Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Некоторые физико-химические и иммунобиологические свойства липополисахаридов Salmonella enterica sv typhi и shigellae

На правах рукописи

шмиголь

Владимир Игоревич

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ SALMONELLA ENTERICA SV

TYPHI И SHIGELLAE

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004

Работа выполнена в Институте иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук П.Г.Апарин, кандидат химических наук В.Л. Львов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин,

кандидат биологических наук И.С. Литвинов

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

диссертационного совета Д 208.017.01 в Институте иммунологии Федерального управления "Медбиоэкстрем" при Минздраве России по адресу: 115478, г.Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Федерального управления "Медбиоэкстрем" при Минздраве России.

Автореферат разослан С^^ОМ-Г 2004 г.

РАМН.

Защита состоится «2004

года в ^ часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

&P6S

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Липополисахариды (ЛПС), расположенные на внешней поверхности наружной мембраны грамотрицательных бактерий, представляют собой класс биологически активных полимерных молекул, эффективно активирующих адаптивный иммунный ответ и протективную активность. Вместе с тем, ЛПС являются бактериальными эндотоксинами, что до последнего времени препятствовало их использованию для создания бактериальных вакцин.

Одна из принципиальных возможностей получения нативных низкотоксичных ЛПС связана с их фракционированием с помощью различных методов и выделением «узких» гомогенных фракций ЛПС.

Комплексное систематическое исследование физико-химических и иммунобиологических свойств фракций ЛПС представляется весьма актуальным и открывает возможность для дальнейшего исследования таких соединений в качестве иммунотропных препаратов.

Следует подчеркнуть, что проведенное нами исследование впервые привело к получению серий низкотоксичных ЛПС из вирулентных штаммов бактерий кишечной группы, возбудителей таких распространенных острых кишечных инфекций, как шигеллез и брюшной тиф.

Цель работы

Основная цель работы заключалась в получении из суммарного ЛПС Shigella sonnei, фаза 1, Shigella flexneri 2а и Salmonella enterica sv typhi отличающихся длиной полисахаридной цепи, в изучении физико-химических и биологических характеристик этих фракций, а также в изучении возможности выделения иммуногенных низкоэндотоксичных ЛПС.

Задачи исследования

• Провести фракционирование ЛПС Sh. sonnei, фаза 1, Sh. flexneri 2а и

S. enterica sv typhi. ---——

I РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 3 БИБЛИОТЕКА

\ С Петербург

| гоо^Рк _

• Изучить физико-химические характеристики выделенных фракций.

• Изучить иммунобиологические характеристики выделенных фракций с целью поиска низкотоксичных и высокоиммуногенных фракций ЛПС.

Научная новизна работы

Впервые с использованием трех различных методов фракционирования выделены фракции ЛПС Sh. sonnei, фаза 1, Sh. flexneri 2а и S. enterica sv typhi, отличающиеся по молекулярной массе и проведен сравнительный анализ их пирогенности, эндотоксичности и иммуногенности.

Впервые установлено, что с увеличением длины О-специфического полисахарида (О-СП) уменьшается пирогенность и эндотоксичность ЛПС-фракций, причем фракция с максимально длинным О-СП обладает эндотоксичностью на уровне полисахаридных вакцин.

Впервые показано, что низкотоксичный ЛПС Sh. sonnei является иммуногенным для экспериментальных животных и индуцирует высокий уровень протективных антител.

Впервые показана способность низкоэндотоксичного ЛПС Sh. sonnei вызывать толерантность к эндотоксину у мышей.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается в расширении представлений о взаимосвязи строения ЛПС, в частности, длины полисахаридной цепи и его физико-химических характеристик с биологическими свойствами.

В результате проведенного исследования показана возможность создания протективных профилактических препаратов с высоким уровнем безопасности на основе нативного низкотоксичного ЛПС энтеробакгерий.

Осуществлено получение нескольких серий низкотоксичного ЛПС Sh. sonnei, фаза I и показана их высокая иммуногенность, что свидетельствует о воспроизводимости метода фракционирования и создает предпосылки к созданию технологической схемы выделения ЛПС вакцинного качества.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ в центральной научной печати.

Апробация работы

Результаты работы доложены: на четвертом международном симпозиуме по брюшному тифу и другим сальмонеллезам (5-8 декабря, 1999, Тайпей, Тайвань), на IV ежегодной конференции по вакцинным исследованиям (23-25 апреля, 2000, Арлингтон, США), на 5 конгрессе "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (12-14 ноября, 2002, Москва).

Внедрение результатов в практику

Диссертация выполнена в рамках работы по созданию зарегистрированной вакцины Шигеллвак для иммунизации взрослых и детей.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений и выводов. Список литературы включает 142 источника. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методы определения молекулярной массы О-СП Sh. sonnei

Для определения молекулярной массы применяли метод гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-150 в воде или буфере следующего состава: 0.137 M NaCI, 8.1 mM Na2HP04, 1.5 тМ КН2Р04 и 2.7 тМ KCI рН 7,2. Для калибровки колонки использовали декстраны Т500, Т80, Т40, Т20 и Т10 с молекулярной массой 500, 80, 40, 20 и 10 кД, соответственно, и азид натрия.

Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле изучаемых препаратов проводили на приборе для электрофореза фирмы BioRad (С.Ш.А.) в присутствии додецилсульфата натрия [Laemli, 1970]. После проведения электрофореза окрашивание геля осуществляли аммиачным раствором азотнокислого серебра [Tsai, 1989].

Определение иммуногенности препаратов

Для изучения иммуногенности фракций ЛПС Sh. sonnei мышей-гибридов (CBAXC57B1/6)FIÇÇ иммунизировали внутрибрюшинно

нефракционированным ЛПС, а также фракциями Ос1-ЛПС-ОсЗ-ЛПС и С-ЛПС^.в) Sh. sonnei в цозе 1 рг/мышь и 10 рг/мышь.

Анализ сывороток с помощью РПГА

Серологическую активность препаратов ЛПС определяли в реакции торможения пассивной гемагглютинации микрометодом с использованием монорецепторных О-сывороток Sh. sonnei, Sh. fiexneri 2a, S. enterica sv typhi, (СПбНИИВС, Россия; МНИИЭМ, Россия; Diagnostic Pasteur, Франция).

Анализ сывороток с помощью ИФА

Иммуноферментный анализ проводили, используя рекомендации, изложенные в кн. «Теория и практика иммуноферментного анализа» [Егоров,1991].

Определение пирогенности препаратов

Тест проводился на кроликах в соответствии с требованиями "Государственной Фармакопеи" (XI изд., 1990) и "Европейской Фармакопеи" (1992). Апирогенным считали препарат, для которого суммарное (на трех кроликов) повышение температуры составляло не более 1.15°С.

Определение токсичности препаратов

Оценку острой токсичности препаратов проводили с использованием галакгозаминовой модели. Мышей внутрибрюшинно иммунизировали ЛПС в дозах от 0,001 до 400 мкг/мышь в 0,5 мл 0,9% физиологического раствора, содержащего 15 мг О-галактозамина Гибель мышей регистрировали в течение трех суток.

Кератоконъюнктивальный тест

Кератоконъюнктивальный тест проводили по методу, предложенному Бегет, 1957, с использованием морских свинок весом 250-300 г.

Индукция толерантности

Мышей (СВАХС57В1/6)Р19$ внутрибрюшинно иммунизировали 0,5 мл апирогенного физиологического раствора, содержащего С-ЛПС(БЬ в) в концентрациях 2, 20, 200 и 2000 нг/мл. Контрольная группа была иммунизирована 0,5 мл апирогенного физиологического раствора. Через 12 часов мышам контрольной и опытной групп внутрибрюшинно вводили 10 ЛДюо (Ю0 мкг/мышь) нефракционированного высокоэндотоксичного ЛПС в 0,5 мл апирогенного физиологического раствора, содержащего 30 мг й-галактозамина. Выживаемость мышей регистрировали в течение 3 суток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из анализа литературных источников и полученных нами ранее экспериментальных данных, было сделано предположение, что среди множества близких по структуре молекул ЛПС может присутствовать пул молекул ЛПС с низкой эндотоксичностью, что может быть связано либо с низким содержанием липидной компоненты в молекуле ЛПС, которая, как известно, определяет эндотоксичность ЛПС, либо с тем, что структура липида А в этих молекулах ЛПС отличается от «классической», либо с обоими этими факторами.

Предположение о возможности выделения низкотоксичных форм нативного ЛПС из эндотоксичных штаммов грамотрицательных бактерий требовало систематического изучения. В этой связи нами были предприняты попытки фракционирования суммарного ЛПС, то есть содержащего широкий набор молекул с различной длиной полисахаридной цепи - 3-100 kD, с целью выделения наиболее высокомолекулярных фракций ЛПС с последующим отбором препаратов с уровнем пирогенности, не превышающим этот параметр для коммерческих полисахаридных вакцин.

Таким образом, в качестве основных критериев отбора наиболее перспективных препаратов S-ЛПС были выбраны максимальная длина О-СП и уровень пирогенности.

Фракционирование ЛПС и физико-химические свойства выделенных фракций Sh. sonnet, фаза I

Из анализа литературных данных следовало, что для фракционирования ЛПС по молекулярной массе могут быть использованы следующие методы: экстракция смесью хлороформ-метанол-водный HCl, гидрофобная хроматография и ультрацентрифугирование (смотри раздел 1.3). В основе фракционирования ЛПС с использованием этих методов лежит тот факт, что молекула ЛПС состоит из гидрофобной (липидной) и гидрофильной (полисахаридной) области, причем их соотношение определяет растворимость (в случае экстракции), время элюции (при гидрофобной хроматографии) и скорости седиментации (в процессе ультрацентрифугирования).

Выделение нефракционированного ЛПС проводилось из бактериальных клеток Sh. sonnei, фаза I экстракцией 45%-ным горячим водным фенолом по Вестфалю [Westphal, 1954]. ЛПС, содержащийся в водном слое экстракта, был освобожден от примесей нуклеиновых кислот обработкой цетавлоном [Watanabe, 1986], а окончательная очистка ЛПС была проведена действием нуклеаз и далее протеиназой К. Содержание белка [Lowry, 1951] и

нуклеиновых кислот [Спирин, 1958] в препаратах Л ПС не превышало 2%. Выделенный таким образом ЛПС обладал высокой серологической активностью в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

РРМ

Рис.1. Спектр 13С-ЯМР БЬ. эоппе'!.

Для подтверждения структуры выделенный ЛПС был подвергнут мягкому кислотному гидролизу с последующим отделением нерастворимого липида А и гель-хроматографией углеводной фракции. Для выделенного таким образом О-СП, серологическая активность которого в РТПГА была сопоставима с активностью исходного ЛПС, были получены спектры 1Н- и 13С-ЯМР (рис.1).

Сопоставление спектров ЯМР полисахарида, выделенного в процессе настоящего исследования и описанного ранее [ВаКа, 1998], показало их полную идентичность. Аналогичный подход, включающий сравнительный анализ молекулярно-массового распределения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-ПААГ), ЯМР-спектров, серологической активности и пирогенности, был использован для характеристики фракций ЛПС, выделенных из суммарного ЛПС с помощью различных методов.

Электрофоре-грамма фракций ЛПС, полученных с помощью ультрацентрифугировани я и нефракционирован-ного ЛПС.

1 - C-JinC(Sh.s), 2 - ОсЗ-ЛПС, 3 - Ос2-ЛПС, 4 -Ос1-ЛПС, 5 - нефрак-ционированный ЛПС.

На следующем этапе исследования были предприняты попытки фракционирования ЛПС по молекулярной массе с использованием указанных выше методов. Однако, препаративные количества высокомолекулярного S-ЛПС были получены только с помощью

ультрацентрифугирования. В результате же экстракции смесью хлороформ-метанол-HCI [Galanos, 1988] был получен препарат ЛПС с высоким уровнем пирогенности, а при использовании гидрофобной хроматографии [Fischer, 1990] выход низкопирогенной фракции ЛПС оказался чрезвычайно низким (по данным ДДС-ПЭГ большое количество фракций содержало низкомолекулярный ЛПС).

В предварительных экспериментах по препаративному ультрацентрифугированию было установлено, что фракционирование суммарного ЛПС успешно протекает при увеличении концентрации исходного водного раствора, а также времени и скорости препаративного ультрацентрифугирования (важно отметить, что

наилучшие результаты препаративного ультрацентрифугирования были достигнуты только при использовании неочищенных образцов ЛПС). Оказалось, что основная часть Я-ЛПС и низкомолекулярных фракций Б-ЛПС может быть удалена в виде осадка (Ос1-ЛПС) в процессе центрифугирования 1% раствора при 50000д. Заметные количества низкомолекулярного ЛПС осаждались также в результате ультрацентрифугирования при 105000д полученного на этом этапе супернатанта (Ос2-ЛПС). Супернатант после удаления Ос2-ЛПС был

лиофилизован и его раствор в воде в концентрации 3,5-4% был подвергнут ультрацентрифугированию при 105000д Образовавшиеся при этом осадок (ОсЗ-ЛПС) и супернатант (С-ЛПС^БЬ.б)), а также все фракции, полученные в результате ультрацентрифугирования, для выделения чистого препарата ЛПС, были подвергнуты обработке РНК-азой и ДНК-азой с последующим действием протеиназы К и гель-хроматографией на колонке с сефарозой С1_-4В в воде.

Анализ с помощью ДДС-ПААГ показал, что Ос1-ЛПС содержит, в основном, низкомолекулярный Э-ЛПС и И-форму, Ос2-ЛПС низкомолекулярный Э-ЛПС, а ОсЗ-ЛПС и С-ЛПС^.э) представляют собой Б-ЛПС без примеси Р-ЛПС (рис 2).

Серологические данные, полученные с помощью РТПГА, подтвердили результаты ДДС-ПААГ: серологическая активность С-ЛПС(5Ь.з), ОсЗ-ЛПС и Ос2-ЛПС была на уровне исходного ЛПС, тогда как для ЛПС-фракции Ос1-ЛПС наблюдалось в 2-4 раза менее интенсивное торможение (табл.2).

ЛПС каждой из четырех фракций был подвергнут гидролизу 1% уксусной кислотой при 100°С в течение 2 часов с последующим удалением нерастворимого липида А. Анализ, полученных таким образом ОСП, проводили с помощью аналитической гель-хроматографии на калиброванной колонке с сефадексом С-150 в 0,15 М фосфатно-солевом буфере.

Оказалось, что молекулярная масса О-СП из С-ЛПС(8И.з) и ОсЗ-ЛПС составила 80-100 и 50-60 кО, соответственно. Определенная этим же методом молекулярная масса О-СП из ЛПС-фракции Ос2-ЛПС составила 25-30 кй;

Табл.1. Выход фракций ЛПС вЬ. воппе'!, выделенных ультрацентрифугированием.

Фракция Выход фракции, %

С-ЛПС^.в) 4-6%

ОсЗ-ЛПС 5-8%

Ос2-ЛПС 30-40%

Ос1-ЛПС 55-60%

основными же продуктами уксуснокислой деградации Ос1-ЛПС были олигосахарид кора и О-СП, содержащий от 1 до 5 повторяющихся звеньев.

Для фракций Ос2-ЛПС и ОсЗ-ЛПС были определены уровни пирогенности и установлено, что, несмотря на отсутствие в ОсЗ-ЛПС низкомолекулярного ЛПС и R-ЛПС, их пирогенность была довольно высока. ДДС-ПААГ-анализ полученной на последней стадии C^nC(Sh.s) показал наличие в ней S-ЛПС с большей молекулярной массой, чем в ОсЗ-ЛПС (рис.2). Уровень пирогенности C-nnC(Sh.s) был в 8-16 раз ниже, чем для ОсЗ-ЛПС и, по меньшей мере, в 2 раза ниже, чем у коммерческих полисахаридных вакцин.

Резкое отличие в пирогенности между близкими по молекулярной массе фракциями ОсЗ-ЛПС и C^nC(Sh.s) заставило предположить, что они могут различаться не только по длине О-СП, и, следовательно, по содержанию эндотоксического липида А, но и по первичной структуре последнего. Действительно, предварительные

результаты показали, что с увеличением длины О-СП падает общее содержание жирных кислот в липиде А и наблюдается замена додекановой и тетрадекановой кислот на гексадекановую и октадекановую.

Следует отметить, что только ультрацентрифугирование позволило выделить максимальное количество ЛПС с высокомолекулярным О-СП. Таким образом, показана возможность фракционирования ЛПС Sh. sonnei, в результате которого удалось с препаративным выходом выделить низкопирогенный S-ЛПС.

Аналогичные результаты были получены при исследовании нативных ЛПС Sh. flexneri 2а и бескапсульного штамма S. enterica sv. typhi 0901. Фракционирование с помощью ультрацентрифугирования привело к

Табл.2. Концентрации торможения РПГА для различных образцов Sh. sonnei.

Фракция Концентрация торможения, рг/мл

C^nC(Sh.s) 1.56

ОсЗ-ЛПС 1.56

Ос2-ЛПС 1,56

Ос1-ЛПС 3.12

ЛПС 1.56

низкопирогенным Л ПС-фракциям, содержащим высокомолекулярный О-СП и измененный по жирнокислотному составу липид А.

Иммунобиологические свойства фракций ЛПС

Sh. sonnei

Тот факт, что в результате проведенного исследования удалось из суммарного ЛПС Sh. sonnei выделить фракцию C-nnC(Sh.s) с низкой пирогенностью позволило предположить возможность использования этой фракции в качестве потенциального вакцинного препарата.

На следующем этапе проведено сравнительное изучение некоторых биологических характеристик выделенных фракций ЛПС, и в частности: токсичности и способности к индукции системного и локального гуморального иммунного ответа, причем, основное внимание было уделено низкопирогенной фракции C^nC(Sh.s).

Токсичность C-JinC(Sh.s)

В серии экспериментов на мышах была определена острая токсичность низкопирогенного C^nC(Sh.s) и нефракционированного ЛПС Sh. sonnei с использованием разных моделей.

Полная выживаемость мышей, сенсибилизированных D-галактозамином (15мг/мышь), была зарегистрирована при введении 1 pr C^nC(Sh.s) Sh. sonnei, фаза I, который по токсичности был сопоставим с капсульным Vi-полисахаридом, используемым для производства коммерческой брюшнотифозной вакцины (табл.3) Выживаемость мышей при введении нефракционированного ЛПС Sh. sonnei была зарегистрирована в интервале доз, по крайней мере, в 100 раз более низких по сравнению с фракцией С-ЛПС^И.в).

Аналогичные результаты были получены при исследовании фракций ЛПС Sh. flexneri 2а и S. enterica sv. typhi 0901, содержащих высокомолекулярный О-СП.

Табл.3. Определение эндотоксичности ЛПС при введении беспородным белым мышам, сенсибилизированным 0-галактозамином.

Препарат Выживаемость мыи. препарата ЛПС, (рг) |ей (%) после введения

0.001 0.01 0.1 1.0 10 100 400

нефракционированный ЛПС БЬ. воппе! 40 0 0 0 0 N0 N0

С-ЛПС^Ь.э) БЬ. эоппе'! N0 N0 100 100 40 0 0

\Л-антиген N0 N0 100 100 100 100 40

Следует отметить, что О-галакгозаминовая модель токсичности наиболее чувствительна и позволяет анализировать чрезвычайно низкие дозы эндотоксина, однако, применение гепатоксического агента делает такую модель не вполне адекватной. Поэтому, острая токсичность С-ЛПС(5И.з) также изучена в прямом тесте без использования сенсибилизатора. Установлено, что полная выживаемость мышей наблюдалась даже при концентрации С-ЛПС^Ь.б) вЬ. вопле/ 320 мг/кг (табл.4), тогда как при иммунизации нефракционированным ЛПС мыши начинали погибать при дозе 20 мг/кг, а при 80 мг/кг 100 % животных погибали.

Табл 4. Определение острой токсичности препаратов ЛПС при

введении беспородным белым мышам.

Препарат Доза иммунизации, (мг/кг)

5 20 80 320

Выживаемость мышей, %

С-ЛПС^.э) 100 100 100 100

Ос2-ЛПС 100 100 40 0

ЛПС 100 40 0 0

ЛД50 С-ЛПС(81п.5) БЬ. воппе/' составила >256 мг/кг, и была, как минимум, в 36 раз больше, чем у нефракционированного ЛПС (ЛД50=7 мг/кг). Обращает внимание тот факт, что Ос2-ЛПС (фракция ЛПС, сравнимая по пирогенности с нефракционированным ЛПС) была в 4 раза менее токсична (ЛД50=28 мг/кг), чем нефракционированный ЛПС, что, по-видимому, объясняется отсутствием в Ос2-ЛПС наиболее токсичного Я-ЛПС.

14

Таким образом, низкая зндотоксичность C-finC(Sh.s) Sh. sonnei была зарегистрирована в тестах по определению токсичности на мышах с использованием или без использования сенсибилизатора, а также в фармакопейном тесте пирогенности на кроликах.

Иммуногенность фракций ЛПС Sh. sonnei

Считается, что важная роль в защитном эффекте при дизентерии может принадлежать индукции выраженного гуморального иммунного ответа у иммунизированных индивидуумов. Специфические антитела к ЛПС клеточной стенки бактерий являются протективными и нейтрализуют возбудитель in vitro.

Системный иммунный ответ

Установлено, что низкоэндотоксичный C-nnC(Sh.s) Sh. sonnei при однократной иммунизации способен индуцировать первичный гуморальный ответ к О-СП Sh. sonnei. Титр анти-О-антител, определенный в РПГА тесте, после иммунизации C-JinC(Sh.s) составил 1:32 и 1:16 при иммунизации дозами 1 и Юрг/мышь, соответственно, и был близок к ответу на нефракционированный ЛПС (титр при 1 рг/мышь - 1:8 и при 10 рг/мышь - 1:57) (рис.3). Фракции Ос1-ЛПС-ОсЗ-ЛПС также индуцировали синтез анти О-СП Sh. sonnei антител примерно на одном уровне с C^nC(Sh.s).

Двукратная иммунизации мышей фракцией C-nnC(Sh.s) в дозе 10 рг/мышь, по сравнению с однократной, вызывала достоверное 3,5-кратное (р<0.05) увеличение титра анти-O-Sft. sonnei антител в сыворотках иммунных мышей (рис.3). Это свидетельствует о невысокой, но достоверной способности C^nC(Sh.s) индуцировать вторичный иммунный ответ в виде выработки агглютинирующих антител. Следует отметить, что и ЛПС фракция Sh. sonnei ОсЗ-ЛПС, пирогенность которой хотя и выше, чем у C^nC(Sh.s), но заметно ниже, чем у Ос2-ЛПС, не индуцировала вторичного ответа. Двукратная иммунизация нефракционированным ЛПС приводила к лучшему бустерному эффекту (4,5-кратное повышение титра анти-0 антител при дозах 1 и 10 мкг)

(рис.3). Фракции Ос2-ЛПС и Ос1-ЛПС, обладающие высокой токсичностью, индуцировали максимальный бустерный эффект.

ЛПС С-ЛПС^М ОсЗ-ЛПС Ос2-ЛПС Ос1-ЛПС Контроль

□ 1мкг/мышь первичный ответ К 1 + 1 мкг/мышь вторичный ответ НЮ мкг/мышь первичный ответ Е310 + 10 мкг/мышь вторичный ответ

Рис.3. Титр агглютинирующих антител после иммунизации нефракционированным ЛПС ¿Ь. 8оппе1 и его фракциями.

Таким образом, не только токсичные фракции ЛПС ЭЛ. вопле/, но и низкотоксичная фракция С-ЛПС^И.э) способны индуцировать первичный и вторичный иммунный ответ в виде выработки агглютинирующих антител. Причем, уровень вторичного ответа, индуцированного как нефракционированным ЛПС, так и его фракциями, был примерно одинаковым.

Индукция анти-ЛПС-антител 1дЭ класса была зарегистрирована при однократной внутрибрюшинной инъекции фракций С-ЛПС(ЗЬ.э)-Ос1-ЛПС или нефракционированного ЛПС (рис.4). Обращает на себя внимание тот факт, что уровень первичного ответа при иммунизации низкопирогенной фракцией С-ЛПС^.э) и нефракционированным эндотоксичным ЛПС практически не различался (р<0,05). Двукратная иммунизация низкотоксичной ЛПС фракцией С-ЛПС(Э11.з) вызывала значительное (4- и 6-кратное) превышение анти-О-СП ЭЛ. яолпе/ 1дв титра над уровнем первичного ответа, что указывает на способность С-ЛПС^.б) индуцировать 1дО вторичный анамнестический иммунный ответ.

□ 1 мкг/мышь первичный ответ И 1 + 1 мкг/мышь вторичный ответ ЕЭЮ мкг/мышь первичный ответ И10 ■*■ 10 мкг/мышь вторичный ответ

Рис.4. 1дС иммунный ответ к ЛПС фракциям БЬ. воппе/ в сыворотке мышей (СВАХС57В1/6)Р1??.

Напротив, фракции ОсЗ-ЛПС и Ос2-ЛПС практически не индуцировали вторичного 1дй ответа. Можно предположить, что для индукции 1дС анти-ЛПС БЬ. Боппе/' вторичного гуморального ответа в составе препарата необходимо либо присутствие антигена с высокой эпитопной плотностью антигенных детерминант (высокомолекулярный О-СП фракции С-ЛИС^И-в)), либо высокого содержания адъюванта (Р-форма в нефракционированном ЛПС и Ос1-ЛПС).

• Изучение первичного 1дМ ответа при иммунизации фракциями ЛПС

ЭЛ. золле/ продемонстрировало его активацию примерно на одном уровне с нефракционированным ЛПС (табл.5). Двукратная иммунизация обнаружила, что фракции С-ЛПС^Кб) и ОсЗ-ЛПС индуцируют довольно слабый вторичный 1дМ ответ, кратность повышения которого для С-ЛПС^.э) не превышала 2,5, а для ОсЗ-ЛПС - 3,5 (р<0,05).

Напротив, Ос2, Ос1-ЛПС и нефракционированный ЛПС вызывают мощный бустерный ответ, кратность подъема 1дМ достигала 14, 6 и 8 раз соответственно, при наличии выраженной дозовой зависимости. Следует заметить, что данные, полученные в РПГА, хорошо коррелируют с данными ИФА по вторичному 1дМ ответу. Следовательно, пентамерные 1дМ молекулы

доминируют в пуле О-специфических агглютинирующих антител. Фракции, пирогенность которых была высокой, индуцировали максимальный вторичный 1дМ ответ, то есть механизм запуска вторичного 1дМ ответа в большей степени зависит от костимулирующих воздействий липида А, чем вторичного от 1дв ответа.

Табл 5. 1дМ иммунный ответ к ЛПС фракциям Sh. sonnei в сыворотке мышей (CBAXC57B1/6)FI$$._

Среднегеометрический титр IgM

Препарат Доза иммунизации анти-ЛПС антител.

первичный ответ вторичный ответ

ЛПС 1 рг/мышь 800±393 6400±0

10 рг/мышь 1600±0 11404±2613

C-nnC(Sh.s) 1 рг/мышь 1796±980 3200±0

10 рг/мышь 1425±876 3592±1306

ОсЗ-ЛПС 1 мг/мышь 800±0 2786±716

10 рг/мышь 1393±358 2851±653

Ос2-ЛПС 1 рг/мышь 566±219 5080±1652

10 рг/мышь 800±0 11404±2613

Ос1-ЛПС 1 рг/мышь 800±0 3592±1306

10 рг/мышь 1393±358 8063±3305

Контроль неиммунизированные мыши 200±0

Таким образом, фракция C-nnC(Sh.s), обладая низкой эндотоксичностью, вызывала индукцию системного гуморального ответа, который сопровождался эффектом иммунной памяти. Обращает на себя внимание тот факт, что вторичный иммунный ответ регистрировался только на те ЛПС иммуногены, пирогенность которых была чрезвычайно высока (нефракционированный ЛПС и Ос1-ЛПС) или на ЛПС с высокомолекулярным О-СП (C-JinC(Sh.s) фракций).

Аналогичные результаты были получены при исследовании фракций ЛПС Sh. flexneri 2а и S. enterica sv. typhi 0901, содержащих высокомолекулярный О-СП. Введение мышам препаратов этих фракций вызывает образование высоких титров специфических анти-ЛПС антител.

Иммунный ответ на слизистых оболочках

Считается, что первым и, возможно, наиболее важным барьером на пути проникновения энтеробатерий в организм являются слизистые кишечника. Поэтому, чрезвычайно важно было установить, способна ли низкотоксичная фракция ЛПС - С-ЛПС^И.в) индуцировать локальный гуморальный иммунный ответ к инфекции БЬ. вопле/.

С этой целью морским свинкам, предварительно иммунизированным двукратно подкожно С-ЛПС^.б) в дозе 25 и 50 рг, вводили в конъюнктиву глаза суспензию клеток вирулентного штамма БЬ. воппе1 5063 (тест Бегепу). У всех неиммунизированных животных контрольной группы развился дизентерийный кератоконъюнктивит (табл.6). Иммунизация дозой 50 рг С-ЛПС^И.э) обеспечивала защиту 55% глаз животных при заражении дозой 4x109 клеток и 75% защиту глаз животных при заражении дозой 2x109 клеток. Иммунизация дозой 25 рг С-ЛПС(ЗЬ.з) обеспечивала защиту 75% глаз животных при заражении дозой 4x109 клеток и 80% защиту глаз животных при заражении дозой 2x109 клеток.

Табл.6. Кератоконъюнкгивальная проба.

Доза вакцины Доза заражения Заражено животных Заражено глаз Число глаз с керато-конъюнктиви том Число глаз, защищенных от кератоконъю нкгивита Процент защищенных глаз

50цг 0,4x10 кл./глаз 10 20 9 11 55%

50рг 0,2x101икл./глаз 10 20 5 15 75%

25цг 0,4x1 о10кл./глаз 10 20 5 15 75%

25рг 0,2хЮ1Окл./глаз 10 20 4 16 80%

Контроль 0,4х101икл./глаз 10 20 20 0 0%

Контроль 0,2x101°кл/глаз 10 20 15 5 25%

Из совокупности приведенных выше данных следует, что фракция С-ЛПС^.в) Б/?, золле/, обладая высоким уровнем биологической безопасности и способностью вызывать как системный, так и местный иммунный ответ, может рассматриваться в качестве активной субстанции для создания полисахаридной противошигеллезной вакцины.

Действительно, в дальнейшем, при проведении контролируемого опыта под эгидой Национального контрольного органа Минздрава Российской Федерации по иммунизации добровольцев было установлено резкое повышение титров агглютинирующих, а также IgA, IgG и IgM специфических анти-ЛПС Sh. sonnei антител после вакцинации в группе лиц, привитых вакциной на основе C-nnC(Sh.s) Sh. sonnei. В настоящее время третий этап клинических испытаний антишигеллезной вакцины полностью завершен.

Получение серий низкотоксичной фракции ЛПС Sh. sonnei, фаза I и оценка их иммуногенности

Низкоэндотоксичная фракция ЛПС - C-nnC(Sh.s) - может рассматриваться в качестве кандидат-вакцины против шигеллеза Зонне. Одной из основных технологических проблем, возникающих при производстве вакцин, является возможность стабильного получения серий целевого продукта с одинаковыми свойствами. В доступной нам литературе отсутствовали описания возможности воспроизводимо получать серии фракций ЛПС.

Из ЛПС S h sonnei, полученного при культивировании в пилотном ферментере, выделено несколько серий фракции C-nnC(Sh.s): серия 23, 27 и 28. Все выделенные серии обладали пирогенностью на уровне полисахаридных вакцин.

Изучение иммунного ответа на серии фракции C-nnC(Sh.s) после иммунизации мышей (CBAXC57B1/6)FIÇÇ показало, что однократная иммунизация сериями 23, 27 и 28 способна индуцировать синтез анти-О-СП Sh. sonnei специфических IgG, IgM и агглютинирующих антител.

Таким образом, нами было впервые установлено, что из высокотоксичного нефракционированного липополисахарида

Sh. sonnei, фаза I можно стабильно выделять ЛПС-фракцию C^nC(Sh.s), с безопасностью на уровне полисахаридных вакцин, и способную индуцировать высокие титры анти-О-СП Sh. sonnei, фаза I антител. И, как следствие этого,

возможно пилотное (тысячи доз) производство низкотоксичного высокоиммуногенного ЛПС БЛ. вопле/, фаза I.

Толерогенность фракций С-ЛПС^И.в) БЬ. эоппе'!

Одним из чрезвычайно интересных свойств ЛПС является его способность вызывать в макроорганизме толерантность или невосприимчивость к повторному введению эндотоксина. В связи с этим представлялось важным установить, способна ли ЛПС-фракция С-ЛПС^.э) индуцировать толерантность к эндотоксину. С этой целью мышам (СВАХС57В1/6)Р1?$ внутрибрюшинно вводили ЛПС фракцию С-ЛПС(8И э) и нефракционированный ЛПС в различных концентрациях. Через 12 часов мыши получали внутрибрюшинно ЮЛДюо нефракционированного высокоэндотоксичного ЛПС ЭЬ. воппе/', фаза I в присутствии О-галактозамина (сенсибилизирующий агент), которая, как было определено при изучении токсичности ЛПС, составила 100 нг/мышь, и регистрировали выживаемость мышей.

Табл.7. Индукция толерантности к эндотоксину ЛПС и его

низкопирогенной фракцией С-ЛПС(31п.5).

Препарат Доза иммунизации, (нг/мышь)

1 10 100 1000

Выживаемость мышей, %

с-лпс^м 0 0 80 100

ЛПС 0 100 100 100

0 0 0 0

Было установлено, что при иммунизации ЛПС фракции С-ЛПС^.э) в дозе 100 нг/мышь с последующим введением летальной дозы ЛПС (100 нг/мышь) наблюдалась 80% выживаемость мышей. Нефракционированный высокопирогенный ЛПС индуцировал толерантность более активно (начиная с дозы 10 нг/мышь) (табл.7). Таким образом, низкотоксичная фракция С-ЛПС^И.э) ЭЛ. вопле/ может рассматриваться в качестве потенциального клинически применимого препарата, способного вызывать невосприимчивость к эндотоксину

Заключение

В результате данной работы ЛПС бактерий Sh. sonnei, Sh. fíexneri и S. enterica sv typhi были успешно фракционированы по молекулярной массе и установлено, что оптимальным методом фракционирования являлось ультрацентрифугирование. При этом, ЛПС фракций, с максимально высокомолекулярным О-СП, обладали пирогенностью на уровне коммерческих полисахаридных вакцин.

Высокомолекулярные фракции ЛПС бактерий Sh. sonnei, Sh. fíexneri 2a и ' S. enterica sv typhi обладали не только низкой пирогенностью и токсичностью, но и довольно высоким иммуногенным потенциалом, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных профилактических препаратов. На основе низкотоксичного ЛПС Sh. sonnei (фракция C-nnC(Sh.s)) была создана первая вакцина против шигеллеза Зонне - "Шигеллвак", которая в настоящее время успешно прошла заключительную фазу клинических испытаний.

ВЫВОДЫ

1. Липополисахариды Sh. sonnei, фаза I, Sh. fíexneri 2а и S. enterica sv typhi могут быть разделены на несколько фракций, различающихся длиной О-специфи-ческого полисахарида, причем с • увеличением длины О-специфического полисахарида эндотоксичность этих липополисахаридных фракций снижается.

2. Установлено, что липополисахаридные фракции Sh. sonnei, фаза I, Sh. fíexneri 2а и S. enterica sv typhi с максимально длинным О-специфическим полисахаридом обладают токсичностью, не превышающей токсичность коммерческих полисахаридных вакцин.

3. Низкоэндотоксичные липополисахаридные фракции Sh. sonnei, фаза I, Sh. fíexneri 2а и S. enterica sv typhi способны к индукции первичного IgG и IgM и вторичного IgG анти-0 ответов у мышей.

4. Низкоэндотоксичная липополисахаридная фракция Sh. sonnei, фаза I способна индуцировать у морских свинок синтез специфических протективных антител на слизистых оболочках.

5. Показано, что низкотоксичная фракция Sh. sonnei, фаза 2а способна предотвращать эндотоксический шоку мышей, вызванный введением 10 ЛДюо высокоэндотоксичного липополисахарида.

6. Показана воспроизводимость выделения серий низкотоксичных липополисахаридных фракций из Sh. sonnei, фаза I, что создает основу для создания технологической схемы получения низкотоксичного ЛПС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. TeshevaA.M., Golovina М.Е., Aparin P.G., Shmigol V.I., L'vovV.L. Salmonella typhi carbohydrate antigen: isolation, chemical analysis and application for serologic diagnostics. Fourth international symposium on typhoid fever and other salmonellosis (Taiwan, December 5-8, 1999, Taipei). Academia sinica, Final Program and Abstract Book, p.11.

2. Aparin P.G., Golovina M.E., ErshovV.I, GanchoT.V., Shmigol V.I., Pavlova L.I., Chuprynina R P , Yolkina S.I , L'vov V L. Systemic and mucosal (local) immune response after immunisation with new type low-endotoxic LPS vaccine Shigeliae sonnei. The fourth annual conference on vaccine research (April 23-25, 2001, Arlington). Arlington, VA, Final Program and Abstract Book, p.49.

3. Апарин П.Г., Шмиголь В.И., Головина М Э , Руднева Т.Б., Львов В.Л. Исследования иммунобиологических свойств липополисахарида Shigella sonnei, фаза 1. Материалы 5 конгресса "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (12-14 ноября, 2002, Москва). М„ ВИНИТИ, 2002, т. 2, с.319.

4. Шмиголь В.И., Головина М.Э., Руднева Т.Е., Апарин П.Г., Львов В.Л. Фракционирование липополисахарида Shigella sonnei, фаза 1.

Материалы 5 конгресса "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии" (12-14 ноября, 2002, Москва), М„ ВИНИТИ, 2002, т. 2, с.315.

5. Шмиголь В.И. Необычные свойства липополисахарида Shigilla sonnei. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, №7, с.67.

6. Чикилева И.О., Халтурина Е.О., Мазуров Д.В., Львов В.Л., Шмиголь В.И, Апарин П.Г., Шингарова Л.Н., Василенко Р.Н., Абрамов В.М., Доненко Ф.В., Киселевский М.В. Влияние различных типов л бактериального липополисахарида на дифференцировку дендритных клеток человека. Молекулярная медицина, 2003, № 3, с.54-58.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им НИ Елохииа РАМН Подписано о печатью . 06 . 04 Заказ № 182 Тираж 100 экз

!

4

У

РНБ Русский фонд

2007-4 4061

\

\

г \

itгс,im :-i\ !

Строение ЛПС и его локализация в клеточной мембране.11

Одна из принципиальных возможностей получения нативных низкотоксичных ЛПС связана с их фракционированием с помощью различных методов и выделением «узких» гомогенных фракций ЛПС.

1 Комплексное систематическое исследование физико-химических ииммунобиологических свойств фракций ЛПС представляется весьма актуальным иvоткрывает возможность для дальнейшего исследования таких соединений в качестве иммунотропных препаратов.

Следует подчеркнуть, что проведенное нами исследование впервые привело к получению серий низкотоксичных ЛПС из вирулентных штаммов бактерий кишечной группы, возбудителей таких распространенных острых кишечных инфекций как шигеллез и брюшной тиф.

Цель работыОсновная цель работы заключалась в получении из суммарного ЛПС Shigella sonnei, фаза 1, Shigella flexneri 2а и Salmonella enterica sv typhi с использованием различных методов фракционирования ЛПС-фракций, отличающихся длинойполисахаридной цепи, в изучении физико-химических и биологических характеристик этих фракций, а также в изучении возможности выделения иммуногенных низкоэндотоксичных ЛПС.

Задачи исследования• Провести фракционирование ЛПС Sh. sonnei, фаза 1, Sh. flexneri 2а и S. enterica sv typhi.• Изучить физико-химические характеристики выделенных фракций.• Изучить иммунобиологические характеристики выделенных фракций с целью поиска низкотоксичных и высокоиммуногенных фракций ЛПС.

Научная новизна работыВпервые с использованием трех различных методов фракционирования выделены фракции ЛПС Sh. sonnei, фаза 1, Sh. flexneri 2а и S. enterica sv typhi, отличающиеся по молекулярной массе и проведен сравнительный анализ их пирогенности, эндотоксичности и иммуногенности.

Впервые установлено, что с увеличением длины О-специфического полисахарида (О-СП) уменьшается пирогенность и эндотоксичность ЛПС-фракций, причем фракция с максимально длинным О-СП обладает эндотоксичностью на уровне полисахаридных вакцин.

Впервые показано, что низкотоксичный ЛПС Sh. sonnei является иммуногенным для экспериментальных животных и индуцирует высокий уровень протективных антител.

Впервые показана способность низкоэндотоксичного ЛПС Sh. sonnei вызывать толерантность к эндотоксину у мышей.»Теоретическая и практическая значимость работыТеоретическая значимость работы заключается в расширении представлений о взаимосвязи строения ЛПС, в частности, длины полисахаридной цепи и его физико-химических характеристик с биологическими свойствами.

В результате проведенного исследования показана возможность создания протективных профилактических препаратов с высоким уровнем безопасности на основе нативного низкотоксичного ЛПС энтеробактерий.

Осуществлено получение нескольких серий низкотоксичного ЛПС Sh. sonnei, фаза I и показана их высокая иммуногенность, что свидетельствует о воспроизводимости метода фракционирования и создает предпосылки к созданию технологической схемы выделения ЛПС вакцинного качества.

выводы

1. Липополисахариды Sh. sonnei, фаза I, Sh. flexneri 2а и S. typhi могут быть разделены на несколько фракций, различающихся длиной О-специфи-ческого полисахарида, причем с увеличением длины О-специфического полисахарида эндотоксичность этих липополисахаридных фракций снижается.

2. Установлено, что липополисахардные фракции Sh. sonnei, фаза I, Sh. flexneri 2а и S. typhi с максимально длинным О-специфическим полисахаридом обладают токсичностью, не превышающей токсичность коммерческих полисахаридных вакцин.

3. Низкоэндотоксичные липополисахаридные фракции Sh. sonnei, фаза I, Sh. flexneri 2а и S. typhi способны к индуции первичного IgG и IgM и вторичного IgG анти-0 ответов у мышей.

4. Низкоэндотоксичная липополисахаридная фракция Sh. sonnei, фаза I способна индуцировать у морских свинок синтез специфических протективных антител на слизистых оболочках.

5. Показано, что низкотоксичная фракция Sh. sonnei, фаза 2а способна предотвращать эндотоксический шок у мышей, вызванный введением 10 LDjoo высокоэндотоксичного липополисахарида.

6. Показана воспроизводимость выделения серий низкотоксичных липополисахариднных фракций из Sh. sonnei, фаза I, что создает основу для создания технологической схемы получения низкотоксичного ЛПС.

Заключение

В результате данной работы ЛПС бактерий Sh. sonnei, Sh. flexneri и S. enterica sv typhi был успешно фракционирован по молекулярной массе и установлено, что оптимальным методом фракционирования являлось ультрацентрифугирование. При этом, ЛПС фракции, с максимально высокомолекулярным О-СП, обладали пирогенностью на уровне коммерческих полисахаридных вакцин.

Также было установлено, что высокомолекулярный ЛПС бактерий Sh. sonnei, Sh. flexneri 2a и S. enterica sv typhi обладает не только низкой пирогенностью и токсичностью, но и довольно высоким иммуногенным потенциалом, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных профилактических препаратов. И, действительно, в случае Sh. sonnei на основе низкотоксичной фракции C^nC(Sh.s) была создана первая вакцина против шигеллеза Зонне Шигеллвак, которая в настоящее время успешно прошла заключительную фазу клинических испытаний.

Таким образом, проведено систематическое, комплексное исследование методов выделения, физико-химических и иммунобиологических характеристик ЛПС-фракций некоторых энтеробактерий. Наиболее полно охарактеризованы фракции ЛПС Sh. sonnei, фаза I. Была продемонстрирована возможность систематического получения фракций ЛПС с безопасностью на уровне полисахаридных вакцин и высокой иммуногенностью. И, как следствие этого, возможно пилотное (тысячи доз) производство низкотоксичнного высокоиммуногенного ЛПС Sh. sonnei, фаза I.

Исходя из вышеописанного, следует предположить, что не только из бактерий, использованных в данной работе, могут быть выделены низкотоксичные высокоиммуногенные ЛПС, которые способны выступать в качестве вакцинных препаратов.