Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Новые подходы к оценке взаимосвязи электронного строения и специфической активности лекарственных веществ на примере производных сульфонилбензойной кислоты

СМИРНОВ ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ЭЛЕКТРОННОГО СТРОЕНИЯ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРИМЕРЕ ПРОИЗВОДНЫХ СУЛЬФОНИЛБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 5 ДЕК 2011

Томск-2011

005006219

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, Брюханов

ПР°Фесс°Р Валерий Михайлович

доктор медицинских наук, У дут

профессор, Заслуженный деятель науки РФ Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО университет имени М.В. Ломоносова

Алиев

Олег Ибрагимович Маслов

Леонид Николаевич Ваизова

Ольга Евгеньевна

Московский государственный

Защита состоится «_

2012 г. в

- -------- " _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028 г Томск пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «_» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние годы достигнуты определенные успехи в области создания принципиально новых лекарственных веществ с новым механизмом действия, имеющих свою терапевтическую нишу и открывающих новые возможности в лечение тех или иных заболеваний. Однако поиск новых высоко активных и селективных лекарственных веществ и разработка принципов их проектирования по-прежнему остается одной из наиболее актуальных задач современной фармацевтической и фармакологической науки [Машковский М.Д., 1994; Харкевич Д.А., 2003]. А в последние годы сформулированы стратегические цели правительства РФ в области производства отечествешшх лекарств [Путин В.В., 2009].

В настоящее время в создании новых лекарственных средств основную роль играют фундаментальные исследования. Они касаются не только химических проблем (теоретической химии, физической химии, технологии органического синтеза и др.), но и сугубо биологических. Успехи молекулярной биологии, молекулярной фармакологии, генетики и других медико-биологических дисциплин стали существенным образом влиять на такой важный аспект фармакологии, как создание препаратов [Venter et al., 2003; Waterston et al., 2003; Levy et al., 2007].

Известно, что механизм действия, фармакологическая активность и селективность лекарственного вещества напрямую связаны с его химическим, т.е. электронным строением. Молекулярный механизм действия большинства лекарственных веществ заключается в физико-химическом взаимодействии их с биологическими мишенями [Цирельсон В.Г., 2000; Шкуматов В.М., 2003].

Ранее предпринималось большое число попыток объяснить роль той или иной функциональной группы молекулы действующего вещества в обеспечении его фармакологической активности. Для этого было организовано много проектов по предсказанию биологической активности основанные как на статистическом анализе частоты встречаемости функциональных групп (PASS) [Поройков В.В., 2004], так и на соответствии определенного набора физико-химических дескрипторов вещества наблюдаемым фармакологическим эффектам при его действии (MATRIX) [Погребняк A.B., 2004]. Помимо этого для объяснения активности широко использовалось трехмерное подобие пространственного строения мишени и лиганда, основанное на принципе «ключа и замка» [Rarey et al., 1996; Jones et al., 1997]. Однако, все же пока еще остаются непонятными глубинные механизмы биологической активности множества действующих веществ. В связи с этим, разработка новых методов и технологий проектирования и оценки биологической активности высокоактивных и высокоселективных лекарственных веществ, а так же поиск закономерностей взаимосвязи «структура-активность», основанных на данных электронного и пространственного строения молекулы лекарства являются актуальными и практически значимы.

Детальное изучение сложных механизмов действия диуретических средств позволило в короткие сроки создать и внедрить в клиническую практику большое число мочегонных препаратов с различными механизмами действия. Однако, современные диуретики пока не отвечают всем требованиям врачей-клиницистов к этой группе лекарственных средств. До сих пор частыми осложнениями диуретической терапии остаются гипокалиемия, гиперурикемия, обратимое ухудшение слуха и другие [Глезер Г.А., 1993; Брюханов В.М., 2003].

Учитывая широкое применение мочегонных средств в клинической практике, представляется важным исследовать отдельные стороны механизма действия и некоторых закономерностей фармакологической активности диуретических средств, связанных с их электронным строением. Наиболее интересным объектом исследования представляется фуросемид. В группе петлевых диуретиков он по праву является «структурой-лидером» [Носков В.Б., 1999]. Этот препарат находит широкое применение в лечении гипертонической болезни, сердечной недостаточности, нефротического синдрома, цирроза печени и многих других заболеваний, являясь сегодня популярнейшим представителем группы мочегонных средств [Зверев Я.Ф., 2000].

Достижения последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии пролили свет на клеточные механизмы действия многих современных диуретиков. Стало известно, что многие из них прямо взаимодействуют с высокоспециализированными ионными каналами и котранспортерами, в изучении топологии и функциональной роли которых также сделан большой шаг вперед [ОегекаУсЪап й а1„ 2000; Шек е1 а!., 2002].

Учитывая то обстоятельство, что среди современных мочегонных средств нет оригинальных отечественных препаратов, работы по углубленному изучению закономерностей фармакологической активности этой группы лекарственных веществ с целью разработки новых, более отвечающих требованиям клиницистов являются весьма актуальными и практически важными. Данная работа посвящена разработке технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности и исследованию особенностей молекулярного механизма действия лекарственного вещества с помощью компьютерного моделирования, поиску взаимосвязи его электронного строения и фармакологической активности в эксперименте, а также созданию на основе полученных данных нового диуретика с заданной мочегонной активностью. В качестве соединения-лидера использован фуросемид, в структуре которого при модификации теоретически обоснованно усиливали или ослабляли целевые свойства.

Цель исследования:

Разработать и апробировать новую технологию проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности по результатам расчетов пространственного и электронного строения молекулы действующего вещества с оценкой роли основных функциональных групп и ключевых фрагментов. На примере производных сульфонилбензойной кислоты

в эксперименте изучить расчетные изменения фармакологической активности спроектированных молекул.

Осповные задачи исследования.

1. Разработать технологию определения величины специфической активности лекарственного вещества на основе модели «заместительного механизма» комплексообразования органических лигандов с белковыми мишенями в водной среде.

2. Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы фуросемида и оценить константы прочности связи с целевыми белками-мишенями, рассчитать термодинамический спектр его активности. Определить ключевые дозы, при которых происходит насыщение основной целевой мишени.

3. Провести структурный анализ катион-хлорных транспортеров, оценив первичные структуры этих белков с учетом влияния специфической сольватации на ключевые функциональные группы. Определить возможные точки взаимодействия фуросемида и ключевых фрагментов белков, рассчитать термодинамические параметры комплексообразования «лиганд-мишень».

4. Построить молекулярную модель комплесообразования диуретика с ЫКССг-траиспортером на основе полученных данных кваптово-химических расчетов фуросемида и структурного анализа первичной структуры катион-хлорного транспортера.

5. Изучить свойства молекулы фуросемида при различных значениях рН среды и в эксперименте оцепить его диуретическую и салуретическую активность на фоне различных значений кислотности мочи.

6. Оценить роль карбоксильной группы в структуре фуросемида в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

7. Изучить роль пространственного строения молекулы фуросемида, его геометрию и подвижность структуры в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

8. Изучить роль гидрофобного сегмента в обеспечении диуретической и салуретической активности фуросемида.

9. Спроектировать новое производное сульфонилбензойной кислоты с большей специфической активностью и сохранением селективности к целевой мишени.

Научная новизна работы. Основное значение работы заключается в разработке новой технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности включающей возможность моделирования взаимодействий в системе «лиганд-мишень», количественно связанных с фармакологическими эффектами. А также в установлении взаимосвязи электронного и пространственного строения молекулы фуросемида с его фармакологической активностью, выявлении роли ключевых фрагментов молекулы в реализации его диуретической и салуретической активности.

В работе было использовано оригинальное авторское программное обеспечение.

Впервые детально показано различие в диуретической активности молекулярной и ионной форм фуросемида, а так же влияние на нее различных значений рН мочи. Установлено, что именно молекулярная форма диуретика обладает высокой мочегонной активностью

Впервые показана ключевая роль карбоксильной группы в молекуле фуросемида в обеспечении прочности комплекса «лиганд-мишень» с катион-хлорным транспортером, что вносит основной вклад в диуретическую активность данного соединения.

Впервые показано, что геометрия молекулы фуросемида определяет активность препарата наряду с ключевыми функциональными группами. Изменение пространственного строения молекулы с разрывом внутримолекулярной водородной связи полностью лишает препарат диуретической активности.

Впервые установлено, что фурановый цикл в структуре фуросемида является ключевым гидрофобным сегментом, значительно определяющим активность и селективность молекулы диуретика.

Наряду с этим, выявленные закономерности позволили спроектировать и синтезировать новое производное сульфонилбензойпой кислоты с большей диуретической и салуретической активностью, обладающей обладающее аналогичным механизмом действия.

Выполненная работа предлагает новую технологию для проектирования новых лекарственных веществ и оценки величины их специфической активности и расширяет фармакологическую характеристику фуросемида, показывая связь между химическим строением препарата и его биологическим действием, и несет информацию фундаментального характера. Эти данные существенно расширяют границы нашего понимания природы биологической активности не только изученного диуретика, но и, возможно, целого ряда лекарственных веществ и эндогенных лигандов, имеющих в своем электронном строении схожий с фуросемидом набор ключевых фрагментов.

Научно-практическая значимость работы. Практическая значимость работы определяется необходимостью разработки новых вычислительных технологий для целенаправленного синтеза лекарственных средств, а также широким применением фуросемида в клинической, а так же важностью электролитного транспорта в организме, в регуляцию которого вмешиваются петлевые диуретики.

С учетом того, что в работе на практике был применен новый подход к изучению зависимостей «структура-активность», основанный на расчете ключевых термодинамических параметров межмолекулярного взаимодействия лигандов и мишеней в водной среде, можно предположить перспективность применения разработанного метода для дальнейшего углубленного изучения существующих лекарственных веществ, предсказания биологической активности при проектировании новых лекарств, оценки активности при

модификации лекарств с целью улучшения их фармакологических характеристик. Использованный в работе метод позволяет радикально изменить подход к разработке новых диуретиков, уменьшив число вариантов модификаций молекул и исключив потенциально неактивные структуры.

Проведенное сравнительное исследование активности фуросемида при различных значениях рН мочи указало на необходимость учитывать этот параметр у пациентов при назначении фуросемида и его аналогов и показало перспективу создания комбинированных средств этого препарата с веществами, способными подкислять мочу с целью модулирования активности диуретика Такая комбинация позволяет не только снизить терапевтическую дозу препарата, а вместе с тем и выраженность побочных эффектов, но и использовать подкислитель для профилактики развития фосфатурии. Кроме того, появляется возможность объяснить ряд клинических наблюдений, касающихся различий в эффективности препарата с точки зрения выявленной зависимости его активности от рН мочи.

Спроектированное и синтезированное в ходе исследования новое производное сульфонилбензойной кислоты с улучшенными фармакологическими характеристиками свидетельствует о том, что предложенный оригинальный авторский алгоритм дает возможность отойти от господствующего до сегодняшнего дня метода тотального скрининга и вплотную подойти к целенаправленному проектированию и синтезу высокоактивных и селективных лекарственных веществ, что при дальнейшей разработке позволит значительно сократить стоимость исследований и сократить путь от набора соединений к целевому лекарственному препарату.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана и экспериментально обоснована новая оригинальная технология проектирования лекарственных веществ и оценки величины их специфической активности.

2. Молекула фуросемида в своем электронном строении содержит несколько полярных функциональных групп, среди которых только карбоксильная группа способна увеличивать прочность комплекса с белковой мишенью посредством образования прочной водородной связи с глутаминовой или аспарагиновой кислотами. Остальные полярные группы способны определять только селективность препарата и поддерживать его растворимость в воде.

3. Все белки семейства катион-хорных транспортеров во 2, 3 и 4 суперфициальных петлях содержат глутаминовую и аспарагшювую кислоты, которые способны образовывать прочные комплексы с карбоксильной группой молекулярной формы фуросемида.

4. Пространственное строение фуросемида и его мочегонная активность в значительной степени зависит о наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы.

5. Диуретическая и салуретическая активность фуросемида прямо зависит от величины рН мочи. Только молекулярная форма фуросемида обладает значимой мочегонной активностью. Понижение значений рН мочи увеличивает концентрацию молекулярной формы диуретика в просвете канальца, что открывает перспективу применения фуросемида в комбинации с веществами, подкисляющими мочу. Это позволяет существенно снизить дозу препарата и выраженность его побочных эффектов.

6. Рациональное увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы фуросемида существенно увеличивает его диуретическую и салуретическую активность, не меняя при этом селективность препарата в отношении основной целевой мишени.

Материалы внедрении.

Результаты диссертационной работы включены в монографию А.А. Бондарева, И.В. Смирнова, В.В. Удута «Термодинамические основы фармакодинамики».

Получен патент РФ на изобретение (№2416404) «Средство, обладающее мочегонным действием».

Результаты данного исследования, касающиеся закономерностей фармакологической активности и молекулярного механизма действия фуросемида и его производных внедрены в учебный процесс и НИР в ГБОУ Новосибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет в преподавании фармакологии, в ГБОУ ВПО Томский политехнический университет в преподавании органической химии и технологии органического синтеза.

Апробации материалов диссертационной работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на: VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005); президиуме СО РАМН (Новосибирск, 2006); 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология» (Томск, 2006); VIII конгрессе молодых ученых и специалистов. «Науки о человеке». (Томск, 2007); III съезде фармакологов России «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); XI научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2009); научно-практической конференция посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул, 2010); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «СИБИРСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС» (Барнаул, 2011); ежегодных научных семинарах кафедры

органической химии и технологии органического синтеза ГОУ ВПО ТПУ (Томск, 2005-2011 гг.).

Связь задач исследований с проблемным планом медицинских наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» (№ гос. регистрации 01200600351).

Синтез производных фуросемида и доказательство их строения осуществлялись совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии и органической химии Национального исследовательского Томского политехнического университета под руководством д.х.н., профессора В.Д. Филимонова.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 32 научных работах, в том числе в 1 монографии, 1 патенте РФ на изобретение, 14 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 287 страницах (включая приложения) машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7 глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения результатов, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 145 отечественных и 158 иностранных источников и приложений. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 35 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Квантово-химические расчеты. Квантово-химический расчет выполнен с помощью программного комплекса PCGAMESS (Firefly), версия 7.1.С., разработанная группа под руководством профессора Грановского А.А., в лаборатории химической кибернетики МГУ.

На первом этапе были оптимизированы геометрии образующихся комплексов фуросемида с олигопепгадами. Образование таких структур происходит за счет одной или нескольких водородных связей. Затем, исходя из конечных структур комплексов, были построены исходные системы, таким образом, чтобы молекулы растворителя образовывали межмолекулярные водородные связи, подобные связям в структурах образующихся комплексов. Одним из требований, предъявляемых к рассматриваемым системам, является равенство числа водородных связей в исходных супермолекулах и в результирующем комплексе, так как в водной среде при температуре 298К все водородные связи насыщенны. Таким образом, производился учет специфической сольватации. Для учета общей сольватации все системы, включая молекулы растворителя, были рассчитаны с пользованием модели Томази (РСМ). В ходе процесса комлексообразования молекула фуросемида замещает молекулы воды в сольватационной оболочке олигопептида, и

наоборот молекула олигопептида замещает молекулы воды в оболочке лекарственного вещества. Таким образом, при образовании комплексов происходит частичное замещение молекул воды в сольватных оболочках. Высвобождаемые молекулы воды также образуют водородные связи с молекулами растворителя.

С учетом всех этих факторов для оценки прочности комплексов были рассчитаны термодинамические параметры следующих процессов замещения:

(Фуросемид...пН20)рсм + (Пептид...пН20)Рсм = (Фуросемид.. .Пептидам + п(Н20...Н20)рсм

Расчеты были проведены в Межрегиональном супервычислительном центре Томского государственного университета на суперкомпьютере «СКИФ-СуЬепа».

Методика построения спектров. Спектры взаимодействия строятся на основе квантово-химических расчетов прочности комплексов органических молекул с белковыми мишенями. На первом этапе производится вычисление прочности комплекса между различными аминокислотными остатками и центрами органических молекул, способными участвовать в образовании водородных связей. Расчет прочности осуществляется с учетом того, что исходные молекулы образуют водородные связи с молекулами воды, то есть находятся в условиях специфической сольватации. Из всех возможных вариантов взаимодействия для расчета спектра выбираем только те виды связей, которые способны увеличить прочность комплекса органической молекулы с белком.

На втором этапе производим оценку энергетики гидрофобного взаимодействия. Величины гидрофобных эффектов изучены экспериментально и разработаны методы их оценки. Величина гидрофобного эффекта добавляется к энергии Гиббса и увелиивает прочность комплекса. Затем мы составляем спектр, путем полного перебора все центров со всеми аминокислотными остатками. Получаем набор всех возможных комплексов, а после расчета их энергий, набор всех возможных энергетических состояний молекулы. Основным энергетическим состоянием, энергия которого принимается за ноль, является свободное сольватированное состояние, когда молекула не взаимодействует с белковыми мишенями.

На следующем этапе мы строим распределение Гиббса для этих состояний. Из термодинамических законов следует, что наибольшее количество молекул будет находиться в состояниях с наименьшей энергией. Это распределение зависит от температуры, от количества этих состояний и самое главное от величины энергии Гиббса. Это позволяет рассчитать заселенность этих микро состояний, и с учетом этого рассчитать средние значения энергий Гиббса для всего ансамбля. Учет заселенностей позволяет отбросить из рассмотрения те состояния, вероятность обнаружения которых ничтожно мала.

Набор всех значений позволяет определить и состояние с наименьшей энергией, которое и будет наиболее выгодным и вероятным. Это и есть

величина максимально возможного аффинитета к белковым мишеням, для данной органической молекулы.

Кроме того, этот спектр позволяет определить какие центры молекулы обеспечивают прочное связывание, какой вклад имеет гидрофобный эффект и специфические взаимодействия.

Молекулярное моделирование и визуализация. Визуализация рассчитанных квантово-химических систем выполнена с помощью пакета программ Molekel 5.3. Молекулярное моделирование и визуализация белковых молекул и их комплексов с органическими молекулами выполнены с помощью программного пакета Chimera 1.5.3.

Исследование структуры катион-хлорных транспортеров. Для оценки структуры катион-хлорных транспортеров были взяты первичные структуры всех представителей семейства катион-хлорных транспортеров. Их молекулярная характеристика опубликована в Международном банке протеинов (США). В ходе исследований были сформированы сравнительные таблицы первичных структур NKCCi (человеческий U30246.1 ген протеин ААС50561), NKCC2 (человеческий ген U58130.1 протеин ААВ07364.1), NCC (крысиный ген NMJ319345.2 протеин NP_062218.2), KCCi (домашней мыши ген AF047339.1 протеин ААС32816.1), КСС2 (крысиный ген U55815.1 протеин ААС52634.1), КСС3 (человеческий ген AFI 16242.1 протеин AAF24986.1), КСС4 (человеческий ген NM_005072.3 протеин NP_005063.1) транспортеров. При анализе учитывалось количество и положение аминокислот Glu, Asp, His, Ser, Thr в трансмембранных доменах и суперфициальных петлях транспортера, способных образовывать прочный комплекс реакционными центрами фуросемида.

Методика оценки энергетики взаимодействия молекулы с белковыми мишенями, имеющими выделенные сегменты. Для оценки используются с одной стороны - термодинамический спектр, который описывает потенциальные возможности молекулы при ее взаимодействии с белковым субстратом в водной среде. С другой стороны, на основе первичной последовательности определяются потенциальные возможности каждого сегмент, конкретного белка. В частности нами были проанализированы возможности катион-хлорных транспортеров. В результате из термодинамического спектра выбираются только те энергетические состояния, которые способны реализоваться в сочетании с конкретным фрагментом структуры белка. То есть они содержат тот набор аминокислотных остатков, который соответствует определенному набору взаимодействий для конкретной линии спектра. Учитывается также соответствие гидрофобных участков исследуемой молекулы и конкретного сегмента белка. В результате остается набор состояний, который может наблюдаться при образовании комплексов данной молекулы и определешюго белковой мишени. Для полученного спектра состояний, также проводится анализ заселенностей при температуре 310 К.

Это исследование позволяет определить, какие из участков аминокислотной последовательности способны образовывать прочные комплексы с молекулой-лигандом. Если образуется несколько устойчивых

комплексов, можно оценить вероятность их реализации, исходя из анализа заселенностей. Кроме этого, данный метод позволяет оценить максимально возможный аффинитет органической молекулы к конкретной целевой мишени, а также рассчитать среднюю энергию Гиббса и константы прочности образующихся комплексов.

Экспериментальные фармакологические исследовании.

Экспериментальное фармакологическое исследование диуретической и салуретичской активности фуросемида и его производных было проведено в лаборатории кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета. Эксперименты выполнены на 250 крысах «Вистар» в возрасте 2-2,5 месяцев и массой 180-220 г., выращенных в питомнике ГУ НИИ цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Содержание крыс соответствовало требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР №75 от 12.08.1987 года) и Федеральным законом РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 года.

Постановка экспериментов на животных. Участвующих в экспериментах животных содержали в индивидуальных клетках, специально оборудованных воронкой для сбора мочи. Животные круглосуточно имели свободный доступ к воде и пище. За семь дней до начала экспериментов начинали осуществлять контроль за суточным диурезом. В результате подготовительных наблюдений для каждой серии опытов формировались группы по 12 крыс самцов.

Сравнительное исследование диуретической активности фуросемида и его производных. Для сравнительного исследования диуретической активности фуросемида и его производных исследуемые вещества вводили однократно подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. В качестве контроля подкожно вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Через сутки после введения контрольного раствора собирали суточную мочу, измеряли величину диуреза и концентрацию в ней ионов натрия и калия. Полученные результаты считали контрольной величиной выделительной функции почек. Через сутки после контрольного введения подкожно вводили модифицированные производные фуросемида в дозах 5, 10 и 50 мг/кг для определения наличия у полученных веществ диуретической и салуретической активности. После введения производных фуросемида и оценки изменений функции почек животных оставляли под наблюдением до момента восстановления контрольных величин суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия. Затем вводили фуросемид в дозе 5 мг/кг для оценки его мочегонной активности в данной группе крыс. В опытах с применением йод-фуросемида участвовало две группы животных. Первая группа - контрольная, получала фуросемид в дозе 15 мкмоль/кг. Вторая группа получала йод-

фуросемид в эквимолярной фуросемиду дозе (15 мкмоль/кг) для оценки диуретической и салуретической активности.

Сравнительное исследование диуретической активности фуросемида при различных значениях рН мочи. Для сравнительного исследования диуретической активности фуросемида при различных значениях рН мочи было сформировано 4 группы животных по 12 крыс самцов. У животных собирали мочу и проводили измерение ее рН. В течение последующих семи дней внутрижелудочно с помощью зонда животные получали: контрольная группа - 3 мл воды; первая опытная группа - 3 мл 5% раствора гидрокарбоната натрия с целью подщелачивания мочи; вторая опытная группа - 3 мл 5% раствора ОЬ-метионина с целью подкисления мочи; третья опытная группа - 3 мл 5% раствора аскорбиновой кислоты с целью подкисления мочи. После собирали мочу и проводили измерение ее рН. Далее животным опытных групп в качестве контроля вводили подкожно 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. После определения фоновых значений величины суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия однократно подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия вводили фуросемид в дозе 2 мг/кг. Величину суточного диуреза и экскреции ионов натрия и калия определяли через сутки после введения препарата.

Исследование закономерностей взаимоотношения «ДОЗА-ЭФФЕКТ» для фуросемида у крыс. Исследование проведено в осенний период на крысах-самцах. Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. В контроле крысам однократно подкожно вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Фуросемид вводили подкожно в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия последовательно в дозах 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 мг/кг. Через сутки после введения очередной дозы производили сбор суточной мочи, измеряя величину диуреза, экскрецию ионов натрия, калия, хлора и креатишша. После введения очередной дозы фуросемида животные выдерживались в клетках вплоть до возвращения оцениваемых показателей до контрольных величин.

Определение веществ и вычисление показателей функции почек.

Величину диуреза измеряли мерным цилиндром с ценой деления шкалы 0,1 мл. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном автоматизированном фотометре ПАЖ-3.

Определение рН мочи осуществлялось при помощи ионометра И-130 (Россия). Хлориды определяли колориметрическим методом при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия) на фотоколориметре КФК-3-01 (Россия) при длине волны 492 нм.

Метод определения клубочковой фильтрации (эффективного почечного кровотока). Концентрацию креатинина определяли псевдо кинетическим колориметрическим методом по реакции Яффе при помощи диагностического набора «КРЕАТИНИН-12-ВИТАЛ» (ООО «Витал Диагностике Спб», Россия) на фотоколориметре КФК-3-01 (Россия) при длине волны (490-510) нм. Определение креатинина основано на реакции Яффе и принципе Слота Разность в интенсивности окраски в щелочной и кислой среде прямо

пропорциональна концентрации креатинина в пробе. Содержание креатинина в моче в ммоль/суг рассчитывали по формуле, результат умножали на объем суточной мочи (мл), на коэффициент разбавления мочи (50).

Статистическая обработка полученных результатов. Полученные результаты экспериментальных исследований обработаны статистическим методом вариационных рядов с использованием параметрического критерия Стьюдента. Все расчеты велись по общепринятым формулам. Для расчетов использовалась компьютерная программа SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc., США) для Windows, предназначенной для статистической обработки результатов медицинских и биологических исследований. Для всех статистических тестов различия были достоверными при р<0,01.

Результаты исследовании энергии взаимодействии функциональных групп фуросемида с катион-хлорными транспортерами.

Проведены расчеты всех вариантов взаимодействия молекулы фуросемида с олигопептидами строения С1у-Х-С1у, моделирующими остатки аминокислот в пептиде. В качестве X - аминокислоты, способные образовывать водородные связи с молекулой фуросемида и молекулами воды. Для всех систем был рассчитаны ИК спектр и термодинамические поправки для 298 К. Во всех структурах имеются одна или несколько межмолекулярных водородных связей. Структура фуросемида представлена на рисунке 1.

У фуросемида есть 8 центров способных образовывать водородные связи с субстратом, их взаимодействие с различными аминокислотными остатками дает набор возможных энергий взаимодействия и прочности комплексов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Л ■>■>

26

29

28

Рисунок 1. Структура молекулы фуросемида, рассчитанная методом функционала плотности (ОРТ - ВЗЬУР) в базисе 6-31Ю*.

Из полученных результатов видно, что лишь 30 наиболее низких по энергии уровней имеют заселешюсть более 0.1% . Это позволяет значительно сократить число состояний, которые реализуются для данной молекулы. Общее число линий в спектре фуросемида 296352, однако лишь самые низкие по энергии имеют высокую степень заселенности.

Общий вклад гидрофобных сегментов фуросемида в прочность комплекса составил -34.560 кДж/моль, константа прочности комплекса (К) при 310К составила 6,704-Ю5. Отсюда максимально возможный аффинитет фуросемида к белковым мишеням в водной среде составил -76.262 кДж/моль (К = 7,19-1012), средний -73.802 кДж/моль при температуре 310 К (К = 2,767-1012).

Следует заметить, что оценивая максимально возможную прочность комплекса «лиганд-белок», в первую очередь мы учитывали образование сильных водородных связей и гидрофобное взаимодействие, имеющие наибольший энергетический эффект. Все остальные виды межмолекулярных взаимодействий по величине энергии в 10-100 раз меньше.

Суммируя выше сказанное, с точки зрения термодинамики процесса комплексообразования согласно предложенному нами «принципу замещения» изначально имеется два энергетических состояния: сольватированный фуросемид (лиганд-вода) и сольватированные глутаминовая и аспарагиновая кислоты в молекуле белка-транспортера (белок-вода).

При образовании комплекса активный водород карбоксильной группы фуросемида замещает молекулу воды в карбоксильной группе ионизированного аминокислотного остатка белка-транспортера в комплексе «белок-вода». В свою очередь карбоксильная группа аминокислотного остатка замещает молекулу воды в комплексе «лиганд-вода». В результате образуется прочный комплекс «лиганд-белок».

Расчеты показали наличие у диуретика прочных водородных связей с серином, треонином, гистидином, аспарагиновой и глугаминовой кислотами целевого белка-мишени, что при максимальном числе связей определяет 55% аффинитета препарата. Гидрофобный сегмент молекулы фуросемида в значительной мере определяет фармакологическую активность препарата, добавляя к аффинитету полярных сегментов до 45% эффекта. Среди полярных функциональных групп диуретика увеличивать прочность комплекса с белком-мишенью способна только карбоксильная группа. Аминогруппа дезактивирована в результате стерического фактора, обусловленного наличием фуранового кольца. Атом водорода аминогруппы задействован в образовании прочной внутримолекулярной связи. Сульфаниламидная группа выполняет функцию только гидрофильного ключевого фрагмента, увеличивая селективность молекулы.

Результаты анализа первичной структуры катион-хлорных транспортеров как белков-мишеней для действия фуросемида.

Нами были исследованы первичные последовательности белков NKCCi, NKCC2, NCC, KCCi, KCC2, KCC3, КСС4, опубликованные в Национальном центре биотехнологической информации (США) на наличие в них аминокислот, способных образовывать прочные водородные связи с молекулами диуретиков. Такими аминокислотами, являются глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), шстидин (His), треонин (Thr). В пептидных цепочках на наличие данных аминокислот исследовались все трансмембрапиые домены и суперфициальные петли между ними.

С NKCC1 прочные комплексы фуросемид способен образовать в SF2 с вероятностью 46%, в SF3 и SF4 с вероятностью 26,5%. С NKCC2 прочные комплексы препарат способен образовать в SF2 с вероятностью 19%, в ТМ4 и SF3 с вероятностями 24% и SF4 с вероятностью 31,5%. С NCC прочные комплексы диуретик способен образовать в SF3 с вероятностью 37%, и в SF4 с вероятностью 61,3%. С KCQ прочные комплексы фуросемид способен образовать в SF2 и SF3 с вероятностями 33,2%, в SF4 с вероятностью 20,2% и ТМ9 с вероятностью 12,9%. С КСС2 прочные комплексы фуросемид способен образовать в SF2 с вероятностью 17,8%, в SF3 с вероятностью 45,9%, в SF4 и ТМ9 с вероятностями 17,8%. С КСС3 прочные комплексы фуросемид способен образовать в SF2 с вероятностью 29,5%, в SF3 с вероятностью 35,2%, в SF4 с вероятностью 21,3% и ТМ9 с вероятностью 13,6%. С КСС4 прочные комплексы фуросемид способен образовать в SF2 с вероятностью 35,8%, в SF3 с вероятностью 28,4%, в SF4 с вероятностью 8,5%, в ТМ9 с вероятностью 16,9% и в ТМ12 с вероятностью 10,7%.

Таким образом, в результате исследования суперфициальных петель и трансмембранных доменов было обнаружено, что возможные центры связывания фуросемида с белком располагаются в SF2-4, ТМ9 и ТМ12. Образующиеся комплексы обладают достаточно большой прочностью (до AG = -76.262 кДж/моль (К = 7,19-Ю12), включая гидрофобный эффект AG гидрофобного эффекта = -34.560 кДж/моль (К = 6,704-105). Самая высокая вероятность связывания внутри транспортера имеется в SF2 и в SF3 петлях, самая низкая в ТМ доменах.

Целевые белки-мишени семейства катион-хлорных транспортеров в экстрацеллюлярной части молекулы только во 2,3 и 4 суперфициальных петлях могут образовывать комплексы «лиганд-белок» посредством водородной связи с глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Эти сегменты способны участвовать в гидрофобном взаимодействии и максимально реализовать возможности молекулы фуросемида за счет относительно высокой подвижности цепочки аминокислот. Вероятность образования прочных комплексов в трансмембранных доменах очень низка, и возможна только в ТМ9 и ТМ12. Реализовать достаточное количество ключевых взаимодействий в ТМ домене не возможно в силу отсутствия достаточной подвижности

пептидной цепи и необходимых аминокислотных остатков, обеспечивающих прочное связывание.

Результаты исследования роли карбоксильной группы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности

В результате исследований было выявлено, что этерификация мало изменяет зарядовые и конформациошше характеристики фрагментов N112802 и фурил-СН^Н относительно бензольного ядра молекулы фуросемида. Параметры внутримолекулярной водородной связи также практически не изменились, значительные изменения эффективного заряда наблюдаются только для атома кислорода, непосредственно связанного с этилыюй группой.

Из всех видов взаимодействия способны увеличивать прочность не все виды взаимодействия. Всего таких видов взаимодействия четыре. Структура этилового эфира фуросемида представлена на рисунке 2.

Данные расчетов показали, что только лишь 8 наиболее низких по энергии уровней имеют заселенность более 0,1%. Это позволяет значительно сократить число состояний, которые реализуются для данной молекулы.

Из всех функциональных групп, имеющихся в структуре этилового эфира фуросемида, образовать водородные связи с белковыми молекулами способна только сульфаниламидная группа. Аминогруппа, так же как и в случае с фуросемидом, дезактивирована в результате стерических затруднений, обусловленных наличием фуранового кольца. Единственный атом водорода аминогруппы задействован в образовании прочной внутримолекулярной связи.

38

Рисунок 2. Структура молекулы этилового эфира 4-хлор-2-(2-фурилметиламин)-5-сульфомилбензойной кислоты (этиловый эфир фуросемида), рассчитанная методом функционала плотности (БЭТ - ВЗЬУР) в базисе 6-31Ю*.

Сульфаниламидная группа, выполняя функцию гидрофильного ключевого сегмента, увеличивает селективность молекулы, но, учитывая ее вклад в энергетику комплексообразования (порядка -10 кДж/моль), этого недостаточно для образования прочного комплекса.

Общий вклад гидрофобных сегментов фуросемида в прочность комплекса составил -40.320 кДж/моль, константа прочности комплекса при 310К составила 6,272-10 . Отсюда максимально возможный аффинитет этой модификации диуретика к белковым мишеням в водной среде составил -50.984 кДж/моль (К = 3,937-108), средний -50.484 кДж/моль при температуре 310 К (К = 3,243-Ю8).

Заселенность сегментов все исследованных транспортеров для этилового эфира фуросемида составила от 6 до 10%, что по сравнению с фуросемидом значительно меньше, заселенность которого на отдельных сегментах достигала 61%. Разница констант прочности комплексов фуросемида и этилового эфира фуросемида с белком составляет 5,48-10"5, что свидетельствует об отсутствии мочегонной активности у модифицированной молекулы. Это было проверено экспериментально.

Далее в опытах на 12 белых крысах была оценена диуретическая активность фуросемида и его этилового эфира.

Как показано на рисунке 3, введение фуросемида в дозе 5 мг/кг

увеличивало суточный диурез в 2,9 раза по сравнению с контролем. %

350 300 250 200 150 100 50 0

Контроль Фуросемид Этиловый Этиловый Этиловый 5 мг/кг эфир эфир эфир

фуросемида фуросемида фуросемида 5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Примечание: * обозначены достоверные отличия от контрольных показателей, р<0,001.

Рисунок 3. Диуретическая активность фуросемида и его этилового эфира.

к

1 -1-

Введение этилового эфира фуросемида в дозах 5, 10 и 50 мг/кг существенно не изменяло величины суточного диуреза, что свидетельствовало об отсутствии диуретической активности у данного соединения.

Как показано на рисунке 4, введение крысам фуросемида в 11,5 раз увеличивало экскрецию ионов натрия по сравнению с контролем, что свидетельствовало о выраженной нагрийуретической активности препарата в дозе 5 мг/кг. Наряду с выраженным натрийуретическим эффектом, в указанной дозе фуросемид вызывал увеличение экскреции ионов калия в 1,4 раза по отношению к исходному фону.

% Ш Натрий И Калий

1200 1000 800 600 400 200 0

Примечание: * обозначены достоверные отличия от контрольных показателей, р<0,001.

Рисунок 4. Суточная экскреция ионов натрия и калия при введении фуросемида и его этилового эфира.

При введении этилового эфира фуросемида во всех указанных дозировках наблюдалось значительное (2 и более раза) снижение экскреции ионов натрия и калия по сравнению с контролем, что свидетельствовало о наличии у данного соединения свойства задерживать в организме ионы натрия и калия.

Для исключения возможных стерических затруднений при образовании комплекса «этиловый эфир фуросемада-белок» было спроектирован, а затем синтезирован метиловый эфир фуросемида. Структура метилдового эфира фуросемида представлена на рисунке 5. Было сделано предположение, что меньшая величина гидрофобного метального радикала по сравнению с этильным в меньшей степени повлияет на пространственное и электронное строение фуросемида, но при этом так же заместит активный атом водорода в карбоксильной группе, что приведет к потере у нового соединения диуретической активности.

ш

1

I 13 * * * * * * I штшгггп WWWS'/1 ШШХ//А

Контроль Фуросемид Этиловый Этиловый Этиловый

S мг/кг эфир эфир эфир

фуросемида фуросемида фуросемида

5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Рисунок 5. Структура молекулы метилового эфира 4-хлор-2-(2-фурилметиламин)-5-сульфомилбензойной кислоты, рассчитанная методом функционала плотности (ОРТ - ВЗЬУР) в базисе 6-31Щ*.

В отличии от этилового эфира фуросемида, у метилового производного есть уже 5 центров в место 4-х способных увеличивать прочность комплекса. Однако, этих эффектов не достаточно для образования устойчивых прочных комплексов, так как их константы имеют величины менее 10.

Из приведенных данных можно определить, что лишь 23 наиболее низких по энергии уровней имеют заселенность более 0.1%. Это позволяет значительно сократить число состояний, которые реализуются для данной молекулы. По сравнению с этиловым эфиром этих состояний почти в 3 раза больше.

Пространственные характеристики метилового эфира оказались практическим идентичными.

Общий вклад гидрофобных сегментов метилового эфира фуросемида в прочность комплекса составил -37.440 кДж/моль, константа прочности комплекса при 310К составила 2.05 МО6. Отсюда максимально возможный аффинитет этой модификации диуретика к белковым мишеням в водной среде составил -46.490 кДж/моль (К = 6,88-107), средний -44.041 кДж/моль при температуре 310 К (К = 2,659-Ю7).

Заселенность сегментов все исследованных транспортеров для этилового эфира фуросемида достигала 27% с ИКСС2, что по сравнению с этиловым эфиром фуросемида значительно больше, заселенность которого на отдельных сегментах не превышала 10%. Разница констант прочности комплексов фуросемида и этилового эфира фуросемида с белком составляет 9,57-10"6, что свидетельствует об отсутствии мочегонной активности у модифицированной молекулы. Это было проверено экспериментально.

Эксперименты на крысах подтвердили теоретические результаты.

Как показано на рисунке 6, введение фуросемида в дозе 5 мг/кг

увеличивало суточный диурез в 3,25 раза по сравнению с контролем. %

350 300 250 200 150 100 50 0

Примечание: * обозначены достоверные отличия or контрольных показателей, р<0,001.

Рисунок 6. Диуретическая активность фуросемида и его метилового эфира. %

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Примечание: * обозначены достоверные отличия от контрольных показателей, р<0,001.

Рисунок. 7. Суточная экскреция ионов натрия и калия при введении фуросемида и его метилового эфира.

I

Контроль

i I Ш:

Фуросвмид Метиловый Метиловый Метиловый

5 мг/кг эфир эфир эфир

фуросемида фуросемида фуросемида

5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Натрий 0 Калий

*

Контроль Фуросешд Метиловый Метиловый Метиловый

5 мг/кг эфир эфир эфир

фуросемида фуросемида фуросемида

5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Введите метилового эфира фуросемида в дозах 5, 10 и 50 мг/кг практически не изменяло величины суточного диуреза, что свидетельствовало об отсутствии диуретической активности у данного соединения.

На рисунке 7 видно, что введение крысам фуросемида в 13,6 раз увеличивало экскрецию ионов натрия по сравнению с кошролем, что свидетельствовало о выраженной натрийуретической активности препарата в дозе 5 мг/кг. Наряду с выраженным натрийуретическим эффектом, в указанной дозе фуросемид вызывал увеличение экскреции ионов калия в 2,7 раза по отношению к фону. При введении метилового эфира фуросемида во всех указанных дозировках не наблюдалось существенных изменений в суточной экскреции ионов в сравнении с контролем, что свидетельствовало об отсутствии у данного соединения влияния на транспорт этих ионов.

Потеря диуретической активности в результате модификации молекулы свидетельствует о ключевой роли атома водорода карбоксильной группы, обеспечивающей высокую активность фуросемида. Этерефицированная молекула фуросемида теряет возможность образовывать прочную водородную связь с ионными формами аспарагиновой и глютаминовой кислот, входящих в состав белка-транспортера. Этерификация мало изменяет зарядовые и конформациоиные характеристики фрагментов Ш^СЬ и фурил-СН2ЫН относительно бензольного ядра молекулы фуросемида, что позволяет поставить под сомнение роль сульфамидной группы как ключевой группы в проявлении диуретической активности фуросемида.

Результаты исследовании роли пространственного строения молекулы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности

Результаты расчетов показали, что проектируемое производное фуросемида в значительной степени отличается от исходной молекулы по ряду электронных и пространственных характеристик. Внесенные в структуру изменения привели к разрыву внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Пространственное строение молекулы в значительной мере претерпело изменения, что проявилось в создании стерических затруднений для взаимодействия карбоксильной группы проектируемого вещества с другими молекулами. Это обстоятельство позволило предположить, что, несмотря на то, что карбоксильная группа диуретика осталась без изменений, диуретическая и салуретическая активность его должна была бы резко снизиться или вообще исчезнуть, поскольку образование прочной водородной связи с карбоксильными группами глютаминовой и аспарагиновой кислот теперь было сильно осложнено стерическим фактором. Прочная водородная связь образуется при условии не превышения ее длины 1,7 ангстрема.

Проведены расчеты всех вариантов взаимодействия молекулы 14-ацетамида фуросемида с олигопептидами, моделирующими остатки аминокислот в пептиде. По результатам расчетов 35 наиболее низких по

энергии уровней имеют заселенность более 0.1%. Следует заметить, что у фуросемида их всего 30. Это говорит о том, что молекула после модификации с разрывом внутримолекулярной водородной связи получила больше возможностей для образования прочных комплексов с белком. Структура ¡4-ацетамида фуросемида представлена на рисунке 8.

27

Рисунок 8. Структура молекулы Ы-ацетамида 4-хлор-2-(2-фурилметиламин)-5-сульфомилбензойной кислоты (Ы-ацетамид фуросемида), рассчитанная методом функционала плотности (ОГТ- ВЗЬУР) в базисе 6-311 О*.

Общий вклад гидрофобных сегментов фуросемида в прочность комплекса составил -40.320 кДж/моль, константа прочности комплекса при 310К составила 6,272-106. Отсюда максимально возможный аффинитет этой модификации диуретика к белковым мишеням в водной среде составил -94.278 кДж/моль (К = 7,833-1015), средний -93.293 кДж/моль при температуре 310 К (К = 5,345-Ю15).

Заселенность сегментов всех исследованных транспортеров для ацетамида фуросемида для отдельных сегментов транспортеров достигла 98% , что по сравнению с фуросемидом значительно больше, заселенность которого на отдельных сегментах достигала только 61%. Разница констант прочности комплексов фуросемида и его ацетамида с белком составляет 1090. У ¡4-ацетамида фуросемида больше видов взаимодействия увеличивающих прочность комплекса, однако нет ни одного, который бы играл роль ключевого, с высокой константой. Максимальный аффинитет хотя и выше чем у фуросемида, однако, он возможен лишь при взаимодействии большого числа центров с соответствующими аминокислотами. Следует отметить, что совпадение трех и более ключей очень маловероятный процесс и ожидать более высокой активности от данной модификации не имеет смысла.

Сравнительное исследование мочегонной активности И-ацетамидного производного с фуросемидом показало, что введение оригинального перарата в дозе 5 мг/кг увеличивало суточный диурез в 2,43 раза по сравнению с

контролем (рисунок 9). %

300 250 200 150 100 50

I

Контроль Фуросемид !\1-ацетамид М-ацатамид Г^-ацетамид 5 мг/кг фуросемида фуросемида фуросемида 5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Примечание: * обозначены достоверные отличия от контрольных показателей, р<0,001.

Рисунок 9. Диуретическая активность фуросемида и Ы-ацетамида фуросемида. % В Натрий и Калий

2500

2000

1500

1000

500

* ■

1

1

1

1 *

_ ДА—чшшкгт 1 ШШкггг}

Контроль Фуросемид 5 мг/кг

Примечание: * обозначены достоверные отличия от контрольных показателей, р<0,001.

М-ацатамид И-ацетамид 1М-аце-гамцд фуросемида фуросемида фуросемида 5 мг/кг 10 мг/кг 50 мг/кг

Рисунок 10. Суточная экскреция ионов натрия и калия при введении фуросемида и М-ацетамида фуросемида.

Введение И-ацетамида фуросемида в дозах 5, 10 и 50 мг/кг практически не изменяло величины суточного диуреза, что свидетельствовало об отсутствии диуретической активности у данного соединения.

Как показано на рисунке 10, введение крысам фуросемида в 21,4 раз увеличивало экскрецию ионов натрия по сравнению с контролем, что свидетельствовало о выраженной натрийуретической активности препарата в дозе 5 мг/кг. Наряду с выраженным натрийуретическим эффектом, в указанной дозе фуросемид вызывал увеличение экскреции ионов калия в 1,7 раза по отношению к фону. При введении Ы-ацетамида фуросемида во всех указанных дозировках не наблюдалось существенных изменений в суточной экскреции ионов в сравнении с контролем, что свидетельствовало об отсутствии у данного соединения влияния на транспорт этих ионов.

Таким образом, пространственное строение молекулы фуросемида в значительной степени зависит о наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Разрыв этой связи приводит существенным изменениям пространственных характеристик его структуры. Изменения геометрии молекулы фуросемида, вызывающие выраженные стерические затруднения при образовании водородной связи с активным атомом водорода карбоксильной группы, приводят к потере диуретической и салуретической активности препарата, не смотря на то, что общая расчетная величина его максимально возможного аффинитета на 18 кДж/моль больше, а максимальная константа прочности комплекса в 1000 раз больше чем у фуросемида. Однако она не реализуется на практике, по крайней мере в отношении катион-хлорных транспортеров.

Результаты исследования роли гидрофобного сегмента молекулы фуросемида в обеспечении его фармакологической активности

Молекула фуросемида в своей структуре наряду с полярными группами имеет достаточно большой гидрофобный сегмент, который состоит из бензольного кольца и фуранового цикла. Согласно расчетам, общий вклад этих фрагментов в аффинитет диуретика составляет -34.560 кДж/моль, константа прочности комплекса (К) при 310К составила 6,704-105. И как уже было сказано, это определяет до 45% эффекта. Такой большой вклад в энергетику комплексообразования естественно отражается на константе прочности комплекса кардинальным образом. Другими словами, отсутствие или меньшая его площадь привела бы к отсутствию диуретических свойств у изучаемого соединения. И в свою очередь, возможно рациональное увеличение его площади должно ощутимо отразиться на его мочегонной активности. Учитывая то, что боковой радикал (фурановый цикл) по нашим предположениям в значительной мере определяет гидрофобный эффект диуретика и в этой области возможно провести рациональное изменение площади неполярного

сегмента молекулы было спроектировано и синтезировано новое производное фуросемида - йод-фуросемид.

Йод-фуросемид представляет собой 4-хлоро-2-((5-иодофуран) метиламино)-5-сулфамилбензойную кислоту, в молекуле которой произведено замещение атома водорода во втором положении фуранового цикла йодом. Атом йода имеет больший размер, способный увеличить площадь гидрофобного сегмента фуранового цикла. Структура йод-фуросемида представлена на рисунке 11.

Рисунок 11. Структура молекулы 4-хлоро-2-((5-иодофуран)метиламино)-5-сулфамилбензойной кислоты, рассчитанная методом функционала плотности (ОРТ - ВЗЬУР) в базисе 6-31Ш*.

Основные геометрические параметры, углы между плоскостями бензольного кольца и фуранового цикла, а также углы между плоскостью кольца, карбоксильной и сульфаниламидной группой практически идентичны в обеих молекулах. В целом геометрия не претерпела существенных изменений, за исключением самого заместителя - атома йода, обладающего существенно большим Ваи-дер-ваальсовым радиусом. Сравнительный анализ структур этих молекул, показал, что их геометрические параметры практически одинаковы, различия в длинах связей незначительны. Распределение заряда на основных функциональных группах, участвующих в специфических взаимодействиях с белковым субстратом, так же не претерпело существенных изменений. Это позволяет предположить, что основную роль в повышении биологической активности молекулы играет само наличие объемного заместителя - йода, в значительной степени увеличивающего гидрофобный эффект. По литературным данным введение йода приводит к увеличению ДО гидрофобного эффекта для йод-бензола, в сравнении с бензолом на 3,7 кДж/моль. Теоретически это приводит к увеличению константы прочности комплекса с белковыми молекулами в 4,2 раза при температуре 31 ОК.

Таким образом, йод-фуросемид по основным электронным и пространственным характеристикам, и термодинамическому спектру,

представляет собой фуросемид, но с большим по площади гидрофобным сегментом.

Общий вклад гидрофобных сегментов фуросемида в прочность комплекса составил -38.260 кДж/моль, что на 3,7 кДж/моль больше чем таковой у фуросемида. Константа прочности комплекса при 310К составила 2,819-10 . Отсюда максимально возможный аффинитет этой модификации диуретика к белковым мишеням в водной среде составил -79.962 кДж/моль (К = 3,023- 10п), средний -77.502 кДж/моль при 310 К (К = 1Д63-1013).

Заселенность сегментов всех исследованных транспортеров для йод-фуросемида составила 61%, что аналогично фуросемиду. Соотношение констант прочности комплексов фуросемида и этилового эфира фуросемида с белком составляет 4,02, что свидетельствует об более высокой мочегонной активности у модифицированной молекулы.

Введение фуросемида увеличивало суточный диурез в 3,2 раза, введение йод-фуросемида - в 5,7 раза по сравнению с контролем. Экскреция ионов натрия под влиянием фуросемида повысилась в 6,1 раза, под влиянием йод-фуросемида - в 11,7 раз по сравнению с контролем. Экскреция ионов калия увеличилась в 1,9 раза по сравнению с контролем под влиянием фуросемида и в 3,3 раза под влиянием йод- фуросемида.

В итоге однократное подкожное применение эквимолярной дозы йод-фуросемида обусловило развитие более выраженного диуретического и одинакового салуретического эффекта.

Прочность комплекса «лиганд-мишень» в водной среде может обеспечивать два основных механизма: 1) полярная функциональная группа, способная в водной среде к образованию водородной связи с полярными группами белка-мишени, замещая молекулы воды в сольватационной оболочке; 2) гидрофобный эффект от взаимодействия гидрофобных фрагментов молекулы препарата и белка-мишени. Это взаимодействие подчиняется ряду известных закономерностей. Чем больше площадь взаимодействия гидрофобных сегментов препарата и белка, тем прочнее образующийся между ними комплекс. Чем выше константа прочности образовавшегося комплекса, тем прочнее связь и, соответственно, сильнее и длительнее эффект.

Проведенное нами сравнительное исследование показало, что новое производное сульфанилбензойной кислоты - йод-фуросемид обладает более выраженным диуретическим и салуретическим действием в сравнении с фуросемидом у крыс. Поскольку атом йода является гидрофобным и не может взаимодействовать с полярными функциональными группами катион-хлорных транспортеров в почечных канальцах, его роль в повышении активности препарата, вероятно, заключается в увеличении площади гидрофобного сегмента молекулы. Это, в свою очередь, позволяет молекулам образовывать более прочные комплексы и либо в меньшей концентрации блокировать то же число катион-хлорных транспортеров, либо в той же эквимолярной дозе блокировать большее число транспортеров, чем молекулы фуросемида. Наряду с этим, практически идентичные соотношения салуретического и диуретического эффектов исследуемых веществ позволяют с большой долей

вероятности предположить, что оба диуретика взаимодействуют с одним и тем же типом белков-мишеней в почечных канальцах, проявляя идентичный механизм диуретического действия, который отличается лишь количественно.

Таким образом, более выраженное по сравнению с фуросемидом диуретическое и салуретическое действие йод-фуросемида указывает на то, что при поиске новых мочегонных средств с большей активностью, наряду с включением высокоактивных полярных групп для повышения прочности комплекса «лиганд-мишень», целесообразно учитывать наличие адекватного гидрофобного эффекта. При этом нельзя исключать то, что введение в молекулу комплементарной полярной группы может увеличить активность модифицируемого соединения в десятки раз. А модификация гидрофобного сегмента за счет значительно более низкой энергетики взаимодействия позволяет более плавно повышать активность вещества, что может иметь практическое значение.

Результаты исследования фармакологической активности фуросемида при различных значениях рН мочи.

Фуросемид является молекулой-амфолитом, в структуре которой присутствуют как карбоксильная группа, так и аминогруппа. Благодаря способности к выборочной ионизации такие молекулы противодействуют изменению рН при добавлении кислоты или основания. В присутствии кислот они принимают на себя протоны, удаляя последние из раствора, и противодействуют повышению его кислотности. При добавлении оснований амфолиты высвобождают ионы водорода в раствор, препятствуя возрастанию рН, тем самым, сохраняя его равновесие.

Высокую прочность комплекса с белком способна образовывать молекулярная форма препарата. В жидкой лекарственной форме (для инъекций) и в организме неметаболизированный фуросемид находится в двух формах: ионной и молекулярной. Энергетический выигрыш при образовании комплекса карбонильной группы с молекулой воды больше, чем с другой карбонильной группой. Взаимодействие ионной формы лигавда с ионной формой отрицательно заряженных аминокислот в структуре белка-мишени, энергетически невозможно. Молекуле фуросемида в ионной форме термодинамически выгоднее образовывать водородную связь с молекулами воды, чем с ЖСС2, так как эта связь значительно прочнее. Следовательно, теоретически с катион-хлорными транспортерами ионная форма фуросемида не образует прочного комплекса и не нарушает их работу в той мере, в какой способна это сделать его молекулярная форма. Согласно расчетам, в ионной форме препарат в организме образует комплексы с другими белками-мишенями.

Для понимания причин его такой высокой активности было необходимо выяснить долю молекулярной и ионной форм препарата в крови и в моче. Основные мишени фуросемида находятся во всех клетках организма и являются важным звеном в обеспечении водно-солевого гомеостаза, поэтому

известно такое множество внепочечных эффектов фуросемида и других современных диуретиков, которые врачи-клиницисты научились использовать в лечении целого ряда заболеваний, таких как бронхиальная астма, муковисцидоз, гипертоническая болезнь, глаукома и другие [Брюханов, 2003].

Присутствие вещества в растворе в молекулярной или ионной форме напрямую зависит от значения рН этого раствора. Фуросемид в водном растворе способен находиться в обеих формах. Однако доля той или иной формы, как уже было сказано, напрямую зависит от рН среды.

Было проведено экспериментальное исследование молекулярной формы фуросемида в растворе с различными значениями рН среды при 37°С, с целью максимально приблизить полученные физико-химические результаты к реальным условиям в организме при нормальной температуре. Поставленный опыт с титрованием показал, что переход фуросемида из ионной формы в молекулярную находится в области значений рН 5,7-5,6. Из этого следует, что в плазме крови и других биологических жидкостях фуросемид находится в основном в ионной форме. А в моче, в зависимости от значения ее рН, его доля существенно колеблется. Следовательно, может колебаться и величина его мочегонной активности.

Основной целью этих опытов было выяснить зависимость диуретической активности препарата и долей его молекулярной формы в моче крыс. В связи с отсутствием прямого метода измерения рН мочи в почечном канальце, кислотность измеряли в выделяемой крысами вторичной моче. Проведенные экспериментальные исследования влияния рН мочи на фармакологическую активность фуросемида показали, что при различных значениях этой величины препарат проявляет разную активность в отношении как водного диуреза, так и экскреции ионов натрия и калия. Сравнительная характеристика по трем

основным критериям мочегонной активности представлена на рисунках 12-13. %

600 500 400 300 200 100 0

Рисунок 12. Суточный диурез при различных значениях рН мочи.

1 1 ■ 1

рН=8,7 рН=7,2 рН=6,6 рН=6,0

Введете фуросемида на фоне применения гидрокарбоната натрия, ОЬ-метионина и без применения модуляторов рП мочи вызывает практически равнозначное нарастание суточного диуреза. Существенно возрастает диуретическая активность фуросемида на фоне применения аскорбиновой кислоты. Практически в 5 раз возрастает суточный диурез по отношению к фону. ОЬ-метионина вызвал сдвиг рН мочи в кислую сторону до 6,6, что практически никак не отразилось на величине суточного диуреза. Сдвиг рН мочи до 6,0 аскорбиновой кислотой привел к резкому увеличению суточного

диуреза в этой группе. %

В Натрий И Калий

1200 1000 800 600 400 200 0

Рисунок 13. Суточная экскреция ионов натрия и калия при различных значениях рН мочи.

Введение фуросемида на фоне применения гидрокарбоната натрия вызвало незначительное увеличение экскреции ионов натрия. Дальнейшее повышение кислотности мочи до 6,6 привело к резкому, практически в 2,6 раза по сравнению с активностью препарата в нейтральной рН мочи, повышению салуретической активности препарата. Полученная высокая активность диуретика в отношении транспорта ионов натрия позволяет сделать вывод о том, что значительно большее число транспортных систем почечных канальцев было заблокировано воздействием препарата. При рН среды 6,6 доля молекулярной формы препарата составляет 0,09. Незначительное снижение рН среды до 6,0 резко повышает долю этой формы препарата до 0,28. Доля молекулярной формы при этом значении рН среды повышается более чем в 3 раза по сравнению с величиной рН=6,6. Отметим, что такой активности препарата без применения подкислителя ранее нам не удавалось достичь I введением даже 20 мг/кг фуросемида.

рН=8,7 рН=7,2 рН=6,6 рН=6,0

Результаты исследовании закономерностей взаимоотношения «ДОЗА-ЭФФЕКТ» для фуросемида

Основные результаты исследования влияния различных доз фуросемида на функцию почек у крыс приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние нарастающих доз фуросемида на основные показатели выделительной

функции почек у крыс.

Доза фуросемида, мг/кг Показатели функции почек

Диурез, мл/сут Экскреция, мкМоль/сут

Натрий Калий Хлор Креати-нин

Контроль 6,2+0,9 17+2,5 423+42,8 169+16,9 41+5,1

0,5 7,1±0,9 26+3,7 446+39,0 181+16,6 48+4,4

1 8,1 ±0,9 140+26,6* 468+42,3 348±22,8* 56+5,9

2 14,4±1,7* 443+51,6* 640±59,7* 741+59,0* 49+6,8

5 18,6±1,7* 588+59,0* 937±87,6* 922±60,8* 50+3,9

10 18,0+1,6* 796+87,5* 923+79,5* 1150+101,8* 54+4,6

20 19,3+1,7* 1197±101* 915±106,0* 1454+112,6* 53,9+6,4

Примечание: звездочками обозначены достоверные отличия от контрольных

показателей, р<0,001.

Из данных таблицы видно, что увеличение дозы фуросемида приводило к последовательному росту суточного мочеотделения, достигавшему достоверных значений при введении 2 мг/кг препарата, после чего диурез стабилизировался на одном уровне в диапазоне доз от 5 до 20 мг/кг. Для экскреции натрия была характерна последовательная динамика роста с пороговым «скачком» в диапазоне 1-2 мг/кг. Выделение калия из организма, практически не изменялось вплоть до применения дозы фуросемида - 2 мг/кг. Затем в диапазоне доз от 2 до 5 мг/кг наблюдался скачкообразный прирост выделения этого иона с последующей стабилизацией на одном уровне независимо от дальнейшего увеличения дозы препарата.

Совместный анализ зависимостей экскреции ионов натрия, калия и хлора позволяет предположительно оценить степень аффинности молекулы фуросемида к различным представителям семейства катион-хлорных

транспортеров, а имешю ИКСС, КСС и N00. Исследование показало, что при дозировках от 1 до 2 мг/кг наблюдается четко выраженный первый порог кривой насыщения для экскреции ионов натрия. Применение 2 мг/кг фуросемида обусловило также резкое повышение выделения ионов калия. По-видимому, в диапазоне доз от 1 до 2 мг/кг преимущественно происходит образование комплексов молекул фуросемида с натрий-калий хлорными котранспортерами, в данном случае в почках 1ЧКСС2.

В интервале доз от 2 до 5 мг/кг наблюдался эффект, свидетельствующий о максимуме процесса экскреции ионов калия, в то время как для выделения натрия в этом диапазоне взаимоотношение «доза-эффект» имело четко выраженную линейную зависимость. Это позволяет предположить, что в отмеченном интервале доз происходит преимущественно образование комплексов молекул фуросемида с калий-хлорными котранспортерами.

В диапазоне высоких доз фуросемида (от 5 до 20 мг/кг) было зафиксировано последовательное увеличение экскреции ионов натрия при неизменном уровне выделения калия. В отношении выделения натрия не исключено, что здесь располагается начальный участок следующего порога насыщения, который находится в области более высоких доз. Экскреция ионов хлора здесь также характеризовалась поступательным нарастанием. По всей вероятности, в области высоких доз молекулы фуросемида в основном образуют комплексы с котранспортером, ответственным за совместный транспорт ионов натрия и хлора - КСС.

Важную информацию о константах прочности комплексов молекулы фуросемида также несет фармакологический эффект препарата в области доз, при которой мы фиксировали кривую насыщения. Дня комплекса фуросемид-NK.CC - это предположительно от 0,5 до 2 мг/кг; для комплекса фуросемид-КСС - от 1,5 до 5 мг/кг. Для комплекса фуросемид-ИСС, по-видимому, интервал максимального комплексообразования начинается с 5 мг/кг, а насыщение достигается при концентрациях, превышающих 20 мг/кг. Близость интервалов комплексообразования для 1ЯКСС и КСС свидетельствует о том, что аффинитет фуросемида, то есть константы прочности образуемых комплексов очень близки и имеют гораздо более высокие значения, чем константа прочности комплекса фуросемида с натрий-хлорным котранспортером.

Таким образом, экскреция ионов натрия достигает первого порога насыщения при дозировках фуросемида от 0,5 до 2 мг/кг, затем в области высоких доз наблюдается дальнейшее медленное нарастание выделения этих ионов. Зависимость экскреции ионов калия от дозы фуросемида отличается от экскреции натрия. Кривая имеет один порог насыщения, который достигается в области доз от 1,5 до 5,0 мг/кг, а в области более высоких доз экскреция ионов калия остается неизменной. Экскреция ионов хлора пропорциональна суммарной экскреции ионов калия и натрия, что характерно для всего семейства катион-хлорных транспортеров, осуществляющих электронейтральный транспорт, с характерной им стехиометрией.

выводы

1.Разработанная технология проектирования лекарственного вещества и определения величины его специфической активности дает возможность заменить скрининг и ряд других методов целенаправленным созданием высокоактивных и селективных мочегонных средств. Спроектированное и синтезированное новое мочегонное средство 4-хлоро-2-((5-иодофуран)метиламино)-5-сулфамилбензойная кислота обладает заявленными лучшими фармакологическими характеристиками.

2.Фуросемид образует прочные водородные связи с серином, треонином, гистидином, аспарагиновой и глутаминовой кислотами целевого белка-мишени, что, при максимальном числе связей, определяет 55% аффинитета препарата. Целевые белки-мишени семейства катион-хлорных транспортеров в экстрацеллюлярной части молекулы только во 2,3 и 4 суперфициальных петлях могут образовывать комплексы «лиганд-белок» посредством водородной связи с глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Эти сегменты способны участвовать в гидрофобном взаимодействии и максимально реализовать возможности молекулы фуросемида.

3. Гидрофобный сегмент молекулы фуросемида в значительной мере определяет фармакологическую активность препарата, добавляя к аффинитету полярных сегментов до 45% эффекта. Рациональное увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы практически удваивает его диуретическую и салуретическую активность, не меняя селективность препарата в отношении основной целевой мишени.

4. Среди полярных функциональных групп диуретика увеличивать прочность комплекса с белком-мишенью способна только карбоксильная группа. Аминогруппа дезактивирована в результате стерического фактора, обусловленного наличием фуранового кольца. Атом водорода аминогруппы задействован в образовании прочной внутримолекулярной связи. Сульфаниламидная группа выполняет функцию только гидрофильного ключевого фрагмента, увеличивая селективность молекулы.

5. Диуретическая активность фуросемида в значительной мере обусловлена наличием в его электронном строении карбоксильной группы. Только эта группа обеспечивает прочность комплекса с кати он-хлорными транспортерами, образуя водородные связи с глутаминовой и аспарагиновой кислотами целевых белков-мишеней. Замещение активного атома водорода в этой группе на гидрофобный радикал различной величины приводит к полной потере диуретической и салуретической активности. Остальные полярные группы определяют только селективность молекулы и растворимость в воде.

6. Пространственное строение фуросемида в значительной степени зависит от наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Разрыв этой связи приводит к существенным изменениям его геометрии и полной потере мочегонной активности при сохранении максимального аффинитета диуретика к белковым мишеням.

7. Диуретическая и салуретическая активность фуросемида прямо зависит от величины pH мочи. Высокой мочегонной активностью обладает только молекулярная форма диуретика. С повышением кислотности мочи увеличивается мочегонная активность препарата, что позволяет существенно снизить дозу препарата и выраженность его побочных эффектов.

8. Максимальный аффинитет к целевым белкам-мишеням группы катион-хлорных транспортеров у фуросемида к NKCC, средний к подгруппе КСС, самый низкий к NCC.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Термодинамические основы фармакодинамики. Томск, 2005. - 92 с. (в соавт. A.A. Бондарев, В.В. Удут)

2. Уравнение состояния лекарственного вещества в организме // Биомедицина. - 2006. - № 2. - С.71-74. (в соавт. A.A. Бондарев, В.В. Удут)

3. Оценка энергии взаимодействия некоторых функциональных групп лекарственных веществ с белковыми молекулами в водной среде // Известия ТПУ. - 2006. - Т.309, № 4. - С.101-104. (в соавт. A.A. Бондарев)

4. Новые возможности вольтамперометрического определения фармацевтических препаратов на органо-модифицированных электродах // Сиб. мед. журн. - 2009. - № 2. - С. 21-24. (в соавт. П.Б. Слепченко, O.A. Мартынюк, П.С. Постников и др.)

5. Взаимосвязь адсорбционных свойств фуросемида и йод-фуросемида с их диуретической и салуретической активностью // Сиб. мед. журн. - 2010. - Т. 25. - № 4. -С.119-123. (в соавт. A.A. Бондарев, В.М. Брюханов, П.С. Постников и др.)

6. Вольтамперометрическое определение фуросемида в биологических жидкостях // Судебная медицина. - 2010. - № 3. - С.56-62. (в соавт. O.A. Мартынюк, П.С. Постников, A.A. Бондарев)

7. Диуретическая активность фуросемида у крыс на фоне применения лечебно-столовых минеральных вод с различной кислотностью // Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 2. - С. 56-59. (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, Я.Ф. Зверев)

8. Квантово-химический расчет комплексообразования кверцетина в водной среде с анилином, бензоат-ионом и нитробензолом // Известия ТПУ. -2010. - Т. 317, № 3. - С. 134-136. (в соавт. A.A., Бондарев, П.С. Постников, М.Е. Трусова и др.)

9. Подкисление мочи как фактор, повышающий диуретическую и салуретическую активность фуросемида у крыс // Нефрология. - 2010. - Т.14, №1. - С.77-80. (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, Я.Ф. Зверев)

10. Сравнительное исследование диуретической и салуретической активности фуросемида и йод-фуросемида в эксперименте на крысах // Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 1. - С. 73-76. (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, Я.Ф. Зверев и др.)

11. Влияние арбутина и гидрохинона на процессы свободно-радикального окисления в крови крыс // Биомедицина. - 2011. - №1. - С.41-49. (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, О.С. Талалаева и др.)

12. Термодинамический спектр взаимодействия фуросемида с белковыми молекулами в водной среде // Биомедицина. - 2011. - №1. - С.50-58. (в соавт. A.A. Бондарев, П.С. Постников, В.Д. Филимонов и др.)

13. Фармакодинамические эффекты взаимовлияния веществ // Биомедицина. - 2011. - №1. - С.59-63. (в соавт. A.A. Бондарев, В.В. Удут, В.Н. Каркищенко)

14. К механизму диуретической активности фуросемида. Роль гидрофобного сегмента молекулы // Сиб. мед. журн. - 2011. - Т. 26. - №1. -С. 123-126. (в соавт. A.A. Бондарев, В.М., Брюханов, A.A. Бондарев и др.)

15. Активность фуросемида при различных значениях pH мочи у крыс // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 37. - №3. -С.47. (в соавт. НЛ. Волобой, A.A. Бондарев, O.A. Еремин и др.)

16. Влияние карбоксильной группы в структуре фуросемида на его диуретическую активность, геометрию и электронное строение // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 37. - №3. - С.23-24. (в соавт. A.A. Бондарев, П.С. Постников, В.Д. Филимонов и др.)

17. Патент № 2416404. Российская Федерация. Средство, обладающее мочегонной . активностью (РФ). - 05.10.2009 (в соавт. A.A. Бондарев, П.С. Постников, В.Д. Филимонов и др.)

18. О роли карбоксильной группы в молекуле фуросемида // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. -Т.7, ч. 2. - С. 1953 (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, П.С. Постников и др.)

19. Классификация биологически активных веществ в зависимости от активности и селективности И Материалы Всерос. науч.-практ. конф. "Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения. - Томск, 2006. - С. 303-307. (в соавт. A.A. Бондарев)

20. Фармакодинамика сложных многокомпонентных лекарственных средств // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. "Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения". - Томск, 2006. - С. 57-60. (в соавт. A.A. Бондарев)

21. Диуретическая активность фуросемида на фоне применения аскорбиновой кислоты // Создание новых лекарственных препаратов: материалы конф. - Томск: Из-во Том. Ун-та, 2007. - С. 74-75. (в соавт. В.М. Брюханов, A.A. Бондарев, С.А. Бокало, В.В. Удут)

22. Исследование механизмов диуретической активности фуросемида и синтез его новых производных // Материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2007. - С.230. (в соавт. П.С. Постников, A.A. Бондарев, В.Д. Филимонов и др.)

23. Исследование влияния модификации аминогруппы фуросемида на диуретическую активность с применением экспериментальных и теоретических методов // Создание новых лекарственных препаратов: материалы конф. -

Томск: Из-во Том. Ун-та, 2007. - С. 76-78. (в соавт. П.С. Постников, А.А. Бопдарев, В. Д. Филимонов)

24. Спектры взаимодействия лекарственного вещества с белковым субстратом в водной среде // Материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2007. - С.219. (в соавт. А.А. Бондарев)

25. Оценка энергии взаимодействия функциональных групп фуросемида И Создание новых лекарственных препаратов: материалы конф. - Томск: Из-во Том. Ун-та, 2007. - С. 118-120. (в соавт. А.А. Бондарев, В.В. Удут)

26. Фуросемид - зависимость «доза-эффект» // Материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2007. - С.219. (в соавт. В.М. Брюханов, А.А. Бондарев)

27. Экспериментальное и теоретическое изучение механизма диуретической активности фуросемида // Фармакология - практическому здравоохранению: материалы. Ш съезда фармакологов России. - СПб., 2007. -С. 1622. (в соавт. В.М. Брюханов, А.А. Бондарев, П.С. Постников и др.)

28. Зависимость мочегонного действия фуросемида от рН первичной мочи у крыс // VI Сибирский физиологический съезд: тез. докл. - Барнаул, 2008. - Т. 1. - С. 134. (в соавт. В.М. Брюханов, А.А. Бондарев)

29. Термодинамический спектр взаимодействия буметанида с белковыми молекулами в водной среде // Материалы I Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс». - Барнаул, 2011. - С. 15. (в соавт. А.А. Бондарев, О.А. Еремин, В.В. Удут)

30. The substitute mechanism for drug interaction and albuminous molecules // 4-th International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs". - M„ 2006. - P. 138. (co-author A.A. Bondarev)

31. The equation of a medicinal substance condition in an organism U 4-th International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs". - M., 2006. - P. 95. (co-author A.A. Bondarev)

32. Experimental and theoretical investigation mechanisms diuretical activities of furosemide and its derived // International conference "Chemistry, chemical engineering and biotechnology". - Tomsk, 2006. - P. 101-105. . (co-authors A.A Bondarev, P.S. Postnikov et al.)

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМК - аминокислота;

БА - биологическая активность;

БАВ - биологически активное вещество;

БД - база данных;

БС - биосубстрат;

КХМ - квантово-химический метод;

КХТ - катион-хлорный транспортер;

JIC - лекарственные средства;

МД - молекулярный дескриптор;

ПБА - прогнозирование биологической активности;

ПЭМ - полуэмпирические методы расчета;

ТМ - трансмембранный домен;

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс.

Asp - аспарагиновая кислота

DFT - метод функционала плотности;

Glu - глутаминовая кислота

His - гистидин

NKCC - натрий-калий-хлорный транспортер; NCC - натрий-хлорный транспортер; КСС - калий-хлорный транспортер; Ser - серин

SF - суперфициальная петля; Thr - треонин AG - энергия Гиббса;

Смирнов Иван Владимирович

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ЭЛЕКТРОННОГО СТРОЕНИЯ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРИМЕРЕ ПРОИЗВОДНЫХ СУЛЬФОНИЛБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ

Автореф. дисс. на соискание учёной степени доктора медицинских наук.

Подписано в печать 21.11.2011 Заказ № 753 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 2,3. Тираж 100 экз.

Отпечатано в Типографии «ПРИНТ-технология» г. Барнаул, Чкалова, 21

Актуальность проблемы.

За последние годы достигнуты определенные успехи в области создания принципиально новых лекарственных веществ с новым механизмом действия, имеющих свою терапевтическую нишу и открывающих новые возможности в лечение тех или иных заболеваний. Однако поиск новых высоко активных и селективных лекарственных веществ и разработка принципов их проектирования по-прежнему остается одной из наиболее актуальных задач современной фармацевтической и фармакологической науки [128,81]. А в последние годы сформулированы стратегические цели правительства РФ в области производства отечественных лекарств (Путин В.В., 2009).

В настоящее время в создании новых лекарственных средств основную роль играют фундаментальные исследования. Они касаются не только химических проблем (теоретической химии, физической химии, технологии органического синтеза и др.), но и сугубо биологических. Успехи молекулярной биологии, молекулярной фармакологии, генетики и других медико-биологических дисциплин стали существенным образом влиять на такой важный аспект фармакологии, как создание препаратов [39,40,295,296,292,232].

Известно, что механизм действия, фармакологическая активность и селективность лекарственного вещества напрямую связаны с его химическим, т.е. электронным строением. Молекулярный механизм действия большинства лекарственных веществ заключается в физико-химическом взаимодействии их с биологическими мишенями [143,139,140].

Ранее предпринималось большое число попыток объяснить роль той или иной функциональной группы молекулы действующего вещества в обеспечении его фармакологической активности. Для этого было организовано много проектов по предсказанию биологической активности основанные как на статистическом анализе частоты встречаемости функциональных групп (PASS) [102,14], так и на соответствии определенного набора физико-химических дескрипторов вещества наблюдаемым фармакологическим эффектам при его действии (MATRIX) [98,99,100]. Помимо этого для объяснения активности широко использовалось трехмерное подобие пространственного строения мишени и лиганда, основанное на принципе «ключа и замка» [227,170,265,215]. Однако, все же пока еще остаются непонятными глубинные механизмы биологической активности множества действующих веществ. В связи с этим, разработка новых методов, технологий проектирования и оценки биологической активности высокоактивных и высокоселективных лекарственных веществ, а так же поиск закономерностей взаимосвязи «структура-активность», основанных на данных электронного и пространственного строения молекулы лекарства являются актуальными и практически значимыми.

Детальное изучение сложных механизмов действия диуретических средств позволило в короткие сроки создать и внедрить в клиническую практику большое число мочегонных препаратов с различными механизмами действия. Однако, современные диуретики пока не отвечают всем требованиям врачей-клиницистов к этой группе лекарственных средств. До сих пор частыми осложнениями диуретической терапии остаются гипокалиемия, гиперурикемия, обратимое ухудшение слуха и другие [16,37,33].

Учитывая широкое применение мочегонных средств в клинической практике, представляется важным исследовать отдельные стороны механизма действия и некоторых закономерностей фармакологической активности диуретических средств, связанных с их электронным строением. Наиболее интересным объектом исследования представляется производное сульфонилбензойной кислоты - фуросемид. В группе петлевых диуретиков он по праву является «структурой-лидером» [86,87].

Этот препарат находит широкое применение в лечении гипертонической болезни, сердечной недостаточности, нефротического синдрома, цирроза печени и многих других заболеваний, являясь сегодня популярнейшим представителем группы мочегонных средств [34,52,36,51].

Достижения последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии пролили свет на клеточные механизмы действия многих современных диуретиков. Стало известно, что многие из них прямо взаимодействуют с высокоспециализированными ионными каналами и котранспортерами, в изучении топологии и функциональной роли которых также сделан большой шаг вперед [244,267,268,187].

Учитывая то обстоятельство, что среди современных мочегонных средств нет оригинальных отечественных препаратов, работы по углубленному изучению закономерностей фармакологической активности этой группы лекарственных веществ с целью разработки новых, более отвечающих требованиям клиницистов являются весьма актуальными и практически важными. Данная работа посвящена разработке технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности и исследованию особенностей молекулярного механизма действия лекарственного вещества с помощью компьютерного моделирования, поиску взаимосвязи его электронного строения и фармакологической активности в эксперименте, а также созданию на основе полученных данных нового диуретика с заданной мочегонной активностью. В качестве соединения-лидера использован фуросемид, в структуре которого при модификации теоретически обоснованно усиливали или ослабляли целевые свойства.

Цель исследования:

Разработать и апробировать новую технологию проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности по результатам расчетов пространственного и электронного строения молекулы действующего вещества с оценкой роли основных функциональных групп и ключевых фрагментов. На примере производных сульфонилбензойной кислоты в эксперименте изучить расчетные изменения фармакологической активности спроектированных молекул.

Основные задачи исследования.

1. Разработать технологию определения величины специфической активности лекарственного вещества на основе модели «заместительного механизма» комплексообразования органических лигандов с белковыми мишенями в водной среде.

2. Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы фуросемида и оценить константы прочности связи с целевыми белками-мишенями, рассчитать термодинамический спектр его активности. Определить ключевые дозы, при которых происходит насыщение основной целевой мишени.

3. Провести структурный анализ катион-хлорных транспортеров, оценив первичные структуры этих белков с учетом влияния специфической сольватации на ключевые функциональные группы. Определить возможные точки взаимодействия фуросемида и ключевых фрагментов белков, рассчитать термодинамические параметры комплексообразования «лиганд-мишень».

4. Построить молекулярную модель комплесообразования диуретика с 1ЧКСС2-транспортером на основе полученных данных квантово-химических расчетов фуросемида и структурного анализа первичной структуры катион-хлорного транспортера.

5. Изучить свойства молекулы фуросемида при различных значениях рН среды и в эксперименте оценить его диуретическую и салуретическую активность на фоне различных значений кислотности мочи.

6. Оценить роль карбоксильной группы в структуре фуросемида в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

7. Изучить роль пространственного строения молекулы фуросемида, его геометрию и подвижность структуры в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

8. Изучить роль гидрофобного сегмента в обеспечении диуретической и салуретической активности фуросемида.

9. Спроектировать новое производное сульфонилбензойной кислоты с большей специфической активностью и сохранением селективности к целевой мишени.

Научная новизна работы. Основное значение работы заключается в разработке новой технологии проектирования лекарственных веществ и определения величины их специфической активности включающей возможность моделирования взаимодействий в системе «лиганд-мишень», количественно связанных с фармакологическими эффектами. А также в установлении взаимосвязи электронного и пространственного строения молекулы фуросемида с его фармакологической активностью, выявлении роли ключевых фрагментов молекулы в реализации его диуретической и салуретической активности.

В работе было использовано оригинальное авторское программное обеспечение.

Впервые детально показано различие в диуретической активности молекулярной и ионной форм фуросемида, а так же влияние на нее различных значений рН мочи. Установлено, что именно молекулярная форма диуретика обладает высокой мочегонной активностью.

Впервые показана ключевая роль карбоксильной группы в молекуле фуросемида в обеспечении прочности комплекса «лиганд-мишень» с катион-хлорным транспортером, что вносит основной вклад в диуретическую активность данного соединения.

Впервые показано, что геометрия молекулы фуросемида определяет активность препарата наряду с ключевыми функциональными группами. Изменение пространственного строения молекулы с разрывом внутримолекулярной водородной связи полностью лишает препарат диуретической активности.

Впервые установлено, что фурановый цикл в структуре фуросемида является ключевым гидрофобным сегментом, значительно определяющим активность и селективность молекулы диуретика.

Наряду с этим, выявленные закономерности позволили спроектировать и синтезировать новое производное сульфонилбензойной кислоты с большей диуретической и салуретической активностью, обладающее аналогичным механизмом действия.

Выполненная работа предлагает новую технологию для проектирования новых лекарственных веществ и оценки величины их специфической активности и расширяет фармакологическую характеристику фуросемида, показывая связь между химическим строением препарата и его биологическим действием, и несет информацию фундаментального характера. Эти данные существенно расширяют границы нашего понимания природы биологической активности не только изученного диуретика, но и, возможно, целого ряда лекарственных веществ и эндогенных лигандов, имеющих в своем электронном строении схожий с фуросемидом набор ключевых фрагментов.

Научно-практическая значимость работы. Практическая значимость работы определяется необходимостью разработки новых вычислительных технологий для целенаправленного синтеза лекарственных средств, а также широким применением фуросемида в клинической практике, а так же важностью электролитного транспорта в организме, в регуляцию которого вмешиваются петлевые диуретики.

С учетом того, что в работе на практике был применен новый подход к изучению зависимостей «структура-активность», основанный на расчете ключевых термодинамических параметров межмолекулярного взаимодействия лигандов и мишеней в водной среде, можно предположить перспективность применения разработанного метода для дальнейшего углубленного изучения существующих лекарственных веществ, предсказания биологической активности при проектировании новых лекарств, оценки активности при модификации лекарств с целью улучшения их фармакологических характеристик. Использованный в работе метод позволяет радикально изменить подход к разработке новых диуретиков, уменьшив число вариантов модификаций молекул и исключив потенциально неактивные структуры.

Проведенное сравнительное исследование активности фуросемида при различных значениях рН мочи указало на необходимость учитывать этот параметр у пациентов при назначении фуросемида и его аналогов и показало перспективу создания комбинированных средств этого препарата с веществами, способными подкислять мочу с целью модулирования активности диуретика. Такая комбинация позволяет не только снизить терапевтическую дозу препарата, а вместе с тем и выраженность побочных эффектов, но и использовать подкислитель для профилактики развития фосфатурии. Кроме того, появляется возможность объяснить ряд клинических наблюдений, касающихся различий в эффективности препарата с точки зрения выявленной зависимости его активности от рН мочи.

Спроектированное и синтезированное в ходе исследования новое производное сульфонилбензойной кислоты с улучшенными фармакологическими характеристиками свидетельствует о том, что предложенный оригинальный авторский алгоритм дает возможность отойти от господствующего до сегодняшнего дня метода тотального скрининга и вплотную подойти к целенаправленному проектированию и синтезу высокоактивных и селективных лекарственных веществ, что при дальнейшей разработке позволит значительно сократить стоимость исследований и сократить путь от набора соединений к целевому лекарственному препарату.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана и экспериментально обоснована новая оригинальная технология проектирования лекарственных веществ, основанная на расчете термодинамики взаимодействия молекул с белковыми мишенями, позволяющая целенаправленно создавать более активные и селективные БАВ.

2. Молекула фуросемида в своем электронном строении содержит несколько полярных функциональных групп, среди которых только карбоксильная группа способна увеличивать прочность комплекса с белковой мишенью посредством образования прочной водородной связи с глутаминовой или аспарагиновой кислотами. Остальные полярные группы способны определять только селективность препарата и поддерживать его растворимость в воде.

3. Все белки семейства катион-хорных транспортеров во 2, 3 и 4 суперфициальных петлях содержат глугаминовую и аспарагиновую кислоты, которые способны образовывать прочные комплексы с карбоксильной группой молекулярной формы фуросемида.

4. Пространственное строение фуросемида и его мочегонная активность в значительной степени зависит от наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы.

5. Диуретическая и салуретическая активность фуросемида прямо зависит от величины рН мочи. Только молекулярная форма фуросемида обладает значимой мочегонной активностью. Понижение значений рН мочи увеличивает концентрацию молекулярной формы диуретика в просвете канальца, что открывает перспективу применения фуросемида в комбинации с веществами, подкисляющими мочу. Это позволяет существенно снизить дозу препарата и выраженность его побочных эффектов.

6. Рациональное увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы фуросемида существенно увеличивает его диуретическую и салуретическую активность, не меняя при этом селективность препарата в отношении основной целевой мишени.

Материалы внедрения.

Результаты диссертационной работы включены в монографию A.A. Бондарева, И.В. Смирнова, В.В. У дут а «Термодинамические основы фармакодинамики».

Получен патент РФ на изобретение (№2416404) «Средство, обладающее мочегонным действием».

Результаты данного исследования внедрены в учебный процесс в ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет, в ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет в преподавании фармакологии, в ГБОУ ВПО Томский политехнический университет в преподавании органической химии и технологии органического синтеза.

Апробация материалов диссертационной работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на:

-VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005);

- президиуме СО РАМН (Новосибирск, 2006);

- 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006);

- Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006);

- международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология» (Томск, 2006);

- VIII конгрессе молодых ученых и специалистов. «Науки о человеке». (Томск, 2007);

- III съезде фармакологов России «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007);

- конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007);

- XI научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2009);

- научно-практической конференция посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (Барнаул, 2010);

- I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «СИБИРСКИЙ МЁДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС» (Барнаул, 2011);

- ежегодных научных семинарах кафедры органической химии и технологии органического синтеза ГОУ ВПО ТПУ (Томск, 2005-2011 гг.).

Связь задач исследований с проблемным планом медицинских наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Г'БОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» (№ гос. регистрации 01200600351).

Синтез производных сульфонилбензойной кислоты и доказательство их строения осуществлялись совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии и органической химии Национального исследовательского Томского политехнического университета под руководством д.х.н., профессора В.Д. Филимонова.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 32 научных работах, в том числе в 1 монографии, 1 патенте РФ на изобретение, 14 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 287 страницах (включая приложения) машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7 глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения результатов, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 145 отечественных и 158 иностранных источников и приложений. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 35 таблицами.

выводы

1. Разработанная технология проектирования лекарственного вещества и определения величины его специфической активности дает возможность заменить скрининг и ряд других методов целенаправленным созданием высокоактивных и селективных мочегонных средств. Спроектированное и синтезированное новое мочегонное средство 4-хлоро-2-((5-иодофуран)метиламино)-5-сулфамилбензойная кислота обладает заявленными лучшими фармакологическими характеристиками.

2. Фуросемид образует прочные водородные связи с серином, треонином, гистидином, аспарагиновой и глутаминовой кислотами целевого белка-мишени, что, при максимальном числе связей, определяет 55% аффинитета препарата. Целевые белки-мишени семейства катион-хлорных транспортеров в экстрацеллюлярной части молекулы только во 2,3 и 4 суперфициальных петлях могут образовывать комплексы «лиганд-белок» посредством водородной связи с глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Эти сегменты способны участвовать в гидрофобном взаимодействии и максимально реализовать возможности молекулы фуросемида.

3. Гидрофобный сегмент молекулы фуросемида в значительной мере определяет фармакологическую активность препарата, добавляя к аффинитету полярных сегментов до 45% эффекта. Рациональное увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы практически удваивает его диуретическую и салуретическую активность, не меняя селективность препарата в отношении основной целевой мишени.

4. Среди полярных функциональных групп диуретика увеличивать прочность комплекса с белком-мишенью способна только карбоксильная группа. Аминогруппа дезактивирована в результате стерического фактора, обусловленного наличием фуранового кольца. Атом водорода аминогруппы задействован в образовании прочной внутримолекулярной связи.

Сульфаниламидная группа выполняет функцию только гидрофильного ключевого фрагмента, увеличивая селективность молекулы.

5. Диуретическая активность фуросемида в значительной мере обусловлена наличием в его электронном строении карбоксильной группы. Только эта группа обеспечивает прочность комплекса с катион-хлорными транспортерами, образуя водородные связи с глутаминовой и аспарагиновой кислотами целевых белков-мишеней. Замещение активного атома водорода в этой группе на гидрофобный радикал различной величины приводит к полной потере диуретической и салуретической активности. Остальные полярные группы определяют только селективность молекулы и растворимость в воде.

6. Пространственное строение фуросемида в значительной степени зависит от наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Разрыв этой связи приводит к существенным изменениям его геометрии и полной потере мочегонной активности при сохранении максимального аффинитета диуретика к белковым мишеням.

7. Диуретическая и салуретическая активность фуросемида прямо зависит от величины рН мочи. Высокой мочегонной активностью обладает только молекулярная форма диуретика. С повышением кислотности мочи увеличивается мочегонная активность препарата, что позволяет существенно снизить дозу препарата и выраженность его побочных эффектов.

8. Максимальный аффинитет к целевым белкам-мишеням группы катион-хлорных транспортеров у фуросемида к ЫКСС, средний к подгруппе КСС, самый низкий к 1ЧСС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

По результатам диссертационной работы предложены практические рекомендации:

1. Полученные теоретические и экспериментальные результаты рекомендуется учитывать при разработке новых диуретических веществ, обладающих более выгодными фармакологическими характеристиками, чем существующие соединения. В частности, перспективно изменение кислотности карбоксильной группы в молекуле производных сульфанилбензойной кислоты, так чтобы интервал рН перехода в молекулярную форму был в диапазоне 5,5-5,8; рационально увеличение площади гидрофобного сегмента молекулы и введение в структуру полярной группы, повышающей прочность комплекса с белком; для повышения селективности к ЫКСС2 транспортеру целесообразно добавление полярной группы.

2. Для модулирования мочегонной активности фуросемида целесообразно использование его совместно с подкислителями мочи, что позволит снизить требуемую дозировку и выраженность побочных эффектов. Назначая в клинической практике фуросемид, рекомендуется учитывать зависимость его активности от рН мочи пациентов.