Автореферат и диссертация по медицине (14.00.28) на тему:Новые подходы в антигенспецифической иммунотерапии злокачественных глином головного мозга

На правах рукописи

Козлов Юрий Петрович

НОВЫЕ ПОДХОДЫ В АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ГЛИОМ ГОЛОВНОГО МОЗГА

14.00.28. - нейрохирургия

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2006

003062370

Работа выполнена в отделении нейрохирургии Федерального государственного учреждения «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Вячеслав Владимирович Ступак

доктор медицинских наук,

профессор Елена Рэмовна Черных

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Андрей Юрьевич Савченко

доктор медицинских наук Владимир Сергеевич Кожевников

Ведущая организация: Красноярская государственная медицинская академия.

Защита состоится «_»_2007 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.064.01. ФГУ НИИ травматологии и ортопедии Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке по адресу: ФГУ «Новосибирский НИИТО Росздрава», г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 17.

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.064.01 доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Среди первичных опухолей головного мозга глиомы у взрослого населения составляют около 50%. Из них 55-57% являются злокачественными (Качков И.А., 1984, В.В.Ярцев с соавт., 1997; ЮЛ.Зозуля с соавт., 1998; Олюшин В.Е., Улитин А.Ю., 1997; Савченко А.Ю. с соавт., 1997; Олюшин В.Е., 1994, 2004, H.Ahsan et al., 1995; F.G.Devis et al., 1996; Wrensch M.R. et al., 2000). В настоящее время выработан единый комплексный подход к лечению низкодифференцированных внутримозговых опухолей головного мозга, который включает оперативное вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию с использованием современных химиопрепаратов (Ромоданов А.П., 1983; Качков И.А., 1984; Mahaley Y.L. et al., 1989; Марченко C.B., 1997; Олюшин В.Е. и соавт., 1998, 2004, 2006, Желудкова О.Г. и соавт., 2004, Коновалов А.Н. и соавт., 2006, Кобяков Г. и соавт., 2006, Stupp R., et.all., 2005).

Тем не менее, средняя продолжительность жизни больных при низкодифференцированных глиомах остается даже с использованием новейшей химиотерапии темодалом низкой и варьирует, по данным разных авторов, в диапазоне от 9-12 до 25 месяцев (Г.А.Круминя, 1981; М.Янева, 1993; С.В.Марченко, 1997; Савченко А.Ю., 1997; А.Н.Коновалов, 1988; А.В.Голанов, А.Г.Коршунов, 1998; В.А.Лошаков, 1998; Олюшин В.Е. с соавт., 2000; Желудкова О.Г. и соавт., 2004, Холодов Б. и соавт., 2006, Yen S.A. et al., 1999; Tjoa B.A., Salgaller M.L, 2000; Wrensch M.R. et al., 2000, Stupp R., et.all., 2005 ).

Согласно данным литературы перспективы улучшения результатов лечения злокачественных опухолей в общей хирургии связывают с сочетанием хирургических подходов с методами иммунотерапии. При этом предполагается, что комбинация различных иммунотерапевтических подходов может существенно повысить эффективность иммунотерапии. Так, например, включение в комплекс лечения метода комбинированной иммунотерапии, основанного на сочетании адоптивной иммунотерапии с курсом цитокинотерапии, позволяет 2-кратно увеличить показатели 2-летней выживаемости у больных злокачественными опухолями головного мозга (Никонов С.Д. и соавт., 2000, Центнер М.И. и соавт., 2002). Однако в более поздние сроки у больных отмечается возникновение рецидивов, что свидетельствует о целесообразности поддержания противоопухолевого иммунитета по завершении курса комбинированной иммунотерапии и диктует необходимость разработки более эффективных методов генерации цитотоксических лимфоцитов для элиминации опухолевых клеток.

В связи с этим значительный интерес представляет включение в программу иммунотерапии дендритных клеток (ДК). ДК являются наиболее профессиональными антигенпрезентирующими клетками, способны преодолевать толерантность к опухолевым антигенам и запускать эффективный иммунный ответ, приводящий к регрессии опухоли у экспериментальных животных (Wallenfriedman и соавт., 1999, Ashley, Faiola,

1997). Исходя из этого можно полагать, что использование ДК, нагруженных опухолевыми антигенами, для генерации цитотоксических лимфоцитов и вакцинации после удаления опухоли позволит значительно повысить эффективность апробированного ранее протокола комбинированной иммунотерапии.

Традиционно ДК генерируют путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ—4. Однако в последнее время было показано, что ДК могут быстро генерироваться при культивировании с ГМ-КСФ и ИФН-а. Полученные в этом случае ДК, названные «интерфероновыми» ДК (ИФН-ДК), имеют ряд преимуществ (быстрее генерируются, характеризуются высокой способностью к захвату антигена, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов, имеют более высокую миграционную активность и эффективно стимулируют клеточный иммунный ответ) (Santini S., 2004, Parlato S., 2001). Несмотря на эти достоинства, ИФН-ДК в клинической практике до сих пор не апробировались. Таким образом, исследование возможности применения этих клеток представляется, несомненно, актуальным. Учитывая данные об изменении количества и функций ДК и их предшественников при опухолевом росте, одним из принципиальных вопросов при этом является выяснение возможности генерации ИФН-ДК у больных ЗОГМ и оценка их полноценности.

Цель исследования: на основании изучения возможности генерации дендритных клеток и их характеристики у больных злокачественными глиомами головного мозга разработать метод комбинированной иммунотерапии с применением дендритных клеток и оценить его клиническую эффективность в комплексном лечении больных с данной патологией.

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность генерации интерферон а - индуцированных ДК (ИФН-ДК) у больных ЗОГМ и оценить их фенотипические и функциональные свойства.

2. Изучить возможность развития противоопухолевого иммунного ответа у больных ЗОГМ на фоне комбинированной иммунотерапии с использованием ИФН-ДК.

3. На основании магнитно-резонансной томографии (МРТ) изучить морфологическое состояние головного мозга до, во время и после проведения комбинированной иммунотерапии (КИТ) с использованием дендритных клеток.

4. По данным изучения общего состояния больных, индекса качества жизни по шкале Карновского, показателей выживаемости провести сравнительное исследование результатов комплексного лечения в группах больных, получавших и не получавших КИТ.

Основные положения, выноснмые на защиту:

1. Из периферической крови пациентов со злокачественными глиомами головного мозга возможна генерация ИФНа-индуцированных дендритных клеток, которые, несмотря на некоторые фенотипические особенности, характеризуются функциональной полноценностью и индуцируют у больных сенсибилизацию к белкам, содержащимся в лизате опухолевых клеток.

2. Метод комбинированной иммунотерапии с использованием ИФНа-индуцированных дендритных клеток хорошо переносится больными и не ведет к ухудшению морфологического состояния головного мозга.

3. Разработанный способ комбинированной иммунотерапии с использованием дендритных клеток улучшает общее состояние больных, качество жизни и увеличивает показатели выживаемости.

Научная новизна исследования

Впервые проведено детальное исследование ДК, генерируемых в присутствии ГМ-КСФ и ИФН-а у больных ЗОГМ, и показана принципиальная возможность генерации ИФН-ДК у пациентов с глиальными внутримозговыми опухолями. Популяция генерируемых ИФН-ДК больных имеет ряд фенотипических особенностей, в частности, характеризуются умеренным повышением содержанием ДК с маркерами моноцитов (CD14+) и незрелых ДК (CDla+) и снижением зрелых ДК (CD83+) , что отражает некоторую задержку дифференцировки и созревания. Тем не менее, ИФН-ДК обладают сохранной антигенпрезентирующей функцией, в частности, схожей с таковой у доноров аллостимуляторной активностью ДК и способностью презентировать антигены очищенного туберкулина и белки опухолевого лизата. Кроме того, ИФН-ДК больных обладают выраженной индуцирующей активностью в отношении продукции интерферона у, т.е. эффективно стимулируют Thl, особенно в культурах примированных Т-клеток. При этом проведение комбинированной иммунотерапии с использованием ИФН-ДК сопровождается развитием сенсибилизации к лизату аутологичных опухолевых клеток как in vitro, так и in vivo.

Разработан новый «Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 по заявке № 2004100550 с приоритетом от 05.01.04).

Впервые проведена клиническая апробация ИНФ-индуцированных ДК и изучены результаты комплексного лечения больных с внутримозговыми злокачественными опухолями головного мозга (глиобластомами и астроцитомами III степени анаплазии) с использованием комбинированной иммунотерапии с применением дендритных клеток.

Практическая значимость работы

На основании клинических, иммунологических и морфологических (МРТ) исследований показано, что разработанный новый метод комбинированной иммунотерапии, включающий применение ИФН-индуцированных дендритных клеток, характеризуется хорошей переносимостью, не ведет к ухудшению общего состояния больных,

позволяет значимо улучшить общее состояние, качество жизни и показатели продолжительности жизни больных.

Внедрение в практику

Для практического здравоохранения по теме диссертации разработан проект новой медицинской технологии «Комбинированная иммунотерапия с использованием дендритных клеток в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга», который находится на утверждении в МЗ РФ. Полученные в результате выполнения настоящей работы оригинальные разработки внедрены в практику нейрохирургических отделений ГУ НИИТО Росздрава и Муниципальной клинической больницы №1 г. Новосибирска.

Апробация работы состоялась 02.11.2006 г. на расширенном заседании Учёного совета ГУ НИИТО Росздрава.

Основные положения работы доложены:

1. На всероссийской научно - практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения». Ленинск — Кузнецкий, 2003 г. 2. На Всероссийской конференции «Комбинированное лечение опухолей головного мозга». Екатеринбург, 2004 г. З.На международной конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты). Томск, 2004 г. 4. XII Симпозиуме японо — российского обмена. Красноярск, 2005 г. 5. На всероссийской научно - практической конференции «Поленовские чтения». Санкт - Петербург, 2006 г. 6. На пятнадцатой научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г. 7. Joint meeting of the French and Russian Societies of Neurosurgery (Caen, France, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ. Из них 1 - за рубежом, 2 - в центральном издании.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле, состоит из введения, 4 глав, заключения, библиографического указателя и приложения, изложена на 185 страницах машинописи, иллюстрирована 30 рисунками и 34 таблицами. В указателе литературы приводится 112 отечественных и 182 зарубежных источника.

Личное участие автора в исследовании

Весь материал, представленный в работе, был собран и проанализирован автором. Автор во всех случаях принимал участие в диагностике и определении тактики лечения больных. С участием автора оперировано 68 пациентов. Лабораторный этап комбинированной иммунотерапии всем пациентам исследуемой группы проводился лично автором. Выдвигаемые научно-практические положения были разработаны с участием автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы. Настоящая работа основана на наблюдениях за 119 больными в возрасте от 16 до 69 лет с супратенториальными злокачественными глиомами головного мозга (анапластическими

астроцитомами III степени анаплазии и глиобластомами), которым проведено комплексное лечение в клинике нейрохирургии Новосибирского НИИТО в период с 1995 по 2006 г.г. Референтную группу составили 62 здоровых донора.

Диагноз опухолей проводился в соответствии с Международной классификацией опухолей нервной системы ВОЗ (1993 г.) в модификации Ярцева В.В. с соавт. ( МКБ-10, 1995). Клиническая характеристика больных представлена в табл.1.

Таблица 1

Клиническая характеристика больных__

Общее количество больных (N) Средний возраст, лет (М±т) Мужчины Женщины Анапластические астроцитомы Глиобластомы Количество первично оперированных Количество повторно оперированных

119 44,4±0,6 60 (50,42%) 59 (49,58%) 71 (59,66%) 48 (40,34%) 106 (89,1%) 13 (10,9%)

Среди всех пациентов гистологически верифицированных анапластических астроцитом III степени анаплазии было 71 (59,66%), глиобластом - 48 (40,34%) (Табл.1). Средний возраст по группе составил 44,4 ± 0,6 года. Глиобластомы чаще встречались у пациентов старше 40 лет, в то время как анапластические астроцитомы одинаково часто встречались в возрастных категориях до 40 и старше 40 лет.

В зависимости от вида комплексного лечения были сформированы две группы (Таблица 2).

Таблица 2

Группа Средний возраст, лет (М±ш) Возраст до 40 лет Возраст после 40 лет Мужчины Женщины Анапластические Астроцитомы Глиобластомы Количество первично оперированных Количество повторно оперированных п

1 41,9±1,5 16 41,0% 23 59,0% 22 56,4% 17 43,6% 24 61,5% 15 38,5% 32 82,1% 7 17,9% 39

2 45,7±1,2 27 33,8% 53 66,2% 38 47,5% 42 52,5% 47 58,8% 33 41,2% 74 92,5% 6 7,5% 80

I - 43 76 60 59 71 48 106 13 119

^Примечание: 1 - Исследуемая группа; 2 - Группа сравнения.

В исследуемую группу вошли 39 больных, которым комплексное лечение, включающее оперативное удаление опухоли в пределах видимых границ + лучевая терапия в стандартной дозе на область удаленной опухоли (СОД 55-60 Грэй), было дополнено курсом КИТ, включающим локорегиональное введение цитотоксических клеток в комбинации с ронколейкином с последующей вакцинацией дендритными клетками. Группу сравнения составили 80 больных, которым проводилось комплексное лечение, включающее оперативное лечение и радиотерапию. Как видно (Табл. 2, 3), пациенты сравниваемых групп были достоверно сопоставимы по большинству параметров: 1) среднему возрасту-41,9±1,5 го 45,7±1,2 лет; 2) исходному общему состоянию; 3) величине исходного индекса качества жизни (ИКЖ) Карновского - 56,2±1,9 уя 55,8±1,9 баллов; 4) соотношению количества пациентов с анапластическими астроцитомами и глиобластомами в сравниваемых подгруппах - коэффициент «АА/ГБ» равен 1,6 го 1,4; 5) локализации и распространению опухолевого процесса.

Таблица 3

Распределение больных по тяжести состояния в группах_

СОСТОЯНИЕ Исследуемая группа Группа с равнения

Абс. Отн. Абс. Отн.

Компенсированное 4 10,3% 7 8,9%

Субкомпенсированное 18 46,2% 41 51,1%

Декомпенсированное 15 38,5% 29 36,7%

Крайне тяжёлое 2 5,1% 3 3,8%

ВСЕГО 39 100% 80 100%

Аппаратура, используемая в работе. Для выполнения оперативного вмешательства использовали набор микронейрохирургического инструментария (Казань), механический мозговой ретрактор фирмы «AESCULAP», бинокулярную лупу фирм «Carl Zeiss» (Германия) с увеличением в 4,4 раза и «Heine» (Германия) с увеличением в 5,5 раз, а также ультразвуковые аспираторы хирургические УЗХ-М-2 («МЕДА-НН», г. Нижний Новгород) и Sonoca фирмы «Söring» (Германия). Для обеспечения тщательного гемостаза использовали губку «ГЕМАСЕПТ» (Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, регистрационный № 91/194/5). Для временной герметизации желудочков мозга с целью предотвращения попадания в них крови, активированных МНК, а также предотвращения ликворреи, применяли «Тахокомб» (Hafslund Nycomed Pharma, госуд. per. № 005524 от 25.11.94). В ложе удаленной опухоли устанавливали хлорвиниловый катетер для внутрисосудистых вливаний однократного применения ТУ 6436-003-16548645-94 («БИОМЕДИКАЛ», г. Москва).

Визуализация опухолей головного мозга осуществлялась с помощью MP-томографа «General Electric» с напряжённостью магнитного поля 0,75 Т (США).

Методы оценки эффективности лечения. При исследовании общего состояния изучали выраженность общемозговой симптоматики по «шкале оценки тяжести состояния нейроонкологичесого больного», разработанной в

нейроонкологическом отделении РНХИ им. А.Л.Поленова (С.В.Марченко, 1997). Индекс качества жизни определяли по шкале Карновского (Karnofsky

D.A., Borchenal J.H., 1949) до операции, во время комбинированной иммунотерапии и после выписки.

Диагностика опухолей головного мозга и изучение его морфологического состояния в процессе иммунотерапии проводилось с помощью MP-томографа «General Electric» с напряжённостью магнитного поля 0,75 Т (США).

В ряде случаев при проведении МРТ для дифференцирования опухолевого субстрата от перитуморального отёка и уточнения характера распространенности опухолевого процесса использовали неионное парамагнитное контрастное вещество на основе гадолиния - «Омнискан» (Nicomed, Австрия) или «Гадовист» (Schering AG, Германия). Объем опухоли рассчитывали по формуле Эриксона для определения объема эллипсоида:

V = л-ах^хс, где a, b и с — максимальные диаметры очага (Ericson R., 6

Hakanson S., 1981). Для определения объёма отека перитуморозной зоны головного мозга была использована программа «TOMOSOFT».

Иммунологические методы исследования

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартно центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм (Nunclon, Дания) путём прилипания к пластику в присутствии 10% сыворотки крови AB(IV) группы. ДК генерировали путём культивирования прилипающей фракции МНК во флаконах для культивирования (BD Biosciences Falcon, UK) в течение 3 сут в среде RPMI-1640 (Sigma, США) в присутствии GM-CSF (Leucomax, Шеринг-Плау, Швейцария) 1000 Ед/мл и INF-a (Роферон-А, Roche, Швейцария) 1000 Ед/мл с последующим дозреванием в течение 24 ч с липополисахаридом (ЛПС

E.colli 0114:В4, Sigma) 10 мкг/мл. Фенотипирование ДК проводили методом одноцветной или двуцветной проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson) с использованием FITC-, APC- или РЕ-меченных антител (CDla, CDllc, CD 14, CD25, CD83, CD123; PharMingen, San Diego, США). Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) при соотношении МНК : ДК = 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 5 сут. радиометрически по включению ЗН-тимидина (1 мкКю/лунку). Оценку внутриклеточных цитокинов в популяции Т-клеток проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACS Calibur, Becton Dickinson) после пермеабилизации клеток с помощью 0,2% раствора Твин-20 с использованием моноклональных FITC-коньюгированными анти-INF-y антител и РЕ-меченными анти-1Ь-4, или РЕ-меченных антител (Becton Dickinson, США). Продукцию Thl/Th2 цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) оценивали методом проточной флюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном

анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем.

Методика проведения комбинированной иммунотерапии.

Комбинированную иммунотерапию начинали на 3-7 сутки послеоперационного периода. Новосибирским НИИТО и Институтом клинической иммунологии СО РАМН совместно разработан новый «Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 с приоритетом от 05.01.04).

Оригинальный протокол включал три этапа: Первый этап заключался в трехкратном внутримышечном введении 10000 ME лейкинферона с интервалом в 48 часов (ФС 42-3250-95, номер государственной регистрации 92/132/14). Второй этап включал 2-кратное локорегиональное введение ЛАК и 2-кратное введение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) в ложе удаленной опухоли. ЛАК генерировали в результате 48-часового культивирования МНК с Ронколейкином ( 50 Ед/мл) в пластиковых флаконах, после чего вводили через катетер в ложе удаленной опухоли в комбинации с Ронколейкином в дозе 250 000 ЕД. ЦТЛ генерировали путем культивирования МНК больных в присутствии ДК, нагруженных опухолевым лизатом, в присутствии Ронколейкина (50 Ед/мл) в течение 5 дней, после чего вводили в ложе удаленной опухоли в комбинации с Ронколейкином в дозе 250 000 ЕД. Антигенный материал (лизат опухолевых клеток) для нагрузки ДК получали из фрагмента аутологичной опухоли больного в результате 5-кратного замораживания/размораживания и использовали в концентрации (0,1 мг/мл по белку). Третий этап включал курс вакцинотерапии в виде подкожных инъекций нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток в дозе 10 х 106/введение (в 4-6 точек) с кратностью вакцинаций - 1 раз в 2 недели в сочетании с подкожным введением ронколейкина в дозе 250 000 ЕД.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием программы "STATISTICA 5.0".

Фенотипическая и функциональная характеристика ИФН-индуцированных дендритных клеток.

Сравнение эффективности генерации ИФН-ДК у здоровых доноров и больных ЗОГМ показало, что аналогично донорам в результате культивирования моноцитов больных с GM-CSF и IFN-a в течение 3-4 суток клетки теряли способность прилипать к пластику и приобретали типичные морфологические черты дендритных клеток. Жизнеспособность клеток во всех экспериментах была не менее 90% и не различалась между исследуемыми группами. Выход ДК у больных и доноров был также схожим (0,1 ± 0,01 и 0,13 ± 0,01 х 106 ДК из 1 млн МНК). Тем не менее, анализ фенотипических маркеров ИФН-ДК позволил выявить ряд особенностей (Таблица 4). Так, у больных отмечалось повышенное содержание клеток с фенотипом моноцитов (CD14+) и незрелых ДК (CDla+). В то же время относительное количество клеток с маркером зрелых ДК (CD83) было умеренно снижено.

Таблица 4

Фенотшшческая характеристика дендритных клеток у здоровых _доноров и больных ЗОГМ_

Маркеры Доноры Больные ЗОГМ

С014 8,7 ±1,4 (32) 17,7 ±2,6* (38)

СБ1а 10,4 ±2,0 (18) 19,3 ± 4,5 * (9)

СШ1с 28,7 ±2,2 (18) 40,8 ± 3,8 * (9)

СБ 123 24,9 ±2,64 (18) 34,0 ± 4,6 * (9)

СБ83 29,4 ± 2,9 (32) 22,6 ± 1,9* (38)

СБ25 25,1 ±3,5 (32) 19,2 ± 2,3(38)

Примечание: здесь и в таблице 2 представлены средние значения процентного содержания различных субпопуляций клеток. В скобках количество наблюдений (п). * -Ри<0,05 - достоверность различий по сравнению с донорами (и - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

В отличие от здоровых доноров, у которых большинство СБ83 клеток не несли молекулу СБ 1а (маркер незрелых миелоидных клеток), значительная часть ИФН-ДК больных экспрессировала одновременно СБ83 и СО 1а молекулы либо только С01а-молекулы. В результате у больных отмечалось увеличение общего количества незрелых С083"СШа+ ДК (13,5 ± 3,2 то 5,4 ± 1,9; р<0,05) и ДК промежуточной степени зрелости - С083+СБ1а+ (7,4 ± 2,6 4,7 ± 1,0; р<0,05). Популяция ДК у больных ЗОГМ отличалась также более высоким содержанием С011с+ и С0123+ клеток. Экспрессия СО 123 является одной из особенностей ИФН-ДК. Данный маркер высоко экспрессируется на плазмацитоидных ДК и практически отсутствует на ДК, генерируемых в присутствии вМ-СБР и 1Ь-4. Как следует из представленных выше данных, относительное содержание С0123+ клеток у больных было повышено. Причём одновременный анализ экспрессии С0123 и СЭ11с показал, что у доноров большая часть С0123+ клеток сосредоточена в С011с" популяции, тогда как у больных данный маркер распределялся равномерно в популяциях С011с+ и СО 11с" клеток. Соответственно, у больных относительное количество С011+С0123+ клеток было повышено более чем в 2 раза (17,4 ± 2,9 против 6,7 ± 1,1% у доноров, ри< 0,05).

Для оценки способности ДК презентировать антигены и активировать Т-клетки была исследована аллостимуляторная активность ДК здоровых доноров (п=34) и больных ЗОГМ (п=21). ДК доноров и больных обладали выраженной аллостимуляторной активностью и индуцировали эффективный пролиферативный ответ МНК в соотношении 1:100. При этом уровень пролиферации в СКЛ, индуцированный ДК доноров и больных (13278 ± 1130

и 11500 ± 1400 имп/мин, соответственно), и индексы стимуляции (19,6 ± 1,6 и 15,6 ± 4,4, соответственно) были сходными и статистически не различались. На следующем этапе была исследована способность ДК активировать ТЫ и ТЬ2 ответ (таблица 5). Анализ внутриклеточной продукции Т-клетками 1Ж-у и 1Ь-4 в СКЛ показал, что ИФН-ДК стимулируют в первичной СКЛ продукцию 1Ш-у и практически не усиливают продукции 1Ь-4, т.е. активируют ТЫ ответ. При этом ДК больных, судя по стимуляции внутриклеточной экспрессии ИЧЧ-у, обладали несколько меньшей ТЬ1-стимулирующей активностью.

Таблица 5

Влияние ДК здоровых доноров и больных ЗОГМ на внутриклеточную _продукцию Т-клетками №N-7 и 1Ь-4_

Источник ДК 1Ш-у 11-4

МНК (0) МНК (+ДК) ИВ МНК (0) МНК (+ДК) ИВ

Доноры 1,34 ±0,2 5,0 ± 0,4 4,9 ± 1,0 1,3 ± 0,2 1,6 ±0,3 1,8 ±0,6

Больные ЗОГМ 0,94 ± 0,24 2,7 ± 0,5 * 3,5 ± 0,6* 1,7 ±0,1 2,3 ± 0,36 1,3 ±0,24

Примечание: представлено относительное содержание СРЗ Т-клеток здоровых доноров с внутриклеточной экспрессией №N-7 и 1Ь-4, в культурах МНК, лишенных моноцитов [МНК(О)] и активированных ДК [МНК(+ДК)] здоровых доноров или больных ЗОГМ в течение 48 ч. * - Ри <0,05 - достоверность различий при стимуляции ДК доноров и больных; Рц- критерий Вилкоксона-Манна-Уигни.

При анализе продукции ТЫ/ТЬ2 цитокинов во вторичной СКЛ (таблица 6) было выявлено, что ДК больных обладали сходной с донорами 1РКу-стимулирующей активностью.

Таблица 6

Влияние ДК доноров и больных ЗОГМ на продукцию ТЫ/ТЬ2 цитокинов во ___вторичной СКЛ_

Цитокины 0 + ДК доноров (п=10) ИВ + ДК больных (п=10) ИВ

46±17 1500±356* 430±78 1116±311* 558±155

1Ь-13 78±22 314±43* 6±1,3 744±158*# 15±4,8#

1Ь- 5 92±21 206±33* 4,6±1,2 911±190*# 13±5,9#

1Ы0 6±0,2 19±3* 3,4±0,5 15,6±5 8±2,4

Примечание: представлены средние значения концентрации цитокинов (пг/мл) и индексы влияния ДК (ИВ) на продукцию цитокинов в 48-часовых супернатантах вторичной СКЛ. * - Ри <0,05 - достоверность различий по сравнению с уровнем спонтанной продукции; # Ри <0,05 - достоверность различий в присутствие ДК доноров и больных ЗОГМ, Ри- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Так, индексы стимуляции продукции IFNy ДК больных и доноров достоверно не различались. При этом у больных выявлялась более высокая ТЬ2-стимулирующая активность ДК. Например, уровень продукции и индекс стимуляции IL-5 и IL-13 во вторичной СКЛ, стимулированной ДК, больных был выше, чем при стимуляции ДК доноров. Тем не менее, важно отметить, что и в этом случае IFNy-стимулирующая активность ДК была существенно выше, чем их способность индуцировать продукцию IL-5 или IL-13.

Для оценки эффективности иммунного ответа в процессе проведения иммунотерапии исследовалась динамика антигенспецифического ответа, который оценивали по сенсибилизации МНК больных к антигенам, содержащимся в лизате опухолевых клеток. Анализ сенсибилизации к лизату опухолевых клеток проводили до начала курса вакцинаций, а также через 3 и 6 вакцинаций. Сенсибилизация к антигенам опухолевого лизата (АОЛ) in vitro проявлялась усилением пролиферативного ответа МНК и индекса миграции лейкоцитов больных в присутствии АОЛ. Так, если исходно антигены опухолевого лизата не стимулировали пролиферации МНК, то после 6-и процедур вакцинаций отмечалось достоверное 10-кратное усиление ответа в присутствии АОЛ в дозе 0,01 мг/мл и 7-кратное - при концентрации АОЛ 0,1 мг/мл. При этом достоверного усиления пролиферативного ответа МНК больных на контрольный антиген (экстракт мозговых тканей человека) не наблюдалось. Аналогичным образом, в процессе вакцинаций наблюдалось достоверное увеличение индекса миграции лейкоцитов. Так, индекс миграции после 6 вакцинаций возрастал с 1,02±0,05 до 1,48±0,26 (Ри<0,05). Причём, как и при анализе пролиферативного ответа, усиления индекса миграции на контрольный антиген не наблюдалось, что свидетельствует о генерации иммунного ответа, направленного преимущественно к опухольассоциированным антигенам.

Для оценки генерации иммунного ответа на антигены опухолевого лизата была также исследована реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в кожном тесте in vivo. Кожная проба на АОЛ исходно была отрицательной у всех пациентов. В то же время после 3 и 6 иммунизаций положительная реакция ГЗТ выявлялась, соответственно, у 7 из 25 и 16 из 25 больных.

Для исследования взаимосвязи между развитием противоопухолевого ответа и эффективностью терапии в отдельной группе пациентов был проведен анализ выживаемости у больных с наличием и отсутствием сенсибилизации к антигенам лизата опухолевых клеток после проведения КИТ. Поскольку показатели выживаемости у больных с АА и ГБ существенно различаются, исследования 2-летней выживаемости проводились отдельно в этих группах пациентов.

Было показано, что в группе больных с А А из 19 пациентов, которым проводился анализ сенсибилизации к АОЛ в реакции ГЗТ, количество выживших пациентов составило 15 человек (79%), умерших - 4 (21%) человека. Причем в группе выживших пациентов наличие сенсибилизации к

АОЛ регистрировалось у 8 (53%) больных, а отсутствие - у 7 (47%) пациентов. В группе умерших больных у всех 4 пациентов отмечалось наличие сенсибилизации к АОЛ Что касается пациентов с глиобластомой, то из 10 человек, у которых исследовалась реакция ГЗТ, 4 (40%) пациента на момент 24 месяцев оставались живы, а 6 (60%) умерли. При этом появление сенсибилизации к опухолевым антигенам наблюдалась у 3 из 4 выживших (75%) пациентов и 2 из 6 (33%) умерших. Таким образом, у больных глиобластомами наличие сенсибилизации к антигенам лизата опухолевых клеток ассоциировалось с более высоким уровнем выживаемости, хотя различия в силу небольшой выборки проявлялись только в виде тенденции. Пациенты с АА не различались по уровню 24 месячной выживаемости в зависимости от наличия или отсутствия сенсибилизации к опухолевым антигенам, что, по-видимому, связано с более высокой продолжительностью жизни при АА.

Результаты изучения клинической эффективности использования КИТ в комплексном лечении ЗОГМ

Данные клинических наблюдений за больными при проведении комбинированной иммунотерапии продемонстрировали её хорошую переносимость пациентами. Ни у одного больного не возникли выраженные цитокиновые или токсические реакции.

Оценку морфологического состояния головного мозга во время КИТ проводили с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга.

Всем пациентам проводилась МРТ головного мозга в динамике; количество MP-исследований на одного больного составило от 4 до 8. Продемонстрировано, что проведение КИТ с локорегиональным введением МНК и последующая вакцинация дендритными клетками не приводят к нарастанию отёка мозга. Более того, к моменту выписки у всех больных степень отёка мозговой ткани значительно уменьшается.

Таким образом, можно заключить, что комбинированная иммунотерапия по предложенной методике является безопасным для пациента методом, так как не ведёт к нежелательным морфологическим изменениям в мозге и усилению его послеоперационного отёка.

Общее состояние больных ЗОГМ на фоне комплексного лечения с применением КИТ. Изучение общего состояния включало исследование общемозговой симптоматики, которая оценивалась по пятистепенной «шкале оценки тяжести состояния нейроонкологичесого больного», разработанной в нейроонкологическом отделении РНХИ им. А.Л.Поленова (С.В.Марченко, 1997), исходно, на 7-9 сутки после операции и перед выпиской из стационара.

Согласно степени выраженности гипертензионного синдрома, степени нарушения сознания, а также наличия у больных «застойных» дисков зрительных нервов на глазном дне, дислокационного синдрома, очаговых симптомов и витальных нарушений, состояние пациентов расценивали как терминальное, крайне тяжелое, декомпенсированное, субкомпенсированное и

компенсированное (см. табл.7). До операции у большинства пациентов, как в исследуемой, так и в группе сравнения, выявлена общемозговая симптоматика различной степени выраженности.

Таблица 7

Динамика общемозговой симптоматики

Сравниваемые группы Число больных с общемозговой симптоматикой / Число больных без общемозговой симптоматики (до лечения) Число больных с общемозговой симптоматикой / Число больных без общемозговой симптоматики (при выписке)

n/N % n/N %

Исследуемая группа 29/39 74,4% 2/39 5,1%

Группа сравнения 58/80 72,5% 16/80 20,0%

Уровень различий до и после лечения (х2)* рх2 = 0,82 pz2 = 0,0001**

Примечание: * различия достоверны при рх2<0,05; ** - различия достоверны.

Как видно из таблицы 7, в исследуемой группе общемозговая симптоматика отмечалась у 29 из 39 пациентов (74,4% случаев), в грУппе сравнения - у 58 из 80 пациентов, что составило 72,5%. Таким образом, доля пациентов, имеющих общемозговую симптоматику, до операции в сравниваемых подгруппах статистически не различается (рх2=0,82 и ри=0,22). После проведенного лечения к моменту выписки в исследуемой группе общемозговая симптоматика регрессировала почти у всех больных (у 37 из 39 пациентов), и сохранялась только у 2 пациентов, что составило 5,1%. В группе сравнения также происходило уменьшение количества этих больных, но общемозговая симптоматика сохранялась на момент выписки у 16 из 80 пациентов (20,0%), что достоверно превышало аналогичный показатель в основной группе, рх2<0,00001.

При проведении статистического анализа (см. табл. 8) также установлено, что, у больных, получивших курс КИТ, к моменту выписки зарегистрировано убедительное, статистически значимое увеличение показателей общего состояния больных. К моменту выписки из нейрохирургической клиники оно было значительно более компенсировано по сравнению с пациентами, не получившими иммунотерапию (р<0,0001). Полученные данные можно объяснить, как нам представляется, положительным влиянием, проведенной по оригинальному протоколу иммунотерапии.

Таблица 8

Сравнительный анализ общего состояния больных

СОСТОЯНИЕ ДО ЛЕЧЕНИЯ ПОСЛЕ ОПЕРАЦИИ ПРИ ВЫПИСКЕ

исследуемая сравнения исследуемая сравнения исследуемая сравнения

Компенсированное 4 (10,26%) 8 (10,0%) 12 (30,8%) 10(12,5%) 23 (58,5%) 14(17,5%)

Субкомпен-сированное 18 (46,15%) 46 (51,1%) 25 (64,1%) 63 (78,8%) 15 (38,46%) 63 (78,8%)

Декомпен-сированное 15 (38,46%) 33 (36,7%) 2 (5,1%) 6 (7,5%) 1 (2,56%) 2 (2,5%)

Крайне тяжелое 2 (5,1%) 3 (3,75%) 0 1 (1,25%) 0 1 (1,25%)

ВСЕГО 39(100%) 80(100%) 39(100%) 80(100%) 39(100%) 80 (100%)

Рт 0,62119 0,04115* <0,00001*

Примечание: *Рт - достоверность различий

Оценка динамики качества жизни на фоне комплексного лечения с применением КИТ. В дооперационном периоде пациенты в обеих группах имели близкий индекс качества жизни по Карновскому и статистически не различались друг от друга. В исследуемой группе данный показатель был равен 56,2, в группе сравнения - 55,8 баллов. В послеоперационном периоде нами отмечено статистически достоверное увеличение индекса качества жизни больных. При этом в исследуемой группе, где также проводился начальный этап иммунотерапии, увеличение ИКЖ более выражено и статистически достоверно различимо с группой сравнения - 66,7 и 56,1 балла, соответственно; р<0,01.

В последующем, после проведения второго этапа иммунотерапии по предложенному способу, средний показатель ИКЖ продолжал расти, при этом его рост в исследуемой группе статистически достоверно был выше, чем в группе сравнения и составил 77,1 го 63,3 балла соответственно (р<0,001).

Изучение уровня качества жизни через 6, 12 и 24 месяца с момента окончания комплексного лечения и проведения лучевой терапии продемонстрировало дальнейшее увеличение показателей ИКЖ в обеих группах, сильнее проявляющееся в исследуемой группе; показатели ИКЖ в ней достоверно отличаются от таковых в группе сравнения. Через 6 месяцев с момента лечения он составил 83,9 65,7 баллов, через 12 месяцев - 86,1 га 66,0 баллов, через 24 месяца - 90,7 га 60,7 баллов. На срок наблюдения 36 месяцев качество жизни пациентов группы исследования было выше по сравнению с группой сравнения - ИКЖ равнялся 95,2 и 80 баллам, соответственно, но статистически эти данные из-за малого количества больных на этот период исследования подтвердить невозможно.

Аналогичная тенденция динамики качества жизни была отмечена не только у больных сравниваемых групп, но и между пациентами с разной гистологической структурой опухоли. Так, при отдельном сопоставлении исходных показателей ИКЖ у больных с глиобластомами и с анапластическими астроцитомами выявлена сходная картина. Исходные

показатели ИКЖ статистически не различались, хотя в обеих сравниваемых группах больные с глиобластомами имели ИКЖ ниже, чем больные с анапластическими астроцитомами - 53,8 уя 52,8 баллов и 62,5 га 57,3 балла. Далее, перед выпиской из клиники, у всех больных происходит увеличение показателей ИКЖ (достоверно значимое в группе исследования), но у пациентов с глиобластомами ИКЖ увеличивается медленнее, чем у больных с анапластическими астроцитомами. В поздние сроки наблюдения - до двух лет с момента проведения комплексного лечения выявлены аналогичные закономерности. На данном этапе повышение уровня качества жизни у выживших больных в обеих группах уже не зависело от гистологической структуры опухоли. Полученные нами достоверные различия показателей ИКЖ в исследуемых группах в динамике терапии однозначно свидетельствует о положительном влиянии комбинированной иммунотерапии с дендритными клетками на качество жизни больных ЗОГМ. Качество жизни у пациентов, получивших дополнительно курс иммунотерапии с дендритными клетками, на всех этапах наблюдения за ними было значительно выше, чем у больных группы сравнения.

Изучение показателей выживаемости у больных с ЗОГМ.

При анализе кривых выживаемости больных обнаружено, что выживаемость в исследуемой группе была статистически достоверно выше, чем в группе сравнения, что продемонстрировано на рис. 1.

Время Группа 1 Группа 2

Сплошная линия - группа сравнения; Пунктирная линия - исследуемая группа

Рис.1. Сравнение кривых выживаемости (Р = 0,0001)

Медиана выживаемости в группе сравнения составила 11 месяцев (к этому сроку умерло 50% больных). В исследуемой же группе к этому сроку процент умерших пациентов составил 23.

У больных с глиобластомой медиана выживаемости в группе сравнения составила 8 месяцев, в то время как в исследуемой группе на этот срок

погибло всего 26,7%, Медиана выживаемости у больных с АА в группе сравнения составила 18 месяцев. К этому сроку число умерших больных в исследуемой группе составило 20,8%. Так как за весь срок наблюдения в исследуемой группе погибло 35,9% больных, определить медиану выживаемости не представлялось возможным. Поэтому мы сочли необходимым исследовать показатели 1-, 2-, и 3-летней выживаемости. Количество выживших больных в исследуемой группе к исходу 1 года было статистически достоверно выше, чем в группе сравнения, и составило 74,4% и 52,5% больных, соответственно (рх2<0,05). Двухлетняя выживаемость пациентов в исследуемой группе оказалась также выше и составила 56,5%. В группе сравнения эти показатели были в два раза ниже и равнялись 27,5%. На срок 3 года показатели выживаемости у больных, прошедших курс комбинированной иммунотерапии с дендритными клетками по оригинальному протоколу, были также гораздо выше, чем в группе сравнения- 50,0 и 18,8%, соответственно.

80 70 J 60 501 40 30 20 10

52,5%

□ Исследуемая подгруппа

□ Подгруппа сравнения

56.5%

27,5% I;

1 ГОД

2 года

3 года

Примечание: * достоверность различий методом х Рис.2. Выживаемость пациентов с злокачественными опухолями головного мозга

Анализ 1-, 2-, 3-летней выживаемости в зависимости от гистологического варианта опухоли продемонстрировал, что уровень выживаемости у больных ГБ был существенно ниже, чем у пациентов с АА. Установлено, что в исследуемой группе однолетняя выживаемость пациентов с глиобластомами в два с половиной раза выше, чем у больных в группе сравнения и составляет 66,7% и 27,3%, соответственно. При анализе показателей двухлетней выживаемости пациентов с глиобластомами выявлено также статистически достоверное их превышение в исследуемой группе на 25% по сравнению с группой сравнения. Выживаемость составила соответственно 25% и 0% .

В общей массе больных с АА, получивших комплексное лечение, включающее иммунотерапию по оригинальному протоколу, однолетняя выживаемость оказалась также статистически достоверно выше, чем у

больных без иммунотерапии - 79,2% и 70,2%, соответственно. Показатели 2-летней выживаемости больных в этой же группе с АА в целом оказались также значительно лучше группы сравнения - соответственно, 73,3% и 46,8%. Процент выживаемости больных в группе исследования с АА и на 3-летний срок наблюдения оказался также достоверно и значительно выше, чем в группе сравнения - 57,1% и 27,6%.

Выводы:

1. Комбинированная иммунотерапия, включающая системное введение цитокинов, локорегиональное введение естественных и антигенспецифических цитотоксических лимфоцитов в комбинации с ронколейкином с последующим курсом вакцинаций дендритными клетками, является новым дополнительным методом комплексного лечения больных ЗОГМ

2. Генерируемые в присутствии вМ-СБР и ЮТ-а «интерфероновые» ДК больных ЗОГМ фенотипически характеризуются умеренно выраженными признаками задержки созревания, однако обладают сохранной антигенпрезентирующей функцией и способностью к активации ТЫ ответа.

3. Комбинированная иммунотерапия с использованием дендритных клеток сопровождается появлением сенсибилизации к антигенам лизата опухолевых клеток, что свидетельствует о развитии противоопухолевого иммунного ответа.

4. Проведение комбинированной иммунотерапии с использование ДК не сопровождается развитием выраженных побочных реакций и характеризуется хорошей переносимостью, о чём свидетельствует отсутствие признаков ухудшения морфологического состояния головного мозга и значимое улучшение общего состояния пациентов.

5. Комбинированная иммунотерапия с использование ДК позволяет повысить эффективность лечения больных ЗОГМ, что подтверждается улучшением качества их жизни и значимым увеличением показателей 1-, 2-х и 3-летней выживаемости.

Практические рекомендации

Комбинированная иммунотерапия с применением дендритных клеток должна быть включена в комплексное лечение злокачественных глиом головного мозга в качестве адъювантного метода в дополнение к оперативному лечению, радио- и химиотерапии.

Первый этап КИТ (иммуномодуляция) необходимо начинать уже в раннем послеоперационном периоде, с 3-7 суток после операции. Второй этап состоит из четырех сеансов локорегионального введения цитотоксических лимфоцитов с ронколейкином. После окончания второго этапа удаляют катетер из мозга и через 1-3 суток больного выписывают из стационара. Третий этап КИТ в виде курса вакцинаций ДК следует проводить в амбулаторных условиях после проведения лучевой терапии.

Противопоказанием для проведение КИТ с дендритными клетками является биопсия или парциальная резекция опухоли, выраженный послеоперационный отёк головного мозга и тяжелая декомпенсированная анемия.

Относительными противопоказаниями являются: детский и старческий возраст (до 12 и после 70 лет), миелодепрессия различного происхождения, низкий (менее 50 баллов) исходный и послеоперационный индекс качества жизни (ИКЖ) по шкале Карновского, инфицирование кожных покровов в области операции. При сообщении туморозной полости с желудочковой системой мозга использование метода необходимо проводить на фоне антигистаминных препаратов в стандартной дозировке с целью предотвращения выраженных цитокиновых реакций.

Публикации по теме диссертации:

1. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сычёва Н.В., Останин A.A., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Ступак В.В. Новые клеточные технологии иммунотерапии в лечении злокачественных глиом головного мозга. Материалы Всероссийской научно - практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения». Ленинск - Кузнецкий, 2003. С. 306-307.

2. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин A.A., Черных Е.Р. Эффективность комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга. Нейроиммунология, №2, 2004. Стр. 110.

3. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И, Ю.П.Козлов, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Фенотипическая и функциональная характеристика антигенпрезентирующих клеток при злокачественных глиомах. Нейроиммунология, № 2, 2004. С. 60.

4. Ступак В.В., О.Ю.Леплина, М.А.Тихонова, А.А.Останин, С.Д.Никонов, Е.Р.Черных, Ю.П.Козлов. Опыт использования частично -зрелых дендритных клеток в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга. Вопросы хирургии, 2004, №3-4. С. 107-109.

5. Ступак В.В., О.Ю.Леплина, М.А.Тихонова, A.A. Останин, Ю.П.Козлов, С.Д.Никонов, Е.Р.Черных. Возможность генерации частично -зрелых дендритных клеток и опыт их использования в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга. Материалы Всероссийской конференции «Комбинированное лечение опухолей головного мозга». Екатеринбург, 2004. С. 101-102.

6. Леплина О.Ю., В.В.Ступак, Н.А.Хонина, М.И.Центнер, Ю.П.Козлов, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Ретроспективный анализ эффективности комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга. Материалы VII международного симпозиума «Новые технологии в нейрохирургии». Санкт-Петербург, 2004. С. 172.

7. Леплина О.Ю., В.В.Ступак, Е.Я Шевела, М.А.Тихонова, М.И.Центнер, Ю.П.Козлов, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Характеристика антигенпрезентирующих клеток у больных злокачественными глиомами.

Сборник материалов четырнадцатой научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2004. Глава IX С. 9-10.

8. Ступак В.В., М.И.Центнер, Е.Р.Черных, А.А.Останин, ЮЛ.Козлов. Результаты применения комбинированной иммунотерапии в лечении злокачественных глиом головного мозга. Нейрохирургия и неврология. Сборник научных трудов. Красноярск, 2005. С. 224-227.

9. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Никонов С.Д., Останин A.A., Черных Е.Р. Частично зрелые дендритные клетки как потенциальная основа для индукции противоопухолевого ответа у больных злокачественными глиомами // Мед. иммунология,- 2005,- Т. 7, № 4.- С. 365374.

10. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Генерация частично зрелых дендритных клеток и их использование в лечении злокачественных глиом головного мозга Материалы конференции «клинические и фундаментальные проблемы клеточной биотехнологии» 1-2 декабря 2005 г. Новосибирск С.38.

11. Леплина О.Ю., В.В.Ступак, М.А.Тихонова, С.Д.Никонов, Ю.П.Козлов, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Опыт использования частично -зрелых дендритных клеток в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга. Сборник материалов пятнадцатой научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006. С. 349-351.

12. Ступак В.В., И.В.Пендюрин, В.В.Фонин, Ю.П.Козлов, Ж.М.Мурадов, В.В.Шапоренко, С.А.Ким, С.В.Шабанов. Комбинированная терапия супратенториальных злокачественных глиом головного мозга. Материалы всероссийской научно - практической конференции «Поленовские чтения». Санкт — Петербург, 2006. С. 226-227.

13. Козлов Ю.П., Черных Е.Р., Останин A.A., Ступак В.В. Комбинированная иммунотерапия с использованием дендритных клеток в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга. Материалы всероссийской научно - практической конференции «Поленовские чтения». Санкт - Петербург, 2006. С. 196.

14. Ступак В.В., Козлов Ю.П., Черных Е.Р., Останин А.А Комбинированная иммунотерапия с использованием дендритных клеток в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга. 4 съезд нейрохирургов России. Материалы съезда, Москва 18-22 июня 2006 г., М., 2006.-С. 180.

15. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток у больных злокачественными глиомами головного мозга. Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» 20-21 сентября, Красноярск, 2006.-С. 97-98.

16. Stupak V.V., Pendurin I., Kozlov Y., Muradov J. Combined therapy of supratentorial malignant brain glioms. Joint Meeting of the French and Russian Societies of Neurosurgery. March 29 - April 1,2006. Caen, France. - P.49.

Изобретения

1. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Останин A.A., Никонов С.Д., Ступак В.В., Козлов Ю.П. Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга. Патент на изобретение № 2262941 по заявке № 2004100550 с приоритетом от 05.01.04, зарегистрирован 27.10.05).

Используемые термины и сокрощения

NK - Нормальные киллеры

VJ - Versus (перевод с английского = против)

АА - Анапластическая астроцитома

АПК - Антиген-презентирующие клетки

ГБ - Глиобластома

ГМ-КСФ 1 - Гранулоцитарно-моноцитарный колиний-стимулирующий фактор

ГЭБ - Гемато-энцефалический барьер

ЗВП - Зрительные вызванные потенциалы

ЗОГМ - Злокачественные опухоли головного мозга

ИКЖ - Индекс качества жизни

ИЛ-2 - Интерлейкин-2

ИОЛТ - Интраоперационная лучевая терапия

ИРИ - Иммунорегуляторный индекс

ИТ - Иммунотерапия

ИФН-у - Интерферон-у

КИТ - Комбинированная иммунотерапия

ЛАК - Лимфокин-активированные киллеры

МНК - Мононуклеарные клетки

МРТ - Магнитно-резонансная томография

пхт - Полихимиотерапия

рИЛ-2 - Рекомбинантный интерлейкин-2

СН - Супернатант

сод - Суммарная очаговая доза

тгт - Телегамматерапия

ТГФ-р - Трансформирующий гранулоциты фактор -р

ТРФ-Р - Трансформирующий рост фактор-р

ТЭБ - Туморо-энцефалический барьер

ФНО-а - Фактор некроза опухоли -а

ЦНС - Центральная нервная система

ЦТЛ - Цитотоксические лимфоциты

Отпечатано в типографии ФГУ Новосибирский НИИТО Росздрава, ул. Фрунзе 17 Заказ № 883; формат 60x90/16; печ. л. 1,50; тираж 100 Гарнитура Times New Roman

Среди первичных опухолей головного мозга глиомы у взрослого населения составляют около 50%. Из них 55-57% являются злокачественными (Качков И.А., 1984, В.В.Ярцев с соавт., 1997; Ю.А.Зозуля с соавт., 1998; Олюшин В.Е., Улитин А.Ю., 1997; Савченко А.Ю. с соавт., 1997; Олюшин В.Е., 1994, 2004, ll.Ahsan et al., 1995; Yasargil M.G., 1996; F.G.Devis et al., 1996; Wrensch M.R. et al., 2000). В настоящее время выработан единый комплексный подход к лечению низкодифференцированных внутримозговых опухолей головного мозга, который включает оперативное вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию с использованием современных химиопрепаратов (Ромоданов А.П., 1983; Качков И.А., 1984; Mahaley Y.L. et al., 1989; Марченко С.В., 1997; Олюшин В.Е. и соавт., 1998, 2004, 2006; Желудкова О.Г. и соавт., 2004; Коновалов А.Н. и соавт., 2006; Кобяков Г. и соавт., 2006; Yasargil M.G;, 1996; Bernstein М., Berger M.S. 2000; Stupp R., et.all., 2005).

Тем не менее, средняя продолжительность жизни больных при низкодифференцированных глиомах остается даже с использованием новейшей химиотерапии темодалом низкой и варьирует, по данным разных авторов, в диапазоне от 9-12 до 25 месяцев (Г.А.Круминя, 1981; М.Янева, 1993; С.В.Марченко, 1997; Савченко А.Ю., 1997; А.Н.Коновалов, 1988; А.В.Голанов, А.Г.Коршунов, 1998; В.А.Лошаков, 1998; Олюшин В.Е. с соавт., 2000; Желудкова O.F. и соавт., 2004, Холодов Б. и соавт., 2006, Yen S.A. et al., 1999; Tjoa В.А., Salgaller M.L, 2000; Wrensch M.R. et al., 2000, Stupp R., et.all., 2005 ).

Согласно данным литературы, перспективы улучшения результатов лечения злокачественных опухолей в общей хирургии связывают с сочетанием хирургических подходов с методами иммунотерапии. При этом предполагается, что комбинация различных иммунотерапевтических подходов может существенно повысить эффективность иммунотерапии. Так, например, включение в комплекс лечения метода комбинированной иммунотерапии, основанного на сочетании адоптивной иммунотерапии с курсом цитокинотерапии, позволяет 2-кратно увеличить показатели 2-летней выживаемости у больных злокачественными опухолями головного мозга (Никонов С.Д. и соавт., 2000, Центнер М.И. и соавт., 2002). Однако в более поздние сроки: у больных отмечается возникновение рецидивов, что свидетельствует о целесообразности поддержания противоопухолевого иммунитета по завершении курса комбинированной иммунотерапии и диктует необходимость разработки более эффективных методов генерации цитотоксических лимфоцитов для элиминации опухолевых клеток.

В связи с этим значительный интерес представляет включение в программу иммунотерапии дендритных клеток (ДК). ДК являются* наиболее профессиональными антигенпрезентирующими клетками, способны преодолевать толерантность к опухолевым антигенам и ' запускать эффективный- иммунный ответ, приводящий к регрессии опухоли у экспериментальных животных (Wallenfriedman и соавт., 1999; Ashley, Faiola, 1997); Исходя-из этого можно полагать, что использование ДК, нагруженных опухолевыми антигенами, для генерации цитотоксических лимфоцитов и вакцинации после удаления опухоли позволит значительно повысить эффективность апробированного ранее протокола комбинированной иммунотерапии.

Традиционно ДК генерируют путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-—4. Однако в последнее время было показано, что ДК могут быстро генерироваться при культивировании с ГМ-КСФ и ИФН-а. Полученные в этом случае ДК, названные «интерфероновыми» ДК (ИФН-ДК), имеют ряд преимуществ (быстрее генерируются, характеризуются высокой способностью к захвату антигена, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов, имеют более высокую миграционную активность и эффективно стимулируют клеточный иммунный ответ) (Santini: S., 2004, Parlato S., 2001). Несмотря на эти достоинства, ИФН-ДК в клинической практике до сих пор не апробировались. Таким образом, исследование возможности применения этих клеток представляется, несомненно, актуальным. Учитывая данные об изменении количества и функций ДК и их предшественников при опухолевом росте, одним из принципиальных вопросов при этом является выяснение возможности генерации ИФН-ДК у больных ЗОГМ и оценка их полноценности.

Исходя из вышеизложенного, была сформулирована цель настоящей работы: на основании изучения возможности генерации дендритных клеток и их характеристики у больных злокачественными глиомами головного мозга разработать метод комбинированной иммунотерапии с применением дендритных клеток и оценить его клиническую эффективность в комплексном лечении больных с данной патологией. Задачи исследования:

1. Исследовать возможность генерации интерферон а - индуцированных ДК (ИФН-ДК) у больных ЗОГМ и оценить их фенотипические и функциональные свойства.

2. Изучить возможность развития противоопухолевого иммунного ответа у больных ЗОГМ на фоне комбинированной иммунотерапии с использованием ИФН-ДК.

3. На основании, магнитно-резонансной томографии (МРТ) изучить морфологическое состояние головного мозга до, во время и после проведения комбинированной иммунотерапии (КИТ) с использованием дендритных клеток.

4. По данным изучения общего состояния больных, индекса качества жизни по шкале Карновского, показателей выживаемости провести сравнительное исследование результатов комплексного лечения в группах больных, получавших и не получавших КИТ.

Научная новизна исследования

Впервые проведено детальное исследование ДК, генерируемых в присутствии ГМ-КСФ и ИФН-а у больных ЗОГМ, и показана, принципиальная возможность генерации ИФН-ДК у пациентов с глиальными внутримозговыми опухолями. Популяция генерируемых ИФН-ДК больных имеет ряд фенотипических особенностей, в частности, характеризуются умеренным повышением содержанием ДК с маркерами моноцитов (CD 14+) и незрелых ДК (CDla+) и снижением зрелых ДК (CD83+) , что отражает некоторую задержку дифференцировки и созревания: Тем не менее, ИФН-ДК обладают сохранной антигенпрезентирующей функцией, в частности, схожей с таковош у доноров, аллостимуляторной активностью ДК и способностью презентировать антигены очищенного туберкулина и белки опухолевого лизата. Кроме того, ИФЩДК больных обладают выраженной индуцирующей активностью в отношении; продукции интерферона у,, т.е. эффективно стимулируют Thl, особенно в культурах примированных Т-клеток. При этом проведение комбинированной иммунотерапии с использованием ИФН-ДК сопровождается развитием сенсибилизации к лизату ауто логичных опухолевых клеток как in vitro; так и in vivo.

Разработан новый «Способ иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 по заявке № 2004100550 с приоритетом от 05.01.04).

Впервые проведена клиническая: апробация ИНФ-индуцированных ДК и изучены результаты комплексного лечения- больных с внутримозговыми злокачественными опухолями головного мозга (глиобластомами и астроцитомами III степени анаплазии) с использованием комбинированной иммунотерапии с применением дендритных клеток.

Практическая значимость работы

Разработанный новый метод иммунотерапии с ДК, наряду с хорошей переносимостью, в комплексе с хирургическим лечением и лучевой терапией позволяет улучшить клинические результаты, лечения больных со злокачественными глиомами.

Внедрение в практику

Для практического здравоохранения по теме диссертации издано пособие для врачей «Комбинированная иммунотерапия с использованием дендритных клеток в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга».

Полученные в результате выполнения настоящей работы оригинальные разработки внедрены в практику нейрохирургических отделений Новосибирского НИИТО.

Основные положения; выносимые на защиту:

1. Из периферической крови пациентов со злокачественными глиомами головного мозга возможна генерация ИФНа-индуцированных дендритных клеток, которые, несмотря на некоторые фенотипические особенности, характеризуются функциональной полноценностью и индуцируют у больных сенсибилизацию к белкам, содержащимся в лизате опухолевых клеток.

2. Метод комбинированной иммунотерапии с использованием ИФНа-индуцированных дендритных клеток хорошо переносится больными и не ведет к ухудшению морфологического состояния головного мозга.

3. Разработанный способ комбинированной иммунотерапии с использованием дендритных клеток улучшает общее состояние больных, качество жизни и увеличивает показатели выживаемости.

Апробация работы состоялась 30.10.2006 г. на расширенном заседании Ученого совета Новосибирского НИИТО.

Основные положения работы доложены:

1. На всероссийской научно - практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения». Ленинск - Кузнецкий, 2003 г. 2. На Всероссийской конференции «Комбинированное лечение опухолей головного мозга». Екатеринбург, 2004 г. З.На международной конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты). Томск, 2004 г. 4. XII

Симпозиуме японо — российского обмена. Красноярск, 2005 г. 5; На всероссийской научно — практической конференции «Поленовские чтения». Санкт — Петербург, 2006 г. 6. На пятнадцатой научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г. 7. Joint meeting of the French and Russian Societies of Neurosurgery (Caen, France, 2006 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ. Из них 1 - за рубежом, 2 -в центральном издании.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле, состоит из введения, 4 глав,-заключения, библиографического указателя и приложения, изложена на 185 страницах машинописи, иллюстрирована 27 рисунками и 36 таблицами. В указателе литературы приводится 112 отечественных и; 182 зарубежных источника.

ВЫВОДЫ

1. Комбинированная иммунотерапия, включающая системное введение цитокинов, локорегиональное введениее естественных и антигенспецифических цитотоксических лимфоцитов в комбинации с ронколейкином с последующим курсом вакцинаций дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами, является новым дополнительным методом комплексного лечения больных ЗОГМ

2. Генерируемые в присутствие GM-CSF и INF-a «интерфероновые» ДК (IFN-ДК) больных ЗОГМ фенотипически характеризуются умеренно выраженными признаками задержки созревания, однако обладают сохранной антигенпрезентирующей функцией и способностью к активации Thl ответа.

3. Проведение комбинированной иммунотерапии с использованием дендритных клеток сопровождается появлением сенсибилизации к опухолевым антигенам, что свидетельствует о развитии противоопухолевого иммунного ответа.

4. Проведение комбинированной иммунотерапии с использование ДК не сопровождается развитие выраженных побочных реакций и характеризуется хорошей переносимостью, о чем свидетельствует отсутствие признаков ухудшения морфо-функционального состояния головного мозга и значимое улучшение общего состояния пациентов.

5. Комбинированная иммунотерапия с использование ДК позволяет повысить эффективность лечения больных ЗОГМ, что подтверждается улучшением качества их жизни и значимым увеличением показателей 1-, 2-х и 3-летней выживаемости.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Лечение глиобластом и астроцитом III степени анаплазии должно быть комплексным и включать в себя оперативное вмешательство, направленное на максимально «радикальное» удаление опухоли, комбинированную иммунотерапию и курс лучевой терапии с СОД 45-60 Гр.

Первый этап КИТ (иммуномодуляция) необходимо начинать уже в раннем послеоперационном периоде, с 3-7 суток после операции. Второй этап состоит из четырех сеансов локорегионального введения активированных МНК с ронколейкином. После окончания второго этапа удаляют катетер из мозга и через 1-3 суток больного выписывают из стационара. Третий этап КИТ - вакцинацию дендритными клетками-целесообразно проводить в амбулаторных условиях, не совмещая с проведением лучевой или химиотерапии.

Потивопоказано проведение КИТ при выраженном послеоперационном отёке головного мозга и тяжелой декомпенсированной анемии. Относительными противопоказаниями являются: детский и старческий возраст (до 12 и после 70 лет), миелодепрессия различного происхождения, низкий (менее 50 баллов) исходный и послеоперационный индекс качества жизни (ИКЖ) по шкале Карновского, инфицирование кожных покровов в области операции. Использовать метод с осторожностью необходимо при сообщении туморозной полости с желудочковой системой мозга. Следует дополнительно назначать антигистаминные препараты в обычной дозировке для предотвращения цитокиновых реакций вследствие всасывания введенных цитокинов хориоидальным сплетением.