Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Новая стратегия пептидного дизайна на примере создания оригинальных ноотропов и нейролептиков

А/ / '1

/ ■ ♦ / /

Научно-исследовательский институт фармакологии Российском академии

медицинских наук

на правах рукописи

Гудашева Татьяна Александровна

I-

Новая стратегия пептидного дизайца на примере создания оригинальных ноотропов и нейролептиков

14.00.25 - Фармакология 02.00.10- Биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

у'Ю Г"-,

уСЯО

Диссертаций в виде иаучнйго доклада на соискание / ученой степени ддктораШиологических наук

Москва, 1998 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакологии Российской академи

медицинских наук (директор- академик РАМН Середенин С.Б.)

РОС®МЙСЖля ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

Официальные оппоненты: академик РАМН, профессор И.П. АШМАРИН, член-корр. РАМН , профессор К.С. РАЕВСКИЙ доктор химических наук, профессор С.Д. ВАРФОЛОМЕЕВ

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится "2 1998 г

совета Д.001.25.01 в НИИ фармакологии Р/\

:чии диссертационно) -1, Балтийская улиц

Д.8.

С диссертацией в виде научного докл:

фармакологии РАМН.

Диссертация в виде научного доклада г; .

в Ученой части НИ

1998 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Вальдмак

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Различают два основных этапа в создании нового потенциального лекарственного средства: открытие новой группы биологически активных химических соединений и оптимизация оригинальных соединений внутри этой группы по активности, специфичности, биодоступности и токсичности.

В то время как методы оптимизации уже найденной фармакологически активной структуры хорошо разработаны (например, QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship), открытие новых химических групп биологически активных соединений остается наиболее трудной и дорогостоящей задачей. Ведущие фармакологические фирмы США тратят около 15 млрд. долларов в год на разработку и производство лекарственных препаратов, причем 7-9 млрд. долларов из этой суммы расходуется на открытие новых химических групп, обладающих специфической фармакологической активностью (Martin Y.C., 1991).

Большинство классических психотропных средств было открыто клиницистами или фармакологами эвристическим путем или методами традиционного скрининга. Так, например, бутирофеноновые нейролептики были открыты случайно при изучении этих соединений как аналогов центрально активного анальгетика петидина. Имипрамин как родоначальник трициклических антидепрессантов и пирацетам как первый представитель пирролидоновых ноотропов были открыты эвристическим путем клиницистами. Хлордиазепоксид как первое соединение из ряда бензодиазепиновых транквилизаторов и хлррпромазин как первый фенотиазиновый нейролептик были открыты с помощью целенаправленного фармакологического скрининга. Скрининг и по сей день остается важнейшим методом выявления новых биологически активных структур.

В последние годы активно развивается новое направление скрининга, использующее бкяантные рандомизированные пептидные библиотеки (Bull AT. et al, 1992), ? j-aie синтетические библиотеки (Pavía M.R. et al.,1993, Gallop M. et al., 1994, Gordon al., 1994)) и массовые биохимические методы определения биологической к, позволяющие тестировать тысячи соединений в относительно короткое время, ч i наномолярные количества веществ. В основном используются иммунохимические, .еские и рецепторные методы тестирования. Положительной стороной такого

! \ подхода является высокая степень автоматизации исследований, однако, его недостатком

является сложность использования поведенческих и других системных методов

тестирования фармакологической активности и невозможность поиска лекарственных

средств для патологических состояний, молекулярный механизм которых неизвестен.

Современные подходы к рациональному поиску новых биологически активных структур основаны на понимании фундаментальных принципов молекулярного распознавания. Успех в этой области связан с развитием, с одной стороны, молекулярной биологии, а с другой- компьютерного молекулярного моделирования.

В последние 5-7 лет с развитием компьютерной техники и появлением информации о трехмерной структуре значительного числа ферментов и некоторых рецепторов появились такие методы поиска принципиально новой структуры лиганда, как молекулярный докинг (docking) (Shoichet В.К. et al., 1993, Aqvist J. et al, 1994). Докинг представляет собой компьютерный метод отбора структур, комплементарных зоне связывания белка-акцептора. Существует несколько вариаций этого метода - геометрический докинг, гидрофобный докинг и т.д. (Vakser I.A. 1996, Librand, 1995, Ajay, 1995, McMartin С.,1997). При этом новая структура лиганда или имеется в библиотеке соединений, или должна быть синтезирована de novo.

Трехмерную структуру рецептора для докинга получают методом рентгеносгруктурного анализа после очистки и кристаллизации рецептора, причем, благодаря развитию рентгеноструктурного анализа, лимитирующей стадией является как раз очистка и кристаллизация. Чаще используют гипотетическую трехмерную модель рецептора, исходя из его первичной структуры и трехмерной структуры белков-гомологов. Однако, такая модель является неточной, что заставляет создавать и использовать наборы так называемых «топографических ограничителей», то есть близких по структуре и методам синтеза молекул, позволяющих варьировать расстояние между ключевыми точками центров связывания. Созданные с помощью «топографических ограничителей» (частным случаем которых являются имитаторы JJ-поворотных пептидных структур, Kieber-Emmons Т. et al., 1997) молекулы также представляют собой родоначальники новых физиологически активных групп соединений. Отметим, что мощный поток информации о первичных структурах белков идет благодаря программе «геном человека», обещающей к 2003 году «расшифровку всех 100 ООО генов человеческого генома. Информация о трехмерных структурах белков аккумулируется в компьютерном банке данных PDB (Protein Data Bank,

Brookhaven National Laboratory), доступном через Интернет. Следует отметить, что метод докинга может применяться только в том случае, когда известно, какие именно рецепторы играют ключевую роль в данном патологическом состоянии.

В тех случаях, когда рецептор, ответственный за патологический процесс, неизвестен, используется метод фармакофорного картирования, то есть, построения гипотетической зоны связывания рецептора на основании информации о структуре и биологической активности его агонистов и антагонистов. Современное развитие этого метода ( Snyder J. 1996,1998, Vakser I. 1997, LoewG. 1997, Marshall G. 1986,1997) включает картирование гибкими молекулами путем расчета биологически активных конформаций с учетом эффектов сольватации, влияния раздела фаз в зоне связывания.

Следует отметить, что вычислительные методы переживают пока еще начальный период своего развития и в основном проходят обкатку на различных модельных системах, представляющих собой хорошо изученные зоны связывания ряда ферментов, таких как тромбин, трипсин, тимидилатсинтаза.

Большое число новых структур приходит в медицинскую химию из биохимии и молекулярной биологии. Ими являются вновь открываемые эндогенные биологически активные соединения- нейротрансмиттеры, нейропептиды, иммунопептиды, нуклеотвды, регуляторы ферментов и т.д. Многие существующие лекарственные препараты представляют собой модифицированные классические нейромедиаторы. Так, на основе структуры ГАМК получены противосудорожное средство баклофен, ноотропные препараты фенибут и пикамилон. На основе структуры адреналина получены адреноблокаторы анаприлин, фентоламин, пиидолол и др. Получены лекарства- аналоги ацетилхолина (карбохолин, ацеклидин, дитилин, парамион и др.).

Среди эндогенных соединений для развития нейротропных лекарственных веществ особое значение имеют нейропептиды, играющие роль нейрогормонов, нейротрансмиттеров и нейромодуляторов, вовлеченных в контроль комплекса поведенческих и адаптационных процессов. Это наиболее мощная система нейрорегуляторов, представители которой участвуют в большом числе нейро- и психопатологий. Вопросу роли нейропептидов в биорегуляции и патогенезе нервно-психических заболеваний посвящено большое число работ. Только в нашей стране вышел ряд фундаментальных монографий и обзоров по этой тематике, например, «Лиганды опиатных рецелоров» В.Г. Смагина, В.А. Виноградова, С.А. Булгакова (1983); «Пептиды-регуляторы функций мозга» В.Е. Клуши (1984);

«Нейропептиды» Л.А. Громова (1992); «Функциональная биохимия регуляторных пептидов»

О.А. Гомазкова (1992); «Олигопептидь! мозга- аналептики, стимуляторы памяти и сна», И.П.

*

Ашмария, Молек.биол.,1978, «Регуляторные пептиды, функционально- непрерывная совокупность», И.П. Ашмарин и М.Ф. Обухова, Биохимия, 1986; «Регуляторная активность простейших пролинсодержаших пептидов PG, GP, PGP, GPGG и возможные источники их биосинтеза», И.П. Ашмарин и др., Биохимия, 1998.

В последние 10-15 лет идет лавинообразное нарастание числа, исследований в области создания лекарств на основе нейропептидов (Marshall G.R., 1978, 1993, Farmer P.S., 1980, 1983, Hruby V.J., 1982,1984, 1996, Olson G.L., 1993, 1995, Hirshitian R., 1993, Kemp D.S. et al., 1988, 1995, Чипенс Г.И., 1980, 1988, Ашмарин И.П., 1984, 1996). Из-за склонности к биодеградации и многофункциональности нативные нейропептиды почти не используются в качестве потенциальных лекарств. Вместо этого ведется поиск стабильных лигандов пептидных рецепторов, пептидомиметиков, которые получают с помощью достаточно хорошо развитого набора подходов. Сюда относятся модификация пептидной связи и боковых радикалов аминокислот, введение D-амикокислот, локальных и глобальных конформационных ограничений, замена части пептида непептидными миметиками поворотных структур, a-спиралей и р-структур, спейсерами и т.п. По методам получения пептидомиметиков имеются фундаментальные обзоры, например: «Concepts and progress in the development of peptide mimetics», Olson G.L. et al., 1993; «Case histories of peptidomimetics: progression from peptides to drugs», Adang A. et al., 1994; «Conformatiohally restricted ammo acids and dipeptides, (non)peptidomimetics and secondary structure mimetics», Liskatnp R., 1994 и другие.

Примерами успешно созданных в России лептидергаческих лекарственных средств являются даларгин (D-Ala2,Arg6- Leu-энкефалин), семакс (АКТГ 4-7, стабилизированный пептидным фрагментом Pro-Gly-Pro), селанг (модифицированный тафцин). За рубежом получены такие пептидные препараты, как антинеопластик остреотид (циклоаналог соматостатина, фирма Сандоз), ноотропы пиладокс (гомо-pGlu'Leu2- TRH, фирма Рихтер),

íoitoirw AVTT Л,™.™ Va™l .. Drrr Ífí.<-tfn ч.4 Г! T . ,s D!-.-9 ITT A O- J,.™,-

Органон), противораковый препарат бусерелин (О-трет.бутилвег6 -люлиберин, фирма Хёхст) и другие. Следует отметить, что число пептидергических препаратов до сих пор невелико. .Это связано с тем, что на пути использования структуры нейропептида в качестве основы для создания лекарственного вещества имеются ряд проблем. Достаточно сложной остается

проблема выяснения роли нейропептида в патофизиологических процессах, трудоемко и неоднозначно определение минимального биологически активного участка, выявление биологически активной конформации. Создание пептидомиметика со спектром необходимых терапевтических свойств, таких как высокая специфическая активность, биодоступность, отсутствие побочных эффектов по сей день требует многолетних усилий больших научных коллективов.

Перспективным подходом к созданию пептидергических лекарственных соединений является получение биологически активных олигопептидов. В этом плане наибольший интерес представляют дипептиды, которые, из-за простоты и меньшей гибкости молекулы, теряют многофункциональность, свойственную полипептидам, и в то же время обладают повышенной энзиматической стабильностью и биодоступностью.

В связи с этим актуальным является развитие рациональных методов дизайна коротких пептидов с заданной специфической нейрофармакологической активностью. Создание новых базовых структур дипептидной природы открывает возможности для получения высокоактивных пептидергических лекарств, не вызывающих привыкания и не обладающих другими побочными эффектами, свойственными экзогенным соединениям.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является создание и развитие оригинального метода рационального конструирования коротких биологически активных пептидов на основе структуры известных непептидных лекарств { далее- метода пептидного дизайна) и получению на этой базе новых нейротропных лекарственных средств. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Разработка принципов пептидного дизайна на примере конструирования дипептидных аналогов классического ноотропа пирацетама.

2. Создание новой группы потенциальных дипептидных ноотропов на основе пироглутаминовой кислоты и лролина.

3 Пписк ЭНЗОГвННЫХ ГТГЮТОТНПОП V"■""г'!":''''V """ ■ '-■■ ПИрйЦ^ТЗгЛ3

4. Изучение механизма действия наиболее перспективного дипептидного ноотропа.

5. Применение метода пептидного дизайна для получения новой группы дипептидных антипсихотиков на базе структуры атипичного бензамидного нейролептака сульпирида.

6. Выявление структурно-функциональной связи сульпирида и нейротензина.

7. Получение оригинальной группы потенциальных атипичных антипсихотиков -трипептоидных аналогов нейротензина.

Научная новизна работы.

Разработан оригинальный подход для создания потенциальных пептидергических нейротропных лекарственных соединений, состоящий в том, что структура принципиально нового короткого пептида с заданной биологической активностью конструируется как трехмерный топологический аналог известного непептидного лекарственного соединения с предполагаемым пептидергическим механизмом действия. Алгоритм конструирования основан на принципах молекулярного узнавания в системе пептид-рецептор и учитывает приоритетность гидрофобных взаимодействий и стерических препятствий, векторность водородных связей и энтропийный характер вклада электростатических взаимодействий в связывание лиганда рецептором.

Методом компьютерного моделирования выявлены биологически активные конформации пирацетама и его простейшего пептидного аналога р01и-й!у-№Н2. Показано, что конформацкя последнего является цисоидной и отличается по энергии от глобального минимума менее чем на 1 ккал/мопь.

Получены селективно действующие на отдельные фазы памяти дипептидные аналоги пирацетама: рО!и-Азп-ОН и цикло-Рго<Иу, облегчающие ввод информации, рС!и-А5П-МН2) облегчающий ввод и извлечение информации, рСНи-О-АБП-ЫНг, действующий только на консолидацию.

Получены нейрофармакологические свидетельства в пользу рецепторного механизма действия пептидных аналогов пирацетама, а именно такие факты, как стереоселективность биологического эффекта, наличие структурно близких агонистов и антагонистов и способность веществ оказывать эффект в супермалых дозах (до 0,01 мг/кг в.б ).

Обнаружены термолабильные места специфического стереоселективного связывания одного из аналогов пирацетама- этилового эфира К-фенилацетил-Ь-пролилглицина в мембранах мозга крыс, характеризующиеся К0= б,85*10~9М и Втах= 1,6 пмоль/мг белка

Выдвинута гипотеза о рецепторном пептидергическом механизме действия пирацетама, основанная на нормализующем характере его действия, модуляторном взаимодействии с медиаторными системами, куполообразной дозовой зависимости, наличии антагонизма со структурно близким цетиловым эфиром пролина и на данных о рецепторном механизме действия его пептидных аналогов. Выявлена структурно-функциональная связь

классического ноотропа пирацетама и вазопрессина. наиболее активный пептидный аналог пирацетама pGlu-Asn-NH2 представляет собой N-концевой фрагмент основного метаболита вазопрессина, AVP(4-9), сохраняющего влияние вазопрессина на память и лишенного гормональной активности.

С использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии открыт новый эндогенный пептид памяти цикло-пролилглицин, содержащийся в мозге крыс в концентрации 2,8 нмоль/г сырого веса мозга.

Выдвинута гипотеза о том, что атипичный нейролептик сулъпирид является пептидомиметиком активного участка нейропептида нейротензина, ответственного за нейролептикоподобные свойства последнего. Получены косвенные доказательства этой гипотезы: наличие нейролептической активности у дипептидного аналога сульпирида Рго-Tyr-NH2, последовательность которого совпадает с последовательностью нейротензина NT(lO-ll).

Методом компьютерного моделирования выявлены биологически активные конформации сульпирида и его дипептидного аналога Pro-Tyr-NH2, отличающиеся по энергии от соответствующих глобальных минимумов менее чем на 5 ккал/моль. Показано, что биологически активной конформацией NT(8-13), ответственной за его нейролептикоподобные свойства