Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Некоторые факторы местного иммунитета при первичных злокачественных и метастатических опухолевых поражениях печени

На правах рукописи

НИКИПЕЛОВА Елена Алексеевна

НЕКОТОРЫЕ ФАКТОРЫ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ПЕРВИЧНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ И МЕТАСТАТИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕВЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□03064731

Ростов-на-Дону 2007

003064731

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ» {ДИРЕКТОР ИНСТИТУТА - АКАДЕМИК РАН И РАМН, ПРОФЕССОР Ю.С. СИДОРЕНКО)

Научный руководитель:

■ доктор медицинских наук, профессор Е.Ю. Златник

Научный консультант:

-доктор медицинских наук, профессор А.В. Шапошников

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, Г.В. Жукова

- доктор медицинских наук, Р.А. Беловолова

Ведущая организация:

- Волгоградский государственный медицинский университет

Защита состоится «.3,$» г. в -/^часов на засе-

дании диссертационного совета Д 208.083.01 при Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Автореферат разослан «¿¿у ^(лП^г^^' ^2-2007 г.

Г.А. Неродо

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимоотношения опухоли и организма-опухоленосителя опосредуется через различные механизмы с вовлечением регу-ляторных систем, в частности, иммунной. Иммунный ответ инициируется при поступлении антигена и включает его процессинг, презентацию, распознавание, пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, их миграцию, сложные процессы их взаимодействия, включая экспрессию рецепторов, продукцию моно- и лимфокинов в качестве регуляторных молекул, антителогенез, осуществление эффекторных функций дитотоксическими лимфоцитами путем лизиса клеток-мишеней (Хаитов P.M., 2001; Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005; Симбирцев А.С., 2007). Изучение местного иммунитета является одним из наиболее интересных и актуальных направлений в исследовании иммунного статуса больных с различными заболеваниями, в том числе и онкологическими, поскольку мишенью при патологических процессах в первую очередь является орган, в котором происходят локальные сдвиги, вызванные теми или иными этиологическими факторами. Лимфоциты, инфильтрирующие очаг, в частности опухолевый, находятся там не постоянно, а обмениваются с циркулирующими в крови, в результате в организме поддерживается информация о чужеродном антигене (Фрейдлин И.С., 1998; Хаитов P.M., 2001; Kataki A. et al., 2007).

В Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте под руководством академика РАН и РАМН Ю.С. Сидоренко проводится комплекс научных исследований, касающихся патофизиологических, иммунологических и биохимических аспектов противоопухолевой резистентности. Получены весомые доказательства роли некоторых местных тканевых и иммунных факторов (Непомнящая Е.М. и соавт., 2002; Златник Е.Ю., 2003; Сидоренко Ю.С., Фран-циянц Е.М., 2006; Сидоренко Ю.С. и соавт., 2006; Франциянц Е.М. и соавт., 2006; Франциянц Е.М. и соавт., 2007).

Об участии печени в иммунной защите взрослого организма известно крайне мало. 10% клеток печени относятся к адаптивной (Т- и В-лимфоциты) и к врожденной иммунной системе (клетки Купффера, NK, NKT) (Mehal W.Z. et al., 2001; Zhiping Li, Diehl A.M., 2003). Печень часто подвергается атаке канцероге-

нов и вирусов, попадающих по системе воротной вены, что в дальнейшем может приводить к циррозу и раку печени. Кроме того, различные опухоли метастази-руют в печень, что особенно часто наблюдается при генерализации колорек-тального рака (Конев В.Г., 2002; Beckingham I.J., Krige J., 2001; Ruers Т. et al., 2002; Joseph F., Perz E.J. et al., 2006).

Вызывает особый интерес роль иммунной защиты печени при злокачественных новообразованиях. Эта область практически' не изучена, равно как и возможности локальной иммунотерапии. Несмотря на расширяющийся объем знаний о причинах первичных и метастатических опухолевых поражений печени, многие вопросы, касающиеся механизмов возникновения и прогрессирования этой патологии, остаются открытыми. В связи с этим наше исследование посвящено изучению местного иммунитета при первичных и метастатических опухолях печени.

Цель исследования. Дать оценку состояния местных факторов клеточного иммунитета в сопоставлении с показателями общего иммунитета у больных с первичными злокачественными и метастатическими опухолями печени и на основании полученных данных разработать подходы к локальной иммунотерапии как элемента комплексного лечения опухолевых поражений печени.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Определить количественный и качественный состав популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови, в немалигнизированных участках печени, в первичных и метастатических очагах при гепатоцеллюлярном раке и метастатических поражениях печени.

2. Изучить функциональную активность лимфоцитов и моноцитов крови, немалигнизированных и опухолевых участков печени при ее метастатических поражениях.

3. На основании локальных изменений у больных с первичными злокачественными и метастатическими поражениями печени разработать подходы к интрапортальной иммунотерапии ронколейкином.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе впервые:

• Определен популяционный и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов (СБ2+, С04+, С08+), а также СБ25+, С095+клеток, натуральных киллеров (СБ 16+ и СБ56+) и В-лимфоцитов в немалипшзированных и опухолевых участках у больных гепатоцеллюлярным раком и метастатическими поражениями печени. Определена функциональная активность (митогениндуцированная пролиферация, продукция цитокинов ЮТ-а, 1Ь-8, №N-7,11,-4) лимфоцитами и моноцитами, выделенными из крови, перифокальной зоны и метастаза у больных с метастатическими поражениями печени.

• Установлено, что при метастатических поражениях печени нарушения местного иммунитета являются наиболее глубокими. Изменения состава и функций иммунокомпетентных клеток в перифокальных зонах и в опухоли являются однонаправленными, но более выражены в опухолевой ткани.

• На базе полученных данных апробирован метод итрапортальной иммунотерапии при первичных злокачественных и метастатических поражениях печени.

По теме диссертации подана заявка на изобретение, приоритет от 19.06.06 г.

Практическая значимость работы

На основании изменений показателей клеточного иммунитета в опухолевых и немалипшзированных участках печени разработаны подходы к местной иммунотерапии как компонента комплексного лечения злокачественных опухолей печени.

Внедрение результатов исследования

Полученные сведения о локальных изменениях клеточного иммунитета в немалигнизированных и опухолевых участках печени использованы для проведения местной интрапортальной иммунотерапии в отделении превентивной онкологии, лапароскопической и общей хирургии РНИОИ при первичных и метастатических опухолевых поражениях печени.

Основное положение, выносимое на защиту

Наличие нарушений локального иммунитета как при гепатоцеллюлярном раке, так и при метастатическом поражении печени и их однонаправленность в опухолевых и паратуморальных тканях.

Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института 27 июня 2007 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ. Материалы исследования доложены: на Девятой гастроэнтерологической недели 2003г., 6-м Международном форуме Славянско-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург» - Гастро-2004, г. Санкт-Петербург, 2004; Девятой Российской конференции «Гепатология сегодня» г. Москва, 2004; V съезде Научного Общества гастроэнтерологов России, г. Москва, 2005; V Всероссийской конференции молодых ученых в рамках VI съезда онкологов России 12 октября 2005 года в Ростове-на-Дону, Одиннадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня» г. Москва, 2006 г.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристика материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, заключения и обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 65 отечественных и 199 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 37 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа строилась на основе детального изучения общего иммунного статуса и исследования состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток, выделенных из печени больных гепатоцеллюлярным раком (ГЦР) и метастатическим поражением печени (Mi111), находившихся на лечении в отделении.

Иммунологические исследования показателей местного и общего иммунитета были проведены у 42 больных, из них у 16 (в возрасте 40-69 лет) с первичными злокачественными нерезектабельными опухолями печени и у 26 (в возрасте 40-79 лет) — с Ml 111, ранее оперированных по поводу колоректального рака с удалением первичного очага. Больные в группе с ГЦР имели IV стадию

заболевания (Т3_4 N1.2 М0), а с МПП относились к III стадии по классификации Осплап (1952). Больные с хроническими вирусными гепатитами или циррозом печени были исключены из исследования. После предварительного обследования и предоперационной подготовки пациенты подверглись комплексному лечению, включавшему в себя: частичное удаление очагов, открытую интраопе-рационную изолированную высокочастотную термодеструкцию (ВЧДТ) или комбинированное воздействие - ВЧДТ + локальная инъекционная некротизи-рующая терапия (ЛИНТ) этиловым спиртом. Всем больным также выполнялась катетеризация пупочной вены для последующей интрапортальной и системной курсовой химиотерапии.

В качестве контроля исследовали 10 пациентов с одиночными непаразитарными кистами печени в возрасте от 33 до 73 лет. Для оценки иммунного статуса сравнивали показатели периферической крови больных с показателями 56 здоровых людей в возрасте от 20 до 56 лет.

В ходе оперативных вмешательств проводилась инцизионная биопсия первичных и метастатических опухолей, а также визуально неизмененных участков печени, отступя на 3 см от злокачественных очагов или кист печени. Полученные образцы направлялись для исследования в иммунологическую и пато-морфологическую лабораторию РНИОИ. Параллельно с исследованием периферической крови, взятой до операции, проводили выделение лимфоцитов и моноцитов из опухоли и перифокальной зоны путем размельчения и гомогенизации образцов печени в растворе Версена на магнитной мешалке в течение 15 минут при комнатной температуре, фильтрации через капроновый фильтр, с добавлением кулмуральной среды и последующим выделением в градиенте плотности р- 1,077-1,078.

Использовались иммунологические методы изучения общего и локального иммунитета, позволяющие определить как количественный состав популяций и субпопуляций лимфоцитов, так и функциональную активность моноцитов и лимфоцитов, выделенных из крови, перифокальных зон и опухолевых участков.

Подсчет количества лимфоцитов проводили в камере Горяева с пересчетом на 1 см3 участка печени. Жизнеспособность лимфоцитов оценивали по про-

центу неокрашенных клеток после добавления к взвеси 0,25% раствора трипано-вого синего. Жизнеспособность составляла 97-98%.

Количественное содержание Т- (CD2+) и В-лимфоцитов определяли в реакции спонтанного розеткообразования (РСРО с эритроцитами барана и мыши соответственно) (ФримельХ., 1987).

Иммунофенотипирование лимфоцитов CD4+ (Т-хелперно-индукторные), CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD25+ (активированные Т-лимфоциты), CD95+ (лимфоциты с маркером поздней активации и готовности к апоптозу), CD 16+ и CD56+ (натуральные киллеры) проводили в непрямом иммунофлюо-ресцентном тесте с моноклональными антителами фирмы «Сорбент». Учет проводили путем подсчета процента клеток с мембранной флюоресценцией (Фри-мель X., 1987; Хаитов P.M. и соавт., 1995). Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) вычисляли по формуле CD4+/CD8+.

Функциональную активность лимфоцитов оценивали в реакции властной трансформаг/ии (РБТЛ) после 72-часового культивирования при 37°С в присутствии 5% С02 в полной кулыуральной среде (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992), с добавлением Т-митогенов (ФГА в дозе 5 мкг/мл и Кон А в дозе 10 мкг/мл) и В-митогена (бактериальный липополисахарид (ЛПС), аналогом которого является пирогенал в дозе 50 ЕД/мл) (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1979). При постановке спонтанной РБТЛ вместо митогена добавляли эквивалентный объем куль-туральной среды.

Моноциты крови выделяли путем их адгезии к предметным стеклам во влажной камере при 37°С в течение 2-х часов. Определяли фагоцитарную активность моноцитов (ФА) по проценту клеток, фагоцитирующих частицы латекса (1,5 мкм), вычисляли фагоцитарное число (ФЧ — количество частиц, поглощенных одним моноцитом). Интенсивность кислородо-зависимых реакций оценивали с помощью спонтанного и стимулированного латексом теста восстановления нитросинего тетразолия до диформазана (НСТ-теста), с вычислением индекса активации (ИА), который рассчитывали по формуле НСТ стим./НСТ спонт. (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983).

Продукцию цитокинов (TNF-a, IL-8, IFN-y, IL-4) иммунокомпетентными клетками определяли иммуноферментным методом (Хаитов P.M., 2000). Моно-нуклеарные клетки (МНК), включающие моноциты и лимфоциты, в концентрации 1х106/мл культивировали в полной культуральной среде в течение 24 часов при 37°С в присутствии 5% СОг, продукцию цитокинов МНК индуцировали митогеном ФГА в дозе 5 мг/мл. Надосадочную жидкость стерильно отбирали и хранили при -20°С в течение 1 месяца до иммуноферментного исследования, которое проводили с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест». Уровень продукции цитокинов выражали в пг/мл. Рассчитывали индекс стимуляции (ИС) (ИС = ФГА-стимулированная/спонтанная продукция).

Для верификации диагноза и оценки лимфоидной инфильтрации печени использовали общепринятые морфологические методы. Для проведения шшу-ногистохимических исследований депарафинированные срезы блоков обрабатывали моноклоналъными антителами CD3 (рапТ) и CD20 (рапВ). Принадлежность лимфоцитов к Т- и В- ряду в перифокальной и опухолевой ткани печени оценивали по развитию желтовато-коричневого окрашивания после нанесения визуа-лизационной системы Dako+DAB и докрашивания срезов гематоксилином.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических методов (парного критерия знаков Z, непрямых разностей, U-критерия Уилкоксона (Манна-Уитни)) (Монцевичюте-Эрингене Е.В., 1964; Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты исследований

Результаты иммунологического исследования показали, что у больных с гепатоцеллюлярным раком в периферической крови выявлено низкое по сравнению с кровью здоровых людей содержание лимфоцитов с маркерами CD 16+ (на 17,0%), CD25+ (на 51,0%), CD4+ (на 28,0%), падение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+) (на 27,0%), а также отмечено угнетение функциональной активности Т- и В-лимфоцитов и моноцитов. Аналогичные изменения иммунологических показателей периферической крови были и у больных с метастатиче-

скгш поражением печени, однако, они были более выражены за счет нарушения более широкого спектра исследуемых субпопуляций: в частности снижено количество Т- (СГ)2+ на 14,0%, СБ4+ на 40,0%), №С- (СО 16+ и СВ56+ клеток на 39,0%), В-лимфоцитов на 11,0%, однако был отмечен высокий уровень СБ25+ и СБ95+ клеток (на 47,0%), р<0,05. Кроме того, у них была угнетена функциональная активность Т- и В-лимфоцитов и интенсивность кислородо-зависимых процессов в моноцитах периферической крови по сравнению со здоровыми людьми, р<0,05.

У пациентов с одиночными непаразитарными кистами показатели периферической крови были ниже, чем у здоровых людей: уровень Т-хелперно-индукторных (СБ4+) снижен на 26,0%, угнетена функциональная активность Ти В-лимфоцитов и моноцитов (р<0,05).

Таким образом, у больных с первичными злокачественными и метастатическими поражениями печени наблюдалось угнетение факторов общего клеточного иммунитета, эти изменения более выражены при метастатических поражениях печени. Однако поскольку в контрольной группе также наблюдалось снижение ряда иммунологических параметров периферической крови, не представляется возможным однозначно сказать, связаны ли найденные изменения именно с опухолевьми процессами. Нами было предпринято изучение некоторых показателей местного иммунитета непосредственно в очаге поражения, а также в перифокальных участках печени у больных гепатоцеллюлярным раком, метастатическим поражением и у пациентов с одиночными непаразитарными кистами печени, составивших контрольную группу.

При иммунологическом исследовании мононуклеарных клеток, выделенных из биоптатов печени, было установлено, что в контрольной группе по сравнению с периферической кровью этих пациентов обнаружено на 25,0% более низкое содержание Т-хелперно-индукторных клеток (СВ4+), при этом количество натуральных киллеров (СБ16+ и С056+) было выше, чем в крови на 34,0 и 53,0% соответственно.

Изучение субпопуляционного состава лимфоцитов в перифокальных участках печени при гепатоцеллюлярном раке показало, что уровень СБ56+ клеток

был на 43,0% выше, чем а периферической крови этих больных (табл. 1, рис. I).

Таблица 1

Иммунологические показатели в периферической кропи н в пер »фокальной зоне у бильных 11'пи плн1.1 1Н1.1ириы"\1 раком н ] 111 г П'ИЧ'К'П м поражением печени, %

Иммунологический показатель ГЦР МПП

Кровь п=16 Перифок, зона п=1 6 Кровь п=26 Перифок. зона n=2ú

Т-лимфоциты CD2+ 55,2±2,4 59,3±12,5 50,8±0,2 34,0±0,8*

CD4+ 28,8±2,3 24,3+2,8 24,4±1,4 19,6±2,2

CD8+ 30,5+2,6 28,5£3,8 24,6±1,7 21,9±2,5

CD25+ 7,0±1,7 11,0±4,0 21,1±2,4 11,9±2,1*

NK лимфоциты CD16+ 18,2+1,4 17,7±1,8 13,6±1,2 1 8,4±2,0*

CD56+ 9,3+0,6 13,3+1,7* 7,3 ±0,7 15,1+2,4*

CD95+ 8,5±0,96 10,3 ±2,0 11,0+1,5 7,0±1,2*

В-лимфоциты 16,9+0,5 18,0+3,5 15,8+0,6 11,4+1,5*

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей крови, (р<0,05)

При метастатическом поражении в перифокальных зонах ниже, чем в крови, было содержание Т-лимфоцитов с маркерами CD2+ (на 33,0%), CD25+ (на 44,0%), CD95+ (tía 36,0%) и В-клеток (на 27,0%).

3 f-20

5 й.

S ¥ -40

T(CD2+) CD4+ CDB+ CD1S+ CD5S+ CD25+ С095+ В-ПИМф.

О первичный рак печени ■ метастатическое поражение печени

Ряс. I. Уровни различных субпопу ляций лимфоцитов в пери фокальных зонах по сравнению с периферической кровью у больных и перничным и метастатическим раком печени

* - статистически достоверные отличия от показателей периферической крови

Однако, как и в вышеуказанных группах при метастатических поражениях печени в перифокальных зонах был значительно выше уровень натуральных киллеров (СБ 16+ на 35,0%, СБ56+ в 2 раза) (табл. 1, рис.1), т.е. Ж-клетки накапливаются в печени вблизи очага. Клетки, осуществляющие специфический, в том числе противоопухолевый иммунитет (Т- и В-лимфоциты), не концентрируются в паратуморальных зонах.

При проведении иммуногистохимического исследования биоптатов печени, было установлено, что в перифокальных зонах встречались инфильтраты, представленные Т- и В-лимфоцитами с преобладанием первых, что соответствует содержанию этих популяций в крови. Лимфоидную инфильтрацию удалось обнаружить не во всех образцах; ткань опухоли была инфильтрирована слабее, чем ткань перифокальной зоны.

Субпопуляционный состав лимфоцитов, выделенных из ткани опухоли, имеет более значительные отличия от показателей периферической крови, по сравнению с лимфоцитами перифокальной зоны. Так, в очаге поражения при первичном раке содержание Т-хелперно-индукторных лимфоцитов (СБ4+), ци-тотоксических (СБ8+) и имеющих маркер поздней активации и апоптоза (СВ95+) было ниже (на 45,0, 28,0 и 29,0% соответственно) по сравнению с их количеством в крови (табл. 2, рис. 2).

Таблица 2

Иммунологические показатели в периферической крови и в опухоли у больных гепатоцеллюлярным раком и метастатическим поражением печени, %

Иммунологический показатель ГЦР МПП

Кровь п=16 Опухоль п=16 Кровь п=26 Опухоль п=26

Т-лимфоциты С02+ 55,2±2,4 46,8±5,6 50,8+0,2 29,8±4,3*

СБ4+ 28,8±2,3 15,9±2,3* 24,4±1,4 18,8±2,7

С08+ 30,5+2,6 21,9±3,7* 24,6±1,7 21,3+3,2

СЭ25+ 7,0±1,7 7,6±1,5 21,1±2,4 7,7±1,7*

ЫК-лимфоциты СО 16+ 18,2±1,4 15,9±2,1 13,б±1,2 12,9±2,2

СБ56+ 9,3±0,6 9,0±2,0 7,3±0,7 11,7±2,3*

С095+ 8,5±0,96 6,0±0,6* 11,0+1,5 9,0±2,3

В-лимфоциты 16,9±0,5 15,3+3,1 15,8 ±0,6 10,2±1,9*

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей периферической крови (р<0,05)

При метастатическом поражении е метастазе уровень С1356+ клеток был на 60% выше, чем в крови, но при этом сам был более низкий уровень Т-(С02+), В-лимфоцитов и С025+ клеток (на 42,0, 35,0 и 64,0% соответственно) (табл. 2, рис, 2).

а)

Р -60------

* Т(С02+) СВ4+ С 08+ С016+ С056+ С025+ СОЭ5+ В-лимф.

■ □ первичный рак печени ■ металлическое поражение печени

Рис. 2. Уровни различных субпопуляций лимфоцитов в опухоли но сравнению с периферической кровью у больных с первичным и метастатическим раком печени

* - статиспIчески Достоверные отличии от показателей периферической кроки

Низкое количество С04+ и СШ+ лимфоцитов при гепамщел л ййяярном раке в опухоли но сравнению с кровью говорит о возможном нарушении процессов регуляции и эффекторных функций. Кроме того, на основании низкого уровня С095-1- клеток в очаге поражения можно предположить, что гибель лимфоцитов но механизму акч ивационного шюптоза там снижена. При метастатическом поражении печени из всех исследуемых субпопуляций только СО56+ клетки, осуществляющие не специфическую противоопухолевую защиту, сохранили способность накапливаться в метастазе, вероятно, в связи с особенностями ироения адгезивных рецепторов, благодаря которым происходит их взаимодействие с клетками эндотелия сосудов.

Установлено, что у больных с метастатическим поражением печени снижено не только количество Т-лимфоцитов, но и их функциональная активность,

о чем можно судить по угнетению митоген-индуцировавной пролиферации Т-лимфацитов, выделенных из метастаза (рис. 3).

спонтанная стимулированная ФГА

Рис. 3. Функциональная активность лимфоцитов в периферической крови, в пери фокальной зоне печени и и метастазе у больных с метастатическим поражением печени (п—26) * - статистически достоверные сгтлвчия от показателей периферической кропи

Исследование моноцитарного звена показало, что в контрольной группе у всех больных удалось выделить моноциты из б иол та гов печени, тогда как у больных с первичными и метастатическими поражениями только у 50,0 и 30,0% соответственно. Эти данные были одинаковы как для ткани перифокальной 'юны, гак и для опухоли (рис, 4).

1 2 3

Рис. 4. Процент выявления моноцитов в опухоли и н перифокальной зоне у пациентов контрольной труппы (I). при перцичных (2) И метастатических поражениях (3) печени.

При первичном поражении печени функциональная активность моноцитов, обнаруженных в перифокалышх зонах печени, была иыше (на 34,0%) по срав-

нению с контрольной группой и не отличалась от периферической крови, р<0,05. Моноциты, выделенные из опухоли, функционально не отличались от таковых из периферической крови и из биоптатов контрольной группы. При метастатическом поражении печени отличий функциональной активности моноцитов не обнаружено как по сравнению с периферической кровью, так и по сравнению с контрольной группой.

Несмотря на то, что функциональная активность моноцитов, выделенных из печени, оцениваемая по фагоцитозу и интенсивности кислородо-зависимых процессов, не нарушена, опухолевые клетки или их вещества, по-видимому, угнетают адгезию моноцитов, посредством которой происходит не только их выделение, но и взаимодействие с другими клетками. При этом нарушается межклеточная кооперация моноцитов с лимфоцитами, что в дальнейшем ведет к изменениям последующих звеньев локального противоопухолевого иммунитета.

В качестве важнейшей характеристики функциональной активности лимфоцитов и моноцитов представляло интерес изучение продутой ими цитокинов. У больных с метастатическими поражениями определяли спонтанную и стимулированную продукцию ТИР-а, 1Ь-8, ШЫ-у, 1Ь-4 мононуклеарными клетками, выделенными из крови, перифокальных и метастатических участков печени.

Было обнаружено, что спонтанная продукция монокинов (ТЫР-а, 1Ь-8) МНК крови была высокой, а ее стимуляция митогенами практически отсутствовала, о чем говорят низкие индексы стимуляции (ИС) (рис. 5). В ткани печени, особенно в метастазе, спонтанный уровень продукции Т№-а и 1Ь-8 был статистически значимо ниже, чем в крови, р<0,05; при этом были отмечены более высокие митогениндуцированные показатели и индексы стимуляции (рис.5). Классическими продуцентами монокинов в ткани являются моноциты и макрофаги, в печени это клетки Купффера; однако они могут вырабатываться и другими клетками. Продукция монокинов в ткани была выше, чем в крови, возможно, за счет влияния клеток микроокружения (гепатоциты, эндотелиаль-ные клетки), а также натуральных киллеров и клеток опухоли. Мы полагаем, что при выявлении моноцитов только в 1/3 проб, основная продукция ТЫР-а и 1Г>-8 происходит за счет высокого содержания натуральных киллеров и контаминации взвеси МНК опухолевыми клетками.

Рис. 5* Продукция мопокинов мононух.жфн'-лми клетками крови, нерифокальных. зон и метастазов при метастатическом поражении печени (и—10). * - статистически достоверные отличии от показа гелей периферической крови

11 редукция IL-4 мононуклеарными клетками пер и фокальных зон и метастазов была ниже, чем s крови (р<0,05), что, возможно, связано с низким уровнем ь печени основных клеток-продуцентов, а именно, Т- и В-лимфоцитов (рис. б).

Pite. Продукция лимфокинов мононуклеарными клетками крови, птрифокальных зон и метастазов при метастатическом поражении печени (п=8) * - статистически достоверные отличия от показателей периферической крови

Снижение спонтанного и повышение стимулированного уровня ШЫ-у мононуклеарными клетками перифокальной зоны и опухоли по сравнению с МНК крови выражается в повышении индекса стимуляции, что говорит о более высоком функциональном потенциале клеток, выделенных из биоптатов печени (рис. 6).

Основными продуцентами ШКГ-у являются Т-лимфоциты, хотя он вырабатывается также ЫК-клетками. Мы предполагаем, что в условиях сниженного содержания Т- и повышенного содержания ЫК-клеток в ткани метастаза и перифокальной зоны, отмеченное усиление продукции №N-7 является следствием накопления в ткани ЫК-клеток, сохранивших способность продуцировать лим-фокины и/или стимулироваться ими; в таком случае эти клетки можно активировать интрапортальным введением различных цитокиновых иммуномодуля-торов, прежде всего 1Ь-2.

Поскольку в литературе недостаточно данных о содержании лимфоидных субпопуляций в ткани нормальной печени, мы проводили сопоставление некоторых параметров клеточного иммунитета в перифокальных зонах и в малиг-низированных участках с показателями биоптатов печени пациентов контрольной группы, прооперированных по поводу одиночных непаразитарных кист.

Было установлено, что в 1 см3 ткани перифокальной зоны при первичном раке содержится больше лимфоцитов по сравнению как с контрольными образцами, так и с перифокальной зоной метастаза (на 72,0 и 65,0% соответственно), т.е. в немалигнизированных участках печени при ГЦР происходит концентрация лимфоцитов вблизи опухоли. В опухолевых участках при первичных и метастатических поражениях количество лимфоцитов было меньше по сравнению с их перифокальными зонами.

Субпопуляционный анализ выявил существенные качественные различия между ними (табл. 3).

Изучение локального иммунитета показало, что по сравнению с биопта-тами печени контрольной группы, при первичном раке в перифокальных зонах обнаружен более низкий уровень СБ16+ и СБ56+ клеток (на 29,0 и 23,0% соответственно).

Таблица 3

Иммунологические характеристики лимфоцитов и перификальнон зоне и в очаге поражении при гематоцеллкширком раке, mci астатическом поражении и при пепаразн-тарных кистах (контроль), %

Иммунологический показатель Контроль п=10 ГЦР 11-16 мпп №=26

N ери ф лона Опухоль Перифзоца Опухоль

Т-лимфоциты CD2+ 45,8±3,4 59,3*12,5 46,8±5,6 34,0+0,8* 29,8+4,3*

СП 4+ 22,6±2,1 24,3+2,8 15,9±2,3* • 19,6+2,2 18,8+2,7

СШ+ 28,4±2,4 28,5 ±3,8 21,9+3,7* - 21,9+2,5* 21,3+3,2*

N К.-клетки CD 16+ 24,8*4,1 17,7±1,8+ 15,9±2,1* ] 8,4+2,0* 12,9+2,2*

СО 56+ Í 7.3±2,9 ¡3,3±I,7* 9,0±2,0* - ¡5, ¡+2,4 (1,7*2,3*

5-лкмфоциты 1У,0±3,5 18,0±3,5 15,3±3,1 11,4±1,5* 10,2+1,9*

Примечаний * — статистически достоверные отличия от контроля; ■ — статистически достоверные отличия от пери фекальной зоны

В опухоли были выявлены значительно более глубокие изменения: снижено содержание не только ЫК (С016+ на 36,0%, СБ56+- на 48,0%), по и Т- лим-фоцитов(£Ю4+ на 30,0%, СБ8+ па 23,0%), как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с пер и фокальной зоной, р<0,05 (табл. 3, рис. 7).

I 40

I 30

g го

I ю

I о

1 "10

I -20

S -зо 1

¡ -50

"Stг

1

I "41

-эо - -2Э™ * Г!

* * -36 >■■■

-48 *

T(CD2+) CD4+ CD8+ CD16+ CDS 6+ Впимф.

■ опухоль

□ перифокапьная зона

Рис.7. Уровни различных суйпопуляций лимфоцитов л опухоли и в пери фокальной зоне при ГЦР по сравнению с контролем, * — статистически достоверные отличия от контроля

При метастатическом поражении (МЛП) как в церифокальной зоне, так и в опухоли содержание Т- (на 26,0 и 35,0% ), В- (на 40,0 и 46,0%) и NK-

лимфоцитов (СП 16+ па 26,0 и 48,0%; СП56+ на 13,0 и 32,0% соответственно) было снижено по сравнению с контрольной группой. Несмотря на то, что уровень СШ6+ клеток в очаге поражения был выше, чем в крови, их количество было снижено (на 32,0%) по сравнению с контрольными образцами (р<0,05), что свидетельствует о локальном нарушении ЫК-звепа при МПП (табл. 3, рис. 8).

T(CD2+) С 04+ CDB+ CD16+ CDSS+ В-лимф.

О перифокальная зона ■ метастаз

Рис. 8. Уровни различных субпопуляций лимфоцитов в метастазе н в лерифокалЫЮЙ 'зоне при МПП но сравнению с контролем.

* — статистически достоверные отличия от контроля

Установленное нами угнетение локального иммунитета при первичном и метастатическом поражении печени характеризуется низким содержанием в ткани печени иммунокомпетентных клеток, осуществляющих как специфическую (Т- (CD2+, CD4+, CD 8+) и В-клетки), так и не специфическую (NK, моноциты) противоопухолевую защиту, причем более выраженные нарушения выявлены при метастатическом поражении печени. Мы считаем важным, что однонаправленные изменения обнаружены не только в опухолевых, но и в нем ал и г-низироваппых участках печени; это, по-видимому, связано с дистантным воздействием опухолевых клеток. Распространение злокачественного процесса может поддерживаться благодаря гиперпродукции провоспалителышх цитокинов (IL-8), происходящей в очаге при перифокальпом воспалении.

При удалении первичного очага N К-клетки, концентрирующие вблизи

опухоли, могут быть объектом стимуляции различными иммуномодуляторами, в частности ронколейкином. Нами апробировано интрапортальное пролонгированное введение иммунопрепарата ронколейкина у больных с МПП.

Больным с метастатическими нарушениями печени на фоне сниженных исходных иммунологических показателей в периферической крови, в ткани печени и в очаге поражения, на 10-е сутки после операции по поводу с множественных метастазов печени было проведено лечение ронколейкином. Препарат в дозе 2 млн.МЕ вводили интрапортально в течение суток с интервалом в 3 дня, общее количество введений на курс составило 5, курсовая доза 10 млн.МЕ. После завершения курса ронколейкина проводили стандартную химиотерапию. Результаты оценки иммунного статуса, которую проводили после каждого введения ронколейкина, показали, что оптимальный баланс лимфоцитов исследуемых субпопуляций складывается после введения 6-8 млн.МЕ, т.е. на 18-23 сутки: количество лимфоцитов с маркерами С04+ и СБ8+ достигает нормального уровня и соотношения, повышается содержание №С-клеток (СЕ) 16+ и С056+), а высокий уровень СБ25+ лимфоцитов индуцируется сразу и сохраняется в течение всего срока наблюдения (табл. 4).

Следует особо подчеркнуть, что после курса интрапортальной иммунотерапии на фоне проводимой адъювантной химиотерапии не происходило угнетения иммунологических показателей периферической крови, что сочеталось с улучшением биохимических показателей и общего анализа крови.

Таблица 4

Показатели субпоиуляционного состава лимфоцитов в периферической крови на этапах введения ронколейкина, %

Показатель Исходный фон Время введения препарата (сутки после операции)

10 14 18 23 28

Суммарная доза введенного ронколейкина, млн.МЕ

2 4 6 8 10

СБ4+ 24 34 25 40 44 20

С08+ 22 38 32 20 22 34

СП 16+ 12 16 18 25 18 15

СП56+ 8 10 11 14 21 18

СБ25+ 6 22 20 22 20 20

Таким образом, наши исследования выявили глубокие однонаправленные нарушения местного иммунитета как при гепатоцеллюлярном раке, так и при метастатическом поражении печени, но более выраженные в последнем случае. Эти изменения представлены снижением большинства исследуемых субпопуляций лимфоцитов и моноцитов, а также их функциональной активности как в ткани опухоли, так и в перифокальной зоне, что можно объяснить дистантным иммуносупрессивным влиянием опухолевых клеток.

Полученные данные свидетельствуют о большей значимости локальных иммунологических сдвигов в микроокружении опухоли по сравнению с системными изменениями, регистрируемыми в периферической крови.

ВЫВОДЫ

1. При первичных опухолях печени происходит повышение количества ЫК-клеток (С056+) в перифокальной зоне опухоли, представляющей собой визуально немалигнизированную ткань по сравнению с кровью (13,3±1,7 и 9,3±0,6% соответственно), однако, локальный уровень этих клеток ниже, чем в нормальной печени (17,3±2,9%) (р<0,05).

2. В ткани первичной опухоли достоверно снижено содержание СР4+, СБ8+ и СБ95+ лимфоцитов по сравнению с периферической кровью (15,9±2,3, 21,9±3,7, 6,0±0,6% и 28,8±2,3, 30,5±2,6, 8,5±0,96% соответственно); регистрируется локальное угнетение Т- (СБ4+, СБ8+), Ж- (СБ 16+ на 35% и СБ56+ в 2 раза) и моноцитарного звеньев иммунной системы по сравнению с нормальной печенью (р<0,05).

3. При метастатических поражениях печени в перифокальных зонах выявлено высокое содержание №С- (СБ 16+, СБ56+) по сравнению с периферической кровью (18,4±2,0, 15,1±2,4% и 13,6±1,2, 7,3±0,7% соответственно) и при этом низкое содержание Т- и В-лимфоцитов, 34,0±0,8, 11,4±1,5% и 50,8±0,2, 15,8±0,6% соответственно); параметры ЫК-, Т- (СБ2+, СБ8+) и В-клеточного звеньев были статистически достоверно ниже, чем в образцах ткани контрольной группы (24,8±4,1, 17,3±2,9, 45,8±3,4, 28,4±2,4, 19,0+3,5% соответственно) (р<0,05).

4. Ткань метастатической опухоли характеризуется наиболее выраженным угнетением локального иммунитета, а именно, подавлением моноцитарного звена и низким уровнем Т- (CD2+, CD8+), B-, NK- (CD 16+, CD56+) лимфоцитов (29,8±4,3, 21,3±3,2, 10,2±1,9, 12,9±2,2 и 11,7±2,3% соответственно) по сравнению с их содержанием в биоптатах нормальной печени (45,8±3,4, 28,4±2,4, 19,0±3,5, 24,8±4,1 и 17,3±2,9% соответственно); однако, уровень NK-клеток (CD56+) в ткани метастаза был на 60,0% выше по сравнению с периферической кровью (р<0,05).

5. В ткани метастастатической опухоли обнаружено снижение не только количества, но и функциональной активности Т-лимфоцитов; выявлен дисбаланс продукции монокинов (TNF-a, IL-8) и лимфокинов (IFN-y, IL-4) мононук-леарными клетками крови, перифокальных зон и метастаза.

6. Найденные глубокие изменения местного иммунитета свидетельствуют о доминировании локальных сдвигов в патогенезе первичных и метастатических злокачественных поражений печени над системными, что может служить основанием для проведения интрапортальной иммунотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение локального уровня популяций и субпопуляций лимфоцитов может быть использовано в качестве основания проведения интрапортальной иммунотерапии ронколейкином при первичных и метастатических опухолевых поражениях печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Некоторые механизмы местного иммунитета при метастатических поражениях печени // Материалы 9-й гастроэнтерологической недели 2003 г. Рос. журнал гастроэнтерологии, колопроктологии, 2003. T.XII. №5. прил. №21. С. 99 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

2. Некоторые аспекты местного иммунитета при раке печени // Материалы 9-й Рос. конф. «Гепатология сегодня» 22-24.03.2004 г. Рос. журнал гастроэнтерологии, колопроктологии, 2004. Т. XIV. №1. прил. №22. С. 63. (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю).

3. Некоторые аспекты общего и локального иммунитета при первичных и метастатических опухолях печени // Южно-Российский медицинский журнал. 2004. №3. С. 44-47 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

4. Иммунофенотипическая характеристика внутриопухолевых лимфоцитов при первичных и метастатических опухолях печени // Южно-Российский медицинский журнал. 2004. №3. С. 69 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

5. Факторы клеточного иммунитета у больных первичным и метастатическим раком печени // Южно-Российский медицинский журнал. 2004. №3. С. 67 (соавт.: Златник Е.Ю, Шапошников A.B.).

6. Локальный иммунитет в онкогенезе гепатокарциномы II Гастоэнтероло-гия Санкт-Петербурга. 2004. №2-3. С. 166 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

7. Иммунитет в онкогепатологии // Тезисы V съезда научного общества гастроэнтерологов России, 3-6.02.2005 г., М., С. 318 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

8. Содержание цитотоксических лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, у больных с метастатическими поражениями печени // Тезисы III Всемирного Конгресса по клинической патологии и реабилитации в медицине. Паттайя, Тайланд 4-11.02.2005 г. Аллергология и иммунология. 2005. Т.6. №2. С. 215 (соавт.: Златник Е.Ю, Шапошников A.B.).

9. Количество Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов в биоптатах печени у больных с метастатическими поражениями печени // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии. Материалы V Всероссийской конф. молодых ученых в рамках VI съезда онкологов России. 12 октября 2005 г. Ростов-на-Дону. С. 208-209.

Ю.Цитотоксические субпопуляции лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль и перифокальную ткань, у больных с метастатическими поражениями печени // Медицинская иммунология. 2005. Т.7. №2-3. С. 206-207 (соавт.: Златник Е.Ю., Шапошников A.B.).

11.Уровень Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов в биоптатах при метастатических поражениях печени // Новые технологии в онкологической практике. Материалы Рос. научно-практич. конф. с междунар. участием. Варна-

ул, 7-8.06.2005. С. 221 (соавт.: Златник Е.Ю., Шапошников A.B.).

12.Уровень лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, у больных первичным раком печени // Международный конгресс «Иммунитет и болезни. От теории к терапии». М., 3—7.10.2005 (электронная версия) (соавт.: Златник Е.Ю., Шапошников A.B.).

13.Иммуногепатоканцерогенез. Новые аспекты // Рос. журнал гаст-роэнтерол., гепатол., колопроктол. 2006. T.XVI, №1. Прил. №27 (Материалы 11 Рос. конф. «Гепатология сегодня» 27-29.03.2006, Москва) С. 22 (соавт.: Шапошников А.В, Златник Е.Ю.).

14.Содержание CD25+ и CD95+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль и перифокальные зоны, у больных с метастатическими поражениями печени // Аллергол. и иммунол. 2006. (Материалы VI Съезда аллергол. и иммунол. СНГ, Рос. нац. конгр. аллергол. и иммун., III Рос. конф. по иммунотерапии. Москва 11-14.09.06). Т.7. №3. С. 368 (соавт.: Златник Е.Ю., Шапошников A.B.).

¡5.Некоторые иммунологические аспекты гепатоканцерогенеза И Академический журнал Западной Сибири. 2007. №1. С. 25-30 (соавт.: Шапошников A.B., Златник Е.Ю.).

ИЗОБРЕТЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. «Способ адъювантной иммунотерапии при первичных злокачественных и метастатических опухолях печени» заявка регистрационный №2006121807, приоритет от 19.06.2006.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЦР - гепатоцеллюлярный рак,

МПП - метастатическое поражение печени,

ЫК - натуральные киллеры,

ТОТ-а - фактор некроза опухолей альфа,

1ЕЫ-7 - интерферон гамма,

1Ь - интерлейкин.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л.

Заказ № 249. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Актуальность темы исследования. Современные представления о системе иммунологической противоопухолевой защиты предполагают наличие в ее составе неспецифических (NK, NKT, макрофаги, моноциты, эо-зинофилы, тучные клетки, тромбоциты, нейтрофилы, система комплемента и др.) факторов врожденного иммунитета и специфических (Т-лимфоциты (CD4+, CD8+), В-лимфоциты, противоопухолевые антитела), формирующих адаптивный иммунитет (Хаитов P.M. и соавт., 2000).

Иммунный ответ инициируется при поступлении антигена и включает его процессинг, презентацию, распознавание, пролиферацию и диффе-ренцировку иммунокомпетентных клеток, их миграцию, сложные процессы их взаимодействия, включая экспрессию рецепторов, продукцию моно-и лимфокинов в качестве регуляторных молекул, антителогенез, осуществление эффекторных функций цитотоксическими лимфоцитами путем лизиса клеток-мишеней. В организме-опухоленосителе происходит нарушение различных этапов иммунного ответа и развивается его несостоятельность (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005). Причинами этого являются особенности антигенной структуры опухолевых клеток, неконтролируемая пролиферация, продукция факторов, супрессирующих функции иммунокомпетентных клеток (Cresswell А.С. et al., 2001; Salih H.R., Nussler V. et al., 2001; Zeng G. et al., 2001), а также снижение экспрессии антигенрас-познающих и ко-стимулирующих рецепторов лимфоцитов, дисбаланс продукции цитокинов, снижение уровня хемоаттрактантов и др. (Ярилин А.А., 1999; Хаитов P.M., 2001; Joyce S., 2001; Samija M. et al., 2001; Wakkah A. et al., 2001; Slaughter N. et al., 2003).

В Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте под руководством академика РАН и РАМН Ю.С. Сидоренко проводится комплекс научных исследований, касающихся патофизиологических, иммунологических и биохимических аспектов противоопухолевой резистентности. Получены весомые доказательства роли некоторых местных тканевых и иммунных факторов (Непомнящая Е.М., 2002; Златник Е.Ю., 2003; Сидоренко Ю.С., Франциянц Е.М., 2006; Сидоренко Ю.С. и соавт., 2006; Франциянц Е.М. и соавт., 2006).

Об участии печени в иммунной защите взрослого организма известно крайне мало. 10% клеток печени относятся к адаптивной (Т- и В-лимфо-циты) и к врожденной иммунной системе (клетки Купффера, NK, NKT) (Zhiping Li, Diehl A.M., 2003). Печень богата натуральными киллерами и макрофагами (Mehal W.Z. et al., 2001), поскольку является местом, куда поступают чужеродные антигены, попадающие из желудочно-кишечного тракта в кровь по системе воротной вены, и где они сталкиваются с защитными факторами организма.

Среди лимфоидных клеток нормальной печени большую часть составляют натуральные киллеры (NK) с высокой экспрессией CD56+ (более 50% от общего числа печёночных лимфоцитов) (Сепиашвили Р.И., Балма-сова И.П., 2005). В ней также содержатся СБ16+лимфоциты, несущие мембранный рецептор для Fc-фрагмента IgG, благодаря которому они распознают инфицированные вирусами клетки, опсонизированные антителами класса G, и развивают в отношении этих клеток-мишеней антителоза-висимую клеточную цитотоксичность (Хаитов P.M., 2001). В ходе межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток локальная продукция ци-токинов хелперно-индукторными лимфоцитами (Thl - IFN-y и Th2 - IL-4) активирует NK-клетки через их рецепторы (Chen Н., 1997).

Предшественниками резидентных печёночных макрофагов (клеток Купффера) являются моноциты крови, происходящие, в свою очередь, из костномозговых предшественников (Хаитов P.M. и соавт., 2000; Zhiping Li, Diehl A.M., 2003). Локализуясь в печени, клетки Купффера дифференцируются для выполнения специальных функций, включая фагоцитоз, про-цессинг и представление антигенов, выделение цитокинов (IL-12, IL-18,

IL-10, IL-15), которые участвуют в регуляции функций NK- и ЦТЛ (CDS+клеток), а также влияют на продукцию TNF-a (Mayeux P.R., 1997; Lauwerys B.R., 2000; Fehniger Т.А., 2001).

Если о роли клеток врожденной иммунной системы, содержащихся в печени, известно достаточно хорошо, то о клетках, формирующих ее адаптивный иммунитет, существуют единичные исследования (Mehal W.Z. et al., 2001). Вызывает особый интерес изучение иммунной защиты печени при злокачественных новообразованиях. Эта область практически не изучена равно, как и возможности локальной иммунотерапии.

Среди злокачественных новообразований печени известны первичные (гепатоцеллюлярный рак) и метастатические поражения печени (при злокачественных опухолях желудочно-кишечного тракта, раке молочной железы и др.). Гепатоцеллюлярный рак (ГЦР) в России встречается относительно редко и составляет 1,7-2,2% всех злокачественных новообразований. Медиана выживаемости таких больных находится в пределах 2-6 мес. (Петренко К.Н. и соавт., 2007; Takayama Т., Makuushi М., 2001; Laura М., Kulik А., 2007). У 70-80% больных выполнение радикальных операций невозможно из-за распространенности процесса. Кроме того, различные опухоли метастазируют в печень, что особенно часто наблюдается при колоректальном раке и говорит о генерализации процесса (Конев В.Г., 2002; Гранов A.M., Немет Н.Л., 2005; Коков Л.С. и соавт., 2005; Ruers Т. et al., 2002).

Существует достаточно много циторедуктивных методов хирургического лечения ГЦР и метастатических поражений печени, однако, они имеют свои недостатки и не всегда приемлемы (Таразов П.Г., 2001; Конев В.Г., 2002; Шапошников А.В. и соавт., 2004; Петренко К.Н. и соавт., 2007).

Несмотря на расширяющийся объем знаний о причинах первичных и метастатических опухолевых поражений печени, многие вопросы, касающиеся механизмов возникновения и прогрессирования этой патологии, остаются открытыми. В связи с этим внимание исследователей все чаще обращается на местный иммунитет печени.

Цель исследования: дать оценку состояния местных факторов клеточного иммунитета в сопоставлении с показателями общего иммунитета у больных с первичными злокачественными и метастатическими опухолями печени и на основании полученных данных разработать подходы к локальной иммунотерапии как к компоненту комплексного лечения опухолевых поражений печени.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Определить количественный и качественный состав популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови, в немалигнизиро-ванных участках печени, в первичных и метастатических очагах при гепа-тоцеллюлярном раке и метастатических поражениях печени.

2. Изучить функциональную активность лимфоцитов и моноцитов крови, немалигнизированных и опухолевых участков печени при метастатических поражениях.

3. На основании локальных изменений у больных с первичными злокачественными и метастатическими поражениями печени разработать подходы к интрапортальной иммунотерапии ронколейкином.

Научная новизна и значимость полученных результатов:

• Впервые определен популяционный и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов (CD2+, CD4+, CD8+), а также CD25+, СБ95+клеток, натуральных киллеров (CD 16+ и CD56+) и В-лимфоцитов в немалигнизированных и опухолевых участках у больных гепатоцеллюлярным раком и метастатическими поражениями печени. Определена функциональная активность (митогениндуцированная пролиферация, продукция цитокинов TNF-a, IL-8, IFN-y, IL-4) лимфоцитами и моноцитами, выделенными из крови, перифокальной зоны и метастаза у больных с метастатическими поражениями печени.

• Установлено, что при метастатических поражениях печени нарушения местного иммунитета являются наиболее глубокими. Изменения состава и функций иммунокомпетентных клеток в перифокальных зонах и в опухоли являются однонаправленными, но более выражены в опухолевой ткани.

• На базе полученных данных апробирован метод итрапортальной иммунотерапии при первичных злокачественных и метастатических поражениях печени.

По теме диссертации подана заявка на изобретение, приоритет от 19.06.2006 г.

Практическое значение работы. На основании изменений показателей клеточного иммунитета в опухолевых и немалигнизированных участках печени разработаны подходы к местной иммунотерапии как компонента комплексного лечения злокачественных опухолей печени.

Внедрение результатов исследования. Полученные сведения о локальных изменениях клеточного иммунитета в немалигнизированных и опухолевых участках печени использованы для проведения местной ин-трапортальной иммунотерапии в отделении превентивной онкологии, лапароскопической и общей' хирургии РНИОИ при первичных и метастатических опухолевых поражениях печени.

Основное положение, выносимое на защиту

Наличие нарушений локального иммунитета как при гепатоцеллю-лярном раке, так и при метастатическом поражении печени и их однонаправленность в опухолевых и паратуморальных тканях.

Апробация работы. Материалы исследования доложены: на Девятой гастроэнтерологической недели 2003г., 6-м Международном форуме Славянско-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург» - Гастро-2004», г. Санкт-Петербург, 2004; Девятой Российской конференции «Гепа-тология сегодня» г. Москва, 2004; V съезде Научного Общества Гастроэнтерологов России, г. Москва, 2005; V Всероссийской конференции молодых ученых в рамках VI съезда онкологов России 12 октября 2005 года в Ростове-на-Дону, Одиннадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня» г. Москва, 2006 г. Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института 27 июня 2007 года.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 15 научных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, заключения и обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 74 отечественных и 208 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 37 рисунками.

выводы

1. При первичных опухолях печени происходит повышение количества NK-клеток (CD56+) в перифокальной зоне опухоли, представляющей собой визуально немалигнизированную ткань по сравнению с кровью (13,3+1,7 и 9,3±0,6% соответственно), однако, локальный уровень этих клеток ниже, чем в нормальной печени (17,3+2,9%) (р<0,05).

2. В ткани первичной опухоли достоверно снижено содержание CD4+, CD8+ и CD95+ лимфоцитов по сравнению с периферической кровью (15,9±2,3, 21,9+3,7, 6,0±0,6% и 28,8+2,3, 30,5+2,6, 8,5+0,96% соответственно); регистрируется локальное угнетение Т- (CD4+, CD8+), NK-(CD16+ на 35% и CD56+ в 2 раза) и моноцитарного звеньев иммунной системы по сравнению с нормальной печенью (р<0,05).

3. При метастатических поражениях печени в перифокальных зонах выявлено высокое содержание NK- (CD16+, CD56+) по сравнению с периферической кровью (18,4±2,0, 15,1 ±2,4%> и 13,6±1,2, 7,3+0,7% соответственно) и при этом низкое содержание Т- и В-лимфоцитов, 34,0+0,8, 11,4+1,5% и 50,8+0,2, 15,8+0,6% соответственно); параметры NK-, Т-(CD2+, CD8+) и В-клеточного звеньев были статистически достоверно ниже, чем в образцах ткани контрольной группы (24,8+4,1, 17,3+2,9, 45,8+3,4, 28,4+2,4, 19,0+3,5% соответственно) (р<0,05).

4. Ткань метастатической опухоли характеризуется наиболее выраженным угнетением локального иммунитета, а именно, подавлением моноцитарного звена и низким уровнем Т- (CD2+, CD8+), В-, NK- (CD 16+, CD56+) лимфоцитов (29,8+4,3, 21,3+3,2, 10,2+1,9, 12,9+2,2 и 11,7+2,3% соответственно) по сравнению с их содержанием в биоптатах нормальной печени (45,8+3,4, 28,4+2,4, 19,0+3,5, 24,8+4,1 и 17,3+2,9% соответственно); однако, уровень NK-клеток (CD56+) в ткани метастаза был на 60,0% выше по сравнению с периферической кровью (р<0,05).

5. В ткани метастастатической опухоли обнаружено снижение не только количества, но и функциональной активности Т-лимфоцитов; выявлен дисбаланс продукции монокинов (TNF-a, IL-8) и лимфокинов (IFN-y, IL-4) мононуклеарными клетками крови, перифокальных зон и метастаза.

6. Найденные глубокие изменения местного иммунитета свидетельствуют о доминировании локальных сдвигов в патогенезе первичных и метастатических злокачественных поражений печени над системными, что может служить основанием для проведения интрапортальной иммунотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение локального уровня популяций и субпопуляций лимфоцитов может быть использовано в качестве основания проведения интрапортальной иммунотерапии ронколейкином при первичных и метастатических опухолевых поражениях печени.