота семенников, являющегося вторичным сырьем - отходом производства препарата лидазы. Технология включает следующие основные этапы: (1) криодеструкция сырья, (2) экстракция, (3) фильтрация экстракта, (4) концентрирование, (5) получение осадка, содержащего нуклеиновые кислоты, (6) отделение осадка, (7) сушка, (8) помол.

Препарат «Биостим-Т» представляет собой мелкодисперсный порошок белого с кремовым оттенком цвета, солоноватого вкуса, без запаха. Препарат содержит 59±2% ДНК и 1,1±0,1% РНК в виде натриевых солей, до 10% полипептидов, около 20% зольных веществ, массовая доля влаги не превышает 10%. Максимум поглощения в УФ-спектре равен 260±2 нм. Гиперхромный эффект составляет 11,5±0,3%. Препарат «Биостим-Т» содержит в своем составе широкий спектр полимеров с молекулярной массой от 10 тыс. до 700 тыс. Наибольшее количество фракций имеет молекулярную массу от 50 тыс. до 200 тыс. (рис.1). В 100 мг препарата (рекомендуемая суточная доза) содержится 10-20 нг тестостерона, что примерно в миллион раз меньше дозы гормона, оказывающей терапевтический эффект.

Разработанные нами таблетки массой 0,2 г содержат 50 мг препарата «Биостим-Т». Наполнителем служит микрокристаллическая целлюлоза. Одно драже массой 0,5 г содержит 25 мг препарата. Для усиления эритропоэзстиму-лирующего действия в драже введено 100 мкг фолиевой кислоты и 20 мкг циа-нокобаламина.

Характеристика иммуномодулирующей и биологической активности препарата «Биостим-Т»

При оценке острой токсичности максимально переносимая доза, а также

Ы)5о препарата «Биостим-Т» при пероральном введении мышам не выявлена из-за отсутствия реальной возможности ввести более, чем 10000 мг порошка на

8

23 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 НО 115 120 125

Рис. 1. Хроматографический профиль препарата «Биостим-Т».

По оси ординат - экстинкция при 206 нм; по оси абсцисс - номера фракций.

кг массы тела животного. По этой же причине не определена максимально переносимая доза таблеток и драже. При внутрижелудочном введении всех использованных доз препарата отклонений в поведенческих реакциях и других патологических явлений не наблюдали. Ежедневное пероральное введение препарата «Биостим-Т» кроликам в течение 6 месяцев в дозе 150 мг/кг (100 терапевтических доз) не приводило к изменению поведенческих реакций, общего состояния животных. Изменений внутренних органов при патоморфологиче-ском и гистологическом исследованиях не выявлено. Напротив, установлено, что уже через месяц у животных, получавших «Биостим-Т», отмечается достоверное устойчивое увеличение количества эритроцитов, а также повышение концентрации гемоглобина в периферической крови. Результаты изучения общетоксического действия позволяют заключить, что препарат относится к практически нетоксичным веществам (5 класс токсичности по классификации К.К. Сидорова). Исследование аллергенных свойств препарата «Биостим-Т» показало, что введение препарата не приводит к развитию ГЗТ у мышей ни в одной из использованных доз. Препарат не вызывает реакции в конъюнкти-валыюй пробе у морских свинок, не обнаруживает активности в тесте деграну-

ляции тучных клеток. Установлено, что у препарата отсутствует мутагенная активность, он не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.

Препарат «Биостим-Т» в исследованных дозах существенно не влияет на показатели клеточности, массы тимуса и селезенки интактных мышей. В условиях внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана на фоне перораль-ного введения препарата «Биостим-Т» - порошка, таблеток, драже - отмечена стимуляция системного гуморального иммунного ответа, которая проявилась почти во всех вариантах, о чем свидетельствует увеличение количества АОК в абсолютном и относительном выражении (табл. 1). Титр гемагглютинирующих антител (по -1с^2 титра) на 5-е сутки системного иммунного ответа также достоверно выше у животных, получавших препарат «Биостим-Т» (табл. 2).

Таблица1

Влияние препарата «Биостим-Т» на количество АОК в селезенке при пер-

вичном иммунном ответе

Форма препарата Доза, мг/кг Число наблюдений числа АОК на 106 ЯСК селезёнки Ьо£ю числа АОК на селезенку

Контроль - 9 1,6612±0,1573 4,1849±0,1688

(45,8) (15309)

Порошок 0,15 8 1,7617±0,1031 4,4111±0,1192

(57,8) (25769)

1,5 6 2,190610,0617* 4,865210,0755**

(155,1) (73315)

15,0 7 2,137610,1106* 4,799610,11198*

(137,3) (36328)

Таблетки 1,5 8 2,091410,1180* 4,7428Ю,1347*

(123,4) (55307)

Драже 1,5 8 1,961810,0831 4,5602Ю,0893

(91,6) (36328)

Примечание. Здесь и в табл. 3, в скобках указана средняя геометрическая (антилогарифм из средней арифметической 1одю) числа АОК. Здесь и в табл. 2,9-11, *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по 1-критерию Стьюдента относительно контроля.

Введение препарата «Биостим-Т» во всех дозах и дерината (препарат сравнения) не влияет на генерацию гиперчувствительности замедленного типа и число АОК в регионарных лимфатических умах в условиях подкожной иммунизации 108 эритроцитами барана (данные не приводятся). Однако, нами выявлено существенное повышение числа АОК в селезенке при введении препарата в дозе 15,0 мг/кг (р<0,01). У тех же животных при взятии крови на высоте системного и локального иммунного ответа обнаружен статистически досто-

верный стимулирующий эффект препарата в дозах 1,5 и 15 мг/кг на фагоцитарную активность нейтрофилов in vivo. Помимо этого, выявлена активация сум-

Таблица 2

Влияние препарата «Биостим-Т» на уровень антител при первичном

иммунном ответе

Форма препарата Доза, мг/кг Число наблюдений Титр гемагтлютининов, (-log2)

Контроль — 9 9,11±0,56

Порошок 0,15 8 9,22±0,32

1,5 6 11,6710,33**

15,0 7 11,71±0,29***

Таблетки 1,5 8 10,63±0,71

Драже 1,5 8 10,88±0,48*

марной фагоцитарной активности гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов костного мозга по абсолютным и относительным показателям (р<0,01-0,001, данные не приводятся). Отличия во влиянии препарата «Биостим-Т» на системный и локальный иммунный ответ могут быть связаны с различиями их внутрисистемной регуляции. В частности, ранее было показано, что высота системного иммунного ответа на территории селезенки может находиться под негативным контролем эритроидных клеток (Лорд и др., 1987) и чувствительных к циклофосфамиду антигенспецифических клеток-супрессоров (Гусев, 1996). На территории регионарного лимфатического узла важную роль в регуляции локального иммунного ответа играют дендритные клетки (Von Andrian, Mackay, 2000).

В модели иммунодефицита наблюдается снижение на 50% абсолютного и относительного числа АОК в селезенке, титра антител, весового коэффициента тимуса мышей; на 70% - количества тимоцитов в сравнении с аналогичными показателями у животных, не получавших иммунодепрессант (контроль). «Биостим-Т» полностью отменяет депрессию гуморального иммунного ответа, индуцированную ЦФ, и частично нивелирует снижение массы тимуса (табл. 3, 4). Защитный эффект находится в прямой зависимости от дозы препарата. Статистически значимо по отношению к ЦФ он проявляется в дозе 15,0 мг/кг в отношении количества АОК на селезенку, титров гемагглютининов и весового коэффициента тимуса. Помимо этого препарат восстанавливает индуцированное ЦФ снижение клеточности костного мозга (табл. 5), что может быть связано с активацией гемопоэза, описанного при цитостатической болезни (Богда-шин и др., 1992).

Патологическое снижение активности фагоцитов в организме может яв-

ляться одним из ведущих звеньев в патогенезе вторичных иммунодефицитов. Поэтому представлялось целесообразным изучение влияния препарата «Био-стим-Т» на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови в модели ЦФ-индуцированной иммуносупрессии. Однократное введение ЦФ животным уменьшает процент фагоцитоза и фагоцитарное число более, чем на 50% (табл. 6). По нашим данным, применение препарата «Биостим-Т» оказыва-

Таблица 3

Влияние препарата «Биостим-Т» на гуморальный иммунный ответ на фоне индуцированного иммунодефицита

Доза

Экспери- пре- Число числа Ьодю числа Титр гемаг-

ментальное па- наблю- АОК на 106 АОК на селе- глютининов,

воздействие рата, дений ЯСК селезёнки зенку (-10Н2)

мг/кг

Контроль — 10 2,159810,0267 4,604210,0538 9,4010,34

(144,5) (40200)

ЦФ — 9 1,94401,0587* 4,30201,0890* 7,2210,40*

(87,9) (20046)

Деринат 1,5 10 1,74051,0965* 4,27901,1003* 7,110,46*

(55,0) (19013)

Биостим-Т 1,5 9 2,062410,0483 4,425410,0731 8,22Ю,70

(115,4) (26633)

15,0 10 2,087510,0613 4,67001 8,5010,45*

(122,3) 0,0772**

(46774)

Примечание. Здесь и в табл. 4-7, *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по N критерию Стьюдента относительно ЦФ; *- р<0,05; ** - р<0,01 > ; по I-

критерию Стьюдента относительно контроля.

Таблица 4

Влияние препарата «Биостим-Т» на массу и клеточность тимуса на фоне индуцированного иммунодефицита

Экспериментальное воздействие Доза препарата, мг/кг Число наблюдений Весовой коэффициент, % Число ЯСК, х106/орган ■

Контроль — 10 0,2210,01 69,1319,35

ЦФ — 9 0,1110,01* 22,8415,28*

Деринат 1,5 10 0,1510,02* 24,5815,86*

Биостим-Т 1,5 9 0,1210,01* 25,2917,36*

15,0 10 0,1710,02** 35,7018,23*

ет стимулирующее действие на фагоцитарную активность нейтрофилов на фоне иммуносупрессии. Пероральное введение препарата в дозе 15,0 мг/кг приводит к повышению относительных показателей фагоцитарной активности, в дозах 1,5 и 15,0 мг/кг - к повышению абсолютного количества участвующих в фагоцитозе нейтрофилов, в том числе активных фагоцитов, а также общего числа фагоцитированных объектов (табл. 6,7).

Таблица 5

Влияние препарата «Биостим-Т» на клеточность костного мозга на фоне индуцированного иммунодефицита

Экспериментальное воздействие Доза препарата, мг/кг Число наблюдений Число ЯСК, х106/бедренную кость

Контроль — 10 20,05±1,28

ЦФ — 9 15,46±1,52*

Деринат 1,5 10 18,4613,19

Биостим-Т 1,5 9 18,13±2,87

15,0 10 20,06±2,01

Таблица 6

Влияние препарата «Биостим-Т» на относительные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне индуцированного иммунодефицита

Экспериментальное воздействие Доза, препарата, мг/кг Число наблюдений Процент фагоцитоза Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс Процент активных фагоцитов

Контроль — 10 35,4± 0,62± 1,71± 15,7±

4,55 0,09 0,07 2,84

ЦФ — 9 17,67± 0,29± 1,55± 7,33±

3,70** 0,06** 0,12 1,77*

Деринат 1,5 10 22,4± 0,3 8± 1,65± 9,0±

4,06* 0,07 0,07 1,81

Биостим-Т 1,5 9 24,56± 0,41± 1,56± 11,0±

5,01 0,10 0,07 3,47

15,0 10 30,1± 0,49± 1,67± 11,4±

3,27* 0,05» 0,09 1Д2

Одним из актуальных вопросов современной фармакологии является разработка лекарственных препаратов, способных стимулировать процессы ге-мопоэза при гипо- и апластических состояниях кроветворной ткани (Гольдберг и др., 1998). Данные литературы свидетельствуют о том, что препараты нуклеиновых кислот, а также некоторые пиримидиновые производные, повышают

Таблица 7

Влияние препарата «Биостим-Т» на абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне индуцированного иммунодефицита

Экспериментальное воздействие Доза препарата, мг/кг Число наблюдений Число фагоцитирующих нейтрофилов, х109/л Число активных фагоцитов, хЮ'/л Число фагоцитированных объектов, хЮ'/л

Контроль — 10 0,57±0,13 0,2610,07 0,98Ю,24

ЦФ — 9 0,47±0,14 0,2010,07 0,78Ю,25

Деринат 1,5 10 0,93±0,17 0,3610,08 1,5310,30

Биостим-Т 1,5 9 1,12Ю,21** 0,4810,12 1,8610,39*

15,0 10 1,38±0,28** 0,5110,10* 2,18Ю,41**

анаболизм белков и стимулируют гемопоэз (Рычнев, Фролов, 1981; Рыкова, 2001). В связи с тем, что при изучении хронической токсичности выявлена способность препарата повышать число эритроцитов, а в будущем «Биостим-Т» предполагается применять для профилактики и лечения анемий различного происхождения, мы более подробно исследовали его влияние на показатели красной крови, лейкоцитарной формулы, клеточности селезенки, костного мозга и тимуса на модели постгеморрагической анемии. Уже через 48 ч после острой дозированной кровопотери (2% от массы тела) у мышей выявлены признаки постгеморрагического состояния, характеризующиеся значительным повышением числа ретикулоцитов, снижением количества эритроцитов и концентрации гемоглобина (табл. 8). Помимо этого на 5-е сутки выявлено снижение количества лимфоцитов (исходный уровень - 7500±1280/мкл, на 5-е сутки -41501470; р<0,05).

Введение препарата «Биостим-Т» на фоне формирования постгеморрагической анемии не влияет на массу тимуса и селезенки. Число ядросодержащих клеток селезенки также не претерпевает изменений (данные не приводятся). Однако препарат в дозе 15,0 мг/кг приводит к повышению клеточности костного мозга мышей на 5-й день эксперимента. Число ЯСК костного мозга (хЮ6 клеток/бедренную кость) достигает в опытной группе 31,69+2,19, а в контрольной группе составляет- 22,46+2,60 (р<0,05). Препарат нивелирует лимфопению на 5-е сутки эксперимента. Число лимфоцитов в группах животных, получавших «Биостим-Т» в дозе 1,5 мг/кг, достигает уровня контроля.

Нами установлено, что применение препарата «Биостим-Т» в дозе 1,5 мг/кг способствует повышению работоспособности животных как в зимний, так и в летний периоды исследования (табл. 9). В тесте с поднятием грузиков этот эффект проявился увеличением отношения массы удержанного груза к собственной в опытных группах по сравнению с контрольными, а в тесте пла-

вания - увеличением продолжительности удерживания на поверхности воды (табл. 10).

В связи с тем, что иммуномодулирующее действие препарата in vivo может опосредоваться через целый ряд непрямых механизмов, в частности, повышение уровня колониестимулирующих факторов, провоспалительных цито-кинов, регуляцию процессов созревания и миграции клеток и др., представляется необходимым изучение эффектов препарата «Биостим-Т» в системе in vitro. Подобные исследования необходимы, во-первых, для выяснения возможности прямого действия препарата на клетки иммунной системы и, во-вторых, не исключена возможность дальнейшей разработки инъекционной формы препарата «Биостим-Т».

Таблица 8

Влияние препарата «Биостим-Т» на показатели красной крови мышей па фоне кровопотери

Форма препарата

Доза, мг/кг

Исходный уровень

48 ч

5-е сутки

Количество эритроцитов, х1012/л

Контроль Порошок

Таблетки Драже

Контроль Порошок

Таблетки Драже

1,5 15,0 1,5 1,5

7,8810,33 7,40±0,49 7,1б±0,47 8,0210,50 7,69±0,58

5,9910,44 5,83±0,33* 5,69Ю,30* 6,92±0,53

6,4810,39

Концентрация гемоглобина, г/л

1,5 15,0 1,5 1,5

158,4918,49 154,7913,77 149,7916,94 172,26110,59 163,70111,91

128,4116,04* 128,0917,64* 120,2814,48* 136,2012,94* 124,6716,60*

5,7410,55* 5,7610,59 6,0210,44 7,2410,41* 6,6710,68

108,71111,32*

105,1916,62*

113,1615,0/

129,8017,05*

111,7716,22*

Количество ретикулоцитов, %,

Контроль — 1,31Ю,58 4,5611,0* 7,0710,7*

Порошок 1,5 1,36*0,46 5,511,27* 6,011,25*

15,0 1,1910,25 5,2511,18* 8,4311,46*

Таблетки 1,5 1,010,45 4,79Ю,92* 7,75Ю,92*

Драже 1,5 1,43Ю,62 3,36Ю,97 7,1411,29*

Примечание. Здесь и в табл. 12, 13, *- р<0,05 по t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; * - то же по отношению к исходному уровню.

При оценке активности препарата «Биостим-Т» в реакции микробиолюминесценции in vitro показано, что он обладает четко выраженной способно-

стью стимулировать свечение клеток генноинженерного штамма Е. coli lum +.

Результаты оценки влияния препарата in vitro на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови практически здоровых людей (п=8) представлены на рис. 2. При анализе эмпирической зависимости доза-эффект мито-гена в культурах с добавлением препарата «Биостим-Т» обращает на себя внимание сдвиг оптимума концентрации фитогемагглютинина (ФГА) в сторону более низких значений. Максимальная пролиферация в культурах с добавлением препарата в концентрациях 10"6 и I0'8 г/л отмечена при добавлении 10 мкг/мл ФГА. В культурах без препарата оптимальные концентрации ФГА по

Таблица 9

Влияние препарата «Биостим-Т» на силовую выносливость мышей

Формы препарата

Количество Время удерживания на гори-животных зонтальном стержне, сек

Контроль Порошок

I серия (зимний период) 18 13

П серия (летний период)

8,17±1,79 16,3813,85*

Контроль 9 12,22±2,31

Порошок 10 33,1015,82»*

Таблетки 10 36,5015,22***

Драже 9 29,6716,93*

Таблица 10

Влияние препарата «Биостим-Т» на силовую устойчивость и мышечную выносливость мышей

Варианты опыта Масса удерживаемых грузиков, г Время плавания, сек

Контроль 36,1813,32 465,67173,91

(ч=Н) (п=6)

Препарат 44,5011,62* 778,201158,77*

(п=12) (п=5)

средним значениям включения 3Н-тимидина составляли 20 и 40 мкг/мл. При анализе эффекта препарата в отдельно взятых культурах установлено, что «Биостим-Т» в концентрации 10 г/мл вызывает достоверное снижение количества включенного в лимфоциты 3Н-тимидина в культурах с субоптимальными (5 и 10 мкг/мл) и оптимальными (20 и 40 мкг/мл) концентрациями ФГА Аналогичный эффект наблюдается при концентрации 10"' г/мл в культурах без добавления митогена и с добавлением ФГА в концентрации 20 мкг/мл (рис. 2).

Поскольку концентрации препарата «Биостим-Т» 10'3 и 10"4 г/мл достаточно высоки, не исключено, что наблюдаемый эффект может иметь не физиологический характер, а быть связан с физико-химическими свойствами нуклеиновых кислот, в частности, с их полианионной структурой. Другой причиной этого может являться конкурентное включение в ДНК лимфоцитов азотистых оснований, поступающих в клетку из препарата «Биостим-Т», что приводит к снижению количества включенного меченого тимидина.

Рис. 2. Влияние препарата «Биостим-Т» на пролифера-тивный ответ лимфоцитов в культуре in vitro.

По оси абсцисс - концентрация ФГА, мкг/мл; по оси ординат -средняя геометрическая абс. числа имп./мин (антилогарифм из средней арифметической log10 имп./мин). Цифрами рядом с кривыми указаны концентрации препарата «Биостим-Т», к соответствующим культурам без препа-

рата.

При исследовании влияния препарата «Биостим-Т» на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови здоровых людей (n=9) in vitro выявили его стимулирующее действие при использовании рабочих концентраций препарата

Оценка in vitro влияния препарата «Биостим-Т» на кислородозависимую микробицидность нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием показывает, что в концентрациях 10"4 и 10~5 г/мл препарат достоверно повышает показатели цитологического индекса, не влияя на него в концентрациях (табл.11).

Таблица 11

Влияние препарата «Биостим-Т» на микробицидую активность нейтрофилов периферической крови людей в тесте с нитроснним тетразолием (п=10)

Контроль Концентрация препарата, г/мл

ю-4 10Г» Ю-6 ю-7

Цитологический индекс

21,0±4,15 32,0±4,80* 34,80±4,99* 23,70±3,92 11,83±2,56

Наличие иммуномодулирующей активности препарата «Биостим-Т» в сис-

теме in vitro прямо указывает на возможность его непосредственного действия на клетки иммунной системы.

Испытания препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже с привлечением группы добровольцев

У добровольцев (женщины, средний возраст - 43,9 лет), участвующих в испытаниях таблеток, имели место следующие заболевания и синдромы: хроническая железодефицитная анемия, астеновегетативный синдром, хронические холецистит, гастродуоденит. Соответственно этому при первичном осмотре участники испытаний предъявляли жалобы на общую слабость, повышенную утомляемость, сонливость, особенно во 2-й половине дня, нарушение сна, одышку, боли за грудиной и в эпигастрии. Через 4 недели от начала приема препарата подавляющее большинство жалоб, высказанных в начале испытаний, не предъявлялось. Это подтверждается динамикой физиологических показателей. В частности, ежедневный прием препарата «Биостим-Т» в таблетках способствовал нормализации частоты пульса, артериального давления. Изменились под воздействием препарата и показатели гемограммы (табл. 12). У всех участников испытаний с исходно сниженным уровнем гемоглобина через 4 недели приема препарата данный показатель достиг нормы. Аналогичная картина наблюдается в отношении содержания эритроцитов периферической крови. Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула в среднем не изменились. Аллергических и других побочных реакций при применении таблеток не наблюдали.

У добровольцев (женщины, средний возраст - 39,2 лет), участвующих в испытаниях драже, имели место практически те же заболевания и синдромы (железодефицитная анемия, астеновегетативный синдром, хронический холецистит, гипертоническая болезнь, бронхиальная астма, остеохондроз). Поэтому при первичном осмотре участники испытаний предъявляли аналогичные жалобы. Через 4 недели от начала приема драже подавляющее большинство этих жалоб не предъявлялось. Ежедневный прием драже не вызвал изменений артериального давления, частоты пульса и частоты дыхания. Практически у всех участников испытаний с исходным сниженным уровнем гемоглобина через 4 недели приема препарата данный показатель достиг нормы (табл. 12). Количественный состав лимфоцитов крови, несущих различные маркеры, практически не изменился (р>0,05; данные не приводятся). Применение драже не оказало влияния на концентрацию цитокинов и иммуноглобули-

нов (р>0,05) в сыворотке крови (табл. 13).

Подтверждением стимулирующего воздействия препарата на работу неспецифического звена иммунной системы явилось достоверное повышение фа-

гоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у добровольцев, принимавших драже (табл. 13).

Таблица 12

Влияиие препарата «Биостим-Т» на показатели гемограммы

Показатели

Исходный уровень

Через 4 недели

Гемоглобин, г/л Эритроциты, хЮ12/л

Гемоглобин, г/л Эритроциты, х1012/л

Таблетки 115,3 ±2,6 3,98±0,1 Драже

113,3±5,5 3,9110,17

124,813,0* 4,22Ю,08*

122,914,29* 4,2910,09*

Таблица 13

Измепения концентрации цитокинов, сывороточных иммуноглобулинов и показателей фагоцитарной активности нейтрофнлов у добровольцев, принимавших препарат «Биостим-Т» в форме драже

Показатели

Исходный уровень Через 1 месяц

44,9514,63 40,6212,97

11,9812,34 10,2211,54

14,1610,78 15,2610,77

1,7710,11 1,8510,14

1,4210,11 1,5610,16

38,8312,43 50,8313,77**

1,4810,07 1,5910,05

0,57+0,04 0,8310,08**

12441130 12641127

17861172 20701245

1Ь-4, пкг/мл ТИРа, пкг/мл ДО, г/л г/л IgM, г/л

Процент фагоцитоза Фагоцитарный индекс Фагоцитарное число Абс. число участвующих в фагоцитозе клеток Абс. число захваченных объектов фагоцитоза

Аллергических и других побочных реакций при применении драже не выявили.

В целом, по заключению врачей-терапевтов через месяц приема таблеток и драже практически у всех испытуемых отмечено улучшение общего состояния.

Кроме того, в течение 12-ти месяцев до приема препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже количество обращений участников испытаний к врачу по поводу инфекционных и неинфекционных заболеваний составило в среднем

0,73+0,20, а за аналогичный период после испытаний уменьшилось до 0,41± 0,14 (р<0,05).

Полученные результаты указывают на возможность использования препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже для профилактики и лечения состояний, сопровождающихся нарушениями процессов эритропоэза, а также для повышения неспецифической резистентности организма.

Таким образом, результаты исследований позволяют заключить, что препарат «Биостим-Т», оказывая иммуномодулирующее, эритропоэзстимулирую-щее действие и повышая работоспособность, является безвредным средством и может быть рекомендован для длительного применения. Таблетки и драже зарегистрированы в качестве биологически активных добавок к пище.

ВЫВОДЫ

\. Новый препарат «Биостим-Т», полученный оригинальным способом из семенников крупного рогатого скота, содержит 59±2% ДНК и 1,1±0,1% РНК в виде натриевых солей.

2. Установлено, что препарат «Биостим-Т» при пероральном введении не оказывает общетоксическое, эмбриотоксическое и тератогенное действие, не обладает аллергенными и мутагенными свойствами.

3. Показано, что препарат «Биостим-Т» при пероральном введении обладает выраженной иммуномодулирующей активностью. Применение препарата стимулирует накопление антителообразующих клеток в селезенке, вызывает повышение титра антител к эритроцитам барана, фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови и макрофагов костного мозга.

4. Обосновано, что в условиях экспериментального иммунодефицита пе-роральное введение препарата «Биостим-Т» после инъекции цитостатика способствует восстановлению сниженных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, клеточности тимуса, костного мозга и стимулирует накопление антителообразующих клеток в селезенке, увеличение титра антител в сыворотке крови.

5. На модели экспериментальной анемии показано, что препарат «Био-стим-Т» проявляет выраженные эритропоэзстимулирующие свойства.

6. Установлено, что пероральное введение препарата «Биостим-Т» способствует значительному повышению мышечной и силовой выносливости животных.

7. С привлечением группы добровольцев подтверждена иммуномодули-рующая и эритропоэзстимулирующая активность препарата «Биостим-Т», применяемого в форме таблеток и драже.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Петров В.Ф., Сафонова Г.М., Старцсва Н.В., Юшкова Т.А., Фарцейгер А.Г., Колчанова Н.А. Получение препарата, содержащего ДНК, из отходов производства препарата лидазы//В кн.: Современная вакцинология: Тез. докл. - Пермь, 1998.-С. 186-187.

2. Петров В.Ф., Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Биологически активная пищевая добавка, содержащая ДНК//В кн.: Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Матер. II Междунар. съезда -СПб, 1998.-С. 179-179.

3. Петров В.Ф., Сафонова Г.М., Старцева И.В. Биологически активная добавка, содержащая ДНК//В кн.: Современные проблемы валеологии и эндоэколо-гической реабилитации в лечебном и учебном процессе: Матер. Всерос. научн. конф. - Пенза, 1999. - С. 43-44.

4. Старцева Н.В. К разработке биологически активной добавки, содержащей ДНК//В кн.: Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Матер, конф. - Пермь, 1999. - С. 60-61.

5. Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Влияние биологически активной добавки к пище «Биостим» на фагоцитарную активность нейтрофилов//В кн.: Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Матер. XIV Всерос. научн. конф. - Челябинск, 2000. - С. 9S-99.

6. Старцева Н.В. К вопросу об использовании в здравоохранении биологически активных добавок к пище//Х1У Респуб. молод, научн. конф.: Тез. докл.— Сыктывкар, 2000. - Т. 1. - С. 112 - U2.

7. Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Влияние биологически активной добавки к пище «Биостим» на показатели гемограммы//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Труды Всерос. конф. - Уфа, 2000. - С. 79-81.

8. Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Оценка влияния препарата «Биостим» на иммунный ответ при экспериментальном иммунодефицитс//Иммунология Урала. -2001.-N. 1(1).-С. 124-125.

9. Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Влияние препарата «Биостим» на гуморальный иммунный ответ//В кн.: Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Тез. докл. — Томск,2001.-С. 81-83.

10. Сафонова Г.М., Несчисляев В.А., Перевозчиков А.Б., Старцева Н.В., Хилько М.Г., Чистохина Л.П. Иммунобиологическая характеристика некоторых препаратов природного происхождения, разрабатываемых Пермским НПО «Био-мед»//В кн.: Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов

природного происхождения: Матер. V Междунар. съезда. - СПб, 2001. - С. 285289.

11. Старцева Н.В., Сафонова Г.М. К вопросу о клинической оценке препарата, содержащего натриевую соль ДНК//Перспекшвы развития естественных наук в высшей школе: Труды Междунар. научн. конф. - Пермь, 2001. - Т. IV. - С. 200203.

12. Старцева Н.В., Сафонова Г.М. Клиническое изучение эффективности биологически активной добавки к пище «Биостим»//Объединенный мед. журнал. -2002.-К2(3).-.-С. 58-60.

13. Сафонова Г.М., Пшеничное Р.А., Старцева Н.В., Лужецкая М.Г. Оценка стимулирующих свойств «Вермина», «Олексина», «Биостима» в реакции микро-биолюминесценции//В кн.: Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер, конф. - Пермь, 2003. - С. 312-315.

14. Старцева Н.В., Сафонова Г.М. Влияние биологически активной добавки к пище «Биостим» на течение экспериментальной анемии//Там же. — С. 310-312.

15. Сафонова Г.М., Старцева Н.В. Иммунобиологические свойства препарата биостим-Т//Пермский мед. журнал. - 2004. - N. 1. - С. ¿'''£3.

16. Петров В.Ф., Сафонова Г.М., Старцева Н.В., Фарцейгер А.Г., Эпштсйн Л.М., Колчанова Н.А. Способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения. Патент на изобретение РФ № 2139068 от 10.10.1999. Заявка № 97118948 от 31.10.1997. Приоритет № 97118948/20 от 31.10.1997.

Старцева Наталья Валерьевна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА «БИОСТИМ-Т» НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Автореферат

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать 19.02.2004. Формат 60X84/16. Набор компьютерный. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 78/2004.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29а, к.113, т.(3422) 198-033

»-4482

Актуальность проблемы. Создание препаратов, обладающих адапто-генной и иммунокорригирующей активностью, является важной задачей, стоящей перед иммунофармакологами. Ряд иммуномодулирующих препаратов, разработанных отечественными специалистами уже внедрены в лечебную практику. Это полиоксидоний, имунофан, ликопид, рибомунил, лейкин-ферон, виферон и др. [17, 38, 72, 91, 101, 193]. Однако необходимость дальнейшего поиска и испытаний новых иммуномодуляторов, действующих избирательно на отдельные звенья иммунной системы [103] и являющихся безопасными лекарственными препаратами, не исчезает. Это определяется ростом частоты вторичных иммунодефицитных состояний, аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Практически важен поиск новых сырьевых источников для производства препаратов, регулирующих функции иммунной системы. К настоящему времени в Пермском НПО «Биомед» разработаны и прошли доклинические испытания ряд препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью: молокин и ганглиин, выделенные из речных и морских животных [11, 73], вермин, полученный из наземных беспозвоночных [82], олексин, выделенный из растительного сырья (сухие листья персика обыкновенного) [127, 143].

В связи с доказанной высокой иммуномодулирующей активностью препаратов на основе природных нуклеиновых кислот и их синтетических производных [55, 56, 131] является актуальной разработка новых препаратов этой группы для перорального применения и оценка их иммунотропного действия.

Цель настоящего исследования - изучение иммунобиологических свойств нового препарата «Биостим-Т».

Основные задачи исследования:

1. Разработать эффективный способ выделения нуклеиновых кислот из семенников крупного рогатого скота. Создать на их основе пероральный препарат «Биостим-Т».

2. Изучить общетоксическое действие препарата «Биостим-Т».

3. Исследовать иммунобиологическую активность препарата «Биостим

Т».

4. Оценить иммуномодулирующее и эритропоэзстимулирующее действие препарата «Биостим-Т» с привлечением группы добровольцев.

Научная новизна. Разработан и запатентован оригинальный способ выделения нуклеиновых кислот из семенников крупного рогатого скота, на основе которого создан пероральный препарат «Биостим-Т». Изучены общетоксическое, эмбриотоксическое и тератогенное действие, аллергенные и мутагенные свойства препарата «Биостим-Т» [124, 134].

Исследовано влияние препарата «Биостим-Т» на гуморальный и кле-точноопосредованный иммунный ответ, активность фагоцитирующих клеток, показатели клеточности органов лимфомиелоидного комплекса у животных с ненарушенными функциями иммунной системы и при экспериментальном иммунодефиците. Изучена эффективность применения препарата «Биостим-Т» в условиях экспериментальной анемии. Исследовано влияние препарата «Биостим-Т» на мышечную и силовую выносливость животных. Оценено иммуномодулирующее и эритропоэзстимулирующее действие препарата «Биостим-Т» с привлечением группы добровольцев.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представление о принципиальной возможности использования в качестве сырьевого источника семенников крупного рогатого скота для промышленного получения препаратов, содержащих нуклеиновые кислоты. Разработан патентоохраняемый способ экспериментального и промышленного получения препарата «Биостим-Т», содержащего натриевые соли ДНК и РНК (приложение 1). Разработана технология, оформлена нормативная документация и получены регистрационные удостоверения на выпуск препарата «Биостим-Т» в форме таблеток и драже (приложения 2-5). Данный препарат рекомендуется для профилактики и в комплексном лечении анемий, коррекции вторичных иммунодефицитных состояний. Качество препарата отмечено золотой медалью им. И.И. Мечникова (2002) и золотой медалью им. Пауля Эрлиха (2003) (приложения 6, 7).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новый препарат «Биостим-Т» на основе нуклеиновых кислот, выделенных из семенников крупного рогатого скота, не обладает выраженным общетоксическим, аллергенным, мутагенным, эмбриотоксическим и тератогенным действием.

2. Препарат «Биостим-Т» проявляет выраженную иммунотропную активность. Применение препарата приводит к активации гуморального иммунного ответа и фагоцитоза, а также к восстановлению нарушенных показателей иммунитета при экспериментальном иммунодефиците.

3. Препарат «Биостим-Т» характеризуется высокой эритропоэзстиму-лирующей активностью, проявляющейся при его введении на фоне сниженных гематологических показателей.

4. Применение препарата «Биостим-Т» способствует повышению мышечной и силовой выносливости животных.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции молодых ученых, Пермь 1999; XIV Коми республиканской молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской научной конференции, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Имму-нопрепарат», 2000; I Конференции иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Естественный научный институт при Пермском государственном университете, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2001; Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского научно-производственного объединения «Биомед», 2003. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген». МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»; расширенном заседании лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов, Пермь.

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ. Полученные результаты исследований защищены Патентом на изобретение РФ № 2139068.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 6 рисунков и 58 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 301 литературный источник, из них 218 отечественных и 83 зарубежных авторов, 11 приложений.

ВЫВОДЫ

1. Новый препарат «Биостим-Т», полученный оригинальным способом из семенников крупного рогатого скота, содержит 59+2% ДНК и 1,1±0,1% РНК в виде натриевых солей.

2. Установлено, что препарат «Биостим-Т» при пероральном введении не оказывает общетоксическое, эмбриотоксическое и тератогенное действие, не обладает аллергенными и мутагенными свойствами.

3. Показано, что препарат «Биостим-Т» при пероральном введении обладает выраженной иммуномодулирующей активностью. Применение препарата стимулирует накопление антителообразующих клеток в селезенке, вызывает повышение титра антител к эритроцитам барана, фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови и макрофагов костного мозга.

4. Обосновано, что в условиях экспериментального иммунодефицита пероральное введение препарата «Биостим-Т» после инъекции цитостатика способствует восстановлению сниженных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, клеточности тимуса, костного мозга и стимулирует накопление антителообразующих кцеток в селезенке, увеличение титра антител в сыворотке крови.

5. На модели экспериментальной анемии показано, что препарат «Биостим-Т» проявляет выраженные эритропоэзстимулирующие свойства.

6. Установлено, что пероральное введение препарата «Биостим-Т» способствует значительному повышению мышечной и силовой выносливости животных.

7. С привлечением группы добровольцев подтверждена иммуномо-дулирующая и эритропоэзстимулирующая активность препарата «Биостим-Т», применяемого в форме таблеток и драже.