Непрямая молекулярно-генетическая идентификация личности при массовом поступлении неопознанных тел

Корниенко, Игорь Валериевич

Диссертации по медицине → Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Непрямая молекулярно-генетическая идентификация личности при массовом поступлении неопознанных тел

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Корниенко, Игорь Валериевич Санкт-Петербург 2005 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.46

Автореферат диссертации по медицине на тему Непрямая молекулярно-генетическая идентификация личности при массовом поступлении неопознанных тел

На правах рукописи

КОРНИЕНКО

Игорь Валериевич

НЕПРЯМАЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИЧНОСТИ ПРИ МАССОВОМ ПОСТУПЛЕНИИ НЕОПОЗНАННЫХ ТЕЛ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2005

Работа выполнена в 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической

идентификации МО РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук профессор

Колкутин Виктор Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор доктор биологических наук профессор доктор медицинских наук

Слозина Наталия Михайловна Носиков Валерий Вячеславович Ковалев Андрей Валентинович

Вьдущая организация: Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова

Защита диссертации состоится

2005 года в

на

заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС России (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д. 4/2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России

Автореферат разослан

200

К.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проведение боевых операций в Северо-Кавказском регионе в 1994-1996 гг. повлекло за собой поступление значительного числа тел погибших военнослужащих (ТПВ), не подлежащих визуальному опознанию. Уже в начале 1995 года в связи с массовыми поступлениями неопознанных погибших российских военнослужащих перед руководством министерства обороны Российской Федерации (МО РФ) встала острая социально-политическая задача идентификации личности погибших. Данная задача осложнялась тем, что ни в МО РФ, ни в других ведомствах РФ не имелось структур, обладающих достаточным потенциалом сил и средств для решения такой широкомасштабной проблемы в кратчайшие сроки [Колкутин В.В. и соавт., 2003].

Кроме того, было очевидно, что только традиционными судебно-медицинскими методами идентификации справиться с этой задачей практически невозможно. Классические методы идентификации личности, основанные на сравнительном анализе морфологических признаков, изучении минерального состава костей скелета и других специальных технологиях, имеют предел идентификационных возможностей [Абрамов С.С. и соавт., 2000]. Отсутствовала и нормативно-правовая база для организации подобной работы, так как официально на момент первой чеченской кампании в МО РФ не существовало каких-либо руководящих документов, регламентирующих стратегию и тактику командования и медицинской службы военного ведомства в подобных ситуациях. В том числе и по этой причине внезапно возникшая необходимость идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел стимулировала использование современных молекулярно-генетических методов в судебно-медицинской практике.

Первые судебно-генетические экспертизы по установлению личности военнослужащих, погибших на территории Чеченской Республики, были проведены в 1995-1996 годах. Однако отсутствие на тот момент времени базы сравнительного биологического материала с одной стороны и опыта работы такого масштаба с другой, не позволяло проводить сколь-нибудь эффективное аналитическое сравнение генотипов погибших со всем массивом кровных родственников.

идентификации военнослужащих, погибших во время вооруженного конфликта 1994-96 гг. в районе Чеченской Республики: в постановлении № 1052 от 20 августа 1997 года Правительства РФ. были определены требования по отношению к идентификационным исследованиям останков погибших в ходе чеченской войны, и, в частности, в качестве обязательного элемента предусмотрен анализ на уровне ДНК.

Применительно к специфике поставленной задачи, ввиду отсутствия референтной базы молекулярно-генетических данных на ТПВ, использовались методы так называемой непрямой идентификации или идентификации на основании установления фактов кровного родства [Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002]. Около 40% ТПВ поступали на идентификационные исследования в состоянии сильной деградации или сравнительный материал на них был представлен только родственниками по материнской линии. В связи с этим основным методом молекулярно-генетической идентификации в таких случаях становился анализ полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК).

Типирование локусов митохондриальной ДНК (мтДНК) в целях молекулярно-генетической идентификации личности незаменимо в случаях ограниченного количества исследуемого материала или сильной деградации биологических образцов. В настоящее время идентификационная значимость мтДНК-типирования определяется полиморфной природой двух гипервариабельных регионов D-петли (HV1 (16024-16365) и HV2 (73-340) [Wilson MR. et.al., 1993; Miller K.W.P. et.al., 1996]. Однако невысокий потенциал дискриминации традиционно используемых митохондриальных маркеров не позволяет эффективно применять этот метод в случаях больших или открытых групп потенциальных источников данного образца [Holland M.M. et al., 1993; Inman К., Rudin N., 1997; Holland M.M., Parsons T.J., 1999]. Так как нуклеотидные последовательности мтДНК практически идентичны у всех матроклинных родственников, в методе мтДНК-типирования заложена не идентификация личности как таковой, а выяснение принадлежности испытуемой пробы к определенному митотипу или матрилинейному ряду [Parsons T.J., Coble M.D., 2001].

Эффективность использования генетических маркеров мтДНК в целях идентификации личности может быть существенно повышена при условии оценок дискриминирующего потенциала настоящего метода. Однако это может произойти только при наличии Баз Данных полиморфизма мтДНК для данной этнической группы. С использованием методов расшифровки первичных нуклеотидных последовательностей к настоящему времени накоплены многочисленные данные о полиморфизме гипервариабельных сегментов контрольного региона мтДНК в различных этнических группах [Lutz S. et al., 1998; Parson W. et al., 1998; Rousselet F., Mangin P., 1998; Crespillo M. et al., 2000; Dimo-Simonin N. et al., 2000; Pereira L. et al., 2000; Gabriel M.N. et al., 2001; Tagliabracci A. et al., 2001; Monson K.L. et al., 2002; Malyarchuk B.A. et al., 2003]. В общем случае, отсутствие частот митотипов для данной этнической группы приводит только к качественной оценке мтДНК-идентификации кровного

родства: "родство исключается полностью" и "родство не исключается" [Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002].

До недавнего времени анализ первичной структуры мтДНК предоставлял возможность надежной идентификации лишь в пределах относительно небольшой замкнутой группы потенциальных претендентов. Однако в ряде случаев возникает необходимость идентификации двух и более индивидуумов с одинаковыми нуклеотидными последовательностями гипервариабельных регионов (HV1 и HV2). То есть одна из основных проблем мтДНК-идентификации заключается в наличии абсолютно идентичных митотипов у двух и более исследуемых проб, что является следствием низкого потенциала дискриминации традиционно используемых митохондриальных маркеров (HV1 и HV2). И если два и более индивидуумов имеют идентичные митотипы по локусам HV1 и HV2, их дальнейшая дифференцировка в пределах данного подхода невозможна. Для повышения эффективности мтДНК-идентификации необходимо исследование дополнительных полиморфных генетических маркеров мтДНК.

Полиморфизм нуклеотидных последовательностей за пределами гипервариабельных локусов контрольного региона (HV1 и HV2) не используется в рутинной практике судебно-медицинской идентификации личности и установления кровного родства. Имеются данные литературы, свидетельствующие о наличии полиморфных позиций за пределами локусов HV1 и HV2 [Johnson K.P., Sorenson M.D., 1998; Балмышева Н.П., Соловенчук Л.Л., 1999; Ingman M. et а!., 2000; Lee S.D. et al., 2002; Brandstatter A. et al., 2003; LutzBonengel S. et al., 2003; Mishmar D. et al., 2003]. Поэтому исследование полиморфных позиций за пределами контрольного региона позволит получить ценную информацию, которая могла бы увеличить потенциал индивидуализации ДНК-идентификации личности.

Несмотря на наличие принципиальной возможности решения экспертной задачи, непрямая мтДНК-идентификация неопознанных тел в условиях их массового поступления - например, в ходе боевых действий, - является чрезвычайно трудоемкой задачей при использовании методов и средств, рассчитанных на применение в стандартных судебно-медицинских идентификационных экспертизах. Эти методы не приспособлены для решения аналитических задач, возникающих в условиях идентификационной работы, характеризующейся большим объемом и поточным поступлением объектов.

В условиях массового поступления неопознанных тел проблема идентификации останков связана в первую очередь с применением новых автоматизированных медико-криминалистических систем, основное назначение которых заключается в автоматической обработке огромных массивов первичной информации с целью предоставления точных данных об исключенных объектах идентификации и набора рекомендательных списков с вероятностными оценками возможного кровного родства с объектами сравнения.

идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ полиморфизма различных областей некодирующей области мтДНК и исследовать зависимость частоты точечных замен в контрольном регионе от расположения функциональных элементов митохондриального генома.

2. Исследовать полиморфизм нуклеотидных последовательностей в области структурных геноз митохондриального генома и сравнить их дискриминирующую способность в качестве дополнительных генетических маркеров для непрямой мтДНК-идентификации личности.

3. Разработать критерии повышения надежности при интерпретации результатов непрямой мтДНК-идентификации с учетом механизма и частоты возникновения точечных нуклеотидных замен в мтДНК.

4. Провести анализ степени надежности непрямой мтДНК-идентификации при комплексном анализе генетических маркеров ядерной и митохондриалыюй ДНК в зависимости от размера рабочей базы данных митотипов.

5. С учетом опыта ДНК-идентификации военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе разработать стратегию непрямой молекулярно-генетической идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.

6. Разработать алгоритмы для решения задач непрямой мтДНК-идентификации личности при массовом поступлении неопознанных тел с учетом специфики перекрестной обработки массивов данных, получаемых для родственных групп и для неопознанных тел.

Научная новизна и теоретическое значение работы

По сравнению с ИУ1 и центральный регион (CR) D-петли обладает наименьшим полиморфизмом. Тем не менее, дискриминирующая способность этого региона достаточна для использования локуса СЯ в качестве дополнительного генетического маркера при мтДНК-идентификации.

Показана неоднородность распределения полиморфных сайтов в контрольном регионе митохондриального генома, что связано с наличием функционально-значимых областей. Будучи лишенными функциональной нагрузки и потенциально нейтральными для генетического отбора, некоторые участки контрольного региона мтДНК обладают значительным полиморфизмом. Функционально-значимые участки некодирующей области мтДНК имеют наименьшее число "горячих" точек.

Впервые описана расширенная терминационно-ассоциированная нуклеотидная последовательность 3-го типа (ETAS3) в области гипервариабельного сегмента НУ1 D-петли митохондриального генома человека. В районе гипервариабелыюго сегмента 2-го типа, НV2, описан блок консервативных нуклеотидных последовательностей (аналогичный CSB).

Показан взаимосвязанный характер точечных нуклеотидных замен в консервативных участках расширенных терминационных областей ETAS1 и ETAS2. На примере терминационных последовательностей (TAS, ETAS1 и ETAS2) показано, что дублирование функционально значимых участков D-петли мтДНК связано с наличием полиморфных позиций внутри этих областей.

С учетом механизмов возникновения нуклеотидных замен в мтДНК разработаны критерии повышения надежности при интерпретации результатов непрямой мтДНК-идентификации.

Введено понятие «Динамической» (постоянно пополняемой) Базы Данных первичных нуклеотидных последовательностей гипервариабельных регионов мтДНК для оценки идентификационной значимости непрямой мтДНК-идентификации.

Выделено 6 структурных генов ND2, ND3, ND5, ND6, CytB и АТР6, наиболее подходящих на роль дополнительных генетических маркеров митохондриального генома. Два из них (ND3 и ND6), вследствие небольших размеров, могут с успехом применяться для типирования высоко деградированных биологических образцов. Четыре маркера (ND2, АТР6, ND5 и CytB) имеют наиболее высокий дискриминирующий потенциал.

Практическое значение работы

Разработана концепция динамической базы данных митотипов. Использование объединенной базы данных европеоидных митотипов позволяет повысить идентификационную значимость ДНК-типирования более чем в 10 раз в случае уникальных типов мтДНК.

Показано, что вследствие высокого полиморфизма участок центрального региона D-петли и структурные гены мтДНК, такие как АТР6, CytB, ND2, ND3, ND5 и ND6, могут быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров при мтДНК-идентификации личности. Показано, что дискриминирующая способность отдельно взятых структурных генов мтДНК ниже, чем гипервариабельных сегментов контрольного региона. Однако комплексный анализ этих генетических маркеров существенно повышает надежность мтДНК-идентификации личности.

Разработаны экспертные схемы для анализа совпадающих HV1/HV2-профилей, которые должны предусматривать получение дополнительных данных секвенс-анализа о нуклеотидных последовательностях, лежащих за пределами участков 16024-16365 и 73-340.

Впервые в практике российской судебно-медицинской генетики проведена широкомасштабная непрямая молекулярно-генетическая идентификация военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе в период за 1994-2002 годы. Разработаны принципы и стратегии ДНК-идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел. Показано, что типирование биологических образцов, подвергшихся сильным гнилостным и термическим повреждениям наиболее эффективно по локусам ДНК, размер которых не превышает 200 оснований.

Разработана новая автоматизированная медико-криминалистическая система, использующая результаты мтДНК-анализа для решения задач непрямой идентификации личности на основе данных полиморфизма нуклеотидных последовательностей мтДНК в условиях поточной обработки информации при массовом поступления неопознанных тел.

Показано, что интеграция методов анализа некодирующей области мтДНК и области структурных генов в рамках единой схемы мтДНК-идентификации позволяет существенным образом повысить надежность непрямой идентификации с учетом статистических оценок.

Настоящее исследование является частью мероприятий, осуществляемых Правительством РФ (постановление № 1052 от 20.08.1997) в рамках программы по идентификации военнослужащих, погибших во время вооруженного конфликта 1994-96 гг. в районе Чеченской Республики.

Результаты настоящего исследования используются в образовательном процессе Ростовского государственного университета при подготовке специалистов биологического профиля.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Научно-методические принципы и подходы к решению задач непрямой молекулярно-генетической идентификации личности при массовом поступлении неопознанных тел наиболее эффективно реализуются при интеграции рутинных и компьютерных методов в идентификационных исследованиях, позволяющих производить сравнительный анализ ДНК-маркеров в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.

2. Комплексный анализ структурных генов и всей некодирующей области мтДНК позволит повысить индивидуализирующую способность мтДНК-идентификации по традиционным генетическим маркерам (ИУ1 и ИУ2) за счет увеличения количества уникальных митотипов.

3. Типирование маркеров ядерной и митохондриалыюй ДНК в рамках единой схемы идентификации личности на 2-3 порядка повышает надежность непрямой ДНК-идентификации личности в случае неполных родственных групп.

4. Разработанная модель динамической базы данных нуклеотидных последовательностей типов мтДНК существенно повышает идентификационную значимость мтДНК-типирования.

5. Критерии надежности интерпретации результатов мтДНК-идентификации включают в себя сведения о скорости химических реакций, лежащих в основе точечных нуклеотидных замен, и генетическую локализацию нуклеотидной замены.

Апробация работы

Основные результаты рабош освещались на следующих научных конференциях и симпозиумах:

1. 2-й Международный симпозиум «Химия и химическое образование», Владивосток, 2000.

2. Международная конференция «Химическое образование и развитие общества», Москва, 2000.

3. The Second European-American Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics, Dubrovnik, Croatia, 2001.

4. VI Международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 2002.

5. Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии», Краснодар, 2002.

6. 14th International Symposium on Human Identification, USA, Promega, 2003.

7. The Third European-American Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics, Zagreb, Croatia, 2003.

8. 20th International Congress ISFG, Arcachon, France, 2003.

9. The 39th IUPAC Congress and 86th Conference of the Canadian Society for Chemistry, Ottawa, Canada, 2003.

10. IV Научная сессия Ростовского медицинского государственного университета, Ростов-на-Дону, 2004.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 46 научных работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и включает 38 таблиц и 34 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов исследования (1 глава), результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 430 источников, в том числе 71 публикация на русском языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для исследования HV1 и HV2 локусов мтДНК служили образцы крови от 221 субъекта, не родственных по материнской линии, из случайной выборки российских граждан - родственников военнослужащих, пропавших без вести во время боевых действий на Северном Кавказе в период с 1994 по 2002 годы. В результате проведенных антропологических исследований установлено, что 8 субъектов из 221 принадлежали к монголоидному типу, остальные 213 -к европеоидному. Широта выборки охватывала 7 Федеральных округов Российской Федерации: Северо-западный - 11 человек, Центральный -37, Южный - 47, Приволжский - 58, Уральский - 35, Сибирский - 30, Дальневосточный - 3 человека. Широта и случайность выборки позволяет далее в тексте условно называть ее «российской популяцией».

Энзиматическую амплификацию гипервариабельных участков мтДНК, основанную на полимеразной цепкой реакции, проводили по локусам HV1 (16024-16365) и HV2 (00073-00340) с использованием следующих праймеров. Для HVl-локуса: FI5971 (5'-ТТА ACT CCA CCA ТТА GCA СС-3') и R16410 (5'-GAG

GAT GGT GGT CAA GGG AC-3'), для НУ2-локуса: F15 (5'-CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG-3') и R448 (5 VTGA GAT TAG TAG TAT GGG AG-3').

Материалом для исследования центрального региона D-петли и области структурных генов мтДНК служили образцы крови от 71 неродственного индивидуума (паспортизированные образцы крови, без выяснения этнической принадлежности, из депозитария 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации (ЦЛ МКИ) МО РФ). Из них 33 человека имели идентичные митотипы по локусам HV1 и HV2 (табл. 1), т.е. более 45% исследованных нами проб не поддавались дифференцировке с помощью исследования традиционных митохондриальных локусов HV1 и HV2.

Энзиматическуго амплификацию центрального региона D-петли проводили с использованием праймеров F16144 (5'-TGA CCA CCT GTA GTA CAT AA-3') и R270 (5'-TGG AAA GTG GCT GTG CAG AC-3').

Энзиматическую амплификацию гена 1-й субъединицы цитохром С оксидазы СОХ1; гена 3-й субъединицы цитохром С оксидазы СОХЗ; гена цитохрома В CytB; гена 2-й субъединицы NADH дегидрогеназы ND2; гена 3-й субъединицы NADH дегадрогеназы ND3; гена 4-й легкой субъединицы NADH дегадрогеназы ND4L; гена 5-й субъединицы NADH дегадрогеназы ND5; гена 6-й субъединицы NADH дегидрогеназы ND6 и гена 6-й субъединицы АТФазы АТР6 проводили с использованием следующих праймеров:_

Маркер Праймеры Исследуемый регион мтДНК

ND2 5'-GTTATACCCTTCCCGTACTA-3' 5'-TCAACTGCCTGCTATGATGG-3' 4470-4951

СОХ1 5'-TGCTTCACTCAGCCATTTTA-3' 5'-GTTGGTATAGAATGGGGTCT-3' 5904-6403

АТР6 5'-GTTCGCTTCATTCATTGCCC-3' 5'-TTGTCGTGCAGGTAGAGGCT-3' 8527-9207

СОХЗ 5'-CTGCACGACAACACATAATG-3' 5'-CTAAAAGAGTAAGACCCTCA-3' 9210-9600

ND3 5' - TAACTAGTTTT GACAACATT - 3' 5'-ATTCGTTTTGTTTAAACTAT-3' 10059-10406

ND4L 5'-TGATAATCATATTTACCAAATG-3' 5'-ATATAATTGTTGGGACGATT-3' 10470-10766

ND5 5'-AGCAGTCTGCGCCCTTACAC-3' 5'-TGAGATTGCTCGGGGGAATA-3' 13219-14150

ND6 5'-CCTACTCCTAATCACATAAC-3' 5'-TAGTCCGTGCGAGAATAATG-3' 14149-14673

CytB CATCGACCTTCCAGCCCCATCAAACAT TGTTCTACTGGTTGGCCTCCAATTСА 14830-15754

Секвенирование амплифицированных участков мтДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377 с помощью тест-наборов для секвенирования DNA Sequencing Kit, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready

Reaction (PE Applied Biosystems) с использованием флюоресцентно меченных дидезоксинуклеотидтрифосфатов с одним из перечисленных выше праймеров. Нуклеотидные последовательности L- и Н-цепи мтДНК сравнивались с эталонной кембриджской референтной последовательностью CRS [Anderson S. et al., 1981].

Вероятность случайного совпадения типов мтДНК (matching probability, МР) рассчитывали по формуле [Jones D.A., 1972; Stoneking M. et al., 1991]:

где f,—частота встречаемости i-ro митотипа.

Популяционные характеристики объединенных баз данных митотипов рассчитывали с помощью программы Mitosearch [Monson K.L. et al., 2002].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Использование центрального региона (CR) D-петли мтДНК в качестве дополнительного генетического маркера

Идентификационная значимость мтДНК-типирования по традиционным локусам (ИУ1 и ИУ2) не достаточно высока для получения надежных экспертных выводов о наличии кровного родства. Основное ограничение при мтДНК-идентификации личности заключается в получении сходных митотипов по ИУ1 и что снижает дискриминирующий потенциал этих генетических маркеров, поэтому возникает необходимость типирования дополнительных генетических маркеров. Однако -в случаях сильной деградации биологического материала исследование ядерных маркеров не всегда представляется возможным. Вследствие этого представляется перспективным исследование дополнительных полиморфных участков мтДНК, которые лучше сохраняются в деградированных биологических образцах.

Мы исследовали полиморфизм центрального региона некодирующей области мтДНК, который располагается между двумя гипервариабельными сегментами - ИУ1 и HV2 (рис. 1).

Рис. 1.

Локализация генетического маркера CR.

При исследовании CR, как потенциального генетического маркера мтДНК, обнаружено 10 полиморфных позиций, в пределах которых имели место 56 точечных замен. Вставок и делеций в пределах исследованной нами выборки не обнаружено: подавляющее большинство точечных замен были транзициями, и только в позиции 16524 имела место трансверсия А—»С (табл. 1). Только у 22-х

Таблица 1

Полиморфизм ( К среди 71 представителей российской популяции.

Г»й Номера Н71/НУ2 митотапо 1 ск

ец НУ1 НУ2 16399 А 16482 А 16519 Т 16524 А 16526 в >00573 00059 Г 00064 С 00065 т 700721

1Л1 1 16069,16126 16290 ГЗ 185.188 728 263 295 315 1 С

тЗ 2 6'23 16227,16234 16278 16162 ГЧ 50 263,009 1,3151

тб 3 16171 16223 16298 16327 161« 16357 ¡73 195 А 249Д63 3151

т; 4 16126 16294 16296 16334 B3.263.3i5 1 с

т13 5 16093,16724 16311 16154 И 263,309 1.315 1

в 16 6 16192 16125.16356 Ьз 52 185,18° 195 263,315 1 с

т|7 7 182СА186.263 309 1 315 1 с

т ■ 8 С 16343 ¡73,150 189,263,315 1

т19 9 16256 1627 рЗ 263 309 1,315 1 С

т20 10 16093 16311 11)5,263309 1 315 1 г

т'1 II 16242 1150 728.263.309 1,315 1

1П" 12 16294.16298 Е00^63Д09 1Л5 1

т24 25 13 16124 16>94,162Л 16304 [-3 195 263,309 1 315 1 с

т'6 14 16093 16224 16259 16311 03 265309 13151 С с

т27 15 16271.16298 363 109 1 315 1 С

га'9 16 1649,16362 С39 763,309 1,451 С с

тЧ 17 16197 16 04 00,315 1 с

|»12 18 16131 16304 М3.309 1,315 1

тЗЗ 19 16724,16311 [73,146,152,263,315 1 с

т34 20 16168 152263315 1 с

т15 21 16126,16294.16796,6324 173,261,309 1 115 1 с

тЗб 22 '1 161МЛС16183 16189 16249 16265 16311 03 93 152 263,285 309 1 315 1

т38 23 Ж16188 рЗ 263 315 ) с

т39 24 ;»16| 14.16192 16256.16270,16294 [73.263,315 1 А

г 40 25 ШЧ> ЬбЗ 309 1,315 1

т47 26 1Л19 РЗ 263,309 1315 1 г

.п44 27 16144.16189,-С16193 1.16770 33,150263,309 1315 1

в 46 28 16069 16126 73 185 188 228,263 295 309 1 3151 с

п>50 79 16304 93.263.315 1

т57 30 6126 16189,16294.16296,16304 '3,198.263.315 1 с

т53 31 73,263 315 1

в.54 32 16136 16223 16192 73 152 189 195 199 204,207,234 '63 315 1 с

1г55 33 16278 195 263 109 1,309 2,315 1 С

та 34 НЧ >3,182,263,309 1,315 1 с

тз7 35 6126 16140,16189.16194,163ц 73,195 263,309 1 309 2315 1

т5Я 36 150.203309 1,315 1

тбО 37 16189,1627 73 150,152^63309 1315 1 с

11161 38 16153,16798 73,763,309 1,315 1

9)5! 39 '63,315 1 с т

¿0 21 39 СКЬ ¡63 315 1 с

«Я 39 СЯ5 ¡63,315 1 с

378-79 39 СРЧ ¡63 315 1 с

1111148 40 1« ¡63 309 1,315 1 с

596 40 свэ «3,309 1 315 1 с

г>45 «1 сне 163.309 1,315 1 с

!]|| 112 40 С|!!> 763 309 1 315 1 С С

!» 40 ЖБ >63 309 1315 1

тП 41 гм ¡63 309 1,3092 315 1 с

ИЗО 41 361309 1 309 2 315 1 с Г

105 10« 41 же ¡63.1091 309 2Л 51

>12« 41 же ¡63 109 1,3092,315 1

1И9 10 42 6362 ¡39 263,309 1,315 1 С

(42 42 6У2 ¡39.263,309 и 15 1 С

>63 42 6362 Р 39.263309 1315 1 Ь

»70 42 6362 [¡19 263 309 0151 С

1П14 43 6156 Й 195 2633091,)151 с

1153 43 6 56 5 19з,'б ио9 1315 1 с

т!5 44 6354 263.14913151 с

5107 44 6154 263,309 13151 с

>143 144 45 6311 '63 315 1 с

«9 45 6311 763 315 1

т59 46 6304 '63 115 1 с

>176 46 6304 ¡63315 1

$113 47 6304 ¡63309 1,315 1

1 54 47 6304 63 309 1 315 1

т..7 48 672^,16356 73.195,263 310 с

!»7 48 6723 16356 73.1)5 263310 с т с

т7' 49 62.19 16256 '63 315 1 с

« 5 49 6209,16256 ¡63 315 1 с

50 6192,16256.16270 "3 2633151 А

130 50 6192 16256,16270 '3.263,315 1 с

Примечание Обозначение образцов приведено согласно их шифру в банке данных биологических образцов 124 ЦП МКИ МО РФ

человек из нашей выборки по локусу CR не было обнаружено отличий от CRS-последовательности [Anderson S. et al., 1981].

В то же время у 43 человек было по одной нуклеотидной замене, у 5 - по две и у 1 - три нуклеотидных замены (табл. 1). Таким образом, по количеству полиморфных позиций гипервариабельные участки контрольного региона ранжировались следующим образом: подавляющее большинство полиморфных точек локализованы в области HV1, наименьшее - в области CR. Такой же порядок сохранялся и при сравнении величин генетического разнообразия типов мтДНК.

В области CR мы обнаружили палиндромные и повторяющиеся нуклеотидные последовательности с неизвестными функциями. Так на участке 16373-16393 расположен большой палиндром с неизвестной функцией: 5'-GACCCCCCTC :::::: :: А 3'-CTGGGGATAG

Примечательно, что ни в области контрольного элемента L-цепи (mt3), ни в палиндромных последовательностях нам не удалось обнаружить полиморфных точек.

Таблица 2.

Индивидуализирующие характеристики локуса CR как дополнительного маркера для мтДНК-идентификации.

Маркер Локализация Кол-во Кол-во Вероятность

полиморфных митотипов случайного

точек совпадения митотипов, %

HV1 16024-16365 46 40 0,078

HV2 73-340 26 30 0,078

HV1+HV2 16024-16365 73-340 72 50 0,028

CR 16366-72 10 12 0,319

HV1+HV2+CR 16024-340 82 59 0,021

CR-локус продемонстрировал достаточно высокую степень полиморфизма для его использования в качестве дополнительного генетического маркера при мтДНК-идентификации кровного родства. При совместном анализе традиционных гипервариабельных локусов контрольного региона (ИУ1 + HV2) и CR количество образцов с одинаковыми митотипами сократилось с 33 до 20, т.е. приблизительно на 40%. При этом величина случайного совпадения митотипов (МР) при комплексном исследовании трех локусов HV1, и CR уменьшилась в 1,4 раза и составила 0,0208 (табл. 2).

Таким образом, наше исследование наглядно продемонстрировало возможность эффективного использования локуса CR как дополнительного

маркера митохондриального генома к традиционно используемым локусам ИУ1 и ИУ2 при мтДНК-идентификации личности.

3.2. Увеличение идентификационной значимости мтДНК-типирования при дополнительном анализе структурных генов митохондриального генома

В целях повышения потенциала индивидуализации мтДНК-идентификации представляется перспективным анализ дополнительных генетических маркеров мтДНК, лежащих за пределами некодирующей области.

Для демонстрации возможностей структурных генов мтДНК в качестве дополнительных генегических маркеров мы провели исследование полиморфизма нуклеотидных последовательностей девяти структурных генов мтДНК: гена 1-й субъединицы цитохром С оксидазы (СОХ1), гена 3-й субъединицы цитохром С оксидазы (СОХЗ), гена цитохрома В (СуВ), гена 2-й субъединицы КАОН дегидрогеназы (N02), гена 3-й субъединицы КАОИ дегидрогеназы (N03), гена 4-й малой субъединицы КАОИ дегидрогеназы (К04Ь), гена 5-й субъединицы КАОИ дегидрогеназы (N05), гена 6-й субъединицы КАОН дегидрогеназы (N06), гена 6-й субъединицы АТФазы (АТР6) (табл. 3).

Таблица 3.

Индивидуализирующие характеристики структурных генов мтДНК для выборки из 71 представителя российской популяции.__

Локус Локализация Кол-во полиморфных позиций Частота молчащих Кол-во митотипов Кол-во митотипов с учетом ИУ1 и Вероятность случайного совпадения

ИУ2 митотипов

ИУ1 + ИУ2 16024-16365 00073-00340 72 1 50 50 0,028

N02 4470-4951 11 0,545 15 57 0,340

N03 10059-10406 8 0,750 9 51 0,652

nd4l 10470-10766 3 1 4 51 0,816

N05 13219-14150 18 0,556 15 56 0,545

N06 14149-14673 8 0,875 8 52 0,696

Су® 14830-15754 12 0,667 10 53 0,589

СОХ1 5904-6403 6 0,833 6 57 0,682

СОХЗ 9210-9600 6 0,833 6 51 0,721

АТР6 8527-9207 19 0,526 16 56 0,503

Ввиду того, что в экспертной судебно-медицинской практике нередко приходится иметь дело с деградированной ДНК, то нас в первую очередь интересовали небольшие локусы, размеры которых сопоставимы с размерами гипервариабельных сегментов ИУ1 и ИУ2. Естественно, на роль таких потенциальных дополнительных генетических маркеров претендуют в первую очередь гены АТР8 (207 н.п.), ND4L (297 н.п.), N03 (346 н.п.) и N06 (525 н.п.) Исследование таких локусов имело бы большие перспективы для мтДНК-анализа высоко деградированных биологических объектов.

Крайне низкая величина разнообразия АТР8-митотипов (0,043) позволила нам исключить этот локус из потенциальных генетических маркеров для мтДНК-идентификации.

Анализ первичной структуры гена ND6 показал, что исследуемый локус (14149-14673) является полиморфным. Вставок и делений в пределах исследуемой выборки обнаружено не было - точечные мутации были представлены в основном транзициями. Полиморфизм был обнаружен по 8 позициям: 14182, 14200, 14233, 14272, 14364, 14365, 14484 и 14569. Величина генетического разнообразия митотипов участка гена ND6 равна 0,308, т.е. вероятность того, что два, случайно выбранных из популяции, индивида будут иметь идентичный митотип ND6 равна 0,696.

При анализе полиморфизма гена ND4L-гeHa было выявлено 4 митотипа, один из которых (10692) был уникальным. Были обнаружены 3 полиморфные позиции 10550, 10589, 10692, в которых имели место транзиции А—>0, О—> Аи С Т, соответственно.

Среди трех структурных генов мтДНК (ND6, ND4L и ND3) ген 3-й субъединицы НАДН-дегидрогеназного комплекса обладал наибольшим полиморфизмом (табл. 3). Здесь было обнаружено 8 полиморфных позиций.

Большинство мутаций, обнаруженных в генах 3-й, 4-й малой и 6-й субъединиц НАДН-дегидрогеназного комплекса мтДНК, не приводит к аминокислотным заменам, а смысловые замены ограничены аминокислотами с алифатическими радикалами и также, по-видимому, нейтральны.

Величина случайного совпадения ND3-митотипов составляет 0,652. Следовательно, этот генетический маркер является наиболее информативным из трех структурных генов ND3, ND4L и ND6.

По сравнению с локусами ND3, ND6 в гене ND4L относительная частота встречаемости полиморфных позиций крайне низка и составляла в среднем одна полиморфная позиция на почти 100 нуклеотидов. При этом величина МР для этого локуса (0,816) позволяет исключить его из потенциальных дополнительных маркеров для мтДНК-идентификации. Тем более что результаты его типирования практически не влияли на дискриминирующую способность мтДНК-идентификации (табл. 3).

При совместном типировании двух локусов ND3 и ND6 величина случайного совпадения митотипов оказалась ниже, чем для каждого из рассмотренных структурных генов, и составила 0,433. Это указывает на хорошую дискриминирующую способность этих двух структурных генов как дополнительных генетических маркеров для молекулярно-генетической идентификации личности человека. Тем не менее, их дискриминирующая способность оказалась ниже, по сравнению с НУ1- и НУ2-маркерами.

Следующим этапом нашей работы было исследование полиморфизма гена АТР6, который, также как и гены ND3 и ND6, обладает небольшими размерами и удобен при исследовании сильно деградированных образцов ДНК.

На участке 8527-9207 было обнаружено 19 полиморфных позиций. Число митотипов по локусу АТР6 равнялось 16 (табл. 3). Величина случайного совпадения АТРб-митотипов была меньше чем для каждого из трех

рассмотренных выше локусов, и составила 0,503. То есть исследование только одного локуса АТР6 позволяет в 2 раза повысить надежность ДНК-идентификации.

Действительно, использование локуса АТР6 как дополнительного генетического маркера для мтДНК-идентификации позволило уменьшить число субъектов с идентичными митотипами по локусам ИУ1 и с 33 (табл. 1) до 26 человек, при этом число типов мтДНК увеличилось от 50 до 56 (табл. 3) Для сравнения, комплексный анализ всех трех генов ND3, ND4L и ND6 позволил дифференцировать только 2 сходных митотипа - (263, 315.1С) и (263, 309.1С, 309.2С, 315.1С). И это притом, что размер локуса АТР6 практически равен суммарному размеру двух локусов ИУ1 и ИУ2.

Совместный анализ трех локусов (АТР6, ND3 и ND6) позволил выделить уже 20 митотипов из 12 идентичных, при этом число субъектов с одинаковыми ИУ1- и НУ2-митотипами сократилось почти на одну треть, т.е. с 33 (табл. 1) до 23 человек. То есть комплексный анализ маркеров АТР6, ND3 и ND6 продемонстрировал хороший потенциал дискриминации.

Анализ остальных маркеров мтДНК - CytB, COX1, СОХ3, №2 и ND5 -показал, что наиболее полиморфным среди них является локус ND2. Для него величина разнообразия миготипов равна 0,669, а вероятность случайного совпадения - 0,340. Т.е. анализ только одного локуса ND2 позволяет почти в 3 раза увеличить дискриминирующую способность ДНК-идентификации.

Дискриминирующие характеристики остальных локусов (CytB, COX1, СОХЗ, ND2 и ND5) приведены в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что наиболее приемлемые для генетических маркеров характеристики имеют локусы: ND2, ND5, CytB.

Таким образом, из девяти исследованных структурных генов ND2, ND3, ND4L, ND5, ND6, СОХ1, СОХЗ, CytB и АТР6 наиболее перспективны как дополнительные генетические маркеры для мтДНК-идентификации являются локусы ND2, АТР6, ND5 и CytB. Каждый из них потенциально способен повысить дискриминирующую способность ДНК-идентификации в 2,9, 2, 1,8 и 1,7 раза, соответственно.

Причем два локуса ND3 и ND6, несмотря на невысокие дискриминирующие характеристики, имеют небольшие размеры, и, поэтому могут с успехом применяться для типирования высоко деградированных биологических образцов.

Комплексный анализ всех 9 структурных генов позволил увеличить количество митотипов с 50 до 68 за счет разделения идентичных HV1 и митотипов (табл. 4). Дополнительный анализ первичных нуклеотидных последовательностей центрального региона (CR) мтДНК позволил разделить около 94% идентичных митотипов (кроме митотипа 16304, 263, 315.1С), что позволило увеличить число митотипов с 50 до 70 (табл. 4).

Наши экспериментальные данные показали, что исследованные структурные гены обладают более низким уровнем полиморфизма по сравнению с вариабельными участками некодирующей области мтДНК. Поэтому в качестве самостоятельных генетических маркеров для мтДНК-идентификации личности они не представляют большого интереса. Однако если типировать структурные

гены в дополнение к традиционным маркерам ЫУ1 и ЫУ2, дискриминирующая способность мтДНК-идентификации существенно возрастает (табл. 4).

Таблица 4.

Дискриминирующие характеристики дополнительных маркеров мтДНК при их комплексном типировании с маркерами ЫУ1 и ЫУ2.

Локусы Кол-во митотипов вероятность случайного совпадения митотипов величина генетического разнообразия митотипов

ЫУ1+ЫУ2 50 0,028 0,986

мв2+мб3+мв5+мб6+су1в+атр6 52 0,063 0,950

ыу1+ыу2+мв2+мв3+мв5+мб6+ Су1В+АТРб 64 0,017 0,997

ыу1+ыу2+мв2+мв3+мв4ь+мв5+ МБ6+С0Х1 +С0Х3+Су1В+АТР6 68 0,015 0,998

ыу1+ыу2+мв2+мв3+мв4ь+мб5+ МБ6+С0Х 1+С0Х3+Су1В+АТР6+СЯ 70 0,014 0,9995

Таким образом, несмотря на то, что дискриминирующая способность отдельно взятых структурных генов мтДНК ниже, чем гипервариабельных сегментов контрольного региона, комплексный анализ этих генетических маркеров существенно повышает надежность мтДНК-идентификации личности.

Исходя из вышеизложенного, схемы исследования для судебно-медицинских случаев необходимо создавать в соответствии со стандартными рабочими процедурами и с учетом общего количества образцов, поступивших на анализ. Разрешающая способность применяемого комплекса методов должна быть адекватной количеству потенциальных источников происхождения данного образца и количеству/качеству выявленных митотипов. Если сравниваемые по НУ1/НУ2 локусам образцы проявляют уникальные (не повторяющиеся) в пределах данной выборки митотипы, анализ дополнительных локусов мтДНК не требуется.

Для анализа совпадающих НУ1/НУ2-профилей экспертные схемы должны предусматривать получение дополнительных данных секвенс-анализа о нуклеотидных последовательностях, лежащих за пределами участков гипервариабельных сегментов 1-го и 2-го типов. В этом случае расшифровка нуклеотидных последовательностей проводится для обеих цепей (легкой и тяжелой) одного продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР), либо одной из цепей (с использованием прямого или обратного праймера), но для двух разных продуктов ПЦР.

Предлагаемый нами подход вполне логично вписывается в общепринятую схему ДНК-идентификадии личности с использованием генетических маркеров мтДНК и поэтому не потребует применения качественно нового оборудования, реактивов, программных продуктов или принципиально иных подходов для

интерпретации полученных данных. Нуклеотидные последовательности дополнительных генетических маркеров митохондриального генома обладают хорошей стабильностью в процессе смены поколений и поэтому представляют собой новый, хорошо воспроизводимый, чувствительный и высокоэффективный инструмент для решения задач идентификации личности в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.

3.3. Оптимизация баз данных митотипов для решения задач ДНК-идентификации личности

Стандартная схема судебно-медицинской мтДНК-идентификации личности предусматривает проведение секвенс-анализа гипервариабельных локусов 1-го и 2-го типов контрольного региона. Экспертное использование баз данных (БД) HV1 и HV2 секвенсов должно учитывать этнорасовые различия. Выявленные нами особенности строения контрольного региона мтДНК для российской популяции европеоидов имеют место у других европеоидных этнических групп с малой межиндивидуальной дифференцировкой митохондриальных геномов: Германия [Lutz S. et al., 1998], Австрия [Parson W. et al., 1998], Франция [Rousselet F., Mangin P., 1998], Швейцария [Pult I. et al., 1994; Dimo-Simonin N. et al., 2000], Португалия [Pereira L. et al., 2000], Испания [Corte-Real H.B. et al., 1996; Crespillo M. et al, 2000], Италия [Tagliabracci A. et al., 2001], Хорватии [Gabriel M.N. et al., 2001].

Латиноамериканцы [Monson K.L. et al., 2002] имеют ряд характерных отличий в первичной структуре контрольного региона мтДНК. Распределение частот встречаемости точечных мутаций в позициях 16183, 16223, 16290, 16296, 16319, 16362, 73, 235 и 249 у латиноамериканцев имеет наибольшее совпадение с азиатскими этническими группами, нежели с европейскими.

Распределение полиморфных сайтов в контрольном регионе мтДНК азиатских популяций - Корея [Pfeiffer H. et al., 1998], Япония [Horai S. et al., 1996], Китай (Тайвань) [Horai S. et al., 1996; Monson K.L. et al., 2002], Таиланд [Monson K.L. et al., 2002], Гуам [Monson K.L. et al., 2002] также имеют ряд отличий по сравнению с европейскими популяциями.

Практически у всех популяций азиатского происхождения и большинства негроидов в 73 позиции (HV2) наблюдается транзиция A/G, тогда как в российской популяции она встречалась только в 57,9% случаев. Замена С/Т в 16223 позиции у азиатских популяций и негроидов встречалась в 68,3% и 91,7% случаев, соответственно, тогда как в российской популяции только в 12,7% случаев. В азиатских этнических группах и у негроидов практически не встречались замены в позициях 16069 и 16296

Для БД афро-американских митотипов (n=1148) среднее количество нуклеотидных различий между индивидуумами равно 14,5 [Monson K.L. et al., 2002], что почти в 2 раза выше, чем для европеоидов. Частота совпадений идентичных НУ1/НУ2-митотипов при попарном сравнении в европейской и афро-американской БД составляет 0,00022, что на порядок отличается от аналогичного показателя только для европейских баз данных. Все это указывает на различия

нуклеотидных последовательностей мтДНК между базами данных различных расовых групп и демонстрирует необходимость поддержания отдельных баз данных для основных этно-расовых групп.

Обратимся к статистической оценке результатов мтДНК-идентификации: частоте (Р), с которой специфические профили мтДНК распространены в различных этнических группах и связанном с ней в судопроизводстве показателе LR. Потенциал дискриминации мтДНК-идентификации личности ограничен, прежде всего, размером существующих баз данных митотипов. Все популяционные базы данных европеоидов проявляют сходную картину в виде наличия большого количества уникальных и редких митотипов и меньшего количества общих типов мтДНК. Наблюдаемая частота или вероятность обнаружения (Р) уникальных митотипов рассчитывается, как величина:

P=l/N,

где N - размер реально существующей базы данных митотипов для данной популяции.

Так как величины Р и LR (в самых простых случаях) связаны между собой соотношением LR=1/P, очевидна необходимость увеличения БД митотипов для повышения надежности мтДНК-идентификации. Например, увеличение размера БД в 10 раз, увеличивает величину LR, при выполнении условия очевидных различий сравниваемых митотипов, также в 10 раз.

БД НУ1 -митотипов 124 ЦЛ МКИ МО РФ содержит данные на 221 человека, представленных в EMBL GenBank [регистрационные номера AF448598-AF448721 и AF450327-AF450450, IV., Ivanov P.L., 2001].

В случае секвенс-анализа обоих гипервариабельных участков величина случайного совпадения митотипов (МР) для российской БД (п=221) составляет 0,0068. Это значит, что митотипические признаки, при их случайном сочетании, в среднем встречаются у одного человека из 147 для данной БД. Очевидно, что эта величина недостаточна для категоричного утверждения о наличии кровнородственных связей в случае достаточно большой или открытой выборки.

Поэтому очевидна необходимость разработки объективных критериев, позволяющих объединять базы данных нуклеотидных последовательностей, полученных в различных лабораториях, для повышения доказательной способности мтДНК-идентификации личности. Для обозначения постоянно пополняемой базы данных нуклеотидных последовательностей мтДНК мы предлагаем ввести термин «динамическая база данных митотипов». Существуют все основания для того, чтобы пополнять динамическую БД нуклеотидными последовательностями, полученными в других лабораториях мира для данной этно-расовой группы. Для корректного объединения митотипов в постоянно пополняемой динамической базе данных (ДБД), необходимо выполнение следующих методических условий:

1. Стандарты лабораторий, являющихся потенциальными поставщиками нуклеотидных последовательностей, должны соответствовать требованиям технической рабочей группы по методам ДНК анализа (TWGDAM) [TWGDAM, 1991; TWGDAM, 1995].

2. Каждый образец ДБД митотипов должен быть паспортизирован.

3. Необходима унификация базовых процедур определения нуклеотидных последовательностей мтДНК.

4. Митотипы, включаемые в объединенную базу данных (БД), должны отвечать требованию «случайной выборки».

Таблица 5.

Популяционные характеристики баз данных европеоидных митотипов

База данных Кол-во человек в БД Кол-во митотипов Кол-во уникальных митотипов (%) Вероятность случайного совпадения митотипов Среднее число различий МР% h

Италия 83 75 72 (96,0) 0,00676 8,212±3,405 1,87 0,9932

Австрия 101 89 80(89,9) 0,00297 8,422*4,091 1,28 0,9970

Словения 103 86 73 (84,9) 0,00457 7,880±3,597 1,42 0,9954

Германия 109 100 92 (92,0) 0,00241 8,012±3,622 1,09 0,9983

Франция 107 97 93 (95,9) 0,00388 7,194±3,294 1,32 0,9961

Босния 144 115 95 (82,6) 0,00437 7,630±3,566 1,13 0,9956

Россия 221 185 161 (87,0) 0,00226 8,341±3,460 0,68 0,9977

США 1392 914 758(82,9) 0,00377 8,015±3,715 0,45 0,9963

Объединенная БД митотипов 2260 1420 1165 (82,0) 0,00320 8,011±3,655 0,36 0,9968

О корректности объединения и непрерывного пополнения баз данных митотипов, полученных в разных лабораториях, мы можем судить по процентному содержанию уникальных и общих митотипов, частотам специфических нуклеотидных замен в полиморфных точках, наличию делеций/инсерций и по другим базовым генетическим характеристикам БД митотипов. Европеоидная группа митотипов является относительно однородной и обладает сходными характеристиками по таким показателям как: величина генетического разнообразия, вероятность случайного совпадения митотипов, частота совпадений митотипов и среднее число различий (табл. 5). Это может быть проиллюстрировано моделированием увеличения объема базы данных европейских митотипов. Нами были исследованы базы данных митотипов российских граждан [EMBL GenBank AF448598-AF448721 и AF450327-AF450450; , Kornienko I.V., Ivanov P.L., 2001], белого населения США [Miller K.W.P. et al, 1996; Budowle B. et al., 1999; Miller K.W.P., Budowle В., 2001; Monson K.L. et al., 2002], боснийцев [Malyarchuk B.A. et al., 2003], словенцев [Malyarchuk B.A. et al., 2003], австрийцев [Parson W. et al., 1998], французов [Miller K.W.P. et at., 1996; Budowle B. et al., 1999; Miller K.W.P., Budowle В., 2001; Monson K.L. et al., 2002], итальянцев [Tagliabracci A. et al., 2001], немцев [Pfeiffer H. et al., 1999]. С помощью программы Mitoseurch [Monson K.L. et al., 2002] были рассчитаны популяционные характеристики объединенных баз данных митотипсв (табл. 5). Например, для российской популяции европеоидов результатом этого анализа являются 55 случаев совпадений митотипов из 24310 парных сравнений, а эмпирически определяемая вероятность случайного совпадения равна 0,00226.

Таким образом, митотипы двух случайным образом выбранных индивидуумов из этой популяции совпадают в среднем в одном из ~442 случаев (табл. 5).

— ■ч- VI \о г- — -<Ч

Объем БД митотипов Кол-во митотипов —* — Кол-во уникальных митотипов

Рис. 2.

Зависимость количества общих и уникальных митотипов от объема базы данных.

Наблюдаемая зависимость изменения числа общих и уникальных митотипов от объема БД (рис. 2) дает основание для использования общей Базы Данных европеоидных митотипов для вероятностной оценки кровного родства при непрямой мтДНК-идентификации. Таким образом, введение термина ДБД для оценки значимости мтДНК-идентификации представляется вполне корректным. Данные, приведенные в таблице 5, наглядно демонстрируют, что при увеличении объема динамической базы данных процент содержания уникальных митотипов от общего количества митотипов плавно уменьшается (рис. 2). Для самой маленькой БД (Италия, п=83) относительное количество уникальных митотипов составляет 96,0%, а для российской БД (п=221) относительное количество уникальных митотипов составляет уже 87,0%. При объединении баз данных по европеоидам (п=2260) относительный процент содержания уникальных митотипов сокращается еще на 5% и составляет 82,0% (табл. 5).

При объединении всех восьми БД европеоидных митотипов значение величины случайного совпадения типов мтДНК (МР) уменьшается с 0,68% до 0,36% (табл. 5). Следовательно, использование объединенной БД митотипов европеоидов позволяет более чем в два раза увеличить надежность результатов непрямой молекулярно-генетической идентификации с использованием гипервариабельных локусов контрольного региона мтДНК. В объединенной БД европеоидных митотипов около половины всех субъектов имеют уникальные митотипы. Это указывает на то, что при оценке идентификационной значимости результатов мтДНК-идентификации использование объединенной БД европейских митотипов (п=2260) вместо российской БД (п=221) позволит в

половине экспертных случаев (когда идентифицируемые объекты имеют уникальные митотипы) увеличить значение LR более чем на порядок.

Дальнейшая дифференцировка идентичных митотипов возможна лишь при условии увеличения количества локусов мтДНК, вовлекаемых в процесс идентификации личности. Это подход приведет к увеличению процента относительного содержания уникальных митотипов, в зависимости от степени полиморфности дополнительно анализируемых локусов.

Таким образом, использование объединенной ДБД митотипов, сформированной с выполнением критериев TWGDAM [TWGDAM, 1991; TWGDAM, 1995], позволит существенно повысить надежность идентификации личности с использованием локусов мтДНК в условиях массового поступления неопознанных тел.

3.4. Разработка критериев надежности при интерпретации результатов мтДНК-идентификации

Анализ первичных последовательностей показал, что HV1 и HV2 являются высоко полиморфными регионами. Результаты исследования нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов локусов HV1 и HV2 показали наличие 185 митотипов, 161 из которых были уникальными. Первичные последовательности всех митотипов представлены в EMBL GenBank (регистрационные номера AF448598-AF448721 и AF450327-AF450450). При сравнении с референтной последовательностью мтДНК в пределах контрольного региона обнаружили 140 полиморфных позиций, 95 из которых были на участке HVl,a 45-на HV2.

Большинство различий между митотипами носили характер транзиций, что не исключает реализации этих различий по метилазному типу, хотя по некоторым литературным данным метилазная активность в норме в митохондриях отсутствует.

Высокий уровень нуклеотидных замен в гипервариабельных областях D-петли доказывает, что этот регион имеет высокий потенциал для генетического маркирования в популяционных исследованиях.

Полиморфизм региона HV1 выше, чем HV2. Вероятно, это связано с тем, что HV2 является местом локализации сайтов, ответственных за начало репликации мтДНК: здесь расположены сайты связывания белковых факторов mTFl и репликативных праймеров. Тогда как в HV1 расположены последовательности, ответственные в основном за терминацию транскрипции мтРНК. Естественно, что большее давление отбора будут испытывать мутации, возникающие в HV2.

Аспект экспертного использования данных о полиморфизме мтДНК определяется значительной этно-расовой дифференциацией митохондриальных геномов. Следует отметить, что выявленные особенности строения контрольного региона мтДНК внутри русской популяции имели место у других европейских этнических групп с малой межиндивидуальной дифференциацией митохондриальных геномов [Lutz S. et al., 1998; Parson W. et al., 1998; Crespillo M.

et al., 2000; Dimo-Simonin N. et al., 2000; Gabriel M.N., 2001; Malyarchuk B.A. et al., 2003].

Мы предложили механизм возникновения нуклеотидных замен в одноцепочечных нуклеотидных фрагментах D-петли, и в основе которого лежит гидролиз гликозидной СЕЯЗИ между азотистыми основаниями и углеводным остатком в нуклеотидах на фоне свободно-радикального повреждения ДНК-полимеразы

Данный механизм позволяет объяснить преимущественное накопление транзиций.

Скорость химической реакции, приводящей к нуклеотидной замене необходимо учитывать при интерпретации результатов мтДНК-анализа. Так, в случае несовпадения по одному нуклеотиду в контрольном регионе мтДНК предполагаемых матрилинейных родственников необходимо провести анализ характера этой замены. Если мы имеем дело с транзицией типа Т->С, то, учитывая высокую частоту замены такого типа в контрольном регионе мтДНК, мы не в праве исключить кровное родство. И в этом случае возникает необходимость проведения мтДНК-типирования по дополнительным генетическим маркерам. В случае трансверсий (за исключением 16183 А/С) у нас есть основание, принимая во внимание относительно низкую скорость химической реакции такого рода, для исключения кровного родства.

То же самое относится к вставкам в поли-С последовательностях (1618316193 и 303-315). Если два НУ1/НУ2-митотииа отличаются на один нуклеотид в поли-С последовательности, нельзя исключить их принадлежность к одному матрилинейному ряду. В этом случае необходимо проведение дополнительного молекулярно-генетического исследования других участков мтДНК.

Кроме того, необходимо учитывать генетическую локализацию той или иной точечной замены. Так, мы показали, что вероятность возникновения точечных замен в функционально нейтральных участках контрольного региона в несколько раз выше, чем в функционально значимых. Поэтому идентификационный «вес» точечных замен в функционально значимых сайтах (TAS, ETAS 1, ETAS2, ETAS3, CSB1, CSB2, mtTFl) гораздо выше по сравнению с функционально нейтральными участками мтДНК.

На основании рассмотренных механизмов возникновения нуклеотидных замен (транзиций, трансверсий, вставок и делеций) можно определить критерии надежности мтДНК-идентификации матрилинейного родства:

1. В тех случаях, когда две нуклеотидные последовательности мтДНК из различных биологических источников совпадают, нельзя исключить, что два источника мтДНК имеют происхождение от одного лица или от лиц, состоящих в родстве по материнской линии.

2. В тех случаях, когда две нуклеотидные последовательности мтДНК из двух отдельных источников не совпадают, можно сделать ряд вероятных выводов:

а. При наличии трех или более различий в нуклеотидных последовательностях -матрилинейное родство исключается.

б. Если имеется 1-2 различий в нуклеотидных последовательностях, нужно осторожно интерпретировать полученные результаты. Необходимо оценить тип

точечной замены и ее генетическую локализацию, а также учесть родственные взаимоотношения между биологическими образцами, т.е. число генераций, отделяющих идентифицируемые объекты от образцов сравнения в матрилинейном ряду.

3.5. Комплексный анализ ядерных и митохондриальных ДНК-маркеров при непрямой идентификации личности

ДНК-индивидуализация никогда не обеспечивает 100%-ную достоверность идентификации в условиях открытых групп. При установлении возможного кровного родства проводится вероятностная оценка принадлежности неопознанного индивида к определенной родственной группе. Часто вероятностную оценку кровного родства проводят с помощью байесовских алгоритмов, основанных на расчетах отношения правдоподобия оценки гипотез кровного родства (likelihood ratio, LR) [Evett I.W. et al., 1989]. Ранжирование значений отношения вероятностей гипотез кровного родства при непрямой ДНК-идентификации личности можно провести в соответствии с общепринятыми формулировками [Evett I.W., Weir B.S., 1998]. При этом кровное родство при непрямой ДНК-идентификации можно считать пракгически доказанным при значении LR превышающем величину 1000.

Наш многолетний практический опыт показал, что в ряде случаев, когда объектом сравнения выступают неполные семьи (в качестве образца сравнения доступен только один из кровных родственников), коэффициент отношения вероятностей их кровного родства (LR) оказывается низким (меньше тысячи), что не позволяет с высокой надежностью сделать вывод о возможном кровном родстве.

Так с 1998 по 2003 год в ДНК-депозитарий 124 ЦЛ МКИ МО РФ был доставлен сравнительный материал на 926 военнослужащих, погибших или пропавших без вести в ходе боевых операций на Северном Кавказе. При этом 53,5% сравнительного материала было представлено полными семьями, т.е. парами мать-отец или супруг(а)-ребенок (табл. 6).

Таблица 6.

Характеристика сравнительного материала, поступившего в ДНК-депозитарий 124 ЦЛ МКИ МО РФ в период с 1998 по 2003 гг.__

классификация родственных групп Состав родственных групп Количество Процент

Полная мать-отец, супруг(а)-ребенок 495 53,5

Неполная матрилинейные родственники 363 39,2

Неполная патрилинейные родственники 41 4,4

Неполная дети 27 2,9

Всего 926 100

Непрямая молекулярно-генетическая идентификация только по локусам системы HLA DQA1+ Polymarker (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC) в подавляющем большинстве случаев не позволяла преодолеть барьер LR=1000. Для полных родственных групп только в 22% случаев значение LR при типировании 6 локусов системы DQAl+Polymarker было достаточным для категоричных выводов о наличии кровного родства. В случаях, когда объектами сравнения для непрямой ДНК-идентификации выступали неполные родственные группы, типирование этой генетической системы не позволяло достигать необходимой регламентирующей величины LR (табл. 7).

Таблица 7.

Зависимость коэффициента правдоподобия оценки гипотез кровного родства от состава родственных групп

Генетическаятест-система Родственная группа Кол-во экспертиз Значение коэффицнента правдоподобия, LR

<10 10-100 1001000 >1000

DQA1+Polymarker Полная (n=263) 9 1 (11,1%) 6 (66,7%) 2 (22,2%)

DQAl+Polymarker, D1S80 9 4 (44,4%) 5 (55,6%)

DQAl+Polymarker, LPL,vWA,TH01 46 9 (19,55%) 9 (19,55%) 28 (60,9%)

DQAl+Polymarker, D1S80, LPL, vWA, TH01 11 1 (9,1%) 10(90,9%)

ProfilerPlus 157 6 (3,8%) 151 (96,2%)

DQAl+Polymarker, ProfilerPlus 31 1 (3,2%) 30(96,8%)

DQAl+Polymarker Неполная (n=165) 5 4 (80,0%) 1 (20,0%)

DQAl+Polymarker, D1S80 7 3 (42,9%) 4 (57,1%)

DQAl+Polymarker, LPL,v\VA,TH01 31 11 (35,5%) 16 (51,6%) 3 (9,7%) 1 (3,2%)

DQAl+Polymarker, D1S80, LPL, vWA, TH01 6 2 (33,3%) 4 (66,7%)

ProfilerPlus 92 8 (8,7%) 21 (22,8%) 63 (68,5%)

DQAl+Polymarker, ProfilerPlus 24 1 (4,1%) 7 (29,2%) 16(66,7%)

Дополнительный анализ 3 8ТК локусов ЬРЬ, vWA и ТН01 позволил усилить надежность непрямой ДНК-идентификации. Так, для более чем 60% полных родственных групп стало возможным проведение ДНК-идентификации кровного

родства с высокой степенью вероятности (табл. 7). Тогда как для неполных родственных групп только в 3% случаев коэффициент правдоподобия оценки гипотезы о кровном родстве превышал значение 1000 (табл. 7).

Внедрение в экспертную практику мультилокусной системы AmpFlSTR Profiler Plus позволило генотипировать одновременно 9 STR-локусов: D3S1358, vWA, FGA, D8S1J79, D21S11, D18S51, D5S818, DJ3S317 и D7S820, что существенно повысило потенциал дискриминации непрямой молекулярно-генетической идентификации личности [Kornienko I.V. et al., 2002]. При генотипировании 9 локусов (D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 и D7S820) молекулярно-генетическая верификация кровного родства среди полных родственных групп в 96% случаев имела доказательную силу (табл. 7).

В случаях же когда сравнительных материал для непрямой молекулярно-генетической идентификации был представлен неполными родственными группами, примерно в Уз случаев не удалось преодолеть барьер LR=1000 (табл. 7). В этих случаях для повышения дискриминирующей способности непрямой ДНК-идентификации необходимо было увеличить количество анализируемых генетических маркеров. Дополнительный анализ локусов системы HLA DQAl+PolyMarker существенно не повлиял на значение LR (табл. 7).

Принимая во внимание, что около 40% сравнительного материала, поступившего в ДНК-депозитарий 124 ЦЛ МКИ МО РФ, представлено только родственниками по материнской линии (табл. 6), повышение надежности непрямой ДНК-идентификации могло быть достигнуто за счет дополнительного исследования генетических маркеров мтДНК.

Комплексное исследование ядерных и митохондриальных генетических маркеров в случаях неполных родственных групп существенно повышало надежность непрямой ДНК-идентификации. По совокупности своих свойств мтДНК в процессах наследования и в смысле генетической характеристики личности ведет себя очень сходно (но не идентично) с любым из ядерных аллелей. Следовательно, в данном случае для оценки вероятности сочетания конкретного митотипа с остальными ядерными аллелями можно применить тот же математический аппарат, что и при комбинации ядерных аллелей друг с другом. Таким образом, вероятность сочетания ядерных аллелей с данным митотипом будет определяться как произведение частот ядерных аллелей и данного митотипа: Р^РЯ*РМТ

Проиллюстрируем эффективность комплексного анализа ядерных и митохондриальных генетических маркеров при непрямой ДНК-идентификации, когда сравнительный материал представлен неполными матрилинейными родственными группами (табл. 8). Во всех представленных экспертных случаях величины отношения вероятностей кровного родства (LR), вычисленные только по популяционным характеристикам ядерных локусов, были меньше 1000, что не позволяло сделать статистически достоверные выводы о возможном кровном родстве (табл. 8). Для повышения надежности непрямой ДНК-идентификации были дополнительно исследованы локусы мтДНК (регионы HV1 и HV2)

Таблица 8.

Демонстрация увеличения степени надежности непрямой молекулярно-генетической идентификации при комплексном

типировании ядерных и митохондриальных ДНК маркеров.

№ Объе кты Генотип по системе ProfilerPlus LR. HVI/HV2-митотип Частота митотипа в российско Я БД LR-, LR=LR,*LR„

D3S1358 vWA FGA D8SI179 D21SI1 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820

1 и 18,18 16,18 24,26 12,14 29,30 14,16 10,12 9,12 10,11 646 16126.16294, 16296,16304,73195, 263.309 1,315 1 0,0045 221 1,43*10'

с 17,18 17,18 21,24 13,14 29,30 14,16 12,12 9,12 8.11 16126,16294, 16296,16304.73195, 263,309 1,315 I

2 и 14,18 14,18 20,21 12,14 28,29 13,14 11,12 8,11 8,12 237 16114 A, 16192,1625 5,16270, 16294,73.263,315 1 0,0045 221 5,24*104

с 15,18 14,17 21,21 13,14 28,30 13,16 11,12 8,8 11,12 16M4A.16192.1625 S, 16270. 16294,73 263,315 1

3 и 17,18 16,19 - 12,13 30,30 - 12,13 - - 108 16052,16126, 16292,16294,73 146,152,214, 263,279,309 1, 315 1,320 0,0045 221 2,39*10"

с 17,18 16,19 - 12,13 30, 32 2 - 12,13 - - 16052,16126, 16292,16294,73 146,152,214, 253,279,309 1, 3 IS 1,320

4 и 16,18 17,18 20,21 13,14 32 2, 32 2 14,16 12,13 8,9 10,10 609 16126,16294,73 200.263,309 I, 109 2,315 1 0,0045 221 1,35*I05

с 15,16 ¡8,18 20,23 10,13 31, 32 2 13,14 12,12 9,12 10,10 16126,16294.73 200,263,309 !, 309 2,3 IS 1

5 и 16,18 17,18 19,24 12,13 28, 32 2 • 12,12 11,12 8,11 415 16249,16311,263, 315 1 0,0045 221 9,17*104

с 15,18 14,17 20,24 13,13 28, 30 2 - 8,12 9,11 11,11 16249,16311,263, 315 1

Примечания: И — объект идентификации, С — объект сравнения; LR, - отношение правдоподобия гипотез вероятного кровного родства, рассчитанный по ядерным лпкусам системы ProfUerPlus, LRMT- отношение правдоподобия гипотез вероятного кровного родства, рассчитанный по локусам HV1+HY2, при использовании базы данных российских митотипов, LR - отношение правдоподобия гипотез вероятного кровного родства, рассчитанный по локусэм системы ProftlerPlus и HV1+HV2, при использовании базы данных российских митотипов. Расчет вероятности случайного совпадения генотипов проводили с помощью компьютерной программы "DNAdacto" [Гаврилей Ю.К. и соавт, 2002а], Значения частот аллелей взяты для белого населения США из руководства [AmpFlSTR Identifier User's Manual, 2001].

Все биологические объекты в представленных экспертных случаях (табл. 8) имели уникальные митотипы (российская выборка, паспортизированные образцы крови из ДНК депозитария 124 ЦЛ МКИ МО РФ, п=221). Поэтому дополнительный анализ ИУ1 и ИУ2 локусов мтДНК позволил в 221 раз увеличить показатель LR. Как видно из таблицы 8 комплексный анализ генетических маркеров ядерной и мтДНК позволил с высокой степенью надежности сделать вывод о наличии кровного родства.

Таким образом, в наиболее сложных экспертных случаях комплексное типирование локусов ядерной и митохондриальной ДНК позволяет существенно повысить надежность непрямой ДНК-идентификации личности в случаях неполных родственных групп.

3.6. Непрямая ДНК-идентификации неопознанных останков военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе

Совершенствование методов идентификационных исследований в судсбно-криминалистической практике приобрело в последние годы особенную актуальность. Проведение боевых операций на Северном Кавказе повлекло за собой поступление значительного числа обезличенных человеческих останков, не поддающихся визуальному опознанию. Для установления личности погибших требовалось проведение экспертных идентификационных исследований.

В качестве приоритетного экспертного подхода для идентификации неопознанных тел военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе, в 124 ЦЛ МКИ МО РФ был принят сравнительный молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов ядерной (хромосомной) ДНК. Применительно к специфике поставленной задачи, ввиду отсутствия референтной базы молекулярно-генетических данных на безвестно отсутствующих лиц, использовались методы так называемой непрямой идентификации или идентификации на основании установления фактов кровного родства.

Этот подход базируется на сравнительном исследовании индивидуализирующих характеристик ДНК, извлеченной из биологических образцов идентифицируемого трупного материала и из образцов крови предполагаемых родственников погибшего. После изъятия биологических образцов осуществляли экстракцию суммарной клеточной ДНК с последующей энзиматической амплификацией полиморфных локусов хромосомной ДНК. После разделения и идентификации продуктов амплификации определяли их генотипы. Далее формировали базы данных генотипов и проводили сравнительный анализ по соответствующим генетическим маркерам.

Дальнейший процесс идентификации представлял собой процесс компьютерной обработки данных, в результате которого осуществлялся сравнительный перекрестный анализ этих двух массивов данных. В результате полного перебора данных формировался список возможных вариантов идентифицированных тел. Далее этот список ранжировался по значимости идентификационной информации на основе вычисления коэффициента правдоподобия LR и с помощью пороговых критериев производилась экспертная

оценка версий о наличии или отсутствии кровного родства и делался соответствующий вывод относительно принадлежности останков.

Практически весь подвергаемый анализу трупный материал имел выраженные гнилостные изменения, а также признаки высокотемпературной деструкции. Это отражало как особенности боевой травмы, так и явилось следствием задержек эвакуации погибших с поля боя, особенно, в жаркие летние месяцы 1995-1996 годов. Так свыше 55% тел военнослужащих, для которых проводились молекулярно-генетические исследования, по степени их пригодности для визуального опознания относились к категориям непригодных для визуального опознания. Многие тела имели выраженные гнилостные изменения, некоторые были полностью скелетированы. Кроме того, около 10% трупных биологических образцов, большей частью с термическими повреждениями, оказались непригодными для типирования полиморфизма хромосомной ДНК, осуществляемого стандартными методами. В этом случае единственно возможным являлась мтДНК-идентификация.

Сложность ДНК-идентификации заключалась в том, что глубокие гнилостные или термические повреждения трупов не позволяли выделить из биологического материала достаточные количества пригодной для анализа хромосомной ДНК. Поэтому, в целом ряде случаев выявить генетические профили локусов ядерной ДНК не представлялось возможным (табл. 9).

Матричная активность ДНК в полимеразной цепной реакции либо полностью отсутствовала, либо наблюдалась артефактная активность, приводящая к не воспроизводимым результатам или к неспецифической амплификации множественных аллельных вариантов типируемых локусов и, соответственно, к утрате индивидуализирующих признаков, характерных для этих локусов.

В наибольшей степени эта проблема касалась локусов, для которых размеры амплифицированных фрагментов превышают 250 куклеотидных пар (н.п.) (табл. 9). Так, при энзиматической амплификации аллельных вариантов локуса Б1880 в препаратах ДНК, полученных из трупного материала, только 59% постановок ПЦР оказались успешными. При молекулярно-генетическом типировании локусов с размерами амплифицированных фрагментов менее 250 п.н., доля успешных реакций существенно увеличивалась. В случае же амплификации таких локусов как Б381358, 0881179 и Б58818, для которых размер аллельных фрагментов не превышал 170 п.н., количество успешных постановок ПЦР составило 94-95%. Таким образом, естественно предположить, что именно за счет малого размера амплифицируемых фрагментов ДНК, представляющих аллельные варианты этих STR-локусов, реализовалась возможность получения хороших результатов при анализе сильно деградированных препаратов ДНК.

Была установлена зависимость эффективности амплификаций локусов ядерной ДНК, экстрагированной из деградированного биологического материала, от размера их амплифицируемых аллельных фрагментов. Для высоко деградированных образцов наблюдали обратную зависимость между количеством успешных амплификации и размерами чсследуемых локусов ядерной ДНК. Эти данные подтверждают эмпирические наблюдения в той части, что типирование

Таблица 9.

Зависимость матричной активности препаратов ДНК, полученных из биологических объектов с глубокими гнилостными и термическими повреждениями, от размеров амплифицируемых фрагментов (на примере маркеров D1S80, HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC, D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820).

Локус D1S80 HLA-DQA1 LDLR GYPA HBGG D7S8 GC

Размеры ПЦР-продуктов, н.п. 369-801 239/242 214 190 172 151 138

Процент успешных амплификаций 59,4 84,1 87,8 88,3 89,5 89,5 89,5

Локус D3S1358 VWA FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820

Размеры ПЦР-про-дуктов, н.п. 114-142 157-197 219-267 128-168 189-243 273-341 135-171 206-234 258-294

Процент успешных амплификации 94,5 92,6 86,4 94,8 91,6 69,6 94,2 91,6 81,2

ядерной ДНК из биологических образцов, подвергшихся сильным гнилостным и термическим повреждениям, наиболее эффективно осуществляется для локусов, размер которых не превышает 200 н.п. (табл. 9).

Вторая ветвь идентификационных экспертиз, сопряженная с исследованием мтДНК, уже прошла стадию своего развития при идентификации ТПВ, погибших в ходе боевых операций на территории Чеченской Республики в период 1994-1996 годы. Использование генетических маркеров митохондриального генома существенно расширили возможности ДНК-идентификации личности, особенно в случаях, когда исследование ядерной ДНК не представлялось возможным. Однако вследствие низкого дискриминирующего потенциала стандартных митохондриальных генетических маркеров (ИУ1 и ИУ2) не всегда представлялось возможным однозначно трактовать результаты молекулярно-генетического анализа. Поэтому дополнительный анализ полиморфизма структурных генов митохондриального генома в ряде случаев позволил свести к минимуму неоднозначность результатов молекулярно-генетической идентификации личности человека.

Следует учитывать, что метод идентификации на основе митохондриальной ДНК является групповым, тогда как генетический анализ локусов ядерной ДНК реализует индивидуализирующий метод, указывающий конкретный генотип персоны. Интеграция этих двух методов в рамках единого подхода позволили существенным образом повысить эффективность ДНК-идентификации с учетом статистических оценок, особенно в случаях неполных родственных групп, где объектом сравнения является один из матроклинных родственников.

При проведении молекулярно-генетической идентификации биологических образцов, полученных от погибших военнослужащих, было показано, что повышение точности экспертных оценок существенным образом зависит от комбинирования методов анализа ядерной и митохондриальной ДНК. Использование генетических маркеров митохондриального генома существенно расширили возможности судебно-медицинского установления кровного родства, особенно в случаях, когда исследование ядерной ДНК оказывается неэффективным. Однако вследствие низкого дискриминирующего потенциала стандартных генетических маркеров мтДНК не всегда представлялось возможным однозначно трактовать результаты мтДНК-анализа.

Интеграция двух подходов - анализ некодирующей области и структурных геноз мтДНК - в рамках единой схемы идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел позволила существенным образом повысить точность поиска и идентификации с учетом статистических оценок.

Проблема идентификации останков человека, возникшая со всей остротой в период локальных вооруженных конфликтов вызвала необходимость создания и развития информационных технологий, использующих результаты молекулярно-генетических исследований для идентификации личности. В условиях массового поступления неопознанных тел проблема идентификации останков связана в первую очередь с применением новых автоматизированных медико-криминалистических систем.

Основное назначение таких специализированных систем заключалось в автоматической обработке огромных массивов первичной информации с целью представления точных данных об исключенных объектах идентификации и набора рекомендательных списков с вероятностными оценками возможного кровного родства с объектами сравнения. Дальнейший анализ включал детальное исследование первичных данных для формирования заключения по проведенному молекулярно-генетическому исследованию. Таким образом, автоматизированные медико-криминалистические системы представляют собой чрезвычайно важный инструмент как для накопления Баз Данных (БД) с молекулярно-генетической информацией, так и как средство экспертной оценки в задачах ДНК-идентификации.

Главным компонентом автоматизированной системы является программное обеспечение, с помощью которого реализуется решение идентификационных задач. Практика показывает, что те методы обработки, которые используются при проведении единичных молекулярно-генетических экспертиз, оказываются чрезвычайно трудоемкими при большом числе неопознанных останков тел. Они не учитывают специфику перекрестной обработки массивов данных родственных групп и неопознанных тел, а также возможность верификации результатов экспертизы и расчета вариантов полиморфизма мтДНК.

Программные средсгва тВМАЬаяв [Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2002610890] представляют собой новый специализированный инструмент для решения задач непрямой мтДНК-идентификации личности в условиях поточной обработки информации при массовом поступления неопознанных тел.

При большом числе неопознанных останков тел, постановка задачи идентификации выглядит следующим образом. БД сравнительного материала содержит набор записей, включающих информацию о последовательностях нуклеотидов мтДНК отдельных членов каждой из родственных групп, которая разыскивает пропавшего без вести. В БД неопознанных тел, каждая запись содержит информацию о митотипе неопознанного тела. Задача идентификации неопознанного тела состоит в указании идентификатора родственной группы, к которой принадлежит неизвестный. И, наоборот, по заданной родственной группе следует найти номер тела, неопознанного индивида. Компьютерная система идентификации производит сравнительный анализ митотипов и формирует результат в виде списка исключенных тел и списка тех тел, которые могут принадлежать родственной группе, по которой ведется поиск. Далее детально обрабатывается список не исключенных тел. Для каждой записи из этого списка осуществляется сравнительный анализ, производится обращение к БД полиморфизма для оценки частоты встречаемости митотипа объекта идентификации.

Таким образом, работа по молекулярно-генетической идентификации военнослужащих, погибших в ходе боевых действий, потребовала качественно новой стратегии, включающей как современные научные разработки, так и компьютерные технологии, представляющие собой НОВЫЙ высокоэффективный инструмент для решения задач идентификации личности по митохондриальным

генетическим маркерам в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.

Выводы

1. Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей центрального региона и структурных генов мтДНК (ND2, ND3, ND4L, ND5, ND6, СОХ1, СОХЗ, CytB, ATP6) в качестве дополнительных генетических маркеров позволил дифференцировать около 94% идентичных НУ1+НУ2-митотипов. Однако структурные гены мтДНК обладают меньшим по сравнению со стандартными генетическими маркерами мтДНК (HVI и HV2) потенциалом дискриминации и в качестве самостоятельных генетических маркеров для мтДНК-идентификации личности не представляют большого интереса.

2. Изучение полиморфизма структурных генов мтДНК позволило выделить шесть маркеров, наиболее перспективных для мтДНК-идентификации - это локусы ND2, ND3, ND5, ND6, CytB и АТР6. Комплексное типирование этих маркеров в 2 раза повышает дискриминирующую способность мтДНК-идентификации.

3. Дополнительное исследование полиморфизма нуклеотидных последовательностей цешрального региона D-петли (16366-00072) на 40% повышает потенциал дискриминации ДНК-идентификации личности. Анализ всей некодирующей области мтДНК позволяет свести к минимуму неоднозначность в интерпретации результатов мтДНК-идентификации при получении идентичных митотипов по локусам HV1 и HV2.

4. Распределение полиморфных сайтов в локусах HV1, HV2 и CR мтДНК носит неслучайный характер. Нуклеотидные последовательности функционально нейтральных участков контрольного региона более вариабельны по сравнению с функционально значимыми: TAS, ETAS1, ETAS2, ETAS3, CSB1, CSB2, mfTFl.

5. Использование для расчета вероятности кровного родства объединенной базы данных европейских митотипов позволяет на порядок увеличить дискриминирующую способность непрямой МТДНК-идентификации молекулярно-генетической верификации кровного родства для неполных родственных групп, когда идентифицируемые субъекты имеют уникальные митотипы.

6. С учетом статистических оценок комплексный анализ хромосомной ДНК, некодирующей области и структурных генов мтДНК в рамках единой схемы идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел позволил существенно (более чем на 2-3 порядка) повысить надежность непрямой ДНК-идентификации личности.

7. Для повышения надежности результатов интерпретации непрямой мтДНК-идентификации необходимо учитывать механизмы возникновения точечных нуклеотидных залей в мтДНК. При интерпретации результатов мтДНК-идентификации личности необходимо учитывать скорость химической реакций, приводящей к той или иной нуклеотидной замене, характер генетической локализации точечной замены, а также количество

генераций, отделяющих идентифицируемые объекты от образцов сравнения в матрилинейном ряду.

8. Повышение эффективности ДНК-идентификации биологических образцов, подвергшихся сильным гнилостным и термическим повреждениям, достигается за счет анализа генетических маркеров, размер которых не превышает 200 пар нуклеотидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Корниенко И.В., Тарасова ТА., Вейко В.П., Корниенко И.Е., Щербакова Е.В., Давиденко А.В. Влияние различных физико-химических факторов на структуру ДНК // материалы 2-го международного симпозиума «Химия и химическое образование».- Владивосток, 2000.- С. 53-54.

2. Корниенко И.В., Клецкий М.Е., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Егоров А.С. Изучение реакционной способности сывороточных альбуминов - ключ к совершенству молекулярно-генетической идентификации // материалы международной конференции «Химическое образование и развитие общества».-Москва, 2000,-С. 168.

3. Корниенко И.В., Тарасова Т.А., Вейко В.П., Корниенко И.Е., Щербакова Е.В., Давиденко А.В. Использование различных физико-химических факторов для предотвращения ДНК-загрязнения биологических образцов при молекулярно-генетической идентификации // материалы международной конференции «Химическое образование и развитие общества».- Москва, 2000.-С. 169.

4. Kornienko I., Vodolazhsky D., Shcherbakova E., Yakushev V. Identification of remains of soldiers killed during battle operations on the territory of Chechen Republic for period 1994-2001 years // The Second European-American Intensive Course in Clinical and Forensic Genetics,- Croatia. Dubrovnik, 2001.- F25.

5. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел,- Ростов-на-Дону: РостИздат, 2001.- 256 с.

6. Корниенко И.В., Корниенко И.Е., Водолажский Д.И., Вейко В.П. Свободно-радикальный механизм действия ингибиторов полимеразной цепной реакции // Биотехнология.- 2002. № 3.- С.85-89.

7. Kornienko I.V., Vodolazhsky, Ivanov P.L. Genetic variation of the nine Profiler Plus loci in Russians // International Journal of Legal Medicine.- 2002.- Vol. 116,- № 5.-P. 309-311.

8. Гаврилей Ю.К., Корниенко И.В., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Применение компьютерных программных средств при решении задач непрямой молекулярно-генетической идентификации неопознанных тел // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 2.- С.11-16.

9. Корниенко И.В., Афанасьева Г.В., Щербакова Е.В., Иванов П.Л. Распределение аллелей локусов HLADQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC среди населения России // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 3.- С. 2023.

10. Гаврилей Ю.К., Корниенко И.В., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Разработка автоматизированной системы анализа данных секвенирования митохондриальной ДНК «mDNAbase» для целей экспертной идентификации неопознанных тел в условиях массового поступления останков // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 5.- С. 15-21.

11. Корниенко И.В., Земскова Е.Ю., Фролова СА., Якушев В.В., Иванов П.Л. Исследование аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклеотидных тандемных повторов LPL, vWA и ТН01 среди населения России // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 5.- С. 12-14.

12. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Щербакова Е.В., Гуськов Г.Е. Использование мультиплексной системы Polymarker при идентификации личности человека // Известия высших учебных заведений (Северо-Кавказский регион). Естественные науки.- 2002. № 3.- С. 66-68.

13. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Михалкович Л.С. Использование структурных генов митохондриальной (мт)ДНК в целях идентификации личности // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002. № 9.- С. 20.

14. Корниенко И.В., Гаврилей Ю.К., Браславская СИ., Афанасьева Г.В., Щербакова Е.В., Михалкович Л.С, Иванов П.Л. Полиморфизм контрольного региона митохондриальной ДНК среди населения Российской Федерации // Известия высших учебных заведений (Северо-Кавказский регион). Естественные науки.- 2002. № 4.- С. 54-56.

15. Иванов П.Л., Земскова Е.Ю., Тарасова Т.А., Фролова С.А., Михалкович Л.С, Корниенко И.В. Опыт использования FTA-носителей для хранения образцов крови при проведении молекулярно-генетических идентификационных исследований неопознанных погибших - жертв военных действий на территории Чеченской Республики // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 6.- С. 20-27.

16. Корниенко И.В., Щербакова Е.В., Земскова Е.Ю., Иванов П.Л. Распределение аллелей локуса D1S80 в случайной выборке населения Российской Федерации // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 6.- С. 2731.

17. Гаврилей Ю.К., Шепелев И.Е., Корниенко И.В., Щербаков В.В. Программа идентификации личности на основе генетических данных митохондриальной ДНК mDNAbase-M // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2002610890 от 06.062002 г.

18. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллсльных комбинаций системы HLA-DQA1 среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620034 от 22.02.2002 г.

19. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллельных комбинаций системы D1S80 среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620033 от 22.02.2002 г.

20. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллельных

комбинаций системы STR-LPL среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620032 от 22.02.2002 г.

21. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллельных комбинаций системы Polymarker: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620031 от 22.02.2002 г.

22. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллельных комбинаций системы Profiler+: D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620030 от 22.02.2002 г.

23. Корниенко И.В., Гуськов Г.Е. Электронная база данных аллельных комбинаций системы STR локуса ТН01 среди населения Российской Федерации // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2002620029 от 22.02.2002 г.

24. Корниенко И.В., Клецкий М.Е. Протекторное действие цистеина как антиоксиданта на энзиматическую амплификацию ДНК: экспериментальное и теоретическое изучение // материалы VI международной конференции «Биоантиоксидант».- Москва, 2002.- С. 293-294.

25. Корниенко И.В., Водолажский Д.И. Препаративные методы выделения нуклеиновых кислот из костной ткани // материалы международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии».-Краснодар, 2002.-С. 184-185.

26. Водолажский Д.И., Корниенко И.В., Тарасова Т.А. Препаративное разделение нуклеиновых кислот при помощи электрофореза в геле агарозы // материалы международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии».- Краснодар, 2002.- С. 159.

27. Гаева Е.Б., Нарежная Е.В., Корниенко И.В. Использование тонкослойной хроматографии для обнаружения мутагенной активности соединений // материалы международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии».- Краснодар, 2002.- С. 42-43.

28. Корниенко И.В. Методы экстракции ДНК в условиях массового поступления человеческих останков // Проблемы идентификации личности. Сборник научных трудов, выполненных на базе 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ. Отв. ред. В.В. Щербаков.-Ростов-ча-Дону: РостИздат, 2002.- С.238-246.

29. Гаврилей Ю.К., Корниенко И.В., Щербаков В.В., Щербакова Е.В., Иванов П.Л. Использование компьютерных прогргммных средств для решения задач молекулярно-генетической идентификации личности человека в условиях массового поступления неопознанных тел // Проблемы идентификации личности. Сборник научных трудов, выполненных на базе 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ. Отв. ред. В.Б. Щербаков.- Ростов-на-Дону: РостИздат, 2002.- С.222-237.

30. Корниенко И.В., Гаврилей Ю.К., Браславская СИ., Афанасьева Г.В.,

Щербакова Е.В., Михалкович Л.С., Иванов П.Л. Локализация и частота полиморфных позиций в гипервариабельном регионе 2 (73-340) митохондриальной ДНК // Известия высших учебных заведений (СевероКавказский регион). Естественные науки.- 2003. № 1.- С. 60-64.

31. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Михалкович Л.С., Павличенко Г.Н., Иванов П.Л. Полиморфизм гена 6-ой субъединицы комплекса НАДН-дегидрогеназы в российской популяции // Молекулярная Биология, 2003.- Т. 37.-№4,-С. 595-600.

32. Корниенко И.В., Брень А.Б., Войнова Н.В. Использование полиморфизма нуклеотидных последовательностей в молекулярно-генетической идентификации // Научная мысль Кавказа. Приложение.- 2003. № 10,- С. 122127.

33. Корниенко И.В., Якушев В.В., Кабанова Н.П., Фролова С.А., Земскова Е.Ю., Иванов П.Л. Некоторые результаты использования молекулярно-генетических маркеров хромосомной ДНК для идентификации неопознанных останков военнослужащих, погибших в ходе боевых действий на Северном Кавказе // Судебно-медицинская экспертиза.- 2003. № 5.- С. 36-41.

34. Корниенко И. В. Анализ характера точечных мутаций в D-петле митохондриальной ДНК при интерпретации результатов молекулярно-генетической экспертизы // Известия высших учебных заведений (СевероКавказский регион). Естественные науки. Приложение.- 2003. № 10.- С. 72-75.

35. Корниенко И.В. Увеличение разрешающей способности митохондриальной ДНК идентификации при дополнительном анализе участков митохондриального генома, лежащих за пределами локусов HV1 и HV2 // Известия высших учебных заведений (Северо-Кавказский регион). Естественные науки. Приложение.-2003. № 10.-С. 75-80.

36. Komienko I.V., Vodolazhsky D.I., Ivanov P.L. The polymorphism of ND3, ND4L and ND6 structural genes of mtDNA among Russians // 14th International Symposium on Human Identification.- USA. Promega, 2003.- P. 48.

37. A.G. Smolyanitsky, I.O. Perepechina, I.V. Kornienko, V.S. Zamaraev, YuA. Komarovsky, N.N. Khromov-Borisov. Towards Russian reference population data on STR loci // 20th International Congress ISFG.- Arcachon, France, 2003.- A-42.

38. Kornienko I.V., Kletskii M.E., Narezhnaya E.V., Gaeva E.B. The Mechanism of the Point Mutations in DNA under the Action of the NO-containing Agents // The 39th IUPAC Congress and 86th Conference of The Canadian Society for Chemistry.-Canada. Ottawa, 2003.- OR.3.P030.

39. Корниенко И.В., Брень А.Б., Воинова Н.В., Гуськов Е.П. Структурная организация митохондриальной ДНК позвоночных животных // Успехи современной биологии.- 2004,- Т. 124.-№ 1.-С. 17-27.

40. Гаева Е.Б., Нарежная Е.В., Корниенко И.В. Определение мутагенной активности на примере взаимодействия оснований ДНК с азотистой кислотой // Клиническая молекулярная диагностика.- 2004. № 1.- С. 16-18.

41. Корниенко И.В. База Данных (БД) молекулярно-геиетических исследований структурных генов митохондриальной ДНК (регионы CR, COX1, СОХ3, ND2, ND3, ND4L, ND5, ND6, CytB), полученных после выполнения секвенс-анализа//

Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2004620020 от 05.01.2004 г.

42. Корниенко И.В. База Данных (БД) молекулярно-генетических исследований митохондриальной ДНК (регион D-loop, фрагменты HV1, ИУ2), полученных после выполнения секвенс-анализа // Роспатент. Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2004620019 от 05.01.2004 г.

43. Корниенко И.В., Водолажская Л.Н., Колкутин В.В., Водолажский Д.И. Методологические аспекты применения информационных технологий при ДНК-идентификации личности // материалы IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета.- Ростов-на-Дону: РГМУ, 2004.-С. 89-91.

44. Корниенко И.В., Колкутин В.В., Водолажский Д.И. Повышение потенциала дискриминации при непрямой митохондриальной ДНК-идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел // материалы IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета.-Ростов-на-Дону: РГМУ, 2004.- С. 91-93.

45. Корниенко И.В., Водолажская Л.Н., Колкутин В.В., Водолажский Д.И. Единая информационная программная система как основа автоматизации процесса ДНК-типирования личности и сопутствующего документооборота // В кн. Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики / под ред. Новоселова В.П., Саркисяна Б.А. Янковского В.Э.- Новосибирск: Межрегиональная ассоциация «Судебные медики Сибири», 2004.- Вып. 9.- С. 48-52.

46. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Корниенко И.Е., Иванов П.Л. Изучение полиморфизма структурных генов митохондриальной ДНК человека в аспекте судебно-медицинской идентификации личности // Судебно-медицинская экспертиза.- 2004. № 3.- С. 11-15.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Таймс». Формат 60 х 84 / 16. Объем 1,5 п.л. Заказ № 36. Тираж 100 экз. Отпечатано в Ризографии ИП Тигаренко Л.Е. 344002, г. Ростов-на-Дону, Московская, 63. тел: 240-41-63

/ ' 'j /1 /. - b

У i¿7

Оглавление диссертации Корниенко, Игорь Валериевич :: 2005 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК КАК ОБЪЕКТ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ.

1.1. Маркеры ДНК, используемые при молекулярно-генетической идентификации личности человека.

1.2. Структурная организация митохондриальной ДНК.

1.3. Феномен гетероплазмии.

1.4. Мутации структурных генов мтДНК при различных патологиях.

1.5. МтДНК - как объект судебно-медицинских исследований.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Сбор образцов биологических тканей.

2.2. Антропологические методы исследования.

2.3. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.4. Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ДИСКРИМИНИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ НЕКОДИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК.

3.1. Использование центрального региона (CR) D-петли мтДНК в качестве дополнительного маркера для молекулярно-генетической идентификации личности.

3.2. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей гипервариабельных сегментов 1 -го и 2-го типов.

3.3. Анализ закономерностей появления точечных замен в гипервариабельных участках контрольного региона митохондриальной ДНК.

ГЛАВА 4. УВЕЛИЧЕНИЕ ИДЕНТИФИКАЦИОННОЙ ЗНАЧИМОСТИ мтДНК-ТИПИРОВАНИЯ ПРИ ДОПОЛНИТЕЛЬНОМ АНАЛИЗЕ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА.

ГЛАВА 5. НЕПРЯМАЯ мтДНК-ИДЕНТИФИКАЦИЯ В СЛУЧАЯХ НЕПОЛНЫХ РОДСТВЕННЫХ ГРУПП.

5.1. Комплексный анализ ядерных и митохондриальных ДНК-маркеров при непрямой идентификации личности.

5.2. Оптимизация баз данных митотипов для решения задач ДНК-идентификации личности.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ НАДЕЖНОСТИ ПРИ

ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ мтДНК-ИДЕНТИФИКАЦИИ.

ГЛАВА 7. НЕПРЯМАЯ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕОПОЗНАННЫХ ОСТАНКОВ ВОЕННОСЛУЖАЩИХ, ПОГИБШИХ В ХОДЕ БОЕВЫХ ОПЕРАЦИЙ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ.

7.1 Непрямая ДНК-идентификация при массовом поступлении неопознанных тел.

7.2 Единая информационная программная система, как основа автоматизации процесса ДНК-типирования личности и сопутствующего документооборота.

7.3 Разработка автоматизированной системы мтДНК-анализа для решения задач непрямой молекулярно-генетической идентификации неопознанных тел в условиях массового поступления останков.

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Корниенко, Игорь Валериевич, автореферат

Кроме того, было очевидно, что только традиционными судебно-медицинскими методами идентификации справиться с этой задачей практически невозможно. Классические методы идентификации личности, основанные на сравнительном анализе морфологических признаков, изучении минерального состава костей скелета и других специальных технологиях, имеют предел идентификационных возможностей [Абрамов и соавт., 2000]. Отсутствовала и нормативно-правовая база для организации подобной работы, так как официально на момент первой чеченской кампании в МО РФ не существовало каких-либо руководящих документов, регламентирующих стратегию и тактику командования и медицинской службы военного ведомства в подобных ситуациях. В том числе и по этой причине внезапно возникшая необходимость идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел стимулировала использование современных молекулярно-генетических методов в судебно-криминалистической практике.

Первые судебно-генетические экспертизы по установлению личности военнослужащих, погибших на территории Чеченской Республики, были проведены в 1995-1996 годах. Однако отсутствие на тот момент времени базы сравнительного биологического материала с одной стороны и опыта работы ' такого масштаба с другой, не позволяло проводить сколь-нибудь эффективное аналитическое сравнение генотипов погибших со всем массивом кровных родственников.

В 1998 году при непосредственном участии Комиссии при Президенте Российской Федерации по интернированным, военнопленным и пропавшим без вести началось формирование базы данных сравнительного материала, для чего было проведено массовое взятие крови родственников военнослужащих, погибших и пропавших без вести на территории Чеченской Республики. В том же году на базе 124 судебно-медицинской лаборатории Северо-Кавказского военного округа была создана лаборатория молекулярно-генетических исследований, основной задачей которой явилась идентификация личности тел неопознанных российских военнослужащих, погибших на территории Чеченской Республики, с помощью методов молекулярной генетики. Эти исследования являлись частью мероприятий, осуществляемых Правительством РФ в рамках программы по идентификации военнослужащих, погибших во время вооруженного конфликта 1994-96 гг. в районе Чеченской Республики: в постановлении № 1052 от 20 августа 1997 года Правительства РФ были определены требования по отношению к идентификационным исследованиям останков погибших в ходе чеченской войны, и, в частности, в качестве обязательного элемента предусмотрен анализ на уровне ДНК.

Типирование локусов митохондриальной ДНК (мтДНК) в целях молекулярно-генетической идентификации личности незаменимо в случаях ограниченного количества исследуемого материала или сильной деградации биологических образцов. В настоящее время идентификационная значимость мтДНК-типирования определяется полиморфной природой двух гипервариабельных регионов D-петли (HV1 (16024-16365) и HV2 (73-340) [Wilson M.R. et ah, 1993; Miller K.W.P. et al., 1996]. Однако невысокий потенциал дискриминации традиционно используемых митохондриальных маркеров не позволяет эффективно применять этот метод в случаях больших или открытых групп потенциальных источников данного образца [Holland М.М. et al., 1993; Inman К., Rudin N., 1997; Holland M.M., Parsons T.J., 1999]. Так как нуклеотидные последовательности мтДНК практически идентичны у всех матроклинных родственников, в методе мтДНК-типирования заложена не идентификация личности как таковой, а выяснение принадлежности испытуемой пробы к определенному митотипу или матрилинейному ряду [Parsons T.J., Coble M.D., 2001].

Полиморфизм нуклеотидных последовательностей за пределами гипервариабельных локусов контрольного региона (HV1 и HV2) не используется в рутинной практике судебно-медицинской идентификации личности и установления кровного родства. Имеются данные литературы, свидетельствующие о наличии полиморфных позиций за пределами локусов HV1 и HV2 [Johnson К.Р., Sorenson M.D., 1998; Балмышева Н.П., Соловенчук J1.JL, 1999; Ingman М. et al., 2000; Lee S.D. et al., 2002; Brandstatter A. et al., 2003; Lutz-Bonengel S. et al., 2003; Mishmar D. et al., 2003]. Поэтому исследование полиморфных позиций за пределами контрольного региона позволит получить ценную информацию, которая могла бы увеличить потенциал индивидуализации ДНК-идентификации личности.

Несмотря на наличие принципиальной возможности решения экспертной задачи, непрямая мтДНК-идентификация неопознанных тел в условиях их массового поступления - например, в ходе боевых действий, — является чрезвычайно трудоемкой задачей при использовании методов и средств, рассчитанных на применение в стандартных судебно-медицинских идентификационных экспертизах. Эти методы не приспособлены для решения аналитических задач, возникающих в условиях идентификационной работы, характеризующейся большим объемом и поточным поступлением объектов.

Целью настоящей работы явилась разработка комплекса новых молекулярно-генетических маркеров митохондриальной ДНК для определения наиболее эффективной стратегии непрямой молекулярно-генетической идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: Провести сравнительный анализ полиморфизма различных областей некодирующей области мтДНК и исследовать зависимость частоты точечных замен в контрольном регионе от расположения функциональных элементов митохондриального генома.

Исследовать полиморфизм нуклеотидных последовательностей в области структурных генов митохондриального генома и сравнить их дискриминирующую способность в качестве дополнительных генетических маркеров для непрямой мтДНК-идентификации личности.

Разработать критерии повышения надежности при интерпретации результатов непрямой мтДНК-идентификации с учетом механизма и частоты возникновения точечных нуклеотидных замен в мтДНК.

Провести анализ степени надежности непрямой мтДНК-идентификации при комплексном анализе генетических маркеров ядерной и митохондриальной ДНК в зависимости от размера рабочей базы данных митотипов.

С учетом опыта ДНК-идентификации военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе разработать стратегию непрямой молекулярно-генетической идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.

Разработать алгоритмы для решения задач непрямой мтДНК-идентификации личности при массовом поступлении неопознанных тел с учетом специфики перекрестной обработки массивов данных, получаемых для родственных групп и для неопознанных тел.

Научная новизна и теоретическое значение работы

По сравнению с HV1 и HV2 центральный регион (CR) D-петли обладает наименьшим полиморфизмом. Тем не менее, дискриминирующая способность этого региона достаточна для использования локуса CR в качестве дополнительного генетического маркера при мтДНК-идентификации.

Впервые описана расширенная терминационно-ассоциированная нуклеотидная последовательность 3-го типа (ETAS3) в области гипервариабельного сегмента HV1 D-петли митохондриального генома человека. В районе гипервариабельного сегмента 2-го типа, HV2, описан блок консервативных нуклеотидных последовательностей (аналогичный CSB).

Практическое значение работы

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Комплексный анализ структурных генов и всей некодирующей области мтДНК позволит повысить индивидуализирующую способность мтДНК-идентификации по традиционным генетическим маркерам (HV1 и HV2) за счет увеличения количества уникальных митотипов.

3. Типирование маркеров ядерной и митохондриальной ДНК в рамках единой схемы идентификации личности на 2-3 порядка повышает надежность непрямой ДНК-идентификации личности в случае неполных родственных групп

Заключение диссертационного исследования на тему "Непрямая молекулярно-генетическая идентификация личности при массовом поступлении неопознанных тел"

выводы

1. Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей центрального региона и структурных генов мтДНК (ND2, ND3, ND4L, ND5, ND6, СОХ1, СОХЗ, CytB, АТР6) в качестве дополнительных генетических маркеров позволил дифференцировать около 94% идентичных HV1 +НУ2-митотипов. Однако структурные гены мтДНК обладают меньшим по сравнению со стандартными генетическими маркерами мтДНК (HV1 и HV2) потенциалом дискриминации и в качестве самостоятельных генетических маркеров для мтДНК-идентификации личности не представляют большого интереса.

2. Изучение полиморфизма структурных генов мтДНК позволило выделить шесть маркеров, наиболее перспективных для мтДНК-идентификации -это локусы ND2, ND3, ND5, ND6, CytB и АТРб. Комплексное типирование этих маркеров в 2 раза повышает дискриминирующую способность мтДНК-идентификации.

3. Дополнительное исследование полиморфизма нуклеотидных последовательностей центрального региона D-петли (16366-00072) на 40% повышает потенциал дискриминации ДНК-идентификации личности. Анализ всей некодирующей области мтДНК позволяет свести к минимуму неоднозначность в интерпретации результатов мтДНК-идентификации при получении идентичных митотипов по локусам HV1 и HV2.

5. Использование для расчета вероятности кровного родства объединенной базы данных европейских митотипов позволяет на порядок увеличить дискриминирующую способность непрямой мтДНК-идентификации молекулярно-генетической верификации кровного родства для неполных родственных групп, когда идентифицируемые субъекты имеют уникальные митотипы.

7. Для повышения надежности результатов интерпретации непрямой мтДНК-идентификации необходимо учитывать механизмы возникновения точечных нуклеотидных замен в мтДНК. При интерпретации результатов мтДНК-идентификации личности необходимо учитывать скорость химической реакций, приводящей к той или иной нуклеотидной замене, характер генетической локализации точечной замены, а также количество генераций, отделяющих идентифицируемые объекты от образцов сравнения в матрилинейном ряду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Решение проблемы идентификации тел погибших военнослужащих является актуальной задачей без срока давности для всех цивилизованных стран мира. В рамках Министерства Обороны Российской Федерации существует ряд организационных мер и подразделений, выполняющих эту задачу напрямую или косвенно [Колкутин В.В. и соавт., 2003]. При значительной деградации исследуемого материала наилучшим способом зарекомендовали себя методы идентификации личности по локусам митохондриальной ДНК. Профили мтДНК родственников по материнской линии идентичны друг другу (если не учитывать крайне редкие мутации или замены в пределах одного матрилинейного ряда). Анализ мтДНК не является уникальным идентификатором личности, но позволяет установить принадлежность исследуемого образца к определенному матрилинейному ряду.

При проведении мтДНК-идентификации используются, в основном, те же подходы в организации исследования, контроле качества используемых материалов и в интерпретации получаемых результатов, что и при анализе ядерной ДНК. Однако существуют и отличия, обусловленные присущими мтДНК особенностями: матроклинным наследованием, гетероплазмией, высокой копийностью.

Основные этапы мтДНК-анализа состоят из пробоподготовки, создания множества копий нужного участка исходной мтДНК и идентификации продуктов энзиматической амплификации методом секвенирования. В результате секвенс-анализа формируются фрагменты нуклеотидной последовательности мтДНК в регионах HV1 и HV2, которые сравнивают с референтной последовательностью [Anderson S. et al., 1981], для абсолютного позиционирования и выявления возможного полиморфизма.

Использование генетических маркеров митохондриального генома существенно расширяют возможности молекулярно-генетической идентификации, особенно в случаях, когда типирование ядерных локусных систем оказывается неэффективным. Тем не менее, вследствие низкого дискриминирующего потенциала митохондриальных маркеров не всегда представляется возможным однозначно трактовать полученные данные прямого определения нуклеотидных последовательностей. Эффективность мтДНК-идентификации личности может быть повышена при условии оценок дискриминирующей способности всей некодирующей области мтДНК.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Корниенко, Игорь Валериевич

1. Абрамов С.С., Гедыгушев И.А., Звягин В.Н., Назаров Г.Н., Томилин В.В. Медико-криминалистическая идентификация.- М.: Издательская группа НОРМА-ИНФРАМ, 2000.- 472 с.

2. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика.- 2002. Т. 38.- С. 1173-1195.

3. Ашмарин И.П. Молекулярная биология.- Л.: Медицина, 1974.- С. 186191.

4. Балановская Е.В., Нурбаев С.Д. Пространственная изменчивость генофонда человека: геногеография и отбор. Исследования по генетике.- СПб.: изд. СПбУ, 1999. вып. 12.- С. 104-116.

5. Балмышева Н.П., Соловенчук Л.Л. Ассоциация мутаций в генах цитохрома b и NADH-дегидрогеназы 5/6 митохондриальной ДНК соболя {Martes zibellina L.) // Генетика.- 1999. Т. 35. № 12.- С. 16811686.

6. Барсегянц Л.О. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы): Руководство для судебных медиков.- М.: Медицина, 1999.- 272 с.

7. Бунак В.В. Фотопортреты как материал для определения вариаций строения головы и лица // Советская антропология.- 1959. № 2.- С. 326.

8. Вейр Б. Анализ генетических данных.- М.: Мир, 1995.- 400 с.

9. Ю.Войнова Н.В., Корниенко И.В., Водолажский Д.И. Способ подбора особей русского осетра Acipenser guldenstadti в аквакультуре // Роспатент. Изобретение № 2202178 от 20.04.2003.

10. П.Гаврилей Ю.К., Корниенко И.В., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Применение компьютерных программных средств при решении задач непрямой молекулярно-генетической идентификации неопознанных тел // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 2.- С. 11-16.

11. Гаева Е.Б., Нарежная Е.В., Корниенко И.В. Определение мутагенной активности на примере взаимодействия оснований ДНК с азотистой кислотой // Клиническая молекулярная диагностика.- 2004. № 1.- С. 16-18.

12. Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК.- М.: Наука, 1977.- 288 с.

13. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК // Соросовский образовательный журнал.- 1999. № 3.- С. 11-17.

14. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия,- М.: Наука, 1989.- 255 с.

15. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных болезней.- СПб.: Специальная литература, 1997.- 287 с.

16. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика.- 2002. Т. 38.- С. 1013-1033.

17. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий).- М.: Медицина, 1998.328 с.

18. Захаров Е.В., Челомина Г.Н., Журавлев Ю.Н. Выделение ДНК из музейных экспонатов бабочек (Lepidoptera, Papilionidae) и ПЦР-анализ со случайными и универсальными ген-специфичными праймерами // Генетика.- 2000. Т. 36.- С. 1221-1229.

19. Иванов П.Л. Геномная дактилоскопия: гипервариабельные локусы и генетическое маркирование // Молекулярная биология.- 1989. Т. 23.- С. 341-347.

20. Иванов П.Л., Гуртовая С.В., Вербовая Л.В., Болдеску Н.Г., Плаксин

21. B.О., Рысков А.П. Геномная "дактилоскопия" в экспертизе спорного отцовства и определения биологического родства // Судебно-медицинская экспертиза.- 1990. № 2,- С. 36-38.

22. Иванов П.Л. Экспертная идентификация останков императорской семьи посредством молекулярно-генетической верификации родословных связей // Судебно-медицинская экспертиза.- 1998. № 4.1. C. 30-48.

23. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Т. 1.- М.: Мир, 1984.258 с.

24. Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности.- М.: Мир, 1985.-394 с.

25. Колкутин В.В., Харламов С.Г., Толмачев И.А. и др. Молекулярно-генетические методы в практике военной судебно-медицинской экспертизы // Воен. Мед. Журн.- 2000. № з. с. 12-16.

26. Колкутин В.В., Абрамов С.С., Ляненко В.А. Идентификация фрагментированных тел погибших из групповых захоронений // Воен. Мед. Журн.- 2002. № 6.- С. 13-17.

27. Колкутин В.В., Диденко А.С., Попов В.А., Смирении С.А., Фетисов В.А. Организация работы в Северо-Кавказском регионе по приему, исследованию и отправке погибших военнослужащих // Воен. Мед. Жур.- 2003. №3.- С. 21-24.

28. Константинов Ю.М., Вербицкий Д.С., Колесников С.И. Уникальный вариант инсерционного полиморфизма митохондриальной ДНК у представителя популяции приольхонских бурят // Бюл. Экспер. Биол. Мед.- 1999. Т. 128. № 7.- С. 66-68.

29. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел.- Ростов-на-Дону: РостИздат, 2001.256 с.

30. Корниенко И.В., Афанасьева Г.В., Щербакова Е.В., Иванов П.Л. Распределение аллелей локусов HLADQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC среди населения России // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 3.- С. 20-23.

31. Корниенко И.В., Щербакова Е.В., Земскова Е.Ю., Иванов П.Л. Распределение аллелей локуса D1S80 в случайной выборке населения Российской Федерации // Судебно-медицинская экспертиза.- 2002. № 6.- С. 27-31.

32. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Михалкович Л.С. Использование структурных генов митохондриальной (мт)ДНК в целях идентификации личности // Клиническая лабораторная диагностика.2002. № 9. с. 20.

33. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Михалкович J1.C., Павличенко Г.Н., Иванов П.Л. Полиморфизм гена 6-ой субъединицы комплекса НАДН-дегидрогеназы в российской популяции // Молекулярная Биология.- 2003. Т. 37. № 4.- С. 595-600.

34. Корниенко И.В., Брень А.Б., Войнова Н.В., Гуськов Е.П. Структурная организация митохондриальной ДНК позвоночных животных // Усп. Совр. Биол.- 2004. Т. 124. № 1.- С. 17-27.

35. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот.- М.: Химия, 1970.- 720 с.

36. Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.О.- М.: Информатика и компьютеры, 1996.- 257 с.

37. Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Носиков В.В., Сергеев А.С., Дедов И.И. Возможности прогнозирования инсулинозависимого сахарного диабета в семьях больных на основе исследования генетических маркеров // Сахарный диабет.- 1998. № 1.- С. 6-11.

38. Ладик Я. Квантовая биохимия для химиков и биологов.- М.: Мир, 1975.- 256 с.

39. Льюин Б. Гены.- М.: Мир, 1987.- 544 с.

40. Малярчук Б.А., Деренко М.В., Соловенчук Л.Л. Типы контрольного региона митохондриальной ДНК у восточных славян // Генетика.1995. Т. 31. №. 6.- С. 846-851.

41. Малярчук Б.А., Деренко М.В., Лапинский А.Г., Соловенчук Л.Л. Использование полимеразной цепной реакции в анализе древних ДНК (на примере Энмынвеемского мамонта) // Известия РАН. Серия биол.1996. №. 6.- С. 681-686.

42. Малярчук Б.А. Изменчивость митохондриальной ДНК у восточных славян//Цитология и генетика.- 1998. Т. 32. №. 5.- С. 10-16.

43. Малярчук Б.А., Деренко М.В. Изменчивость митохондриальной ДНК человека: распределение «горячих точек» в гипервариабельном сегменте I главной некодирующей области // Генетика.- 2001. Т. 37. №. 7.-С. 991-1001.

44. Малярчук Б.А., Деренко М.В., Денисова Г.А., Нассири М.Р., Рогаев Е.И. Полиморфизм митохондриальной ДНК в популяциях Каспийского региона и южной части Восточной Европы // Генетика.-2002. Т. 38. №.4.- С. 534-538.

45. Роберте Дж., Кассерио М. Основы органической химии. Т. 2.- М.: Мир, 1978.- 671 с.

46. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология.- 1999. Т. 33.- С. 997-1011.

47. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: в 2-х т. Т. 2.- М.: Мир, 1998.- 391 с.

48. Сирота Н.П., Васильева Г.В., Ломаева М.Г., Сирота А.Н., Безлепкин В.Г. Компьютерный анализ вариабильности полос на ДНК -фингерпринтах // Генетика.- 2000. Т. 36.- С. 570-574.

49. Сойфер В.Н. Молекулярные механизмы мутагенеза.- М.: Наука, 1969.512 с.

50. Томилин В.В., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование крови в делах о спорном отцовстве, материнстве и замене детей.- М.: Медицина, 1981.- 240 с.

51. Туманов А.К., Томилин В.В. Наследственный полиморфизм изоантигенов и ферментов крови в норме и патологии человека.- М.: Медицина, 1969.- 436 с.

52. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена.- М.: Мир, 1978.- 720 с.

53. Флейс Дж. Статистические методы для изучения таблиц долей и пропорций.- М.: Финансы и статистика, 1989.- 319 с.

54. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. Херрингтона С., Макги Дж.- М.: Мир, 1999.- 558 с.

55. Adam W., Kurz A., Saha-Moller C.R. Peroxidase-catalyzed oxidative damage of DNA and 2-deoxyguanosine by model compounds of lipid hydroperoxides: involvement of peroxyl radicals // Chem. Res. Toxicol.-2000.-Vol.13.- P. 1199-1207.

56. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. MoL Biol.- 1990.- Vol. 215.- P. 403-410.

57. Alves-Silva J., da Silva Santos M., Guimaraes P.E., Ferreira A.C., Bandelt H.J., Pena S.D., Prado V.F. The ancestry of Brazilian mtDNA lineages // Am. J. Hum. Genet.- 2000.- Vol. 67.- P. 444-461.

58. AmpFlSTR Identifier PCR Amplification Kit. User's Manual.- PE Applied Biosystems, 2001.- P. 4-44-4-52.

59. Angers В., Bernatchez L., Complex evolution of a salmonid microsatellite locus and its consequences in inferring allelic divergence from size information//Mol. Biol. Evol.- 1997.- Vol. 14.- P. 230-238.

60. Antoshechkin I., Bogenhagen D.F. Distinct roles for two purified factors in transcription of Xenopus mitochondrial DNA // Mol. Cell. Biol.- 1995.-Vol. 15.-P. 7032-7042.

61. Aquadro C.F., Greenberg B.D. Human mitochondrial DNA variation and evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals // Genetics.- 1983.-Vol. 103.- P. 287-312.

62. Arnaiz-Villena A. MHC research: fast forward // Immunology Today.-1993.-Vol. 14.- P. 3-5.

63. Arnason E., Rand D.M. Heteroplasmy of short tandem repeats in mitochondrial DNA of Atlantic cod, Cadus morhua II Genetics.- 1992.-Vol. 132.-P. 211-220.

64. Arnason U., Johnston E. The complete mitochondrial DNA sequence of the harbor seal, Phoca vitulina II J. Mol. Evol.- 1992.- Vol. 34.- P.493-505.

65. Arnason U., Gullberg A., Xu X. A complete mitochondrial DNA molecule of the white-handed gibbon, Hylobates lar, and comparison among individual mitochondrial genes of all hominoid genera // Hereditas.- 1996,-Vol. 124.-P. 185-189.

66. Arnason U., Gullberg A., Janke A. Molecular timing of primate divergences as estimated by two nonprimate calibration points // J. Mol. Evol.- 1998.-Vol.47.- P. 718-727.

67. Arnheim N., Cortopassi G. Deleierious mitochondrial DNA mutations accumulate in aging human tissues // Mutat. Res.- 1992.- Vol. 275.- P. 157167.

68. Aruoma O.I., Hallivell B. DNA-damage and free radicals // Chem. Brit.-1991.-Vol. 27.-P. 149-152.

69. Attardi G., Montoya J. Analysis of human mitochondrial RNA // Methods in Enzymology.- 1983.- Vol. 97.- P. 435-469.

70. Attardi G., Schatz G. Biogenesis of mitochondria // Annu. Rev. Cell Biol.-1988.- Vol.4.- P. 289-333.

71. Avise J.C. Ten unorthodox perspectives on evolution prompted by comparative population genetic findings on mitochondrial DNA // Annu. Rev. Genet.- 1991.- Vol. 25.- P. 45-69.

72. Barrientos A., Casademont J., Crdellach F., Estivill X., Urbano-Marquez A., Nunes V. Reduced steady-state levels of mitochondrial RNA and increased mitochondrial DNA amount in human brain with aging // Mol. Brain Res.- 1997.- Vol. 52.- P. 284-289.

73. Bendall K.E., Sykes B.C. Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mitochondrial mtDNA control region // Am. J. Hum. Genet.- 1995.- Vol. 57.- P. 248-256.

74. Bendall K.E., Macaulay V.A., Baker J.R., Sykes B.C. Heteroplasmic point mutations in the human mtDNA control region // Am. J. Hum. Genet.1996.- Vol. 59.-P. 1276-1287.

75. Bendall K.E., Macaulay V.A., Sykes B.C. Variable levels of a heteroplasmic point mutation in individual hair roots // Am. J. Hum. Genet.1997.- Vol.61.- P. 1303-1308.

76. Bentzen P., Leggett W.C., Brown G.G. Length and restriction site heteroplasmy in the mitochondrial DNA of American Shad (Alosa sapidissimd) U Genetics.- 1988.- Vol. 118.- P. 509-518.

77. Bidwell J.L., Bignon J.D. DNA-RFLP methods and interpretation scheme for HLA-DR and DQ typing // Eur. J. Immunogenet.- 1991.- Vol. 18.- P. 522.

78. Bielawski J.P., Noack K., Pumo D.E. Reproducible amplification of RAPD markers from vertebrate DNA // Biotechniques.- 1995.- Vol. 18.- P. 856860.

79. Bimboim H.C. A superoxide action induced DNA strand-break metabolic pathway in human leukocytes: effects of vanadose // Biochem. Cell. Biol.-1988.-Vol. 66.- P. 374-381.

80. Birky C.W. Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes: mechanisms and evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.-Vol. 92.-P. 11331-11338.

81. Blanquer-Maumont A., Crouau-Roy В., Polymorphism, monomorphism, and sequences in conserved microsatellites in primate species // J. Mol. Evol.- 1995.- Vol. 41.- P. 492-497.

82. Blok R.B., Gook D.A., Thombum D.R., Dahl H.-H.M. Skewed segregation of the mtDNA nt8993 (T—»G) mutation in human oocytes // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 60.- P. 1495-1501.

83. Bodenteich A., Mitchell L.G., Merril C.R. A lifetime of retinal light exposure does not appear to increase mitochondrial mutations // Gene.-1991.-Vol. 108.- P. 305-309.

84. Bodmer W.F., Bodmer J.G. Evolution and function of the HLA system // Brit Med. Bull.- 1978.- Vol. 34.- P .390-416.

85. Bogenhagen D., Clayton D.A. The number of mitochondrial deoxyribnucleic acid genomes in mouse L and HeLa cells: quantitative isolation of mitochondrial deoxyribonucleic acid // J. Biol. Chem.- 1974.-Vol. 249.- P. 7991-7995.

86. Bogenhagen D.F. Repair of mtDNA in vertebrates // Am. J. Hum. Genet.- 1999.-Vol. 64.-P. 1276-1281.

87. Boore J.L. Animal mitochondrial genomes // Nucl. Acids Res.- 1999.-Vol. 27.-P. 1767-1780.

88. Bowcock A.M., Ruiz-linared A., Tomfohrde J., Minch E., Kidd J.R. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites // Nature.- 1994.- Vol. 368.- P. 455-457.

89. Brandstatter A., Parsons Т., Parson W. Rapid screening of mtDNA coding region SNPs for the identification of west European Caucasian haplogroups // Int J Legal Med.- 2003.- Vol. 117.- P. 291-298.

90. Brenner S., Elgar G., Sandfond R., Macrae A., Venkatesh В., Aparicio S. Characterization of the pufferfish (Fugu) genome as a compact vertebrate genome //Nature.- 1993.- Vol. 366.- P. 265-268.

91. Brenner Ch. DNA* VIEW: an integrated software package for DNA identification // http://www.dna-view.com/dnaview.htm

92. Brohede J., Ellegren H. Microsatellite evolution: polarity of substitutions within repeats and neutrality of flanking sequences // Proc. R. Soc. Lond. Ser.- 1999.- Vol. 266.- P. 825-833.

93. Brown W.M., George M., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979.- Vol. 76.- P. 1967-1971.

94. Brown G.G., Gadaleta G., Pepe G., Saccone C., Sbisa E. Structural conservation and variation in the D-loop-containing region of vertebrate mitochondrial DNA // J. Mol. Biol.- 1986.- Vol. 192.- P. 503-511.

95. Brown M.D., Wallace D.C. Molecular basis of mitochondrial DNA disease //J. Bioenergetics Biomembranes.- 1994.- Vol. 26.- P. 273-289.

96. Brown T.A. DNA sequencing.- Oxford: IRL Press, 1994.- 101 p.

97. Budowle В., Chakraborty R., Guisti A.M., Eisenberg A.J., Alien R.C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE // Am. J. Hum. Genet.- 1991.- Vol. 48.- P. 137-144.

98. Budowle В., Moretti T.R., Keys K.M., Koons B.W., Smerick J.B. Validation studies of the CTT STR multiplex system // J. Forensic. Sci.-1997.- Vol. 42.- P. 701-707.

99. Budowle B. CODIS and PCR-based short tandem repeat loci: Law enforcement tools // In: Proceedings from the Second European Symposium on Human Identification.- Promega. Madison. Wis., 1998.- P. 73-88.

100. Budowle В., Allen R.C. Analysis of Amplified Fragment-Length Polymorphisms (VNTR/STR Loci) for Human Identity Testing // Forensic DNA Profiling Protocols. Eds. P.J. Lincoln, Thomson J.- Totowa, New Jersey, Humana Press, 1998.- P. 155-172.

101. Budowle В., DiZinno J.A., Wilson M. Interpretation guidelines for mitochondrial DNA sequencing // The 10th Intern. Symposium on Human Identification.- Promega, 1999.

102. Budowle В., Wilson M.R., DiZinno J.A., Stauffer C., Fasano M.A., Holland M.M., Monson K.L. Mitochondrial DNA regions HVI and HVII population data // Forensic Sci. Int.- 1999.- Vol. 103.- P. 23-35.

103. Bugawan T.L., Saki R.K., Levenson C.H., Watson R.M., Erlich H.A. The use of non-radioactive oligonucleotide probes to analyze enzymatically amplified DNA for prenatal diagnosis and forensic HLA typing // Biotechnology.- 1988.- Vol. 6.- P. 943-947.

104. Burgoyne L.A. Solid medium and method for DNA storage // US patent, 1996.- Serial number 5,496,562.

105. Calloway C.D., Reynolds R.L., Herrin G.L., Anderson W.W. The frequency of heteroplasmy in the HVII region of mtDNA differs across tissue types and increases with age // Am. J. Hum. Genet.- 2000.- Vol. 66.-P. 1384-1397.

106. Campbell R.D., Trowsdale J. Map of the human MHC // Immunology Today.- 1993.- Vol. 14.- P. 349-352.

107. Cann R.L., Stoneking M., Wilson A.C. Mitochondrial DNA and Human Evolution // Nature.- 1987.- Vol. 325.- P. 31-36.

108. Cecconi F., Giorgi M.I., Mariottini P. Unique features in the mitochondrial D-loop region of the European sea bass Dicentrarchus labrax //Gene.- 1995.- Vol. 160.- P. 149-155.

109. Cesarone C., Bolognesi C., Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst // Anal. Biochem.- 1979.- Vol. 100.- P. 188-197.

110. Chen X., Prossner R., Simonetti S., Sadlock J., Jagiello G., Schon E.A. Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes // Am. J. Hum. Genet.- 1995.- Vol. 57.- P. 239-247.

111. Christiansen G, Christiansen C. Heterology of mitochondrial DNA from mammals detected by electron microscopic heteroduplex analyses // Nucleic Acids Res.- 1983.- Vol. 11.-P. 37-56.

112. Clary D.O., Wolstenholme D.R. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila Yacuba: nucleotide sequence, gene organization and genetic code // J. Mol. Evol.- 1985.- Vol. 22.- P. 252-271.

113. Clayton D.A., Doda J.N., Friedberg E.C. The absence of a pyrimidine dimer repair mechanism in mammalian mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1974.- Vol. 71.- P. 2777-2781.

114. Clayton D.A. Transcription of the mammalian mitochondrial genome // Annu. Rev. Biochem.- 1984.- Vol. 53.- P. 573-594.

115. Clayton D.A. Transcription and replication of mitochondrial DNA // Hum. Reprod.- 2000.- Vol. 15.- P. 11-17.

116. Colbourne J.K., Neff B. D., Wright J.M., Gross M.R. DNA fingerprinting of bluegill sunfish (Lepomis macrochiris) using (GT)n microsatellites and its potential for assessment of mating success // Can. J. Fish. Aquat. Sci.- 1996.- Vol. 53.- P. 342-349.

117. Crespillo M., Luque J.A., Paredes M.,"Fernandez R., Ramirez E., Valverde J.L. Mitochondrial DNA sequences for 118 individuals from northeastern Spain // Int. J. Legal Med.- 2000.- Vol. 114.- P. 130-132.

118. Christiansen G., Christiansen C. // Nucl. Acids Res.- 1983.- Vol. 11.- P. 37-56.

119. Comas D., Paabo S., Bertranpetit J. Heteroplasmy in the control region of human mitochondrial DNA // Genome Res.- 1995.- Vol. 5.- P. 89-90.

120. Cummins J.M. Fertilization and elimination of the paternal mitochondrial genome // Hum. Reprod.- 2000.- Vol. 15.- P. 92-101.

121. Daxhelet G.A., Coene M.M., Hoet P.P., Cocito C.G. Spectrofluorometry of dyes with DNAs of different base composition and conformation // Anal. Biochem.- 1989.- Vol. 179.- P. 401-403.

122. Derenko M., Malyarchuk В., Shields G.F. Mitochondrial cytochrome b sequence from a 33 000 year-old woolly mammoth (Mammuthus primigenius) // Ancient Вiomolecules.- 1997.-Vol. 1.- P. 149-153.

123. Dib C., Faure S., Fizames C., Samson D., Drouot N. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites // Nature.-1996.-Vol. 380.-P. 152-154.

124. Dietrich W.F., Miller J., Steen R., Merchant M.A., Damaron-Boles D. A comprehensive genetic map of the mouse genome // Nature.- 1996.- Vol. 389.- P. 149-152.

125. Dimitri P., Junakovic N. Revising the selfish DNA hypothesis. New evidence on accumulation of transposable elements in heterochromatin // Trends Genet.- 1999.-Vol. 15.-P. 123-124.

126. Dimo-Simonin N., Grange F., Taroni F., Brandt-Casadevall C., Mangin P. Forensic evaluation of mtDNA in a population from south west Switzerland // Int. J. Legal Med.- 2000.- Vol. 113.- P. 89-97.

127. Di Rienzo A., Wilson A.C. Branching pattern in the evolutionary tree for human mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- Vol. 88.-P. 1597-1601.

128. Dizdaroglu M., Bergtold D.S. Characterization of free radical-induced base damage in DNA at biologically relevant levels // Ann. Biochem.-1986.-Vol. 156.-P. 182-188.

129. Doda J.N., Wright C.T., Clayton D.A. Elongation of displacement-loop strands in human mouse mitochondrial DNA is arrested near specific template sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981.- Vol. 78.- P. 6116-6120.

130. Doersen C.J., Guerrier-Takada С., Altman S., Attardi G. Characterization of an RNase P activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RNase P activity // J. Biol. Chem.- 1985.- Vol. 260.-P. 5942-5949.

131. Dufresne C., Mignotte F., Gueride M. The presence of tandem repeats and the initiation of replication in rabbit mitochondrial DNA // European J. Biochem.- 1996.- Vol. 235.- P. 593-600.

132. Dunbar D.R., Moonie P.A., Jacobs H.T., Holt U. Different cellular backgrounds confer a marked advantage to either mutant or wild type mitochondrial genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- Vol. 92.- P. 6562-6566.

133. Dykes D.D. Detection of red cell enzyme and serum protein polymorphisms in bloodstains: In: Serological Methods in Forensic Science (Eds: Rolih S.D., Judd W.J.). American Association of Blood Banks: Arlington, 1985.-P 63.

134. Edwards A., Civitello A., Hammond H.A., Caskey C.T. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats // Am. J. Hum. Genet.- 1991.- Vol. 49.- P. 746-756.

135. Ellegren H. Mutation rates at porcine microsatellite loci // Mammal. Genome.- 1995.- Vol. 6.- P. 376-377.

136. Englund P.T., Najduk S.L., Marini J.C. The molecular biology of trypanosomes // Ann. Rev. Biochem.- 1982.- Vol. 51.- P. 695-726.

137. Erlich H.A., Scheldon E.L., Horn G. HLA typing using DNA probes // Biotechnology.- 1986.- Vol. 4.- P. 975-981.

138. Evett I.W., Werett D.J., Pinchin R., Gill P. Bayesian analisis of single locus DNA profiles // Proceedings for the International Symposium of Human Identification.- Promega Corporation. Madison, 1989,- P. 77-101.

139. Evett I.W., Scranage J., Pinchin R. An illustration of the advantages of efficient statistical methods for RFLP analysis in forensic science // Am. J. Hum. Genet.- 1993.- Vol. 52.- P. 498-505.

140. Evett I.W., Weir B.S. Interpreting DNA evidence: statistical genetics for forensic scientists. Sunderland: Sinauer Associates, Inc. 1998.- 278 p.

141. Farias I.P., Orti G., Sampaio I., Meyer A. The cytochrome b gene as a phylogenetic marker: the limits of resolution for analysing relationships among cichlid fishes // J. Mol. Evol.- 2001.- Vol. 53.- P. 89-103.

142. Ferris S.D., Prager E.M., Ritte U., Wilson A.C. Mitochondrial DNA evolution in mice//Genetics.- 1983.- Vol. 105.- P. 681-721.

143. Finnila S., Lehtonen M.S., Majamaa K. Phylogenetic network for European mtDNA // Am. J. Hum. Genet.- 2001.- Vol. 68.- P. 1475-1484.

144. Fisher D.L., Holland M.M., Mitchell L., Sledzic P., Wilcox A.W., Wadhams M., Weedn V.W. Extraction, evaluation, and amplification of DNA from decalcified and undecalcified United States Civil War bone // J. Forensic Sci.- 1993.- Vol. 38.- P. 60-68.

145. Foran D.R., Hixson J.E., Brown W.M. Comparisons of ape and human sequences that regulate mitochondrial DNA transcription and D-loop DNA synthesis//Nuc. Acid. Res.- 1988.- Vol. 16.-P. 5841-5861.

146. Freese E.B. Transitions and transversions induced by depurination agents // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1961.- Vol. 47.- P. 540-545.

147. Fregeau C.J., Foumey R.M. DNA typing with fluorescently tagged short tandem repeats: a sensitive and accurate approach to human identification // Biotechniques.- 1993.-Vol. 15.-P. 100-119.

148. Fujii H., Shimada Т., Goto Y., Okazaki T. Cloning of the mitochondrial genome of Rana catesbeiana and the nucleotide sequences of the ND2 and five tRNA genes //J. Biochem. (Tokyo).- 1988.- Vol. 103.- P. 474-481.

149. Gentil A., Le Page F., Cadet J., Sarasin A. Mutation spectra induced by replication of two vicinal oxidative DNA lesions in mammalian cells // Mutat. Res.- 2000.- Vol. 452.- P. 51-56.

150. Giles R.E., Blanc H., Cann H.M., Wallace D.C. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980.- Vol. 77.-P. 6715-6719.

151. Gill P., Ivanov P.L., Kimpton C., Piercy R., Benson N., Tully G., Evett I., Hagelberg E., Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis // Nat. Genet.- 1994.- Vol. 6.- P. 130-135.

152. Gordenin D.A., Kunkel T.A., Resnick M.A. Repeat expansion—all in a flap? //Nature Genet.- 1997.- Vol. 16.- P. 116-118.

153. Gyllensten U., Allen M. PCR-based HLA class II typing // PCR Methods and Applications.- 1991.- Vol. 1.- P. 91-98.

154. Gyllensten U., Wharton D., Josefsson A., Wilson A.C. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice // Nature.- 1991.- Vol. 352,- P. 255-257.

155. Haber J.E., Louis E.J. Minisatellite origins in yeast and humans // Genomics.- 1998.- Vol. 15.- P. 132-135.

156. Hagelberg E., Gray I.C., Jeffreys A. Identification of the skeletal remains of a murder victim by DNA analysis // Nature.- 1991.- Vol. 352.-P. 427-429.

157. Haglund W.D., Reay D.T., Tepper S.L. Identification of Decomposed Human Remains by Deoxyribonucleic Acid (DNA) Profiling // J. Forensic Sci.- 1990.- Vol. 35.- P. 724-729.

158. Hall R.M., Nagley P., Linane A.W. // Mol. Gen. Genet.- 1976.- Vol. 145.- P. 169-175.

159. Hamazaki S., Koshiba M., Sugiyama T. Organ distribution of mutant mitochondrial tRNAleu(UUR) gene in a MELAS patient // Acta Pathologica Japonica.- 1993.- Vol. 43.- P. 187-191.

160. Hammond H.A., Jin L., Zhong Y., Caskey C.T., Chakraborty R. Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification applications // Am. J. Hum. Genet.- 1994.- Vol. 55.- P. 175-189.

161. Handt O., Krings M., Ward R.H., Paabo S. The retrieval of ancient human DNA sequences // Am. J. Hum. Genet.- 1996.- Vol. 59.- P. 368-376.

162. Handt O., Meyer S., von Haessler A. Compilation of human mtDNA control region sequences // Nuc. Acid. Res.- 1998.- Vol. 26.- P. 126.

163. Hanekamp J.S., Thilly W.G., Chaudry M.A. Screening for human mitochondrial DNA polymorphisms with denaturing gradient gel electrophoresis // Hum. Genet.- 1996.- Vol. 98.- P. 243-245.

164. Hasegawa M., Di Rienzo A., Kocher T.D., Wilson A.C. Toward a more accurate estimate for the human mitochondrial DNA tree // J. Mol. Evol.-1993.- Vol.37.- P. 347-354.

165. Hauswirth W.W., Laipis P.J. Mitochondrial DNA polymorphism in a maternal lineage of Holstein Cows // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.-Vol. 79.- P. 4686-4690.

166. Hauswirth W.W., Van de Walle M.J., Laipis P.J., Olivo P.D. Heterogeneous mitochondrial DNA D-loop sequences in Bovine tissue // Cell.- 1984.- Vol. 37.- P. 1001-1007.

167. Hauswirth W.W., Clayton D.A. Length heterogeneity of a conserved displacement-loop sequence in human mitochondrial DNA // Nucl. Acids Res.- 1985.- Vol. 13.-P. 8093-8104.

168. Hedrick P.W. Highly variable loci and their interpretation in evolution and conservation//Evolution.- 1999.- Vol. 53.- P. 313-318.

169. Ancient DNA: recovery and analysis of genetic material from paleontological, archaeological, museum, medical, and forensic specimens. Eds. Herrmann В., Hummel S.- New York, Berlin: Springer, 1994.- 264 p.

170. Higuchi R., Beroldingen C.H., Sensabaugh G.F., Erlich H.A. DNA typing from single hairs //Nature.- 1988.- Vol. 332.- P. 543-546.

171. Hixson J.E., Brown,W.M. A comparison of the small ribosomal RNA genes from the mitochondrial DNA of the great apes and humans: sequence, structure, evolution, and phylogenetic implications // Mol. Biol. Evol.-1986.-Vol.3.-P. 1-18.

172. Hochmeister M.N., Budowle В., Borer U.V., Eggmann U., Comey C.T., Dirnhofer R. Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted fromcompact bone from human remains // J. Forensic Sci.- 1991.- Vol. 36.- P. 1649-1661.

173. Hoelzel A.R., Lopez J.V., Dover G.A., O'Brien S.J. Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequence in the mitochondrial DNA control region of carnivores //J. Mol. Evol.- 1995.- Vol. 39.- P. 191-199.

174. Holland M.M., Parsons T.J. Validation and Use of Mitochondrial DNA Sequence Analysis for Forensic Casework // Forensic Science Reviews.-1999.- Vol. 11.- P. 21-50.

175. Holloszy J.O., Coyle E.F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences // J. Appl. Physiol.- 1984,- Vol. 56.-P. 831-838.

176. Holt U., Harding A.E., Petty R.K.H., Morgan-Hughes J.A. A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy // Am. J. Hum. Genet.- 1990.- Vol. 46.- P. 428-433.

177. Hood D.A., Balaban A., Connor M.K., Craig E.E., Nishio M.L., Rezvani M., Takahashi M. Mitochondrial biogenesis in striated muscle //Can. J. Appl. Physiol.- 1994.- Vol. 19.- P. 12-48.

178. Horai S., Hayasaka K. Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondrial DNA // Am. J. Hum. Gen.- 1990.- Vol. 46.- P. 828-842.

179. Horai S., Satta Y., Hayasaka K., Kondo R., Inoue Т., Ishida Т., Hayashi S., Takahata N. Man's place in Hominoidea revealed by mitochondrial DNA genealogy // J. Mol. Evol.- 1992.- Vol. 35.- P. 32-43.

180. Horai S., Hayasaka K., Kondo R., Tsugane K., Takahata N. Recent African origin of modern humans revealed by complete sequences ofhominoid mitochondrial DNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- Vol. 92.- P. 532-536.

181. Horn G.T., Richards В., Merrill J.J., Klinger K.W. Characterization and rapid diagnostic analysis of DNA polymorphisms closely linked to the cystic fibrosis locus // Clinical Chemistry.- 1980.- Vol. 36.- P. 1614-1619.

182. Hoss M., Jaruga P., Zastawny Т. H., Dizdaroglu M., Paabo, S. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues // Nucleic Acids Res.- 1996.-Vol. 24.-P. 1304-1307.

183. Howell N., Halvorson S., Kubacka I., McCullough D.A., Bindoff L.A., Tumbull D.M. Mitochondrial gene segregation in mammals: Is the bottleneck always narrow? // Hum. Genet.- 1992.- Vol. 90.- P. 117-120.

184. Howell N., Xu M., Haivorson S., Bodis-Wollner I., Sherman J. A heteroplasmic LHON family: Tissue distribution and transmission of the 11778 mutation // Am. J. Hum. Genet.- 1994.- Vol. 55.- P. 203-206.

185. Howell N., Kubacka I., Halvorson S., Howell В., McCullough D.A., Mackey D. Phylogenetic analysis of the mitochondrial genomes from Leber hereditary optic neuropathy pedigrees // Genetics.- 1995.- Vol. 140.- P. 285302.

186. Howell N., Kubacka I., Mackey D.A. How rapidly does the human mitochondrial genome evolve? // Am. J. Hum. Genet.- 1996.- Vol. 59.- P. 501-509.

187. Howell N. MtDNA Recombination: What do in vitro data mean? // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 19-22.

188. Howell N., Mackey D. MtDNA mutation rates No need to panic. Reply to Macauley et al. // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 983990.

189. Howell N., Bogolin C., Jamieson R., Marenda D.R., Mackey D.A. MtDNA mutations that cause optic neuropathy: how do we know? // Am. J. Hum. Gen.- 1998.- Vol. 62.- P. 196-202.

190. Hiihne J., Pfeiffer H., Brinkmann B. Heteroplasmic substitutions in the mitochondrial DNA control region in mother and child samples // Int. J. Leg. Med.- 1998.- Vol. 112.- P. 31.

191. Hiihne J., Pfeiffer H., Waterkamp K., Brinkmann B. Mitochondrial DNA in human hair shafts existence of intra-individual differences? // Int. J. Legal Med.- 1999.- Vol. 112.- P. 172-175.

192. Hutchison C.A., Newbold J.E., Potter S.S., Edgell M.H. Maternal inheritance of mammalian mitochondrial DNA // Nature.- 1974.- Vol. 251.-P. 536-538.

193. Ingman M., Kaessmann H., Paabo S., Gyllensten U. Mitochondrial genome variation and the origin of modern humans // Nature.- 2000.- Vol. 408.-P. 708-713.

194. Inman K., Rudin N. An Introduction to Forensic DNA Analysis. Boca Raton, New York: CRC Press, 1997.- 256 p.

195. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. PCR strategies.- San Diego: Academic Press, 1995.- 374 p.

196. Ishida N., Hasegawa Т., Takeda K., Sakagami M., Onishi A., Inumaru S., Komatsu M., Mikoyama H. Polymorphic sequence in the D-loop region of equine mitochondrial DNA //Anim. Genet.- 1994.- Vol. 26.- P. 215-221.

197. Jazin E., Cavelier L., Eriksson I., Oreland L., Cyllensten U. Human brain contains high levels of heteroplasmy in the noncoding regions of mitochondrial DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1996.- Vol. 93.- P. 12382-12387.

198. Jazin E., Soodyall H., Jalonen P., Lindholm E., Stoneking M., Gyllensten U. Mitochondrial mutation rate revisited: hot spots for heteroplasmy and polymorphism // Nat. Genet.- 1998,- Vol. 18.- P. 109110.

199. Jeffreys A., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable minisatellite regions in human DNA // Nature.- 1985.- Vol. 314.- P. 67-73.

200. Jeffreys A., Wilson V., Thein S. Individual specific fingerprints of human DNA // Nature.- 1985.- Vol. 361.- P. 75-79.

201. Jeffreys A.J., Royle N.J., Wilson V., Wong Z. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem-repetitive hypervariable loci in human DNA // Nature.- 1988.- Vol. 332.- P. 278-281.

202. Jenuth J.P., Peterson A.C., Fu K., Shoubridge E.A. Random genetic drift in the female gennline explains the rapid segregation of mammalian mitochondrial DNA //Nat. Genet.- 1996.- Vol. 14.- P. 146-151.

203. Johansen S., Guddal P.H., Johansen. Organization of the mitochondrial genome of Atlantic cod, Gadus morhua // Nucleic Acids Res.- 1990.- Vol. 18.- P. 411-419.

204. Johansson A., Goransson I., Larsson P., Sjostedt A. Extensive allelic variation among Francisella lularensis strains in a short-sequence tandem repeat region // J. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.- P. 3140-3146.

205. Johnson K.P., Sorenson M.D. Comparing Molecular Evolution in Two Mitochondrial Protein Coding Genes (Cytochrome b and ND2) in the Dabbling Ducks (Tribe: Anatini) // Mol. Phylogen. Evol.- 1998.- Vol. 10.-P. 82-94.

206. Jones D.A. Blood samples: Probability of discrimination // J. Forensic Sci. Soc.- 1972.- Vol. 12.- P. 355-359.

207. Kahloun A.E., Chauvel В., Mauvieux V., Dorval I., Jouanolle A., Gicquel I., Gall J., David V. Localization of seven genes around the HLA-A locus // Hum. Mol. Genetics.- 1993.- Vol. 2.- P. 55-60.

208. Kaneda H., Hayashi J.I., Takahama S., Taya C., Lindahl K.F., Yonekawa H. Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1995.- Vol. 92.- P. 4542-4546.

209. Kang D., Miyako K., Kai Y., Irie Т., Takeshige K. In vivo determination of replication origins of human mitochondrial DNA by ligation-mediated polymerase chain reaction // J. Biol. Chem.- 1997.- Vol. 272.- P. 1527515279.

210. Kappes D., Strominger J.L. Human class II major histocompatibility complex genes and proteins // Ann. Rev. Biochem.- 1988.- Vol. 57.- P. 9911028.

211. Kendall E., Sargent C.A., Campbell R.D. Human major histocompatibility complex contains a new cluster of genes between the HLA-D and complement C4 loci // Nucleic Acids Research.- 1990.- Vol. 18.-P. 7251-7257.

212. King M.P., Attardi G. Injection of mitochondria into human cells leads to a rapid replacement of the endogenous mitochondrial DNA // Cell.-1988.- Vol. 52.-P. 811-819.

213. Kirby L.T. DNA Fingerprinting: an Introduction.- New York: Stockton Press, 1992.-366 p.

214. Klevytska A.M., Price L.B., Schupp J.M., Worsham P.L., Wong J., Keim P. Identification and characterization of variable-number tandem repeats in the Yersinia pestis genome // J. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.-P. 3179-3185.

215. Kobilinsky L. Recovery and stability of DNA in samples of forensic science significance // Forensic Science Review.- 1992.- Vol. 4.- P. 67-87.

216. Koehler C.M., Lindberg G.L., Brown D.R., Beitz D.C., Freeman A.E., May field J.E., Myers A.M. Replacement of bovine mitochondrial DNA by a sequence variant within one generation // Genetics.- 1991.- Vol. 129.- P. 247-255.

217. Kogelnik A.M., Lott M.T., Brown M.D., Navathe S.B., Wallace D.C. MITOMAP: a human mitochondrial genome database // Nuc. Acids Res.-1996.- Vol. 24.- P. 177-179.

218. Kogelnik A.M., Lott M.T., Brown M.D., Navathe S.B., Wallace D.C. MITOMAP: a human mitochondrial genome database—1998 update // Nuc. Acids Res.- 1998.- Vol. 26.- P. 112-115 (http://www.gen.emory.edu/mitomap.html).

219. Kondo R., Satta Y., Matsuura E.T., Ishiwa H., Takahata N., Chigusa S.I. Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila // Genetics.- 1990.-Vol. 126.- P. 657-663.

220. Kornberg A., Baker T.A. DNA Replication.- New York: Freeman, 1992.- 288 p.

221. Kornienko I.V., Vodolazhsky, Ivanov P.L. Genetic variation of the nine Profiler Plus loci in Russians // Int. J. Legal Medicine.- 2002.- Vol. 116.- P. 309-311.

222. Kornienko I.V., Vodolazhsky D.I., Ivanov P.L. The polymorphism of ND3, ND4L and ND6 structural genes of mtDNA among Russians // 14th International Symposium on Human Identification.- USA. Promega, 2003.-P. 48.

223. Krasnow M.A., Cozzarelli N.R. Catenation of DNA rings by topoisomerases. Mechanism of control by spermidine // J. Biol. Chem.-1982.- Vol. 257.- P.2687-2693.

224. Krings M., Geisert H., Schmitz R.W., Krainitzki H., Paabo S. DNA sequence of the mitochondrial hypervariable region II from the Neandertal type specimen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- Vol. 96.- P. 55815585.

225. Kumar S. Patterns of nucleotide substitution in mitochondrial protein coding genes of vertebrates // Genetics.- 1996.- Vol. 143.- P. 537-548.

226. Lagerstrom-Fermer M., Olsson C., Forsgren L., Syvanen A.C. Heteroplasmy of the human mtDNA control region remains constant during life // Am. J. Hum. Genet.- 2001.- Vol. 68.- P. 1299-1301.

227. Lanave C., Attimonelli M., De Robertis M., Licciulli F., Liuni S., Sbisa E., Saccone C. Update of AmmtDB: a database of multi-aligned metazoa mitochondrial DNA sequences // Nucl. Acids Res.- 1999.- Vol. 27.- P. 134137.

228. Lander E.S., Budowle B. DNA fingerprinting dispute laid to rest // Nature.- 1994.- Vol. 371.- P. 735-738.

229. Larsson N.G., Hoime E., Kristiansson В., Oldfors A., Tulinius M. Progressive increase of the mutated mitochondrial DNA fraction in Kearns-Sayre syndrome // Pediatr. Res.- 1990.- Vol. 28.- P. 131-136.

230. Larsson N.G., Eiken H.G., Boman H., Hoime E., Oldfors A., Tulinius M.H. Lack of transmission of deleted mtDNA from a woman with Kearns-Sayre syndrome to her child // Am. J. Hum. Genet.- 1992.- Vol. 50,- P. 360363.

231. Larsson N.G., Oldfors A., Holme E., Clayton D.A. Low levels of mitochondrial transcription factor A in mitochondrial DNA depletion // Biochem. Biophys. Res. Com.- 1994.- Vol. 200.- P. 1374-1381.

232. Levinson G., Gutman G.A. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol.- 1987.- Vol. 4.-P. 203-221.

233. Lewin B. Gene Expression, 2 Eucariotic Chromosomes.- New York: Wiley, 1980.- P.531-569.

234. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature.- 1993.- Vol. 362.- P. 709-715.

235. Lunt D.H., Whipple L.E., Hyman B.C. Mitochondrial DNA variable number tandem repeats (VNTRs): utility and problems in molecular ecology//Mol. Ecology.- 1998.- Vol. 7.- P. 1441-1455.

236. Lutz S., Weisser H.-J., Heizmann J., Pollak S. Location and frequency of polymorphic positions in the mtDNA control region of individuals from Germany // Int. J. Legal Med.- 1998.- Vol. 111.- P. 67-77.

237. Lutz-Bonengel S., Schmidt U., Schmidt Т., Pollak S. Sequence polymorphisms within the human mitochondrial genes MTATP6, MTATP8 and MTND4 // Int. J. Legal. Med.- 2003.- Vol. 117.- P. 133-142.

238. Maca-Meyer N., Gonzalez A.M., Larruga J.M., Flores C., Cabrera,V.M. Major genomic mitochondrial lineages delineate early human expansions // BMC Genet.- 2001.- Vol. 2.- P. 13.

239. Macauley V.A., Richards M.B., Forster P., Bendall K.E., Watson E., Sykes B.C., Bandelt HJ. MtDNA mutation rates — No need to panic // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 983-990.

240. Macmillan C., Lach В., Shoubridge E.A. Variable distribution of mutant mitochondrial DNAs (tRNALeu3243.) in tissues of symptomatic relatives with MELAS: the role of mitochondrial segregation // Neurology.- 1993.-Vol. 43.-P. 1586-1590.

241. Malyarchuk B.A., Grzybowski Т., Derenko M.V., Czarny J., Wozniak M., Miscicka-Sliwka D. Mitochondrial DNA variability in Poles and Russians //Ann. Hum. Genet.- 2002.- Vol. 66.- P. 261-283.

242. Malyarchuk B.A., Grzybowski Т., Derenko M.V., Czarny J., Wozniak M., Miscicka-Sliwka D. Mitochondrial DNA variability in Bosnians and Slovenians // Ann. Hum. Genet.- 2003.- Vol. 67.- P. 412-425.

243. Mandel J.-L. Breaking the rule of three // Nature.- 1997.- Vol. 386.- P. 767-769.

244. Manfredi G., Thyagarajan D., Papadopoulou L.C., Pallotti F., Schon E.A. The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 61.- P. 953-960.

245. Marchington D.R., Hartshorne G.M., Barlow D., Poulton J. Homopolymeric tract heteroplasmy in mtDNA from tissues and single oocytes: support for a genetic bottleneck // Am. J. Hum. Genet.- 1997.- Vol. 60.- P. 408-416.

246. Marchington D.R., Macauley V., Hartshorne G.M., Barlow D., Poulton J. Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease // Am. J. Hum. Genet.- 1998.- Vol. 63.- P. 769-775.

247. Marshall H.D., Baker A.J. Structural conservation and variation in the mitochondrial control region of fringilline finches (Fringilla spp.) and the greenfinch (Carduelis chloris) // Mol. Biol. Evol.- 1997.- Vol. 14.- P. 173184.

248. Marzuki S., Noer A.S., Letrit P., Thyagarajan D., Kapsa R., Utthanaphol P., Byrne E. Normal variants of human mitochondrial DNA and translation products: the building of a reference data base // Human Genetics.- 1991.-Vol. 88.-P. 139-145.

249. Matthews P.M., Hopkin J., Brown R.M., Stephenson J.B.P., Hilton-Jones D., Brown G.K. Comparison of the relative levels of the 3243 (A—>G) mtDNA mutation in heteroplasmic adult and fetal tissues // J. Med. Genet.-1994.- Vol.31.- P. 41-44.

250. Mazzochi G., Robba C., Neri G. et al. // Cell Tissue Res.- 1976.- Vol. 172.- P. 149-156.

251. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantation development in mouse heteroplasmic embryos // Genetics.-1998.-Vol. 148.- P. 877-883.

252. Merriwether D.A., Clark A.G., Ballinger S.W., Schurr T.G., Soodyall H., Jenkins Т., Sherry S.T., Wallace D.C. The structure of human mitochondrial DNA variation//J. Mol. Evol.- 1991.- Vol. 33.- P. 543-555.

253. Messier W., Li S., Stewart C. The birth of microsatellites // Nature.-1996.- Vol.381.- P. 483.

254. Michaels G.S., Hauswirth W.W., Laipis P.J: Mitochondrial DNA copy number in bovine oocyles and somatic cells // Dev. Biol.- 1982.- Vol. 94.-P. 246-251.

255. Miclos G. Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate and invertebrate genome \\ Mol. Evol. Genet. Ed. Mclntyre R.J. New York: Plenum Press, 1985.- P. 241-321.

256. Miller K.W.P., Dawson J.L., Hagelberg E. A concordance of nucleotide substitutions in the first and second hypervariabie segments of the human mtDNA control region // Jnt. J. Leg. Med.- 1996.- Vol. 109.- P. 107-113.

257. Miller K.W.P., Budowle B. A compendium of human mitochondrial DNA control region: Development of an international standard forensic database // Croatian Medical J.- 2001.- Vol. 42.- P. 315-327.

258. Monnat R.J., Loeb L.A. Nucleotide sequence preservation of human mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- Vol. 82.- P. 2895-2899.

259. Monnat R.J., Reay D.T. Nucleotide sequence identity of mitochondrial DNA from different human tissues // Gene.- 1986.- Vol. 43.- P. 205-211.

260. Monson K.L., Miller K.W.P., Wilson M.R., DiZinno J.A., Budowle B.The mtDNA Population Database: An Integrated Software and Database

261. Resource for Forensic Comparison // Forensic Sci. Commun.- 2002.- Vol. 4.- № 2. (http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/april2002/mtDNA. htm).

262. Montoya J., Gaines G., Attardi G. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcriptional units // Cell.- 1983.- Vol. 34.- P. 151.

263. Moriyama Etsuko N., Powell Jeffrey R. Synonymous substitution rates in Drosophila: Mitohondrial versus nuclear genes // J. Mol. Evol.- 1997.-Vol. 45.- P. 378-391.

264. Morley J.M., Bark J.E., Evans C.E., Perry J.G., Hewitt С.А.,- Tully G. Validation of mitochondrial DNA minisequencing for forensic casework // Int. J. Legal Med.- 1999.- Vol. 112.- P. 241-248.

265. Morling N. Amplification of Short Tandem Repeat Loci Using PCR // Forensic DNA Profiling Protocols. Eds. P.J. Lincoln and J. Thomson.-Totowa, New Jersey: Humana Press, 1998.- P. 173-180.

266. Mountain J.L., Hebert J.M., Bhattacharyya S., Underbill P.A., Ottolenghi C., Gadgil M., Cavalli-Sforza L.L. Demographic history of India and mtDNA-sequence diversity // Am. J. Hum. Gen.- 1995.- Vol. 56.- P. 979-992.

267. Mullis K.B., Faloona F.A. In: Methods in Enzymology. Wu R. (ed.).-New York: Academic Press, 1987.- Vol. 155.- P. 335.

268. Mullis K.B., Ferre F., Gibbs R.A. PCR, The Polymerase Chain Reaction.- Boston: Birkhauser, 1994.- 458 p.

269. Muniz P., Saez P., Iradi A., Vina J., Oliva M.R., Saez G.T. Differences between cysteine and homocysteine in the induction of deoxyribose degradation and DNA damage // Free Radic. Biol. Med.- 2001.- Vol. 30.- P. 354-362.

270. Myers K.A., Saffhill R., O'Connor P.J. Repair of alkylated purines in the hepatic DNA of mitochondria and nuclei in the rat // Carcinogenesis.-1988.- Vol. 9.- P. 285-292.

271. The Evaluation of Forensic DNA Evidence. National Research Council.-Washington: National Academy Press, 1996.

272. Needleman S.B., Wunsch Ch.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins // J. Mol. Biol.- 1970.- Vol. 48.- P. 443-453.

273. Orekhov V., Poltoraus A., Zhivotovsky L.A., Spitsyn V., Ivanov P., Yankovsky N. Mitochondrial DNA sequence diversity in Russians // FEBS Lett.- 1999.- Vol. 445.- P. 197-201.

274. Paabo S. Mutational hot spots in the mitochondrial microcosm // Am. J. Hum. Genet.- 1996.- Vol. 59.- P. 493-496.

275. Parson W., Parsons T. J., Scheithauer R., Holland M. M. Population data for 101 Austrian Caucasian mitochondrial DNA d-loop sequences: Application of mtDNA sequence analysis to a forensic case // Int. J. Legal Med.- 1998.-Vol. 111.-P. 124-132.

276. Parsons T.J., Coble M.D. Increasing the Forensic Discrimination of Mitochondrial DNA Testing through Analysis of the Entire Mitochondrial DNA Genome // Croatian Medical Journal.- 2001.- Vol. 42.- P. 304-309.

277. Pereira L., Prata M.J., Amorim A. Diversity of mtDNA lineages in Portugal: not a genetic edge of European variation // Ann. Hum. Genet.-2000.- Vol. 64.- P. 491-506.

278. Pesole G., Gissi C., De Chirico A., Saccone C. Nucleotide substitution rate of mammalian mitochondrial genomes // J. Mol. Evol.- 1999.- Vol. 48.-P. 427-434.

279. Pfanner N. Mitochondrial import: crossing the aqueous intermembrane space // Curr. Biol.- 1998.- Vol. 8.- P. 262-265.

280. Pfeiffer H., Steighner R., Fisher R., Mornstad H., Yoon C.-L., Holland M. M. Mitochondrial DNA extraction and typing from isolated dentin-experimental evaluation in a Korean population // Int. J. Legal Med.- 1998.-Vol. 111.-P. 309-313.

281. Piccolo G., Focher F., Verri A., Spadari S., Banff P., Mazzarello P. Myoclonus epilepsy and ragged red fibers: Blood mitochondrial DNA heteroplasmy in affected and asymptomatic members of a family // Acta Neural. Scand.- 1993.- Vol. 88.- P. 406-409.

282. Piko L., Matsumoto L. Number of mitochondria and some properties of mitochondrial DNA in the mouse egg // Dev. Biol.- 1976.- Vol. 49.- P. 110.

283. Pinz K.G., Bogenhagen D.F. Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes // Mol. Cell. Biol.- 1998.- Vol. 18.- P. 1257-1265.

284. Polymeropoulos M.H., Xiao H., Rath D.S., Merril C.R. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human tyrosine hydroxylase gene (TH) // Nucleic Acids Res.- 1991.- Vol. 19.- P. 3753.

285. Prager E.M., Tichyt H., Sage R.D. Mitochondrial DNA Sequence Variation in the Eastern House Mouse, Mus musculus: Comparison With Other House Mice and Report of a 75-bp Tandem Repeat // Genetics.-1996.- Vol. 143.-P. 427-446.

286. Pult I., Sajantila A., Simanainen J., Georgiev O., Schaffner W., Paabo S. Mitochondrial DNA sequences from Switzerland reveal striking homogeneity of European populations // Biol. Chem.- 1994.- Vol. 375.- P. 837-840.

287. Rand M., Harrison R.G. Molecular population genetics of mtDNA size variation in crickets // Genetics.- 1989.- Vol. 121.- P. 551-569.

288. Rand M. Endotherms, ectotherms, and mitochondrial genome-size variation//J. Mol. Evol.- 1993.- Vol. 37.- P. 281-295.

289. Randerath K., Yang P., Danna T.F. Bulky adducts detected by 32P-postlabeling in DNA modified by oxidative damage in vitro. Comparison with rat lung I-compounds // Mutat. Res.- 1991.- Vol. 250.- P. 135-144.

290. Rawson P.D., Secor C.L., Hilbish T.J. The effects of natural hybridization on the regulation of doubly uniparental mtDNA inheritance in blue mussels (Mytilus spp.) // Genetics.- 1996.- Vol. 144.- P. 241-248.

291. Robin E.D., Wong R. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells // J. Cell. Phys.- 1988.- Vol. 136.- P. 507-513.

292. Roberti M., Musicco С., Polosa P.L., Gadaleta M.N., Cantatore P. DNA-helicase activity from sea urchin mitochondria // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1996.- Vol. 219.- P. 134-139.

293. Roberti M., Musicco C., Paola L.P., Milella F., Gadaleta M.N., Cantatore P. Multiple protein-binding sites in the TAS-region of human and rat mitochondrial DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1998.- Vol. 243.- P. 36-40.

294. Rodrick G.E., Corter C.E., Woodcock G.L.F., Fairbairn D. Ascaris suum: mitochondrial DNA in fertilized eggs and adult body muscle // Exp Parasitol.- 1977.- Vol. 42.- P. 150-156.

295. Roe B.A., Ma D.P., Wilson R.K., Wong J.F. The complete nucleotide sequence of the Xenopusl laevis mitochondrial genome // J. Biol. Chem.-1985.- Vol. 260.- P. 9759-9774.

296. Rousselet F., Mangin P. Mitochondrial DNA polymorphisms: a study of 50 French Caucasian individuals and application to forensic casework // Int. J. Legal Med.- 1998.- Vol. 111.- P. 292-298.

297. Russo C., Takezaki N., Masatoshi N. Efficiencies of different genes and different tree-building methods in recovering a known vertebrate phylogeny // Mol. Biol. Evol.- 1996.- Vol. 13.- P. 525-536.

298. Saccone C., Attimonelli M., Sbisa E. Structural elements highly preserved during the evolution of the D-loop-containing region in vertebrate mitochondrial DNA //J. Mol. Evol.- 1987.- Vol. 26.- P. 205-211.

299. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis К. В., Horn О. Т., Erlich H. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science.- 1985.- Vol. 230.-P. 1350-1354.

300. Sajantila A., Lahermo P., Anttinen Т., Lukka M., Sistonen P., Savontaus M.L., Aula P., Beckman L., Tranebjaerg L., Gedde-Dahl Т., Issel-Tarver L.,

301. DiRienzo A., Paabo S. Genes and languages in Europe: an analysis of mitochondrial lineages // Genome Res.- 1995.- Vol. 5.- P. 42-52.

302. Saki R., Bugawan T.L., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Analysis of enzymatically amplified P-globin and HLA-DQa DNA with allele-specific oligonucleotide probes // Nature.- 1986.- Vol. 324.- P. 163-166.

303. Salas A., Comas D., Lareu M.V., Bertranpetit J., Carracedo A. MtDNA analysis of the Galician population: a genetic edge of European variation // Eur. J. Hum. Genetic.- 1998.- Vol. 6.- P. 365-375.

304. Savolainen P., Arvestad L., Lundeberg J. MtDNA Tandem Repeats in Domestic Dogs and Wolves: Mutation Mechanism Studied by Analysis of the Sequence of Imperfect Repeats // Mol. Biol. Evol.- 2000.- Vol. 17.- P. 474-488.

305. Sawaguchi Т., Brenner Ch., Sawaguchi A. Application of DNA*VIEW & PATER to a kinship paternity case // Journal Leg Med.-1998.- Vol. 6.- P. 66-70.

306. Sbisa E., Tanzariello F., Reyes A., Pesole G., Saccone C., Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications // Gene.- 1997.- Vol. 205.- P. 125-140.

307. Schatz G. The doors to organelles // Nature.- 1998.- Vol. 395.- P. 439440.

308. Schwartz M., Vissing J. Paternal inheritance of mitochondrial DNA // N. Engl. J. Med.- 2002.- Vol. 347.- P. 576-580.

309. Shadel G.S., Clayton D.A. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates //Annu. Rev. Biochem.- 1997.- Vol. 66.- P. 409-435.

310. Shinichi K., Minoru F. Structural organization of glycophorin A and В genes: Glycophorin В gene evolved by homologous recombination at Alu repeat sequences // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1989.- Vol. 86.- P. 46194623.

311. Shmookler Reis R.J., Goldstein S., Mitochondrial DNA in mortal and immortal human cells. Genome number, integrity, and methylation // J. Biol. Chem.- 1983.- Vol. 258.- P. 9078-9085.

312. Schneider P.M. Recovery of high-molecular-weight DNA from Blood and Forensic Specimens. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 98: Forensic DNA Profiling Protocols, Eds.: Lincoln P.J., Thomson J., Totowa, NJ.: Humana Press, Inc., 1998.- P. 1-7.

313. Singh G., Maniccia-Bozzo E. Evidence for lack of mitochondrial DNA repair following cis-dichlorodiammineplatinum treatment // Cancer Chemother. Pharmacol.- 1990.- Vol. 26.- P. 97-100.

314. Slightom J.L., Blechl A.E., Smithies O. Human fetal Gy- and Ay- globin genes: complete nucleotide sequences suggest that DNA can be exchanged between these duplicated genes // Cell.- 1980.- Vol. 21.- P. 627-638.

315. Smith T.F., Waterman M.S. Comparison of biosequences //Adv. in Appl. Math.- 1981.- Vol. 2.- P. 482-489.

316. Smith K.H., Johns D.R., Heher K.L., Miller N.R. Heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy // Arch. Ophthalmol.- 1993.- Vol. 111.-P. 1486-1490.

317. Soong Deok Lee, Yoon Seong Lee, Jung Bin Lee. Polymorphism in the mitochondrial cytochrome В gene in Koreans an additional marker for individual identification // Int. J. Legal Med.- 2002.- Vol. 116.- P. 74-78.

318. Soodyall H., Jenkins Т., Mukherjee A., Du Toil E., Roberts D.F., Stoneking M. The founding mitochondrial DNA lineages of Tristan Da Cunha islanders // Am. J. Phys. Anthropol.- 1997.- Vol. 104.- P. 157-166.

319. Southern S.O., Southern P.J., Dizon A.E. Molecular characterization of a cloned dolphin mitochondrial genome // J. Mol. Evol.- 1989.- Vol. 28.- P. 32-42.

320. Stailings R.L., Ford A.F., Nelson D., Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes//Genomics.- 1991.-Vol. 10.-P.807-815.

321. Steighner R.J., Holland M. Amplification and sequencing of mitochondrial DNA in forensic casework // Methods Mol. Biol.- 1998.-Vol. 98.- P. 213-223.

322. Stoneking M., Sherry S.T., Redd A.J., Vigilant L. New approaches the dating suggest a recent age for the human mtDNA ancestor // Phil. Trans. R. Soc. Lond.- 1992.- В 337.- P. 167-175.

323. Stoneking M. Mitochondrial DNA and human evolution // J. Bionerg. Biomembr.- 1994.- Vol. 26.- P. 251-259.

324. Strack H.B., Freese E.B., Freese E. Comparison of mutation and inactivation rates induced in bacteriophage and transforming DNA by various mutagens //Mut. Res.- 1964.- Vol. 1.- P. 10-21.

325. Suomalainen Anu. Mitochondrial DNA and disease // Ann. Med.- 1997.-Vol. 29.- P. 235-246.

326. Sutovsky P., Navara C.S., Schatten G. Fate of the sperm mitochondria, and the incorporation, conversion, and disassembly of the sperm tail structures during bovine fertilization // Biol. Reprod.- 1996.- Vol. 55.- P. 1195-1205.

327. Tabor S., Richardson C.C. Selective oxidation of exonuclease domain of bacteriophage T7 DNA polymerase // J. Biol. Chem.- 1987.- Vol. 262.- P. 15330.

328. Tagliabracci A., Turchi C., Buscemi L., Sassaroli C. Polymorphism of the mitochondrial DNA control region in Italians // Int. J. Legal Med.-2001.- Vol. 114.- P. 224-228.

329. Tagliavini J., Battisti C., Conterio F. Polymorphic Ddel restriction sites in mitochondrial D-loop DNA from Emilian blood donors // Gene Geography.- 1993.- Vol. 7.- P. 221-229.

330. Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism // Genetics.- 1989.- Vol. 123.- P. 585-595.

331. Takeuchi Т., Nakajima M., Morimoto K. Relationship between the intracellular reactive oxygen species and the induction of oxidative DNA damage in human neutrophil-like cells // Carcinogenesis.- 1996.- Vol. 17.-P. 1543-1548.

332. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general sourse for polymorphic DNA markers \\ Nucl. Acids Res.- 1989.- Vol. 17.- P. 64636471.

333. Taylor J.S., Durkin J.M.H., Breden F. The death of a microsatellite: a phylogenetic perspective on microsatellite interruptions // Mol. Biol. Evol.-1999.-Vol. 16.-P. 567-572.

334. Taylor J.S., Breden F. Slipped-strand mispairing at noncontiguous repeats in Poecilia reticulata: a model for minisatellite birth // Genetics.-2000.- Vol. 155.- P.1313-1320.

335. Technical Working Group on DNA Analysis Methods: Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis // Crime Lab. Digest.- 1991.-Vol. 18.- P. 44.

336. Technical Working Group on DNA Analysis Methods: Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis // Crime Lab. Digest.- 1995.-Vol. 22.- P. 21.

337. Tegelstrom H., Hoggeren M. Paternity determination in the adder (Vipera berus) DNA fingerprinting or Random amplified polymorphic DNA?//Biochemical Genetics.- 1994.- Vol. 32.- P. 249-256.

338. Trowsdale J. Genomic structure and function in the MHC // TIG.- 1993.-Vol. 9.- P. 117-122.

339. Tully L.A. Examination of the use of forensic DNA typing from two perspectives: 1. Mitochondrial DNA heteroplasmy; 2. The role of DNA typing in criminal investigations // Doctoral dissertation. University of Maryland: Baltimore. MD. 1998.

340. Van Amstel H.K.P., Reitsma P.H. Tetranucleotide repeat polymorphism in the vWF gene // Nucleic Acids Res.- 1990.- Vol. 18.- P. 4957.

341. Van Belkum A., Scherer S., van Leeuwen W., Willemse D., van Alphen Z., Verbrugh H. Variable number of tandem repeats in clinical strains of Haemophilus influenzae II Infect. Immunol.- 1997.- Vol. 65.- P. 5017-5025.

342. Vilkki J., Savontaus M.L., Nikoskelainen E.K. Segregation of mitochondrial genomes in a heteroplasmic lineage with Leber hereditary optic neuoretinopathy // Am. J. Hum. Genet.- 1990.- Vol. 47.- P. 95-100.

343. Vogel F., Kopun M., Rathenberg R. Mutation and molecular evolution. In.: Molecular anthropology, Goodman M., Tashian R.E. (eds.).- New York: Plenum, 1976.- P. 13-33.

344. Wada C., Shionoya S., Fujino Y., Tokuhiro H., Akahoshi Т., Uchida Т., Ohtani H. Genomic instability of microsatellite repeats and its association with the evolution of chronic myelogenous leukemia // Blood.- 1994.- Vol. 83.- P. 3449-3456.

345. Wakeley J. Substitution rate variation among sites in hypervariable region 1 of human mitochondrial DNA // J. Mol. Evol.- 1993.- Vol. 37.- P. 613-623.

346. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T., Hodge J.A., Schurr T.G., Lezza A.M., Elsas L.J., Nikoskelainen E.K. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy // Science.- 1988.- Vol. 242.-P. 1427-1430.

347. Wallace D.C. Diseases of the mitochondrial DNA // Annu. Rev. Biochem.- 1992.-Vol. 61.-P. 1175-1212.

348. Wallace D.C. Mitochondrial genetics: A paradigm for aging and degenerative diseases? // Science.- 1992.- Vol. 256.- P. 628-632.

349. Walsh S.P., Fildes N., Louie A.S., Higuchi R. Report the Blind Trial of the Cetus AmpliType HLA DQa Forensic Deoxyribonucleic Acid (DNA) Amplification and Typing Kit // J. Forensic Sci.- 1991.- Vol. 36.- P. 15511556.

350. Walsh S.P., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // BioTechniques.- 1991.-Vol. 10.-P. 506-513.

351. Walsh P.S., Fildes N.J., Reynolds R. Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA //Nucleic Acids Res.- 1996.- Vol. 24.- P. 2807-2812.

352. Weber J.L. Informativeness of human (dC-dA)n • (dG-dT)n polymorphisms // Genomics.- 1990.- Vol. 7.- P. 524-530.

353. Weedn V.W. Forensic DNA tests // Clinics in Laboratory Medicine.-1996.- Vol. 16.-P. 187-196.

354. White M.T., Wagner E.K., Tewari K.K. Physicochemical characterization of Novikoff hepatoma mitochondrial DNA // Cancer Res.-1975.- Vol. 35.-P. 873-879.

355. Whitehead P.H. A historical review of the characterization of blood and secretion stains in the forensic laboratory. Part One: Bloodstains // Forensic Sci.Rev.- 1993.-Vol. 5.-P. 35.

356. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers //Nucleic Acids Research.- 1990.- Vol. 18.- P. 6531-6535.

357. Williams G.M., Jeffrey A.M. Oxidative DNA Damage: Endogenous and Chemically Induced // Regul. Toxicol. Pharmacol.- 2000.- Vol. 32.- P. 283292.

358. Wilkinson G.S., Mayer F., Kerth G., Petri B. Evolution of repeated sequence arrays in the D-loop region of bat mitochondrial DNA // Genetics.- 1997.-Vol. 146.-P. 1035-1048.

359. Wilson J.D., Moore G.A., Easteal S. Transmitted atypical methylation of mitochondrial (mt) DNA in the DIDMOAD syndrome // Diabetes.- 1994.-Vol. 43.-P.192.

360. Wilson M.R., Holland M.M., Stoneking M., DiZinno J.A., Budowle B. Guidelines for the Use of Mitochondrial DNA Sequencing in Forensic Science // Crime Laboratory Digest.- 1993.- Vol. 20.- P. 68-77.

361. Wilson M.R., DiZinno J.A., Polanskey D., Replogle J., Budowle B. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis // Int. J. Leg. Med.- 1995.- Vol. 108.- P. 68-74.

362. Wilson M.R., Polanskey D., Butler J., DiZinno J.A., Replogle J., Budowle B. Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts // BioTechniques.- 1995.- Vol. 18.- P. 662669.

363. Wiseman K., Kaur H., Halliwell B. DNA damage and cancer: measurement and mechanism // Cancer Lett.- 1995.- Vol. 93.- P. 113-120.

364. Wright J.M. Mutation at VNTRs: Are minisatellites the evolutionary progeny of microsatellites? \\ Genome.- 1994.- Vol. 37.- P. 345-347.

365. Xu X., Arnason U. A complete sequence of the mitochondrial genome of the Western lowland gorilla // Mol. Biol. Evol.- 1996.- Vol. 3.- P. 691-698.

366. Xu X., Arnason U. The mitochondrial DNA molecule of Sumatran orangutan and a molecular proposal for two (Bornean and Sumatran) species of orangutan // J. Mol. Evol.- 1996.- Vol. 43.- P. 431-437.

367. Yamamoto Т., Davis C.G., Brown M.S., Schneider M.J., Casey M.L., Goldstein J.L., Rassel D.W. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell.- 1984.- Vol. 21.-P. 27-38.

368. Yoneda M., Chomyn A., Martinuzzi A., Hurko O., Attardi G. Marked replicative advantage of human mtDNA carrying a point mutation that causes the MELAS encephalomyopathy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1992.-Vol. 89.- P. 11164-11168.

369. Zouros E., Oberhauser B.A., Saavedra C., Freeman K.R. An unusual type of mitochondrial DNA inheritance in the blue mussel Mytilus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.- Vol. 91.- P. 7463-7467.

370. Zuliani G., Hobbs H.H. Tetranucleotide repeat polymorphism in the LPL gene //Nucleic Acids Res.- 1990.- Vol. 18.- P. 4958.