Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Новые подходы к лечению экспериментальных огнестрельных ран мягких тканей (экспериментальное исследование)

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственный научный центр лазерной медицины

На правах рукописи РГБ ОД

МУРШУДЛИ РАШАД ЧИНГИЗ ОГЛЫ 1 5 та 2002

Новые подходы к лечению экспериментальных огнестрельных ран мягких тканей

(Экспериментальное исследование)

14.00.27 - хирургия 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2002

Работа выполнена в Государственном научном центре лазерной медицины МЗ РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Александр Владимирович Гейниц

Доктор медицинских наук, профессор Геннадий Николаевич Берченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Владимир Ильич Корепанов

доктор медицинских наук, профессс Владимир Павлович Туманов

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится

2002 г. в 1400 часов I

заседании Диссертационного Совета К20#. 022.01 Государственно! научного центра лазерной медицины МЗ РФ по адресу: 121165, г. Москва, ул. Студенческая, 40

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственно! научного центра лазерной медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан

СС »

2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

РА

Г)

Андрей Анатольевич Акимов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что современные теории )аневого процесса отводят свободнорадикальному перекисному жислению роль фундаментальной молекулярной основы заживления )ан, особенно огнестрельных (П.И.Толстых и соавт., 2001; ".Н.Берченко и соавт., 2001). Основным субстратом ;вободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов шляются ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав [юсфолиггидов клеточных мембран и мембран субклеточных )рганелл, липопротеидов плазмы крови (Г.Я.Дубур и соавт., 1981; С.М.Дюмаев и соавт., 1981; Banghan et. al., 1965).

В физиологических условиях продукты свободнорадикального жисления участвуют в регуляции состава биомембран и гроницаемости последних, а также скорости пролиферации клеток Е.Б.Бурлакова и соавт., 1984; А.М.Герасимов, 1985; Grisham,1994). Убыточное накопление гидроперекисей жирных кислот ингибирует интез белка, блокирует функцию макрофагов, изменяет их :емотаксическую и ферментную активность. Их избыток может виться причиной дезинтеграции клеточных мембран и мембран убклеточных органелл, инактивации тиоловых ферментов и других ¡елков, что в свою очередь приведет к нарушению функциональной ктивности клеток (Н.М.Эмануэль, 1979, 1986; Е.Б.Бурлакова, 1984; lalliwell, 1994). Свободные радикалы могут изменять конформацию елка, увеличивать его чувствительность к протеолизу, а также овреждать молекулу ДНК, включая ее фрагментацию (Hinder, 1991; lalliwell, 1994). Проявлению повреждающего действия продуктов вободнорадикального окисления препятствует сложная [ногокомпонентная антиоксидантная система, которая обеспечивает х связывание и модификацию, тем самым предупреждая или силивая разрушение перекисей.

Согласно современным представлениям, в основе равматических повреждений, в том числе и мышечной ткани, лежит бразование и накопление в тканях свободных радикалов кислорода Kaufman, 1989; Hinder, 1991). Это позволило с принципиально новых озиций рассмотреть процессы формирования огнестрельной раны и аметить совершенно новые пути терапии этих повреждений. В вязи с этим, в последнее время при огнестрельных ранах с целью эсстановления жизнеспособности тканей, нормализации етаболических процессов и функций мембран, повышения

устойчивости к гипоксии, рекомендуется применение аптиоксидантов (Ю.Г.Шапошников, 1986).

Ранее был известен положительный эффект влияния аптиоксидантов на предупреждение развития инфекции и заживление гнойных и огнестрельных ран, ожогов, трофических язв (М.Ф.Камаев, 1975; В.К.Сологуб и соавт., 1979; Hinder, 1991; Halliwell, 1994).

Под влиянием аптиоксидантов у экспериментальных животных с огнестрельной раной наблюдается уменьшение распадающихся полиморфноядерных лейкоцитов и увеличение нейтрофильных лейкоцитов с Шик-положительными зернами гликогена, наступает активизация фибробластической реакции. Наиболее активно этот процесс протекает в глубине зоны коммоции, вблизи сосудистых элементов, причем наиболее выраженная пролиферация фибробластов отмечается при использовании эпигида и, особенно, дибунола (Г.Н.Берченко, 1997).

Однако, исследования последних лет показали, что водорастворимые антиоксиданты в лечении более эффективны, чем гидрофобные (С.Н.Чукаев, 1999), которые, к сожалению, в клинической практике применяются редко, что может быть связано с их дефицитом (Г.И.Клебанов и соавт., 2000). В связи с чем в настоящее время проводится широкий поиск и тестирование свойств и активности новых классов ингибиторов свободнорадикальных реакций и их композиций (Ю.В.Климов, 2000; М.П.Толстых, 2002). Примером таких композиций является мексидол, мексидол и трипсин, металлокомплекс меди (Си-ТРИС), антиоксидантные.в том числе и антибактериальные свойства которых до настоящего времени не изучались и для лечения огнестрельных ран не использовались.

Цель исследования - улучшить результаты лечения огнестрельных ран путем применения нативных и иммобилизованных на текстильных носителях водорастворимых антиоксидантов и металлокомплекса меди.

Задачи исследования:

1. Изучить in vitro антимикробную активность мексидола и текстильного металлохелата - дальцекс-трипсин-медь;

2. Дать сравнительную оценку с помощью разных модельных систем окисления антиоксидантной активности мексидола и хелатного комплекса меди;

3. Экспериментально изучить влияние антиоксиданта мексидола, дальцекс-трипсин-мексидола и текстильного металлохелатного раневого покрытия дальцекс-трипсин-медь на течение раневого процесса и дать сравнительную оценку их эффективности в лечении огнестрельных ран конечностей по морфологическим данным и лазерной доплеровской флоуметрии.

Научная новизна. Впервые изучен механизм антиокислительной активности мексидола и комплексированных ионов меди в отдельности и в их смеси и при этом установлено:

- мексидол является ингибитором свободнорадикальных реакций пероксидации липидов за счет его способности к перехвату свободных радикалов как в водной, так и гидрофобной фазах мембран и липопротеидов;

- комплектованные ионы меди эффективно ингибируют перекисное окисление липидов мембран липосом, а в смеси с мексидолом эффективность ингибирования перекисного окисления липидов возрастает за счет независимого суммирования влияний компонентов смеси;

- доказано, что мексидол и комплексированные ионы меди с трипсином обладают выраженной антимикробной активностью по отношению к большинству музейных (S.Aureus-209, E.Coli-125, Cl.Perfringer-235) и клиническим (S.Aureus, S.Epidermidis, E.Coli, P.Aeroginosa) штаммов микроорганизмов в том числе и 50% штаммов грибков Candida;

- установлено, что парентеральное применение мексидола и местное использование биологически активных раневых покрытий (мексидола с трипсином и комплексированных ионов меди) ограничивают расширение вторичного некроза, способствуют очищению огнестрельных ран от микробной обсемененности и раневого детрита.

Впервые в эксперименте на основе результатов гистологических, гистохимических, микробиологических методов исследования и данных компьютеризированной лазерной доплеровской флоуметрии изучено влияние водорастворимого антиоксиданта мексидола и комплексированных ионов меди с трипсином на течение раневого процесса у крыс и собак с огнестрельными ранами.

Практическая значимость работы. Экспериментально разработано и обосновано с помощью микробиологических,

патофизиологических (лазерная доплеровская флоуметрия), морфологических (гистологический и гистохимический) методов исследований с учетом фаз раневого процесса применение водорастворимого антиоксиданта мексидола и комплексированных ионов меди с трипсином для стимуляции репаративной регенерации огнестрельных ран. Предложенный способ позволяет корректировать тактику и методы лечения животных с огнестрельными ранениями на ранних стадиях (1-3 часа) развития раневого процесса.

Апробация работы. Апробация работы проведена на заседании экспериментального и клинического отделов ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ. Основные положения диссертации доложены на Ученом Совете ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ.

Объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав, посвященных изложению материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 16 рисунками. Указатель литературы содержит ссылки на 78 отечественных и 34 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на 16 беспородных собаках обоего пола массой 10-12 кг и 100 крысах-самцах, массой 120±10 г. В качестве носителя мексидола, металлокомплекса меди использовали перевязочное средство на основе диальдегидцеллюлозы (ДАЦ).

Модель получения инфицированной огнестрельной раны мягких тканей. Моделью боевой травмы служили инфицированные огнестрельные раны мягких тканей. Ранения наносились на внутренней поверхности верхней трети правого бедра животных: собакам - из пистолета Макарова (калибр 9 мм), а крысам - из пистолета Марголина (калибр 5,6 мм), с дистанции 3 метра. Начальная скорость полета пуль составляла 850 и 320 м/сек, соответственно. Стандартное инфицирование раневого канала осуществляли следующим образом: в чашку Петри или целлофановый пакет помещали ровную круглую губку из поролона толщиной 1 см и диаметром 2 см, предварительно

простерилизованную и высушенную в термостате. Перед опытом губку заливали микробной взвесью (нагрузка и состав тест-микробов определялась в соответствии с задачами эксперимента). Путем выстригания и бритья волосяной покров наружной поверхности правого бедра животного удалялся, а кожа обрабатывалась стандартным дезинфектантом (йодпирон). С помощью липкого пластыря губку с микробной взвесью прикрепляли на место предполагаемого входного отверстия огнестрельной раны. Затем производили выстрел. Пуля, проходя через поролоновую ткань, обуславливала занос в рану не только микроорганизмов, но и частиц губки. Такая методика обеспечивала получение модели боевой травмы, аналогичной реальной огнестрельной ране (А.Н.Шальнев, 1996).

Общая характеристика экспериментального материала.

Лечебные манипуляции в ранах, которые начинали в течение часа после повреждения, включали: рассечение травматического дефекта на всю глубину раневого канала, удаление видимых обрывков мягких тканей и обработку раневой поверхности растворами антисептиков. Операцию заканчивали наложением перевязочного средства. Особенности заживления экспериментальных огнестрельных ран у собак изучали с помощью клинического и микробиологического методов исследования.

Влияние мексидола на заживление огнестрельных ран изучено на 16 собаках, разделенных на 4 группы, по 4 собаки в каждой. Распределение собак по группам в зависимости от метода применения мексидола представлено в таблице 1.

Огнестрельные раны собак контрольной группы, как видно из таблицы 1, лечили перевязочными средствами с антисептиками и мазевыми повязками. Комплекс лечебных мероприятий 1-ой опытной группы, помимо традиционного метода, дополнялся внутримышечными (в/м) инъекциями водного раствора мексидола [по 0,25 мг/кг веса в течение 10 дней ежедневно). Местное лечение ран животных 2-ой группы осуществляли путем использования перевязочного средства ДАЦ, имобилизованного лекарственным фармакологическим комплексом трипсин-мексидол (ДАЦ-ТМ). 3-ю группу животных лечили комплексным применением в/м инъекций мексидола и местным использованием перевязочного средства ДАЦ-ГМ. (Экспериментальные исследования на собаках и крысах были

крысах были проведены совместно с профессором В.К.Проманенко, Е.Ф.Шином, М.П.Толстых, В.М.Мельниченко.)

Таблица 1.

Распределение собак по группам в зависимости от метода применения мексидола

№ п/п Методы применения мексидола Количество собак

1 Традиционное лечение (перевязочные средства с антисептиками и мазевыми повязками) 4

2 Традиционное лечение + внутримышечные инъекции мексидола (по 0,25 мг/кг в течение 10 дней) -1 опытная группа 4

3 Местно ДАЦ-трипсин-мексидол до очищения раны от раневого детрита - 2 опытная группа 4

4 Внутримышечные инъекции мексидола по 0,25 мг/кг веса в течение 15 дней + местно ДАЦ-трипсин-мексидол -3 опытная группа 4

С целью определения эффективности влияния на заживление огнестрельных ран иммобилизованного металлокомплекса на основе меди, были проведены эксперименты на 100 беспородных крысах-самцах, разделенных: на 4 группы (по 25 животных в каждой). Распределение крыс по группам в зависимости от метода лечения представлено в таблице 2.

Таблица 2.

Распределение крыс по группам в зависимости от метода лечения

№ п/п Распределение крыс по группам в зависимости от метода лечения Количество животных

1 Контрольная группа 25

2 Первая опытная группа (ДАЦ-трипсин) 25

3 Вторая опытная группа (ТРИС-медь) 25

4 Третья опытная группа ДАЦ-трипсин медь (ДАЦ-ТСи) 25

В течение часа после огнестрельного повреждения в раневой канал вводили: в контрольной группе животных - ДАЦ-повязки, смоченные 0,9% раствором хлорида натрия; в 1 опытной группе -ДАЦ-повязки с иммобилизованным трипсином; во 2 опытной группе

- ДАЦ-повязки с иммобилизованным металлокомплексом меди (перевязочное средство ТРИС-медь); в 3 опытной группе - ДАЦ-повязки с иммобилизованными трипсином и металлокомплексом меди (ДАЦ-ТСи).

Гистологические и гистохимические методы исследования

проводили после выведения из опыта крыс из огнестрельной раны на 3, 5, 8 и 12 сутки после ранения. Биопсийный материал фиксировался в жидкости Корнуа в течение 2 часов и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 микрон окрашивали гематоксилин-эозином, микрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна, импрегнировали серебром по Гомори для выявления аргирофильных структур. Использовали также гистохимические методы: окраска толуидиновым синим, выявление ппокозаминогликана и их комплексов с белками (протеингликаны), ПАС-реакция для выявления гликогена и гликопротеинов, реакция Браше для выявления РНК и реакция Фильгена для выявления ДНК в клетках. Гистологические и гистохимические исследования были выполнены под руководством д.м.н., профессора Г.Н.Берченко в центральном институте травматологии и ортопедии.

Лазерную допплеровскую флоуметрию проводили с использованием лазерного анализатора кровотока "ЛАКК-01" (НПП "ЛАЗМА", Москва) в комплексе с РС/АТ 486. В качестве прикладной программы применялась программа Ьакк-25, разработанная на основе Фурье-преобразования.

В качестве излучателя в приборе "ЛАКК-01" используется гелий-неоновый лазер типа ЛГИ-207Б с длиной волны 0,63 мкм. Мощность лазерного излучения на входе световодного кабеля составляет не более 0,3 мВт, что за время регистрации не могло оказать существенного влияния на уровень микроциркуляции в тканях.

Изучение микроциркуляции в экспериментальных огнестрельных ранах проводилось совместно с кандидатом медицинских наук Олегом Александровичем Терманом.

Антиоксидантные свойства мексидола и металлокомплекса (ТРИС-медь) изучали с помощью трех хемилюминесцентных модельных систем окисления: гомогенной системы, состоящей из гемоглобина, пероксида водорода и люминола (НЬ-Н202-ЛМ) (Г.И.Клебанов и соавт., 1999, 2001), гомогенной системы,

представляющей собой раствор азосоединения 2,2'-азобис (2-метилпрохшонамид) дигидрохлорида и люмшюла (АБАП-ЛМ) (Wayner et al., 1987), а также гетерогешюй системы - суспензии модельных мембран липосом (Г.И.Клебанов и соавт., 1998).

Антимикробная активность мексидола и металлокомплекса (ТРИС-медь) с трипсином, иммобилизованных на диальдегидцеллюлозе (текстильный металлохелат), проводилась по методам, рекомендованным Минздравом РФ: методу серийного разведения в бульоне или питательном агаре и методу диффузии в агар. Антимикробное действие мексидола и металлокомплекса (ТРИС-медь) определяли как по отношению к тест-микроорганизмам Staphylococcus aureus АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922, Candida ablicans АТСС 885-653, так и по отношению к госпитальным штаммам S. epidermidis, S.aureus, E.coli, Proteus spp., Streptococcus spp., P.aeruginosa, Candida.

Микробиологические исследования проводились совместно с А.Н.Памбукчаном, к.м.н. М.П.Толстых, старшим научным сотрудником института травматологии и ортопедии им. Н.Н.Пирогова, к.м.н. Г.Г.Окропидзе.

Антимикробную активность мексидола изучали в микробиологическом отделении института хирургии А.В.Вишневского совместно с к.м.н. Р.П.Тереховой.

Результаты экспериментальных исследований

Экспериментальные исследования in vitro показали, что в основе антиоксидантного действия мексидола лежит его способность ингибировать стадию инициации СРР перекисного окисления липидов, во многом обусловленную образованием активных форм кислорода и появлением каталитически активных ионов железа. Это обстоятельство позволяет нам рекомендовать применить мексидол как ингибитора СРР для лечения экспериментальной огнестрельной раны у собак. На тех же модельных системах, на которых изучались антиоксидантные свойства мексидола, изучены антиоксидантные свойства комплексированных ионов меди [Си(Трис2-Н)Н20]С1-Н20. Результаты этих исследований позволили выявить, что комплексированные ионы [Си(Трис2-Н)Н20]С1-Н20 являются эффективным ингибитором свободнорадикальных реакций, что также послужило основанием для использования их в качестве средства,

улучшающего течение раневого процесса у экспериментальных животных с огнестрельными ранами или в сочетании с мексидолом.

Результаты изучения антимикробной активности мексидола показали, что из 6 штаммов Streptococcus spp. и Staphylococcus aureus (каждый штамм высевался 10 раз) чувствительными к мексидолу оказались 4 (67%), Staphylococcus epidermidis - 5 (83%), Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus spp. - в 100%, Candida - 3 из 6 (50%).

Антибактериальные свойства нового раневого покрытия на основе дальцекс-трипсина [Си(Трис2-Н)Н20]С1-Н20 представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3 из 32 штаммов S. Aureus оказались чувствительными к дальцекс-трипсин + комплексированные ионы меди в 90,6%, к S. Epidermidis - 91,3%, к Р. Aeruginosa - 77,8%, к Enterobacter Spp. - 76,5%, к Proteus - 75%. К дальцекс-трипсйну и дальцекс-меди чувствительность микроорганизмов была в 9-10 раз ниже, чем к дальцекс-трипсин-комплексированные ионы меди.

Таблица 3.

Действие испытываемых материалов на клинические штаммы микроорганизмов

Микроорганизмы Испыт. штаммы ДТ Дмедь ДТмедь

Чувств. % Чувств. % Чувств. %

S. Aureus 32 4 12,5 15 46,9 29 90,6

S. Epidermidis 46 5 10,9 13 28,3 42 91,3

P. Aeruginosa 18 3 16,6 9 50 14 77,8

Enterobacter Spp. 17 2 11,8 8 47 13 76,5

Proteus 16 2 12,5 7 43,7 12 75

Для подтверждения полученных данных на твердых, средах был поставлен научный эксперимент, но уже в жидкой среде. Результаты этих исследований полностью совпадают с данными, полученными на твердых средах.

Таким образом, выраженные антиоксидантные и антибактериальные свойства мексидола и комплектованных ионов меди позволяют предполагать, что их применение для лечения огнестрельных ран будет патогенетически оправдано и эффективно.

Результаты лечения экспериментальных гнойных ран

Клиническое наблюдение показало, что раневой канал в мышечной ткани, в буквальном понимании этого слова, не определялся. Был виден только щелевидный дефект в местах входа и выхода ранящего снаряда, несколько смещенный относительно входного и выходного отверстий на коже. В течение ближайших минут после ранения хирургический зонд свободно проходил в раневой канал на всю его глубину. Однако в последующем, введение зонда становилось невозможным в связи с первичной и вторичной девиацией тканей. Возникавшее при ранении кровотечение самостоятельно останавливалось в течение 10 минут. После рассечения раневой канал представлялся в виде неравномерного по ширине линейного дефекта тканей с тусклыми стенками, заполненный кровянистыми сгустками. Признаки травматического отека выявлялись в течение 3 часов после обработки огнестрельных ран и в последующие сроки наблюдения нарастали во всех группах животных. Однако их выраженность была различной и зависела от применяемого метода лечения. У собак, леченных перевязочными средствами с иммобилизованными биологически активными веществами, исчезновение признаков воспаления тканей наблюдалось к 6-7 суткам лечения (таблица 4). В эти же сроки наблюдения раневые поверхности покрывались очагами грануляционной ткани бледно-розового цвета. В то же время, у животных контрольной группы отек и гиперемия тканей определялась до 9,4±1,5 суток, а очищение раневой поверхности от гнойно-некротических масс происходило не ранее 10-11 суток с момента начала лечения. Наибольшая эффективность комплексной терапии огнестрельной раны определялась в 3 опытной группе.

Ежедневные внутримышечные введения мексидола и местное использование перевязочного средства ДАЦ-ТМ позволило добиться заживления огнестрельных ран на 18 сутки после их нанесения. В 1 и 2 опытных группах заживление ран происходило на 18-20 сутки, а в контрольной группе животных - лишь к 23 суткам после огнестрельного ранения.

Таблица 4.

Динамика клинических проявлений заживления огнестрельных ран у собак

Группы собак Средние сроки (в сутках) (М±т)

Исчезновение признаков воспаления Очищение раны Появление грануляций Полное заживление раны

1 опытная 7,3±1,0 7,8±0,5 7,5±0,8 20±0,1

2 опытная 7,5±0,4 7,6±0,5 7,4±0,8 19,5±0,8

3 опытная 6,4±0,2 6,7±0,5 6,5+0,8 18+1,1

Контрольная 9,4+1,5 10,0+1,3 10,9+0,8 23,2+0,12

Данные бактериологического исследования также свидетельствовали о положительном влиянии внутримышечных инъекций мексидола (1 опытная группа животных) и перевязочного средства ДАЦ-ТМ (2 опытная группа) на течение раневого процесса но сравнению с традиционным методом лечения. На 3 сутки лечения уровень микробного обсеменения ран в 1-2 групп несколько превышал критический уровень и ^КОЕ (колониеобразующих единиц) находился в пределах 7-8 (КОЕ), а у собак 3 опытной группы ^КОЕ был 5-6. В то же время, у животных, леченных традиционным методом, 1§К0Е был > 9. К 5 суткам лечения наблюдалось снижение титра микробных тел во всех исследуемых группах животных. У всех собак опытных групп степень микробной обсемененности раневой поверхности не превышала критический уровень (105 КОЕ). Однако, у собак контрольной группы упомянутый бактериологический показатель был все еще достаточно высоким ()£КОЕ=8). На 7 сутки после нанесения огнестрельной раны и начала лечения у всех собак опытных групп ^КОЕ микробной обсемененности ран составлял 4 и далее не менялся. В то же время, у животных контрольной группы гитр микробных тел практически оставался на том же уровне, что и в предыдущий срок наблюдения (^КОЕ=7). Значимое уменьшение степени микробной обсемененности ран у перечисленных собак определялась только к 8-10 суткам лечения (1§КОЕ=4).

Таким образом, внутримышечные инъекции мексидола и трименение перевязочного средства ДАЦ-ТМ положительно влияют процессы репарации огнестрельных ран у собак. Лучшие результаты наблюдаются при одновременном парентеральном ¡ведении мексидола и местном использовании перевязочного

средства диальдегидцеллюлозы-трипсин-мексидола. Эффективность примененного метода лечения объясняется комплексным антиоксидантным и антибактериальным действием используемых материалов.

Изучение влияния комплексированных ионов меди и трипсина на модели гнойной раны у крыс показало, что исчезновение местных воспалительных явлений у крыс контрольной группы наблюдалось на 7,0±1,4, а заживление ран на 26,7±1,6 сутки с момента начала лечения (таблица 5).

Таблица 5.

Динамика клинических проявлений заживления огнестрельных ран у крыс

Группы крыс Средние сроки (в сутках) (М±га)

1 Исчезновение признаков воспаления Очищение ран от детрита Появление грануляций Полное заживление ран

Контрольная группа п=25 7,0 ±1,4 7,4 ± 0,6 7,2 ± 0,7 26,7 ± 1,6

1 опытная группа дальцекс-трипсин (ДАЦ-трипсин) 11=25 5,8 ± 1,3 р<0,05 6,0 ± 0,9 р<0,05 6,7 ± 0,3 р<0,05 23,3 ± 1,3 р<0,05

2 опытная группа купрум-трис (ТРИС-медь) п=25 5,1 ±1,5 р<0,01 5,5 ± 0,8 р<0,01 5,7 ± 0,6 р<0,01 23,0 ±1,4 р<0,01

3 опытная группа (ДАЦ-трипсин-медь) п=25 4,5 ± 1,2 р<0,01 4,8 ± 0,9 р<0,01 4,9 ± 0,7 р<0,01 19,6 ±1,6 р<0,01

При использовании перевязочного средства ДАЦ-трипсин упомянутые характеристики раневого процесса мало отличались от таковых крыс 2 опытной группы (лечение ДАЦ с иммобилизированным металлокомплексом меди). У животных 1-й опытной группы исчезновение местных воспалительных явлений и заживление ран наблюдалось на 5,1+1,5 и 23,0±1,4 сутки соответственно, во 2 опытной группе - на 5,8±1,3 и 23,3±1,3 соответственно. При использовании ДАЦ-трис-медь - на 4,5±1,2 и

19,6±1,6 сутки. Местное использование перевязочных средств ДАЦ-трипсин-медь и ДАЦ-Т обеспечивало более эффективное воздействие на раневой процесс. В этих группах крыс исчезновение воспалительных явлений и очищение ран, появление очагов грануляционной ткани и заживление ран наступало в более ранние сроки по сравнению с другими опытными и контрольной группами животных. Отличие показателей динамики заживления между контрольной и опытными группами было статистически достоверно (Р<0,05).

По данным экспериментально-морфологического исследования среди крыс с огнестрельными пулевыми ранениями наиболее эффективным положительным влиянием на заживление огнестрельных ран обладают повязки с иммобилизованными трипсином и металлокомгшексом меди (ДАЦ-трипсин-медь).

При использовании ДАЦ-трипсин-медь [Си(Трис2-Н)Н20]С1-Н20 наблюдается значительная активизация очищения огнестрельной раны от некротизированных тканей, масс фибрина и колоний микроорганизмов в зоне первичного раневого канала. В зоне сотрясения слабее выражены признаки расстройства системы микроциркуляторного русла, дистрофические и некротические процессы, что в конечном счете проявляется в уменьшении вторичного некротизирования поврежденной ткани этой зоны. В тоже время признаки репарации, в виде образования и созревания грануляционной ткани в области вторично некроза зоны сотрясения, развиваются более активно и в более ранние сроки. Можно предположить, что положительный эффект данной повязки при местном лечении огнестрельных ран мягких тканей основывается на сочетании антиоксидангных свойств металлокомплекса меди и некролитического влияния протеолитического фермента трипсина.

Параллельно с морфологическими исследованиями нами была проведена сравнительная оценка динамики изменения микроциркуляторного русла под воздействием нового раневого покрытия ДАЦ-трипсина + комплектованные ионы меди и контрольной группы, в которой раны покрывались ДАЦ-повязкой, смочешюй 0,9% раствором хлорида натрия. Динамика показателя микроциркуляции допплеровской флоуметрии при лечении экспериментальных огнестрельных ран у крыс представлена в таблице 6.

Таблица 6.

Динамика показателя микроциркуляции допплеровской флоуметрии при лечении экспериментальных огнестрельных ран у крыс

Группы животных ПМ до лечения ПМ 1 сутки ПМ 3 сутки ПМ 7 суток

Дальцекс-трипсин-медь п=15 12,9±1,01 6,4±1,4 7,8±0,8 12,3±0,94

Марлевая повязка, смоченная 0,9% раствором хлорида натрия п=15 12,9+1,01 р>0,5 4,6±1,2 р<0,01 4,6±1,9 р<0,01 10,9±0,95 р<0,05

Примечание: ПМ- показатель микроциркуляции.

Анализ результатов лазерной допплеровской флоуметрии в огнестрельных ранах (см. таблицу 6) показал, что после покрытия раны салфеткой дальцекс-трипсин-медь на первые сутки показатель микроциркуляции (ПМ) составил 6,4±1,4 перфузионных единиц (пер.ед.), а на 3 сутки до 7,8±0,8 пер.ед. На 7 сутки ПМ уже приблизился к исходному состоянию, т.е. 12,3±0,94 пер.ед. В контрольной группе эти цифры составили 4,6±1,2 пер.ед. на 1. сутки; 4,6±1,9 пер.ед. на 3 сутки и на 7 сутки - 10,9±0,95 пер.ед. и были достоверно меньше (р<0,05) аналогичных показателей основной группы.

Таблица 7.

Динамика амплитуды и частоты вазомоций допплеровской флоуметрии при лечении экспериментальных огнестрельных ран у крыс

Группы животных до лечения 1 сутки 3 сутки 7 сутки

Дальцекс- трипсин-медь п=15 6±0,01 А=0,19+0,03 Р=6,8±0,3 А=0,41+0,01 Р=4,4+0,8 А=0,48+0,05 Р=5±0,02 А=1,87+0,12

Марлевая повязка п=15 Р=6±0,2~ А=0,19+0,03" Р=6,2+0,01* А=0,13±0,01* Р=6±0,01* А=0,3+0,05* Р=6±0,01* А=0,32±0,03

Примечание: Б - частота вазомоций, А - амплитуда вазомоций.

(*=р<0,05;~ =р>0,05)

Динамика амплитуды и частоты вазомоций допплеровской флоуметрии при лечении экспериментальных огнестрельных ран у крыс отражена в таблице 7.

Амплитуда вазомоторных колебаний (А) кровотока в микроциркуляторном русле в основной группе животных составляла до лечения 0,19+0,03, на первые сутки лечения (через 24 часа от момента ранения) - 0,13±0,01, на третьи - 0,48±0,05 и на 7 сутки -1,87±0,12 в мин. В контрольной группе животных эти показатели были в 3,1 - 1,6, на 7 сутки в 5,8 раза меньше, чем в основной группе животных, леченных дальцекс-трипсин-медыо. Частота вазомоций (F) между основной и контрольной группами имела достоверное статистическое различие (р< 0,01).

Таким образом, изучение состояния микроциркуляции огнестрельных ран до и в процессе их местного лечения дальцекс-трипсин-медью полностью коррелируют с результатами морфологических исследований и объективно подтверждают, что применение антиоксидантов для лечения огнестрельных ран патогенетически обосновано и высокоэффективно.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения с помощью трех модельных систем окисления (суспензии фосфолипидньтх липосом, водного раствора гемоглобинпероксид, водорода-люмииол и водного раствора 2',2-азо-бис (2-метиламинопропан) 2НС1-люминал) механизма антиокислительной активности мексидола и комплексированных ионов меди установлено, что мексидол ингибирует акивные формы кислорода и хелатирует каталитически активные ионы Fe2+.

2. Результаты изучения антимикробной активности мексидола и комплексированных ионов меди, иммобилизованных на дальцекс-трипсине, позволили выявить их высокую антибактериальную активность по отношению к штаммам Streptococcus spp., Streptococcus aureus (от 67% до 90,6%), Staphylococcus epidermidis (от 83% до 91,3%), Escherichia coli, Proteus spp. (от 75% до 100%).

3. Огнестрельные пулевые раны мягких тканей животных, по данным морфологических исследований и лазерной допплеровской флоуметрии под влиянием гидрофильного антиоксиданта мексидола, применяемого парентерально и местно раневых покрытий с мексидолом и металлокомплексом меди более быстро, по сравнению с контрольной группой животных, очищаются от

раневого детрита и колоний микробов в зоне раневого канала. При этом средние сроки заживления огнестрельных ран у собак сокращались с 25,2+0,7 до 22+1,2 (р< 0,05), у крыс с 2б,7±1,б до 21,2±1,2 суток (р< 0,05). 4. Использование водорастворимого антиоксиданта мексидола парентерально и местно дальцекс-трипсина-мексидола и дальцекс-трипсина с комплексированными ионами меди [Си(Трис2-Н)Н20]С1Н20 у крыс с экспериментальными огнестрельными ранами патогенетически обосновано и высокоэффективно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНТАЦИИ

На основании результатов комплексного изучения влияния водорастворимого мексидола (по 0,25 мг/кг/веса) в течение 15 дней ежедневно и местно дальцекс-трипсин-мексидола и дальцекс-трипсин + комплектованные ионы меди является высокоэффективным средством лечения огнестрельных пулевых ранений. Простота в употреблении, патогенетическая обоснованность и высокая эффективность являются одним из его преимуществ в сравнении с традиционными методами лечения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антиоксиданты и металлокомплексы меди в лечении огнестрельных ран (соавт. Берченко Г.Н., Проманенко В.К., Кесян Г.А. и др.) // В книге "Антиоксиданты и лазерное излучение в терапии ран и трофических язв". -Москва. -2001. -С.172-195.

2. Профилактика нагноений асептических и лечение гнойных ран лазерным излучением и антиоксидантной терапией (соавт. Овчарова Т.В., Толстых М.П., Шехтер А.Б. и др.) // В книге " Антиоксиданты и лазерное излучение в терапии ран и трофических язв". -Москва. -2001. -С.102-137.

3. Новое в лечении огнестрельных ран (соавт. Толстых М.П., Шин Ф.Е., Раджабов A.A.) // Здравоохранение Таджикистана. -№1. -2002. -С.7-9.

Актуальность проблемы. В связи с техническим совершенствованием огнестрельного оружия, эффективности его использования, возрастанием числа локальных конфликтов, высокой криминогенностью современного общества проблема лечения, снижение числа инфекционных осложнений и уровня летальности при огнестрельных ранениях актуальна и не нуждается в какой-то аргументации (Г.А.Кесян, 2001). Это диктует необходимость дальнейших научных исследований в данном направлении, включая исследование возможностей применения более щадящих, малоинвазивных методов лечения с использованием новых патогенетических обоснованных достижений теоретической и практической медицины (М.М.Абакумов, 1999) и, в частности, современных антиоксидантов и их смесей. Известно, что свободнорадикальному перекисному окислению отводится роль фундаментальной молекулярной основы заживления ран, особенно огнестрельных (П.И.Толстых и соавт., 2001; Г.Н.Берченко и соавт., 2001). Основным субстратом свободнорадккальных реакций (СРР) перекисного окисления липидов являются ненасыщенные жирные кислоты (НЖК), входящие в состав фосфолипидов клеточных мембран и мембран субклеточных органелл, липопротеидов плазмы крови (Г.Я.Дубур и соавт., 1981; К.М.Дюмаев и соавт., 1981; Banghan et. al., 1965).

В физиологических условиях продукты свободнорадикального окисления участвуют в регуляции состава биомембран и проницаемости последних, а также скорости пролиферации клеток (Е.Б.Бурлакова и соавт., 1984; А.М.Герасимов, 1985; Grisham,1994). Избыточное накопление гидроперекисей жирных кислот ингибирует синтез белка, блокирует функцию макрофагов, изменяет их хемотаксическую и ферментную активность. Их избыток может явиться причиной дезинтеграции клеточных мембран и мембран субклеточных органелл, инактивации тиоловых ферментов и других белков, что в свою очередь приведет к нарушению функциональной активности клеток

Н.М.Эмануэль, 1979, 1986; Е.Б.Бурлакова, 1984; Halliwell, 1994). Свободные радикалы могут изменять конформацию белка, увеличивать чувствительность к протеолизу, а также повреждать молекулу ДНК, включая ее фрагментацию (Hinder, 1991; Halliwell, 1994). Проявлению повреждающего действия продуктов свободнорадикального окисления препятствует сложная многокомпонентная антиоксидантная система, которая обеспечивает их связывание и модификацию, тем самым предупреждая или усиливая разрушение перекисей.

Согласно современным представлениям, в основе травматических повреждений, в том числе и мышечной ткани, лежит образование и накопление в тканях свободных радикалов кислорода (Kaufman, 1989; Hinder, 1991). Это позволило с принципиально новых позиций рассмотреть процессы формирования огнестрельной раны и наметить совершенно новые пути терапии этих повреждений. В связи с этим, в последнее время при огнестрельных ранах с целью восстановления жизнеспособности тканей, нормализации метаболических процессов и функций мембран, повышения устойчивости к гипоксии, рекомендуется применение антиоксидантов (Ю.Г.Шапошников, 1986; Г.Н. Берченко, 1997; М.П. Толстых, 2002).

Ранее был известен положительный эффект влияния антиоксидантов на предупреждение развития инфекции и заживление гнойных и огнестрельных ран, ожогов, трофических язв (М.Ф.Камаев., 1975; В.К.Сологуб и соавт., 1979; Hinder, 1991; Halliwell, 1994).

Под влиянием антиоксидантов у экспериментальных животных (кролики, свиньи) с огнестрельной раной наблюдается уменьшение распадающихся полиморфноядерных лейкоцитов и увеличение нейтрофильных лейкоцитов с Шик-положительными зернами гликогена, наступает активизация фибробластической реакции. Наиболее активно этот процесс протекает в глубине зоны коммоции, вблизи сосудистых элементов, причем наиболее выраженная пролиферация фибробластов отмечается при использовании гидрофобных антиоксидантов - эпигида и, особенно, дибуноча (Г.Н.Берченко, 1997).

Однако, исследования последних лет показали, что водорастворимые антиоксиданты в лечении более эффективны, чем гидрофобные (С.Н.Чукаев, 1999), которые, к сожалению, в клинической практике применяются редко, что может быть связано с их дефицитом (Г.И.Клебанов и соавт., 2000). В связи с чем в настоящее время проводится широкий поиск и тестирование свойств и активности новых классов ингибиторов свободнорадикальных реакций и их композиций (Ю.В.Климов, 2000; М.П.Толстых, 2002). Примером таких композиций является мексидол, мексидол и трипсин, мексидол и металлокомплекс меди, антиоксидантные, в том числе и антибактериальные свойства которых до настоящего времени не изучались и для лечения огнестрельных ран не использовались.

Цель исследования: улучшить результаты лечения огнестрельных ран путём применения нативных и иммобилизованных на текстильных носителях водорастворимых антиоксидантов и металлокомплекса меди.

Задачи исследования:

1. Изучить in vitro антимикробную активность мексидола и текстильного металлохелата - дальцекс-трипсин-медь;

2. Дать сравнительную оценку с помощью разных модельных систем окисления антиоксидантной активности мексидола и хелатного комплекса меди;

3. Экспериментально изучить влияние антиоксиданта мексидола, дальцекс-трипсин-мексидола и текстильного металлохелатного раневого покрытия дальцекс-трипсин-медь на течение раневого процесса и дать сравнительную оценку их эффективности в лечении огнестрельных ран конечностей по морфологическим данным и лазерной доплеровской флоуметрии.

Научная новизна. Впервые изучен механизм антиокислительной активности мексидола и комплектованных ионов меди в отдельности и в их смеси и при этом впервые установлено, что:

- мексидол является ингибитором свободнорадикальных реакций пероксидации липидов за счет его способности к перехвату свободных радикалов как в водной, так и гидрофобной фазах мембран с липопротеидов;

- комплектованные ионы меди эффективно ингибируют перекисное окисление липидов мембран липосом, а в смеси с мексидолом эффективность ингибирования перекисного окисления липидов возрастает за счет независимого суммирования влияний компонентов смеси;

- доказано, что мексидол и комплексированные ионы меди с трипсином обладают выраженной антимикробной активностью по отношению к большинству музейных (S.Aureus-209, E.Coli-125, CL Perfringer-235) и клиническим (S.Aureus, S.Epidermidis, E.Coli, P.Aeroginosa) штаммов микроорганизмов в том числе и 50% штаммов грибков Candida;

- установлено, что парентеральное применение мексидола и местное использование биологически активных раневых покрытий (мексидола с трипсином и комплексированных ионов меди) ограничивают расширение вторичного некроза, способствуют очищению огнестрельных ран от микробной обсемененности и раневого детрита.

Впервые в эксперименте на основе результатов гистологических, гистохимических, микробиологических методов исследования и данных компьютеризированной лазерной доплеровской флоуметрии изучено влияние водорастворимого антиоксиданта мексидола и комплексированных ионов меди с трипсином на течение раневого процесса у крыс и собак с огнестрельными ранами.

Практическая значимость работы. Экспериментально разработано и обосновано с помощью микробиологических, патофизиологических (лазерная доплеровская флоуметрия), морфологических (гистологический и гистохимический) методов исследований с учетом фаз раневого процесса применение водорастворимого антиоксиданта мексидола и комплексированных ионов меди с трипсином для стимуляции репаративной регенерации огнестрельных ран. Предложенный способ позволяет корректировать тактику и методы лечения животных с огнестрельными ранениями на ранних стадиях (1-3 часа) развития огнестрельной болезни.

Апробация работы. Апробация работы проведена на заседании экспериментального и клинического отделов ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ. Основные положения диссертации доложены на Ученом Совете ГНЦ Лазерной медицины МЗ РФ.

Результаты диссертационного исследования частично нашли свое отражение в монографии П.И.Толстых и соавт.: "Антиоксиданты и лазерная терапия ран и трофических язв" (Москва, 2002).

Объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав, посвященных изложению материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 16 рисунками. Указатель литературы содержит ссылки на 78 отечественных и 34 иностранных авторов.

выводы

1. На основании изучения с помощью трех модельных систем окисления (суспензии фосфолипидных липосом, водного раствора гемоглобинпероксид, водорода-люминол и водного раствора 2',2-азо-бис (2-метиламинопропан) 2НС1-люминал) механизма антиокислительной активности мексидола и комплексированных ионов меди установлено, что мексидол ингибирует акивные формы кислорода и хелатирует каталитически активные ионы Fe2+.

2. Результаты изучения антимикробной активности мексидола и комплексированных ионов меди, иммобилизованных на дальцекс-трипсине, позволили выявить их высокую антибактериальную активность по отношению к штаммам Streptococcus spp., Streptococcus aureus (от 67% до 90,6%), Staphylococcus epidermidis (от 83% до 91,3%), Escherichia coli, Proteus spp. (от 75% до 100%).

3. Огнестрельные пулевые раны мягких тканей животных, по данным морфологических исследований и лазерной допплеровской флоуметрии под влиянием гидрофильного антиоксиданта мексидола, применяемого парентерально и местно раневых покрытий с мексидолом и металлокомплексом меди более быстро, по сравнению с контрольной группой животных, очищаются от раневого детрита и колоний микробов в зоне раневого канала. При этом средние сроки заживления огнестрельных ран у собак сокращались с 25,2±0,7 до 22±1,2 (р< 0,05), у крыс с 26,7±1,6 до 21,2±1,2 суток (р< 0,05).

4. Использование водорастворимого антиоксиданта мексидола парентерально и местно дальцекс-трипсина-мексидола и дальцекс-трипсина с комплексированными ионами меди [Си(Трис2-Н)Н20]С1Н20 у крыс с экспериментальными огнестрельными ранами патогенетически обосновано и высокоэффективно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с техническим совершенствованием огнестрельного оружия, эффективности его использования, возрастанием числа локальных конфликтов, высокой криминогенностью современного общества проблема лечения огнестрельных ран, снижение числа инфекционных осложнений и уровня летальности при данном виде поражения человека актуально и не нуждается в какой-либо аргументации. Это диктует необходимость дальнейших научных изысканий, направленных на использование в лечении огнестрельных ран новых теоретических и практических достижений в медицине и, в частности, использование современных водорастворимых антиоксидантов и полифункциональных раневых покрытий с ферментативной и антиоксидантной активностью. В настоящее время свободнорадикальному перекисному окислению отводится роль фундаментальной молекулярной основы самых различных патологических процессов, в том числе и осложнениям, которые возникают при заживлении огнестрельных ран. Согласно современным представлениям, в основе травматических повреждений при огнестрельном ранении мягких тканей лежит образование и накопление в тканях свободных радикалов кислорода. Это позволило с принципиально новых позиций рассмотреть процессы формирования огнестрельной раны и наметить новые пути терапии этих повреждений. В связи с этим в последнее время при огнестрельных ранах с целью восстановления жизнеспособности тканей, нормализации метаболических процессов и функции мембран, повышения устойчивости к гипоксии применяли раствор эпигида, феназана, линиментов дибунола. В то же время наиболее эффективный антиоксидант мексидол для лечения огнестрельных ран не применялся, не применялись и современные раневые полифункциональные покрытия на основе протеолитического фермента трипсина, мексидола и комплексированных ионов меди. В связи с чем была определена цель исследования:

1. Разработать новые подходы в лечении экспериментальных огнестрельных ран конечностей с использованием нативных и иммобилизованных на текстильных носителях водорастворимых антиоксидантов;

2. Провести медико-биологическое исследование и дать экспериментальное обоснование о целесообразности их использования в клинической практике.

Поставлены задачи исследования:

1. Изучить in vitro антимикробную активность мексидола и текстильного металлохелата - дальцекс-трипсин-медь;

2. Дать сравнительную оценку с помощью разных модельных систем окисления антиоксидантной активности мексидола и хелатного комплекса меди;

3. Экспериментально изучить влияние антиоксиданта мексидола, дальцекс-трипсин-мексидола и текстильного металлохелатного раневого покрытия дальцекс-трипсин-медь на течение раневого процесса и дать сравнительную оценку их эффективности в лечении огнестрельных ран конечностей по морфологическим данным и лазерной доплеровской флоуметрии.

Для решения данных задач предварительно in vitro были впервые изучены антиоксидантные и антибактериальные свойства мексидола, комплексированных ионов меди, иммобилизованных на дальцекс-трипсине. Антиоксидантные свойства мексидола, комплексированных ионов меди ГСи(Трис2-Н)Н20]С1-Н20 изучали с помощью трех модельных систем окисления: гомогенной системы, состоящей из перекиси водорода, гемоглобина и люминола (НЬ-НгОг-ЛМ); гомогенной системы, представляющей собой раствор азосоединения 2',2-азо-бис (2-метиламинопропан) хлорид; суспензии модельных мембран липосом.

Проверку антимикробной активности мексидола и комплексированных ионов меди, иммобилизованных на дальцекс-трипсине проводили по методам, рекомендованным Министерством здравоохранения РФ: методу серийного разведения в бульоне или питательном агаре и методу диффузии в агар. Антимикробное действие мексидола и металлокомплекса (ТРИС-медь) определяли как по отношению к тест-микроорганизмам Staphylococcus Aureus АТСС 885-653, Escherichia Coli АТСС 25922, Candida Ablicans АТСС 885-653, так и по отношению к госпитальным штаммам S. Epidermidis, S.Aureus, E.Coli, Proteus spp., Streptococcus spp., P.Aeruginosa, Candida.

При определении антимикробной активности методом серийного разведения, мы отметили ее и по отношению к музейным, и по отношению к госпитальным штаммам. Для того, чтобы дать качественную оценку антимикробной активности исследуемого препарата (мексидола) был использован метод диффузии в агар. Для этого агар в чашках Петри засевался взвесью тест-микробов по стандартной технологии. На поверхности агара делали лунку и заполняли ее мексидолом или погружали кусочек салфетки с исследуемым раневым покрытием. После инкубации в стандартных условиях оценивали результаты антимикробной активности по величине задержки роста микроорганизмов от краев лунки до границы роста микробов.

Экспериментальные исследования по обоснованию целесообразности применения мексидола и металлокомплекса меди в различных сочетаниях проведены на 16 беспородных собаках обоего пола массой 10-12 кг. (Эти исследования были выполнены совместно с проф. В.К.Проманенко).

В качестве носителя мексидола и металлокомплекса меди использовалось перевязочное средство на основе диальдегидцеллюлозы (ДАЦ). Экспериментальные исследования на крысах проведены с д.м.н. М.П.Толстых и к.м.н. Е.Ф.Шином. Моделью боевой травмы служили инфицированные огнестрельные раны мягких тканей. Ранения наносились на внутренней поверхности верхней трети правого бедра животных: собакам - из пистолета Макарова (калибр 9 мм), а крысам - из пистолета Марголина (калибр 5,6 мм), с дистанции 3 метра. Начальная скорость полета пуль составляла 850 и 320 м/сек, соответственно. Стандартное инфицирование раневого канала осуществляли следующим образом: в чашку Петри или целлофановый пакет помещали ровную круглую губку из поролона толщиной 1 см и диаметром 2 см, предварительно простерилизованную и высушенную в термостате. Перед опытом губку заливали микробной взвесью (нагрузка и состав тест-микробов определялась в соответствии с задачами эксперимента). Путем выстригания и бритья волосяной покров наружной поверхности правого бедра животного удалялся, а кожа обрабатывалась стандартным дезинфектантом (йодпирон). С помощью липкого пластыря губку с микробной взвесью прикрепляли на место предполагаемого входного отверстия огнестрельной раны. Затем производили выстрел. Пуля, проходя через поролоновую ткань, обуславливала занос в рану не только микроорганизмов, но и частиц губки. Такая методика обеспечивала получение модели боевой травмы, аналогичной реальной огнестрельной ране (А.Н.Шальнев, 1996).

Лечебные манипуляции в ранах, которые начинали в течение часа после повреждения, включали: рассечение травматического дефекта на всю глубину раневого канала, удаление видимых обрывков мягких тканей и обработку раневой поверхности растворами антисептиков. Операцию заканчивали наложением перевязочного средства. Особенности заживления экспериментальных огнестрельных ран изучали с помощью клинического, морфологического и микробиологического методов исследования.

Влияние мексидола на заживление огнестрельных ран изучено на собаках, разделенных на 4 группы, по 4 собаки в каждой. Огнестрельные раны собак контрольной группы лечили перевязочными средствами с антисептиками и мазевыми повязками. Комплекс лечебных мероприятий 1 опытной группы, помимо традиционного метода, дополнялся внутримышечными (в/м) инъекциями водного раствора мексидола (по 0,25 мг/кг веса в течение 10 дней ежедневно). Местное лечение ран животных 2 группы осуществляли путем использования перевязочного средства ДАЦ, имобилизованного лекарственным фармакологическим комплексом трипсин-мексидол (ДАЦ-ТМ). 3 группу животных лечили комплексным применением в/м инъекций мексидола и местным использованием перевязочного средства ДАЦ-ТМ.

С целью определения эффективности влияния на заживление огнестрельных ран иммобилизованного металлокомплекса на основе меди, были проведены эксперименты на 100 беспородных крысах-самцах, разделенных на 4 группы (по 25 животных в каждой). В течение часа после огнестрельного повреждения в раневой канал вводили: в контрольной группе животных - ДАЦ-повязки, смоченные 0,9% раствором хлорида натрия; в 1 опытной группе - ДАЦ-повязки с иммобилизованным трипсином; во 2 опытной группе - ДАЦ-повязки с иммобилизованным металлокомплексом меди (перевязочное средство ТРИС-медь); в 3 опытной группе - ДАЦ-повязки с иммобилизованными трипсином и металлокомплексом меди (ДАЦ-ТСи).

Морфологические исследования тканей из области канала огнестрельной раны крыс проводили на 3, 5, 8 и 12 сутки после ранения. Биопсийный материал фиксировался в жидкости Корнуа в течение 2-х часов и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 микрон окрашивали гематоксилин-эозином, микрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна, импрегнировали серебром по Гомори для выявления аргирофильных структур. Использовали также гистохимические методы: окраска толуидиновым синим, выявление глюкозаминогликана и их комплексов с белками (протеингликаны), ПАС-реакция для выявления гликогена и гликопротеинов, реакция Браше для выявления РНК и реакция Фильгена для выявления ДНК в клетках. Гистологические и гистохимические исследования были выполнены под руководством д.м.н., профессора Г.Н.Берченко в центральном институте травматологии и ортопедии.

Лазерную допплеровскую флоуметрию проводили с использованием лазерного анализатора кровотока "JIAKK-01" (НЛП "JIA3MA", Москва) в комплексе с PC/AT 486.

Результаты изучения антиоксидантных свойств мексидола и комплексированных ионов меди показали, что в основе антиоксидантного действия мексидола лежит его способность ингибировать стадию инициации СРР перекисного окисления липидов, во многом обусловлено образованием активных форм кислорода и появлением каталитически активных ионов железа за счет окисления ионов Fe2+ и Fe3+, либо за счет хелатирования ионов Fe2+. Это обстоятельство позволяет рекомендовать применение мексидола парентерально и местно как ингибитора СРР в острый период воспаления раны, когда эффективность стадии инициации весьма велика. При использовании водной, гомогенной модельной системы Hb-H202-L обнаружено, что препарат [Си (Трис2-Н)Н20]С1Н20 эффективно ингибирует перекисное окисление липидов мембран липосом, свободно радикальные реакции.

Изучение антимикробной активности мексидола и комплексированных ионов меди показало, что они подавляют рост микроорганизмов Candida в 50%, Streptococcus spp. и Streptococcus Aureus в 67%, Staphylococcus Epidermidis в 83%, Escherichia Coli и Proteus spp.

Наибольшая антимикробная активность в отношении грамотрицательной и грамположительной микробной флоре выявлена у раневого покрытия дальцекс-трипсин-медь, что является основанием для использования его в качестве раневого покрытия, улучшающего протекание раневого процесса у экспериментальных животных с огнестрельными ранами в отдельности или в сочетании с мексидол ом.

Проведенные экспериментальные исследования на 16 собаках с огнестрельными ранами показали, что признаки травматического отека выявлялись в течение 3 часов после обработки огнестрельных ран и в последующие сроки наблюдения нарастали во всех группах животных. Однако их выраженность была различной и зависела от применяемого метода лечения. У собак, леченных перевязочными средствами с иммобилизованными биологически активными веществами, исчезновение признаков воспаления тканей наблюдалось к 6-7 суткам лечения. В эти же сроки наблюдения раневые поверхности покрывались очагами грануляционной ткани бледно-розового цвета. В то же время, у животных контрольной группы отек и гиперемия тканей определялась до 9 суток, а очищение раневой поверхности от гнойно-некротических масс происходило не ранее 10-11 суток с момента начала лечения. Наибольшая эффективность комплексной терапии огнестрельной раны определялась в 3-ей опытной группе.

Ежедневные внутримышечные введения мексидола и местное использование перевязочного средства ДАЦ-ТМ позволило добиться заживления огнестрельных ран на 19 сутки после их нанесения. В 1 и 2 опытных группах заживление ран происходило на 22-21 сутки, а в контрольной группе животных - лишь к 25 суткам после огнестрельного ранения.

Данные бактериологического исследования также свидетельствовали о положительном влиянии внутримышечных инъекций мексидола (1 опытная группа животных) и перевязочного средства ДАЦ-ТМ (2 опытная группа) на течение раневого процесса, по сравнению с традиционным методом лечения. На 3 сутки лечения уровень микробного обсеменения ран перечисленных групп несколько превышал критический уровень и находился в пределах 1x106"7 колониеобразующих единиц (КОЕ), а у собак 3 опытной группы был 1х105'6. В то же время, у животных, леченных традиционным методом, титр микробных тел составлял 1х109 КОЕ. К 5-м суткам лечения наблюдалось снижение титра микробных тел во всех исследуемых группах животных. У всех собак опытных групп степень микробной обсемененности раневой поверхности не превышала критический уровень (1x105 КОЕ). Однако у собак контрольной группы упомянутый бактериологический показатель был все еще достаточно высоким (1x107 КОЕ). На 7 сутки после нанесения огнестрельной раны и начала лечения, у всех собак опытных групп уровень микробной обсемененности ран составлял 1х103 КОЕ и далее не менялся. В то же время, у животных контрольной группы титр микробных тел практически оставался на том же уровне, что и в предыдущий срок наблюдения (lxlO6"7 КОЕ). Значимое уменьшение степени микробной обсемененности ран у перечисленных собак определялась только к 10-12 суткам лечения (1x105 КОЕ).

Таким образом, внутримышечные инъекции мексидола и применение перевязочного средства ДАЦ-ТМ положительно влияют на процессы репарации огнестрельных ран у собак. Лучшие результаты наблюдаются при одновременном парентеральном введении мексидола и местном использовании перевязочного средства диальдегидцеллюлозы-трипсин-мексидола. Эффективность примененного метода лечения объясняется комплексным антиоксидантным и антибактериальным действием используемых материалов.

Изучение влияния комплексированных ионов меди и трипсина на модели гнойной раны у крыс показало, что исчезновение местных воспалительных явлений у крыс контрольной группы наблюдалось на 7,0±1,4, а заживление ран на 26,7±1,6 сутки с момента начала лечения. При использовании перевязочного средства ДАЦ-трипсин, упомянутые характеристики раневого процесса мало отличались от таковых крыс 2 опытной группы (лечение ДАЦ с иммобилизованным металлокомплексом меди). У животных 1 опытной группы исчезновение местных воспалительных явлений и заживление ран наблюдалось на 5,1±1,5 и 23,0±1,4 сутки, на 5,8±1,3 и 23,3 сутки во второй опытной группе соответственно; при использовании ДАЦ-Трис-медь на 4,5+1,2 и 19,6±1,6 сутки. Местное использование перевязочных средств ДАЦ-трипсин-медь и ДАЦ-Т обеспечивало более эффективное воздействие на раневой процесс. В этих группах крыс исчезновение воспалительных явлений и очищение ран, появление очагов грануляционной ткани и заживление ран наступало в более ранние сроки по сравнению с другими опытными и контрольной группами животных.

Таким образом, по данным экспериментально-морфологического исследования среди рассматриваемых групп животных наиболее эффективным положительным влиянием на заживление огнестрельных ран обладают ДАЦповязки с иммобилизованными трипсином и металлокомплексом меди (ДАЦ-трипсин-медь).

При использовании ДАЦ-трипсин-медь [Си(Трис2-Н)Н20]С1Н20 наблюдается значительная активизация очищения огнестрельной раны от некротизированных тканей, масс фибрина колоний микроорганизмов в зоне первичного раневого канала. В зоне сотрясения слабее выражены признаки расстройства системы микроциркуляторного русла, дистрофические и некротические процессы, что в конечном счете проявляется в уменьшении вторичного некротизирования поврежденной ткани этсй зоны. В то же время, признаки репарации в виде образования и созревания грануляционной ткани в области вторичного некроза зоны сотрясения развиваются более активно и в более ранние сроки. Можно предположить, что положительный эффект данной повязки при местном лечении огнестрельных ран мягких тканей основывается на сочетании антиоксидантных свойств металлокомплекса меди и некролитического влияния протеолитического фермента трипсина.

Проведена сравнительная оценка динамики изменения микроциркуляторного русла под воздействием нового раневого покрытия ДАЦ-трипсин-комплексированные ионы меди и контрольной группы, в которых раны покрывались ДАЦ-повязками, смоченными 0,9% раствором хлорида натрия.

Анализ результатов микроциркуляции в огнестрельных ранах показал, что после покрытия раны салфеткой дальцекс-трипсин-медь на первые сутки показатель микроциркуляции составил 6,4±1,4 пер. ед., а на третьи сутки до 7,8±0,8 пер.ед. На 7 сутки показатель микроциркуляции уже приблизился к исходному состоянию, т.е. 12,3±0,94 пер.ед. В контрольной группе эти цифры были достоверно меньше (р< 0,01) по сравнению с основной группой, а именно 4,6±1,2; 4,6±1,9, на 7 сутки - 10,4±0,95. Амплитуда вазомоторных колебаний (А) кровотока в микроциркуляторном русле в основной группе животных составляло до лечения 0,19±0,03, на первые сутки лечения (через 24 часа от момента ранения) 0,13±0,01, на третьи - 0,48±0,05 и на 7 сутки 1,87±0,12 мин"1.

В контрольной группе животных эти показатели были в 3,1-1,6 и на седьмые сутки в 5,8 раза меньше, чем в основной группе животных, леченных дальцекс-трипсин-медью. Частота вазомоций (F) имела достоверное статистическое различие между основной и контрольной группами только на 3 сутки: в основной 4,4±0,4, в контроле 6,0±0,01, (р< 0,01).

Таким образом, изучение состояния микроциркуляции огнестрельных ран до и в процессе их местного лечения дальцекс-трипсин-медью полностью коррелируется с морфологическими исследованиями и объективно подтверждает, что применение антиоксидантов для лечения огнестрельных ран патогенетически оправдано и высокоэффективно.