Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Недоношенные новорожденные: структурно-метаболические параметры клеток иммуной системы при разном возрасте и респираторном дистресс-синдроме

Па правах рукописи

О04604573

лисихинл

НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

НЕДОНОШЕННЫЕ НОВОРОЖДЕННЫЕ: СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ РАЗНОМ ГЕСТАЦИОННОМ ВОЗРАСТЕ И РЕСПИРАТОРНОМ ДИСТРЕСС-СИНДРОМЕ

14.01.08 - педиатрия 14.03.03 - патологическая физиология, медицинские науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Красноярск - 2010

2 О МДМ 2910

004604573

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН, в лаборатории этногенетических и метаболических проблем нормы и патологии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Манчук Валерий Тимофеевич доктор биологических наук, профессор

Фефслова Вера Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Тарану шенко Татьяна Евгеньевна

доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич

Ведущая организация: Хабаровский филиал Учреждения Российской академии медицинских наук Дальневосточного научного центра физиологии и патологии Сибирского отделения РАМН НИИ охраны материнства и детства

Защита состоится "¿б." , ил. 1. 2010 г. в^б часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.037.01 при ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д.1.

Автореферат разослан <</?»__2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Штарик С.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема недонашивания беременности и преждевременного рождения детей является одной из актуальных в пери- и неонатологии. В настоящее время частота рождения детей раньше срока достаточно высока и не имеет тенденции к снижению (Володин H.H., 2004; Абаев Ю.К., 2005; Янмурзаева 'i.A., 2006; Прахов A.B. с соавт., 2008; Hack М., 1996; Spenser N.J., 2002). В России недоношенные при рождении составляют от 5 до 12% всех новорожденных (Никулин JI.A., Левченко'Л.А., 1999; Ковалевская О.И., 2004; Логинова И.А., 2004).

Высокая заболеваемость и смертность недоношенных новорожденных, различные по тяжести неврологические и соматические нарушения, приводящие чао о к ипвалидизашш, а в ряде случаев к полной социальной дезадаптации - являются одной из основных медико-сониальных проблем. Сохранение жизни и здоровья недоношенным детям продолжает оставаться одной из первоочередных задач педиатрии (Володин H.H. с соавт., 2001; Дементьева Г.М. с соавт., 2003; Anion 1£„ 1999; Fonceca Е.В., 2004).

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению различных параметров при недоношенности, патогенез этого состояния до конца не выяснен. Некоторые авторы считают нарушения иммунологических отношений между матерью и плодом одним из важнейших пусковых факторов недоношенности (Говалло В.И., 1987; Яшнили-Пароксадзе Т.Н. 1990; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003; Макаров О.В. с соавт., 2009; Верясов В.Н. с соавт., 2010).

Считается доказанным, что изменение функциональной активности клеток иммунной системы происходит только при соответствующих изменениях метаболизма лимфоцитов (Нарциссов Р.П., 1978, 1989; Захарова Л.Б., 1981, 1999; Робинсон М.В. с соавт.. 1986, 1994; Савченко A.A., 1996; Труфакин В.А. с соавт., 1997; Булыпш Г.В. с соавт., 1999; Buttgeriet F., 1991). Метаболизм клеток иммунной системы при недоношенности изучался преимущественно у недоношенных новорожденных (Валюлис А. Р., 1994; Болотокова P.A., 2005; Желев В.А., 2005; Ильина A.C., 2005). Между тем иммунологические взаимоотношения матери и плода формируются в рамках единой функциональной системы ,мать-плацента-гшод и нарушение нормальных взаимоотношений в этой системе могут явиться ведущим звеном в возникновении патологии беременности и различных нарушений у недоношенных новорожденных (Шабалов Н.П., 1987; Шишенко В.И., 1988; Гребепяк O.A., 2008).

В структуре причин неонаталыюй смертности, особенно при недоношенности, одно из ведущих мест занимает респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН) и ею последствия (Гармаева В.В., 2008; Кузьменко Г.Н. с соавт., 2009). В настоящее время достигнуты значительные успехи в профилактике и лечении РДСН, однако ожидаемого снижения смертности и осложнении при данном заболевании не произошло.

В литературе встречаются фрагментарные данные о причинах и механизмах развития РДСН (Коцарев О.С., 1989; Гилев А.И., 1995; Ларюшкина P.M.. 1997; Палнлова Л.А., 2001; Хижняк Д.Г. с соавт., 2007; Кузьменко Г.Н. с соавт., 2009). Некоторые авторы (Котова Н.В., 1985; Ларюшкина P.M. с соавт., 2000; Палнлова Л.Д., 2001) считают, что на течение и исход РДСН значительное влияние оказывает повреждение сурфактанта, которое может быть связано с усилением процессов перекиспого окисления липидов. Усиленный катаболизм липидов сурфактанта может быть связан с измененным функционированием лизосом, именно лизосомы ответственны за катаболические процессы в клегках, в том числе за гидролиз структурных фосфолипидов мембран клеток и сурфактанта (Панин Л.Е.. Маянская H.H., 1987; Шаронов A.C., 2007). Представляется актуальным изучение ферментативной активности клеток иммунной системы и линидного спектра мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных и их матерей для уточнения патогенетических аспектов развития недоношенности и РДСН.

Цель исследования: Определить у недоношенных новорожденных патогенетическую значимость изменений структурно-метаболических параметров клеток иммунной системы при разном гестационном возрасте и респираторном дистресс-синдроме. Задачи исследования:

1. Изучить метаболические параметры лимфоцитов и гранулоцитов в пуповинной крови недоношенных новорожденных с учетом гестанионного возраста и в венозной крови их матерей.

2. Исследовать спектр структурных липидов мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с разным, гестационным возрастом и у их матерей.

3. Изучить активность метаболических параметров, в том числе характеризующих активность лизосом, у недоношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом.

4. Определить особенности липидного спектра мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом.

5. Выявить корреляционную зависимость между активностью ферментов клеток иммунной системы и структурными липидами мембран лимфоцитов с учетом гестационного возраста у недоношенных новорожденных.

Научная новизна: Впервые снижение активности СДГ в клетках иммунной системы недоношенных новорожденных и их матерей рассматривается как следствие нарастающей иммунной супрессии при недоношенности.

Впервые изучен липидный спектр мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с разным гестационным возрастом и у их матерей, в сравнении с доношенными новорожденными; выявлены изменения в линидном бислое мембран, которые связаны с обогащением мембран холестерином, повышением процентного содержания ЛФХ, СМ и снижением ФХ по мере снижения гестационного возраста новорожденного.

Проведено изучение маркерного фермента лизосом лимфоцитов - кислой фосфатазы у недоношенных детей с РДСН. Обнаружено статистически значимое повышение активности кислой фосфатазы клеток иммунной системы у недоношенных детей с РДСН но сравнению с недоношенными без РДСН.

Впервые изучено содержание структурных лнпндов мембран лимфоцитов у недоношенных детей с РДСН, выявлено значительное нарастание процессов деполимеризации фосфатидилхолина мембран у недоношенных новорожденных при РДСН. Практическая значимость:

В результате проведенных исследований получены данные, позволяющие представить новую интерпретацию процессов формирования изменений метаболических параметров клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных, которые впоследствии могут влиять на состояние здоровья недоношенных детей.

Полученные данные о повышении функциональной активности лизосом при РДСН могут быть использованы для формирования комплекса лечебных мероприятий по снижению активности лизосомальных ферментов в процессе предупреждения и лечения РДСН. Внедрение в практику:

Результаты исследования внедрены в практику работы МУЗ «Родильный дом №2» (г.Красноярск), МУЗ «Родильный дом №5» (г.Красноярск). Основные положения работы используются в учебном процессе кафедры поликлинической педиатрии и пропедевтики детских болезней с курсом ПО ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенешсого Мииздравсоцразвития РФ». Основные положения, выносимые на защиту:

1. Однонаправленный характер изменений метаболических параметров клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных детей и их матерей рассматривается как проявление нарастающей супрессии иммунной системы при недоношенности.

2. Выявленные у недоношенных новорожденных показатели, свидетельствующие об усилении процессов деполимеризации фосфатидилхолина, являющегося основным структурным компонентом мембран клеток и сурфактанта, позволяют заключить, что дефицит сурфактанта у недоношенных новорожденных обусловлен не только незрелостью, но и нарастанием процессов ею деполимеризации.

3. Установлено повышение активности маркерного фермента лизосом у недоношенных новорожденных с РДСН, что свидетельствует о нарастании их функциональной активности; деполимеризация фосфатидилхолина в мембранных структурах может быть связана у недоношенных детей с РДСН с высокой активностью лизосом, содержащих ферменты, субстратом для катаболических процессов которых является фосфатидилхолин.

Личный вклад автора:

Лично шпором проведено планирование работы, поиск и анализ литературы по теме диссертации. Автором проведено обследование 104

новорожденных детей, у которых изучены особенности течения периода новорожденное™; и у 101 их матери, у которых изучены особенности анамнеза, характер течения настоящей беременности и исходы родов. В ходе сбора материала для диссертационной работы автором были проведены клинико-анамнестические, цитохимические, хроматографические и иммунологические методы исследования, позволяющие оценить структурно-метаболические параметры клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных и их матерей. Автором самостоятельно проводилось выполнение расчетов, обработка и анализ результатов, оформление диссертации и автореферата. Апробация материалов исследования:

Материалы диссертации доложены на: итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири (Красноярск, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-му юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИДОМ «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2006), на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы здравоохранения Сибири» (Красноярск, 2007), на XI межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008), на научно-практической конференции молодых-ученых «Актуальные вопросы здравоохранения Сибири» (Красноярск, 2008), на XII межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2009), на X Международном кошрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Публикации: Г1о теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 1 статья в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 165 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической характеристики обследованных групп, 4-х глав собственных исследований, заключения и списка литературы. Работа включает 35 таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 308 источников, из них 226 работ отечественных и 82 зарубежных акторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и меч оды исследования. В работу включены результаты обследования 205 человек, из них 104 новорожденных и 101 их мать, которые обследованы на базе родильного дома №2 г.Красноярска (главный врач Ковалевская О.И.) с 2003 но 2006год.

Для исследования отбирались здоровые новорожденные, родившиеся доношенными (38-40 недель гестации) ■- 39 детей и новорожденные, родившиеся недоношенными (28-36 недель гестации) 65 детей, у соматически здоровой матери.

11оворожденные, родившиеся недоношенными, были разделены на группы в соответствии с гсстационным возрастом. В первую группу вошли дет, родившиеся со сроком гсстатш 36-35 недель - 36 новорожденных (1 группа). Вторую группу составили 19 новорожденных с гсстационным возрастом 32-34 недели (2 группа). В третью группу (3 группа) вошли 10 новорожденных со сроком гестации 28-31 неделя. Все наблюдаемые матери были разделены на группы, в соответствии с распределением на группы их детей. Кроме того, среди всех недоношенных была выделена группа с РДСН (тяжелой степени) - 15 новорожденных.

Критерии включения новорожденных в исследование: гесташюнный возраст доношенных новорожденных 38-40 недель беременности, геегационный возраст недоношенных новорожденных менее 37 и более 28 недели беременности, родоразрешение через естественные родовые пути, новорожденные без врожденных пороков развития, новорожденные без показателей признаков воспаления в общем анализе крови и биохимических анализах, новорожденные без клинических признаков местной гнойно-воспалительной патологии, новорожденные без генетической патологии. Критерии исключения новорожденных в исследование: клинические и лабораторные признаки патолог ического процесса у новорожденных, течение беременности с клиническими и лабораторными данными, свидетельствующими о течении инфекционного процесса у матерей, соматические заболевания матери до и во время беременности, течение беременности у матерей с обострениями хронических очагов инфекции различного генеза.

На каждого наблюдаемого новорожденного ребенка была заведена специально разработанная анкета, в которой были отражены основные анамнестические данные, характеризующие особенности состояния здоровья родителей, течение предыдущих и настоящей беременности, особенности течения беременности и родов. Учитывались данные клинического осмотра, отражающие общее состояние новорожденного.

Исследование ферментного статуса, спектра нейтральных липидов и фосфолипидов в клетках иммунной системы у новорожденных изучалось в пуповинной крови новорожденных, у матерей те же параметры определялись в венозной крови. Выделение лимфоцитов для последующею определения спектра липидов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографин по методу Л. Boyum (1968). Активность сукципатдегидрогеназы (СДГ) определяли по методике Р.П. Нарциссова (1969). Кислая фосфатаза в лимфоцитах (КФД) и в фапулоцитах (КФГ) выявлялась по методу A. F. Goldberg, 'Г. Barka(I962) с использованием нафтола As-E-фосфата.

Спектр нейтральных липидов и фосфолипидов изучали методом тонкослойной хроматографии (Ростовцев В.Н., Резник Г.Е., 1982). В сыворотке пуповинной крови новорожденных и венозной крови их матерей исследовали содержание иммуноглобулинов класса А, М, G, методом радиальной иммунодиффузии (Mancini L. et а!., 1965).

Исследования одобрены на заседании этического комитета НИИМГ1С СО РАМН. Протокол обследования новорожденных детей и их матерей соответствовал этическим стандартам и был разрешен комитетом по биомедицинской этике НИИМПС СО РАМН.

По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel была сформирована база данных, на основе которой с помошыо пакетов прикладных программ программ Stalistica 6.0, Primer of Biostatistics Version 4.03 by Stanton A. Glantz производился статистический анализ. Нормальность распределения определяли с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Для выборок с нормальным распределением определяли среднее арифметическое значение (М), ошибку средней арифметической (m). Для выборок с распределением, отличных от нормального, определяли медиану (Ме) и нижний и верхний квартили (С25-С75). Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью критерия Т-Стыодента в случае нормального распределения и Манна-Уитни в случаях распределения, отличных от нормального. Сравнение групп с качественными признаками проводилось с использованием теста «¡(.-квадрат». Для качественных данных осуществлялось вычисление доверительного интервала. Связь между отдельными признаками исследовалась при помощи корреляционного анализа. Оценивалась парная корреляционная зависимость (по Спирмену) каждого параметра по значению коэффициента корреляции г. Достоверность коэффициентов корреляции и различий принимали при р<0,05. При значении коэффициента корреляции г>0,75 связь между признаками расценивалась как сильная, при коэффициенте 0,25<г<0,75 - зависимость средней силы, и при значении г<0,25 - слабая степень корреляции между признаками (Реброва О. IO., 2002).

Результаты исследования и их обсуждение

Возраст матерей во всех группах недоношенных новорожденных не имел статистически значимых отличий и составил в среднем 24 [20:28] года. При изучении акушерского анамнеза обращает на себя внимание то, что в группе доношенных новорожденных первородящих - 61,5% [95% ДИ: 46-75] и первоберсменых - 56,4% [95% ДИ: 41-71] матерей было почти равное количество, в то время, как в группе недоношенных новорожденных первородящих матерей - 48,3% [95% ДИ: 36-59] было в два раза больше, чем нервобеременных - 28,5% [95% ДИ: 18-39], разница статистически значима (р<0,05). При анализе данных признаков у матерей, родивших новорожденных с разным гестационным возрастом, прослеживается снижение количества первобеременных матерей с уменьшением срока гестации, особенно у матерей, родивших новорожденных третьей группы (р<0,05). У матерей в группе недоношенных новорожденных выявлено значительное количество женщин с медицинскими абортами в анамнезе (более одного), в сравнении с матерями, родившими доношенных детей (р<0,05): 28,2% [95% ДИ: 16-44] жешшш, родивших доношенных детей, имели в анамнезе медицинский аборт, у 7,6 % из них имели от 1 до 5 мед.абортов; в группе матерей, родивших недоношенных детей, медишшскнй аборт имели 56,5% [95% ДИ; 45 68] женщин, у ¡5,6 % из

них имелось от 1 до 10 мед.абортов. У матерей, при сравнении контрольной группы с группами недоношенных с разным геетационным возрастом, выявлено увеличение количества абортов во всех трех группах, особенно у матерей, родивших недоношенных новорожденных третьей группы (р<0,05). У матерей, родивших недоношенных новорожденных, чаще (р<0,02) фиксировалось дородовое излитие околоплодных вод - 59,2% [95% ДИ: 51-74], в сравнении с матерями, родивших доношенных детей - 20.5%[95% ДИ: 11-35].

Показатели физического развития недоношенных детей (масса тела, длина тела, окружность головы, окружность груди) находились в широких пределах и зависели от гестационного возраста: чем меньше срок гестации, тем меньше физические параметры новорожденного.

Состояние доношенных новорожденных (рис.1) было оценено как удовлетворительное, или близкое к нему у 32 новорожденных 82,05% [95% ДИ: 67-91], средней степени тяжести - у 7 детей (17,94% [95% ДИ: 9-32]. В отличие от доношенных, среди недоношенных новорожденных в удовлетворительном состоянии было всего 2 ребенка - 3,1% [95% ДИ: 1-10], средней степени тяжести - 32 новорожденных - 49,2% [95% ДИ: 37-61] и почти у половицы недоношенных состояние было тяжелым - 47,6% [95% ДИ: 36-59].

Состояние доношенных новорожденных

17,9

82,1

□ удовле! верительное Q средней степени тяжести

47,7

Состояние недоношенных новорожденных 3,1

49,2

□ yiou.ie i ворителъное

□ средней степени гяжестн

□ iяжглос

Рис.1 Состояние доношенных и недоношенных новорожденных (%)

Тяжесть состояния в основном была обусловлена геетационным возрастом ребенка, наличием РДСИ, острой дыхательной недостаточностью шуиго-диффузного и смешанного генеза, неврологической симптоматикой.

В результате проведенных исследований метаболических параметров клеток иммунной системы в пуповинной крови у недоношенных новорожденных, по сравнению с доношенными новорожденными, выявлено значительное статистически значимое снижение активности СДГ (р<0,001) (табл. 1). Эти закономерности были установлены и другими исследователями, но изучение метаболических параметров лимфоцитов часто проводилось только у ребенка (Даурова И.Г., 1985; Никулин Л.Д. с соавт.. 1999; Желев В.А., 2005). Авторы расценивали Обнаруженные изменения (снижение активности

СДГ), как проявление испытываемой недоношенным ребенком гипоксии, плацентарными нарушениями и патологией родов, а также отражением сниженных возможностей иммунитета.

Нами была исследована активность СДГ в нимфоцетах крови не только у недоношенных детей, но и у их матерей (табл. 2). Это позволило установить, что и у матерей, родивших недоношенных детей, активность СДГ также была статистически значимо снижена по сравнению с матерями, родившими доношенных детей.

Таблица 1

Активность ферментов в лимфоцитах и гранулоцитах пупошшной крови доношенных и недоношенных детей

Исследуемый параметр

СДГ __(гращл/кл)_

КФЛ

(ед.Кар!о\у)

КФГ (ед. Кар1о\у)

1 .... \ Доношенные ! новорожденные (п—39) Недоношенные новорожденные (и 63) Статистическая ; значимость различий ! (Р) !

| 9,6 [6.07'. 13.37] 5,1 [3.07:8.73] р-•(!.!)()! !

1 100(82:132] ! 132 [68:226] р<0,001 I

| 158 [110:170] 1 178 [104:270] р-0,009 г !

Примечание: Сравнение показателей осуществлялось при помощи вычисления медианы (Ме) с указанием иптеркваргильно!о размаха (С25-С75) и оцениваюсь по критерию Манна-Уитии.

Известно, что при нормально протекающей беременности формируется толерантность иммунной системы материнского организма, усиливается супрессия, изменяется баланс цитокинов (Черных Е.Р. с соавт., 2004). Функциональная активность лимфоцитов при беременности угнетается. При недоношенной беременности нами было обнаружено статистически значимое (р~0,001) снижение активности СДГ в клетках иммунной системы у матерей, родивших недоношенных, по сравнению с матерями, родивших здоровых доношенных детей. Это согласуется с данными авторов, которые сообщают об обнаружении нарастающего угнетения клеточного иммунитета матери при патологии беременности, в том числе при привычном невынашивании беременности (Никитин А.И.. Сельков С.А., 1992; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003).

Таким образом, очень низкий уровень активности СДГ у матерей, родивших недоношенных детей, по сравнению с женщинами, родившими доношенных дстей, может отражать значительное снижение у них процессов обеспечения энергией клеток иммунной системы, следовательно и снижение их функциональной активности, происходящей за счет нарастания супрессии, которая переходит допустимый уровень, обеспечивающий нормальное протекание беременности, когда происходит не отторжение, а вынашивание плода, являющегося наполовину "аллотрансплантатом.

Полученные данные позволяют предполагать, что низкие показатели активности сукцинатдегидрогеназы у недоношенных детей могут быть обусловлены нарушением иммунных взаимоотношений между матерью и плодом при недоношенной беременности, связанными е.нарастанием процессов иммуносупрсссии.

Таблица 2

Активность ферментов в лимфоцитах и гранулоцитах венозной крови у

матерей, родивших доношенных и недоношенных детей

Исследуемый Родившие доношенных (п=39) Родившие недоношенных (п=62) Статистическая значимость различий (р)

параметр

СДГ (грану л/кл) 3,37 [2,33:6,03] 2,17 [1,43:3,47] р-0,001

КФЛ (ед.Кар1о\у) 124 [100:150] 166(120:190] р<0,001

КФГ (ед.Кар1о\у) 157 [136:180] 178 [140:220] . р—0,035

Примечание: Сравнение показателей осуществлялось при помощи вычисления медианы (Ме) с указанием шперквартильиого рашаха (С25-С75) н оценивалось по критерию Манна-Уитни.

Так как при недоношенной беременности имеются нарушения иммунных взаимодействий между матерью и плодом (Брагина Л.Б., 2000; Сухих Г.'Г., Ванько Л.В., 2003; ВППг^он \V.D-, 1989), отражением этих нарушений, (в том числе регуляторных воздействий) могут быть выявленные нами изменения метаболических параметров клеток иммунной системы при рождении недоношенного ребенка.

Подтверждает это представление отсутствие статистически значимой разницы активности СДГ между группами недоношенных новорожденных с разным гестаиионным возрастом (табл.3).

Разница обнаружена нами только при сравнении каждой из групп недоношенных детей с доношенными детьми (рис.2), в то время, как показатели активности СДГ в разных группах недоношенных детей статистически значимо не отличались между собой.

Это может свидетельствовать о том, что активность ферментов в клетках иммунной системы у недоношенных детей определяется не столько сроком гестации, сколько связана с проблемой недоношенности, как таковой, которая, в свою очередь, может быть обусловлена нарушением иммунных взаимоотношений между матерью и плодом. Еше одно подтверждение этому представлению получено при анализе корреляционных связей активное™ ферментов клеток иммунной системы, между матерью и новорожденным. При доношенной беременности фиксируются прямые, достоверные корреляционные связи между матерью и новорожденным для всех изученных ферментов клеток иммунной системы (СДГ, КФЛ, КФГ). В то время как при недоношенной беременности имеется лишь одна прямая достоверная корреляционная связь

между показателями матери и ребенка (для КФГ). Причем эта закономерность прослеживается во всех группах недоношенных новорожденных.

сдг

Ш Доношенные □Недоношенные 3 группы

Полученные результаты, по-видимому, следует учитывать при анализе механизмов формирования особенностей метаболических параметров клеток иммунной системы у недоношенных детей.

Выявленное нами статистически значимое повышение КФ гидролитического фермента лизосом, характеризующего кагаболические процессы в клетке, в лимфоцитах (р<0,001) и гранулоцитах (р-0,009) у недоношенных новорожденных, по сравнению с доношенными, свидетельствует о значительной активации лизосомапьного аппарата клеток крови у детей, рожденных раньше срока (табл.3). Особенно высокая активность кислой фосфатазы регистрировалась нами у детей третьей группы.

У матерей, родивших недоношенных новорожденных, нами также обнаружено статистически значимое повышение активности КФ в лимфоцитах (р<0,001) и гранулоцитах (р~0,035) венозной крови по сравнению с показателями, выявленными у матерей, родивших доношенных детей (табл.2, табл.4). То есть, изменение метаболических параметров клеток иммунной

системы при недоношенной беременности носит однонаправленный характер у недоношенных детей и у их матерей.

Таблица 3

Активность ферментов в лимфоцитах и гранулоцитах пуповинной крови новорожденных с разным гестационным возрастом

Обследованные группы СДГ (гран./кл.) КФЛ (ед.Кар!ош) КФГ (ед.Кар!о\^)

Доношенные (п^39) (контрольная группа) 9,6 [6,07:13.37] 100 [82:132] 158 [110:170]

Недоношенные 1 группа (п=3б) 5,16 [3,13:9,15] р,<0,001 125 [110:160] ^ рк<0,001 165 [130:210]

Недоношенные 2 группа (П--19) 5,17 [2,71:7,23] рк-0,001 134 [92:184] рк=0,005 178 [162:232] р^-0,007

Недоношенные 3 группа(п=10) 4,43 [3,07:6,83] Рк =0,002 172 [124:202] рк<0,001 187 [170:208] Рк~0,023

Примечание: Сравнение показателей осуществлялось при помощи вычисления медианы (Мс) с указанием интеркваршлыюго размаха (С21-С7?) и оценивалось но критерию Маниа-Уитни. рк- различия относительно контрольной группы

Таблица 4

Активность ферментов в лимфоцитах и гранулоцитах венозной крови матерей, родивших недоношенных детей с разным гестанионным возрастом

Обследованные группы СДГ (гран/кл.) КФЛ (ед.Кар1оуу) КФГ (сд.Кар1оиг)

Родившие доношенных (п=39) (контрольная группа) 3,37 [2,33:6,03] 124 [100.150] 156 [134:180]

Родившие недоношенных 1 группа (п=36) 2,47 [1,57:3,9] рк=0,017 ¡65 [1 12:190] рк,Д008 174 [140:206]

Родившие недоношенных 2 группа (п= 19) 2,25 [1,57:3,2] рк=0,016 156 [128:180] рк-0,017 200 [130:222] рк=0,087

Родившие недоношенных 3 группа (п=10) 1,38 [0,87:3,8] РкД009 ¡89 [140:218] рк-0,002 188 [168:228] Рк-0,013

Примечание: Сравнение показателей осуществлялось при помощи вычисления медианы (Ме) с указанием иитерквартильною размаха (С?? -С75) и оценивалось по критерию Мапна-Уитнн р„ - различия относительно кошролыгой группы

Считается, что сочетание низкой активности СДГ - наиболее информативною показателя состояния метаболизма и энергообеспечения клеток и высокой активности КФ - фермента, отражающего катаболические

процессы в клетке и функциональную активность лизосом, является показателем неблагоприятного состояния метаболизма клеток иммунной системы, свидетельствующем о нарушении энергетического гомеостаза клеток и тканевого дыхания и нарушении функциональной активности клеток (Терновская В.А., 1977).

Анализируя содержание фракции свободного холестерина и общих фосфолипидов в мембранах лимфоцитов иуповинной крови у доношенных и недоношенных детей, нами выявлена тенденция к снижению общих фосфолипидов и повышению свободного холестерина в группе недоношенных детей (табл.5).

Таблица 5

Содержание нейтральных липидов и фосфолипидов мембран лимфоцитов

в пуповинной крови у доношенных и недоношенных детей

Ед.изм. Липидный снектр Доношенные новорожденные (п=19) Недоношенные новорожденные (п=31)

% от структурных липидов ОФЛ 38,48 [34,63:43,60] 34,36 [31,25:41,30]

СХ 61,51 [56,39:65,36] 65,63 [58,70:68,75]

Огн.ед. ОФЛ/СХ 0,62 [0,53:0,77] 0,52 [0,45:0,70]

% от ОФЛ ЛФХ 1,05 [0.80:1,56] 1,62 [1,05:2,38] р—0,014

см 7,01 [6,24:8,10] 9,20 [7,30:12,34] р-0,01

ФХ 50,50 [47,40:52,79] 47,50 [44,60:51,00]

ЛОФР 39,00 [33,80:43,16] 38,60 [27,65:42,10]

Огн.ед. СМ/ФХ 0,14 [0,12:0,16] 0,19 [0,15:0,25] р-0,001

Примечание: Сравнение показателей осуществлялось при помощи вычисления медианы (Мс) с указанием иптерквартильного размаха (С.ч-Оз) и оценивалось по критерию Манна-Уитни. В таблице не приводится содержание фракции неидентифшшрованных фосфолипидов.

Исследовав соотношение свободного холестерина и общих фосфолипидов (ОФЛ/СХ) в мембранах лимфоцитов у недоношенных новорожденных с разным гесгационным возрастом, нами также обнаружены данные, свидетельствующие о повышении содержания свободного холестерина и снижении обших фосфолипидов по мере снижения срока гестации. Эти данные свидетельствуют о накоплении холестерина в мембране, нарушении ассиметричности расположения липидов, повышении жесткости мембран лимфоцитов у недоношенных детей по мере снижения срока гестации. Стерическая форма холестерина такова, что она способствует возрастанию плотности упаковки фосфолипидов. Поэтому нарастание содержания

холестерина повышает микровязкость (жесткость) мембраны (Клейменов Д.Я., Данилко Е.Д., 2007).

Значительные изменения выявлены нами при анализе соотношения различных фракций общих фосфолшшдов. У недоношенных новорожденных (в первой, второй н третьей группе) фиксируется увеличение содержания сфингомиелина (СМ) по сравнению с доношенными детьми, особенно высокие показатели выявлены у детей в третьей группе, они почти вдвое превышают значения полученные в группе доношенных новорожденных Ср—0,004). Выявленное нами статистически значимое повышение процентного содержания фракции сфингомиелина (СМ) в мембранах лимфоцитов пуповинной крови, как при сравнении между доношенными и недоношенными детьми, гак и в группах недоношенных новорожденных по мере снижения гестационного возраста, указывает на повышение жесткости мембран лимфоцитов. СМ - самый насыщенный фосфолипид, особенностью структуры которого являются внутримолекулярные водородные связи, придающие мембранам значительную жесткость (Крепе Е.М., 1981; Соловей Л.И., Манчук В.Т., 1996), что отражается на функциональной активности клеток. Эти данные совпадают с показателями индекса ОФЛ/СХ, приведенными выше, которые также свидетельствуют о нарастании жесткости мембран лимфоцитов пуповинной крови у недоношенных новорожденных.

Повышение содержания СМ оценивается авторами неоднозначно. С одной стороны СМ стабилизирует мембраны клеток, повышает их устойчивость. С другой - накопление СМ неизбежно ведег к повышению микровязкости, ригидности мембран, что отражается на функциональной активности клеток (Крепе Е.П., 1981). Известно, что в процессах миединизашш нервной системы принимают участие фосфолипиды (Юрков Ю.А. с соавт., 1980). В то же время, Е.М. Васильева с соавт. (2002) сообщают о том, что у детей с детским церебральным параличом и другими неврологическими нарушениями в мембранах эритроцитов обнаруживается повышенное содержание сфингомиелина. Имеются данные, свидетельствующие о том, что повышение продукции СМ играет важную роль в патогенезе различных заболеваний ЦНС (Новицкий В.В. с соавт., 1999; Spragno С. С., Шскоп-Вюк Э. Ь., 1999). Так что, выявленное нами повышенное содержание СМ в мембранах клеток иммунной системы у недоношенных детей, в дальнейшем может сказываться на предрасположенности к функциональным нарушениям ЦНС.

При изучении в мембранах лимфоцитов пуповинной крови содержание фосфатидилхолина (ФХ) - основного фосфолигшда мембранных структур, выявлено его снижение у недоношенных новорожденных, но сравнению с доношенными. Особенно значительное и статистически значимое снижение ФХ фиксируется у новорожденных третьей группы по сравнению с доношенными детьми (р~0,016). В то же время на фоне снижения ФХ отмечается повышение содержания ЛФХ в мембранах лимфоцитов пуповинной крови у недоношенных детей во всех группах, особенно у /1е1ей в третьей группе по сравнению с контрольной группой (р-0,004). ЛФХ - продукт реакции гидролитическою

расщепления ФХ, появление которого связано с активацией фосфолипазы Аг (Ушакова С.А., 1995; Сальникова E.H., 2006; CondreaE. 1980).

Таким образом, у недоношенных новорожденных фиксируется более активное образование лизоформы фосфатидилхолина. Именно с этим может быть связано снижение содержания фосфатидилхолина у недоношенных детей. Лизофосфатидилхолин обладает значительным литическим действием и является сильным детергентом; накапливаясь в мембранах, изменяет фазовое состояние мембран, снижает стабильность клеток, приводя к фосфолипазному мембранолизу (Климов E.H. с соавт., 1999). Известно, что значительное накопление ЛФХ дестабилизирует мембраны, что приводит к их разрушению (фосфолипазный мембранолиз), так как при этом возможен переход липидного бкслоя в монослой с нарушением проницаемости мембран для ионов натрия и калия, образование гидрофильных каналов, ведущих к разобщению свободного и окислительного фосфорилирования, а также к активизации лизосомальиых ферментов (Лыкасов А.Г., 1991). Высокий уровень ЛФХ может способствовать нарастанию нестабильности мембран клеток. Возможно, отмеченное выше повышение содержания трудноокисляемой фракции фосфолипидов -сфингомиелпна (СМ) у недоношенных новорожденных является компенсаторным, предотвращающим дестабилизацию мембран.

При изучении корреляционных связей выявлено повышение количества как положительных, так и отрицательных корреляций у недоношенных новорожденных, особенно в 3 группе. Такая особенность корреляционных взаимосвязей огражаег высокую интенсивность и напряженность обменных процессов в клетке у недоношенных новорожденных по мере снижения гестационного возраста.

У матерей, родивших недоношенных детей, по сравнению с группой матерей, родивших доношенных детей, выявляются те же тенденции, что и у новорожденных. Но разница между сравниваемыми группами матерей (в отличие от показателей у новорожденных детей) статистически не значима.

В неонатальном периоде патология органов дыхания является самой частой причиной смерти новорожденных детей (81.7% случаев по данным Демьяновой Т.Г., 2005). К наиболее тяжелой форме патологии органов дыхания у недоношенных новорожденных относится респираторный дистресс-синдром (РДСН) и его последствия (Рюмина И.И., 1996; Шабалов Н.П., 2004; Хижняк Д.Г. с соавт., 2007; Кузьменко Г.Н. с соавт., 2009). Выживаемость новорожденных с РДСН сопровождается физической, интеллектуальной и эмоциональной неполноценностью, определяющей в дальнейшем повышение частоты инвалидизации и ухудшение качества жизни.

В настоящее время, концепция о том, что патогенетической основой респираторного дистресс-синдрома является структурно-функциональная незрелость системы сурфактанта, связанная со сроком гесгационного возраста, остается ведущей. Некоторые авторы (Коцарев О.С., 1989; Палилова Л.А., 2001) считают, что в течении и исходе РДСН большую роль играет повреждение сурфактанта, которое может быть связано с его инактивацией в перинатальный период. Полагают, что при РДСН большое значение имеет

активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) иод воздействием токсических радикалов кислорода (Палилова Л.А., 2001). В го же время можно предполагать, что усиленный катаболизм липидов сурфактанта может быть связан не только с ПОЛ и гипоксией, но и с измененным функционированием лизосом. Известно, что именно лизосомм ответственны за катаболические процессы в клетках. Маркерным ферментом лизосом является кислая фосфатаза (Панин Л.К., Маянская H.H., 1987; Шаронов A.C., 2007).

При сравнении активности кислой фосфатазы у недоношенных с РДСН и у недоношенных без РДСН ( табл.6), нами выявлено повышение активности КФ в лимфоцитах пуповинной крови у недоношенных детей с РДСН, причем разница статистически значима (р<0,001). Изучение активности КФ в гранулоцигах пуповинной крови также выявило статистически значимое повышение КФГ у новорожденных с РДСН, в сравнении с новорожденными без РДСН (р-0,015).

Анализ активности кислой фосфатазы в лимфоцитах еснозной крови матерей выявил повышение активности этого фермента у матерей, родивших детей с РДСН, по сравнению с матерями, родивших детей без РДСН, хотя разница не достигает статистической значимости. Разница активности кислой фосфатазы в гранулоцитах у матерей, родивших новорожденных с РДСН была статистически значима (р-0,025) по сравнению с активностью этого фермента у матерей, родивших детей без РДСН. По данным литературы выявление повышенного содержания лизосомалыюго фермента в лимфоцитах и гранулоцитах является ранним и весьма чувствительным тестом, свидетельствующим об усилении катаболнчсских процессов и патологических изменениях в клетках и тканях (Маянская H.H. с соавт., 2001).

Таблица 6

Активность ферментов в клетках иммунной системы пуповинной крови

недоношенных детей осзРДСН и недоношенных детей с РДСН

.... ,, ■ Статистическая

Исследуемый Недоношенные Недоношенные с

параметр без РДСН РДСН

СДГ

(гранул/кл.)

КФЛ (ед.К.ар!оуу)

КФГ (ед.Кар1о\у)

5,10 [3,20:9,13J

_(п~49) _

"102 [78:126]

(п-47)__

160 [124:212] (п-~47)

5.10 [2,87:7,13] (п~15) __ 176 [124:198] (п-Ц)_

значимость различий (р)

р<0,001

194 [172:236]

р--0,015

Примечание: Сравнение показателей осущест влялось при помощи вычисления медианы (Ме) с указанием интерквартального размаха (С¡у С») и оценивалось по критерию Манна-Уитпи.

При сравнении активности фермента СДГ лимфоцитов пуповинной крови у недоношенных новорожденных с РДСН не выявлено статистической разницы а сравнении с активностью у новорожденных без РДСН (табл.6). У матерей, родивших недоношенных с РДСН, прослеживается та же тенденция, что и у новорожденных.

Считается, что важнейшей причиной развития РДСН являются нарушения в системе сурфактанта. Значительная роль в организации и функционировании мембран, отводится липидному бислою, основу которого составляют фосфолипиды (МусилЯ., 1985; Killian J.A. et al., 2001; Pomorski Г., et al., 2001). При исследовании липидного спектра мембран клеток иммунной системы в пуповинной крови у недоношенных с РДСН по сравнению с недоношенными без РДСН достоверные отличия выявлены для ФХ и ЛФХ (рис.3). Нами зарегистрировано статистически значимое снижение ФХ в мембранах лимфоцитов у недоношенных детей с РДСН (р-0,043), по сравнению с группой новорожденных без РДСН. ФХ составляет основу липидных, компонентов мембран в организме, в том числе и сурфактанта (Таганович А.Д., 1992; Wright J. R., Hawgood S., 1989; Jobe A., 1992)- В то же время содержание ЛФХ у недоношенных с РДСН было почти вдвое выше, чем у недоношенных без РДСН (р=0,026). Эти данные свидетельствуют об усилении процессов деполимеризации ФХ в мембранах и накоплению ЛФХ -продукта гидролиза фосфолипидов, прежде всего ФХ, поскольку известно, что ЛФХ является лизоформой ФХ (Клейменов Д.Я., 2007).

р=0,043

•к р=0,026

'2,4 if

м] j

ч

Рис.3 Содержание ФХ и ЛФХ в мембране лимфоцитах пуповинной крови у недоношенных новорожденных без РДСН и с РДСН (показатель медианы) Н Недоношенные Недоношенные : §1 без РДСН___I с РДСН

Мембраны в организме построены по единому принципу. Следовательно, можно предполагать, что при РДСН, также и в сурфактанте, строение которого соответствует мембранам клеток, происходят те же процессы, которые выявлены нами в лимфоцитах, а именно - деполимеризация ФХ, что может приводить к деструкции сурфактанта, поскольку известно, что на долю ФХ приходится 66% среди всех структурных компонентов, составляющих сурфактант. Если учесть, что ФХ основной структурный компонент сурфактанта, то можно считать, что нарушение строения сурфактанта.

способствующее развитию РДСН, в значительной мере связано с деструкцией сурфактанта, а не только с незрелостью.

Повреждение сурфактанта при РДСН у недоношенных новорожденных связывают с гипоксией, которая приводит к активации процессов ПОЛ и повышению активности фосфолиназ (Палилова Л.А., 2001). Однако S.T. Horvvis с соавт. (1964), изучая группу новорожденных, перенесших в перинатальном периоде асфиксию (тугое обвитие пуповины вокруг шеи), не обнаружили учащения РДСП и подвергли сомнению его связь с гипоксией. J. S. Greenspan в 1988г. обратил внимание на парадоксальный феномен: при пеосложненнон беременности легкие созревали примерно к 35 неделе антенатального развития (в 88% случаев), тогда как у 65% детей родившихся на 26 неделе легкие сразу после рождения функционировали нормально. Таким образом, имеются исследования не подтверждающие высокую значимость гипоксии в развитии РДСН у новорожденных (Валюлис А.Р., 1994).

В 1993 I.achman В., обобщая многолетний опыт применения сурфактанта, резюмировал, что смертность от РДСН в течение 20 лет не изменилась и составила 50-60%. Усилия по замене сурфактанта, снижению активности ПОЛ, повышению антиоксидантной защиты, нормализации гемостаза и т.д. не привели к ожидаемому снижению РДСН и смертности новорожденных.

По-видимому, имеет смысл обратить внимание также и на другие факторы, которые могут иметь значение в патогенезе развития респираторного дистресс-синдрома у новорожденных, в том числе выявленное нами повышенное функциональное состояние лизосом, (в частности активация маркерного фермента - КФ), р. значительной мере определяющих деполимеризацию макромолекул, к которым относится и фосфатидилхолин. составляющий основу фосфолипидной фракции сурфактанта.

Целесообразно подключать медикаментозные средства, снижающие активность лизосом, для профилактики и лечения РДСН. По данным литературы, назначение глюкокортикоидов в качестве профилактики при угрозе преждевременных родов, снижает риск развития РДСН (Ковалевская О.И., 2004). По последним данным (Самсыгина Г.А., 2009), глкжокортикоидную терапию при РДСН рекомендуется подключать в основном при дополнительных осложнениях (острой почечной недостаточности, шоке и др.). Полученные нами данные могут способствовать расширению представлений о спектре показаний к назначению кортикостероидов и других медикаментозных средств, которые, как сообщается в литературе (Шаронов А.С., 2007), обладают способностью стабилизировать мембраны лизосом и тем самым снижать их функциональную активность.

Подводя итог проведенным исследованиям, можно заключить, что снижение активности СДГ у недоношенных новорожденных может быть связано не только с гипоксией, как это представлялось ранее, но может отражать снижение функциональной активности клеток иммунной системы, обусловленное нарастающей супрессией иммунной системы при недоношенности.

Кроме того, выявленные изменения спектра липидов мембран клеток (повышение содержания лизоформы фосфатидилхолина и снижение содержания фосфатидилхолина, являющегося основой не только мембран клеток, но и мембраноподобной структуры сурфактанта), свидетельствуют в пользу представлений о значительном нарастании процессов деполимеризации мембран и мембраноподобных структур, в том числе и сурфактанта, у недоношенных новорожденных, особенно при РДСН.

При РДСН обнаружена высокая активность маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы у недоношенных новорожденных, свидетельствующая о повышении функциональной активности лизосом, ферменты которых осуществляют деполимеризацию макромолекул, в том числе фосфатидилхолина. Полученные данные могут способствовать формированию дополнительных представлений о роли лизосом в развитии РДСН у недоношенных новорожденных.

ныводы

1. У недоношенных новорожденных выявлено статистически значимое снижение активности СДГ в лимфоцитах и повышение активности КФ в лимфоцитах н гранулоцитах пуповинной крови по сравнению с доношенными новорожденными. Подобное сочетание изменений показателей энергетических и катаболических процессов в клетке свидетельствует о неблагоприятном состоянии энзиматической активности клеток иммунной системы крови у недоношенных детей.

2. У матерей, родивших недоношенных детей, наблюдались те же закономерности изменений метаболических параметров клеток иммунной системы, которые были выявлены у недоношенных детей: статистически значимое снижение активности СДГ в лимфоцитах и повышение активности КФ в лимфоцитах и гранулоцитах венозной крови по сравнению с матерями, родивших доношенных детей, что может быть обусловлено нарастанием супрессии иммунной системы при недоношенности.

3. Не обнаружено статистически значимой разницы активности ферментов СДГ, КФЛ и КФГ в клетках пуповинной крови при сравнении групп недоношенных новорожденных с разным гестационным возрастом между собой. Это свидетельствует о том, что активность ферментов в клетках иммунной системы у недоношенных детей не столько зависит от срока гесташш, сколько связана с развитием процессов, приводящих к недоношенности.

4. Соотношение структурных липидов мембран лимфоцитов пуповинной крови у недоношенных детей отличается от показателей у доношенных детей статистически значимым повышением содержания СМ и ЛФХ и снижением содержания ФХ по мере снижения гсстационного возраста, особенно у недоношенных в третьей группе.

5. У матерей, родивших недоношенных детей, не обнаружено статистически значимых отличий в соотношении структурных компонентов мембран лимфоцитов по сравнению с матерями, родивших доношенных детей.

6. Выявленное в лимфоцитах крови у новорожденных с РДСН статистически значимое повышение активности маркерного фермента лизосом - КФ и снижение содержания ФХ - основного структурного компонента мембран клеток и сурфактанта. являющегося субстратом для лизосомальных ферментов, свидетельствует о вовлечении лизосом в патогенетические процессы развития респираторного дистресс-синдрома новорожденных.

7. Выявлено нарастание количества корреляционных связей между активностью ферментов клеток иммунной системы и структурными липидами мембран лимфоцитов по мере снижения гесгационного возраста у недоношенных новорожденных.

Практические рекомендации

1 .Рекомендуется контроль за снижением активности СДГ в лимфоцитах крови недоношенных новорожденных, которое в . дальнейшем может определять снижение функциональных возможностей клеток иммунной системы.

2.При диагностике степени тяжести и при прогнозе развития РДСН рекомендуется определять активность важнейшего фермента маркерного фермента лизосом - КФ в лимфоцитах ну повинной крови у недоношенных новорожденных.

3.При проведении лечебных мероприятий при РДСН рекомендуется обратить внимание на целенаправленное использование препаратов, способствующих снижению функциональной активности лизосом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фефелова, В.В. Метаболизм иммунокомпетентных клеток при перинатальном поражении ЦНС в свете нейропммунных взаимодействий /В.В. Фефелова, Т.В. Манчук, Н.В. Лисихина//'Метаболические механизмы иммунореактивности: матер, всерос. науч.-практ. конф.-Красноярск, 2004.-С. ) 02-103.

2. Изменение активности ферментов иммунокомпетентных клеток у матерей и новорожденных детей при преждевременных родах /В.В. Фефелова, Н.В. Лисихина, Л.Л. Нагирная, С.Ю. Скобелева //Дни иммунологии в Сибири: матер, всерос. науч.-пракг. конф., посвяш. 15-му юбилею Краснояр. Краев. Центра по профилактике и борьбе со СПИДОМ и др. инфекционными заболеваниями,- Красноярск, 2005.--С. 116-117.

3. Течение беременности и активность сукцинатдегидрогеназы в иммунокомпетентных клетках у недоношенных детей и их матерей /11.В. Лисихина, В.В. Фефелова, Л.А. Нагирная, С.Ю. Скобелева //Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири: матер, итог, науч.-практ. конф). с междунар. участием. Красноярск, 2005. - С.308-309.

2.1

4. Активность кислой фосфатазы в лимфоцитах и гранулоцитах пуповинной крови у недоношенных детей /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова, Л.А. Нагирная, О.И. Ковалевская //Здоровье и образование в XXI веке: матер. VII междунар. науч.-практ. конф.-М., 2006. -С.304-305.

5. Лисихина, Н.В. Уровень иммуноглобулинов в пуповинной крови у недоношенных новорожденных с разной степенью недоношенности /Н.В. Лисихина // Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири: матер, итог, науч.-цракт. конф.- Красноярск, 2007.-С.286-287.

6. Активность ферментов лимфоцитов пуповинной крови недоношенных детей с разным гестационным возрастом /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова, Л.А. Нагирная, С.Ю. Скобелева II Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири: матер, итог, науч.-практ. конф - Красноярск, 2007. -C.I07-109.

7. Сравнительный анализ метаболических параметров иммунокомпетентных клеток крови у недоношенных новорожденных и у их матерей / Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова, В.Т. Манчук и др. //Сиб. мед. журн.-2007.-Лг25-C.59-6I.

8. Лисихина, Н.В. Липидный спектр мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных в зависимости от степени недоношенности /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова //Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: матер. 6-й науч.-практ. конф. молодых ученых,- Красноярск, 2008.-С.64-66.

9. Лисихина, Н.В. Нейтральные липиды и фракции фосфолипидов лимфоцитов крови у недоношенных детей /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова //Актуальные проблемы медицины: матер. XI межрегион, науч.-практ. конф,-Абакан, 2008.--С.168.

10. Снижение уровня метаболизма клеток иммунной системы у недоношенных детей как проявление иммунных нарушений в системе мать-плаиента-плод /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова Л.А. Нагирная и др. //Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: сб. тр. X междунар. конгр.- Казань. 2009.-C.29l.

11. Лисихина, Н.В. Ферменты лизосом клеток иммунной системы при преждевременных родах /Н.В. Лисихина, В.В. Фефелова //Дни иммунологии в Сибири: матер, всерос. науч.-практ. конф - Красноярск, 2010.-С.128-129.

Список сокрушений

КФГ - кислая фосфагаза гранулоцнтов КФЛ - кислая фосфатаза лимфоцитов ЛОФР - легкоокисляемые фракции липндов ЛФХ - лизофосфатидилхолин ОФЛ - обшие фосфолшшды

РДСН -- респираторный дистресс-синдром новорожденных

С-ДГ - су шинатдегндрогсназа

СМ -- сфингомиелин

СХ - свободный холестерин

ФИ - фосфатпдилинозитол

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатиднлхолин

ФЭЛ - фосфатидилзтаноламин

^М, ^О - иммуноглобулины классов А, М, в.

Подписано в печать ¡6.04.2010 г. Формат 60x84/16, объем 1 п.л., 0,93 усл. п.л. Тираж 50 экз. Заказ № 707. ООО «Издательство «Гротеск» 660021, г. Красноярск, ул. Декабристов, 26

Охрана здоровья матери и ребенка рассматривается как важная . составная часть здравоохранения во всем мире, имеющая первостепенное значение для формирования здорового поколения с самого'раннего периода их жизни. Недоношенность и ее последствия представляют собой одну из важнейших проблем неонатологии и здравоохранения в целом, и является одной из основных причин смертности новорожденных в перинатальном периоде (Шабалов Н.П., 2004; Браим Д.Г., 2000; Новопольцева Е.Г., 2003; Логинова И.А., 2004; Кравченко E.H. с соавт., 2007). В настоящее время частота рождения детей раньше срока колеблется от 5 до 12 % и не имеет тенденции к снижению (Дементьева Г.М. с соавт., 2003; Володин H.H., 2007; Янмурзаева З.А., 2006; Брюховец Т.В., 2007; Прахов A.B. с соавт., 2008). Медико-социальная значимость проблемы преждевременно * родившихся детей определяется отсутствием тенденции к ее снижению, высокой перинатальной смертностью недоношенных детей, большими экономическими затратами, связанными с выхаживанием, а также их значительной долей среди детей с ограниченными возможностями и больных с хроническими заболеваниями (Виктор В.Х., Вуд Э.К., 1991; Spencer N. J., Logan S., 2002).

Снижение количества преждевременных родов — одна из приоритетных задач акушерства и педиатрии сегодня. Неудачи в этой области связаны с недостаточной изученностью механизмов, вызывающих преждевременные роды (Володин Н.Н с соавт., 2001).

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению различных параметров при недоношенности, патогенез этого состояния до конца не выяснен. Некоторые авторы считают нарушения иммунологических отношений между матерью и плодом одним из важнейших пусковых факторов недоношенности (Говалло В.И., 1987; Яшвили-Пароксадзе Т.И., 1990; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003; Макаров О.В. с соавт., 2009; Верясов В.Н. с соавт., 2010).

Считается доказанным, что изменение функциональной активности клеток иммунной системы происходит только при соответствующих изменениях метаболизма лимфоцитов (Нарциссов Р.П., 1978, 1989; Захарова Л.Б., 1981, 1999; Робинсон М.В. с соавт., 1986, 1994; Савченко A.A., 1996; Труфакин В.А. с соавт., 1997; Булыгин Г.В. с соавт., 1999; Buttgeriet F. et al., 1991). Метаболизм клеток иммунной системы при недоношенности изучался преимущественно у недоношенных новорожденных (Валюлис А. Р., 1994; Болотокова P.A. с соавт., 2003; Желев В.А., 2005; Ильина A.C., 2005). Между тем иммунологические взаимоотношения матери и плода формируются в рамках единой функциональной системы мать-плацента-плод и нарушение нормальных взаимоотношений в этой системе могут явиться ведущим звеном в возникновении патологии беременности и различных нарушений у недоношенных новорожденных (Шабалов Н.П., 1987; Шищенко В.И., 1988). Поэтому целесообразно проводить исследования не только у новорожденных недоношенных детей, но и у их матерей. При этом важное значение имеет анализ не только показателей метаболизма, но и состояние мембран лимфоцитов, которое в значительной мере влияет на функциональное состояние клеток иммунной системы.

Таким образом, представляется весьма актуальным проведение исследования метаболических параметров и спектра структурных липидов мембран клеток иммунной системы крови у недоношенных новорожденных и их матерей при преждевременных родах.

В структуре причин неонатальной смертности одно из ведущих мест занимает респираторный дистресс-синдром (РДСН) и его последствия (Рюмина И.И., 1996; Хижняк Д.Г. с соавт., 2007; Гармаева В.В., 2008; Кузьменко Г.Н. с соавт., 2009). В настоящее время достигнуты значительные успехи в профилактике и лечении РДСН, однако ожидаемого снижения смертности и осложнений данного заболевания не произошло.

В литературе встречаются противоречивые и фрагментарные данные о причинах и механизмах развития РДСН (Коцарев О.С., 1989; Гилев А.И.,

1995; Ларюшкина P.M., 1997; Палилова Л.А, 2001; Бирюкова Т.В. с соавт., 2007; Хижняк Д.Г. с соавт., 2007; Кузьменко Г.Н. с соавт., 2009). Концепция, связывающая патогенетическую основу респираторного дистресс-синдрома с дефицитом сурфактанта, обусловленного структурно-функциональной незрелостью системы сурфактанта, зависящей от срока гестационного возраста, остается ведущей (Гомелла Т.Л., 1995; Murch S. N. et al., 1996).

Несмотря на большое количество исследований, посвященных проблеме биохимического созревания системы легочного сурфактанта в антенатальном периоде и влиянию многочисленных факторов на этот процесс, во многих случаях не удается объяснить формирование РДСН и его клинические варианты. Некоторые авторы (Котова Н.В., 1985; Ларюшкина P.M. с соавт., 2000; Палилова Л.А., 2001) считают, что на течение и исход РДСН значительное влияние оказывает повреждение сурфактанта, которое может быть связано с его инактивацией катаболическими ферментами и усилением процессов перекисного окисления липидов. Усиленный катаболизм липидов сурфактанта может быть также связан с измененным функционированием лизосом, именно лизосомы ответственны за катаболические процессы в клетках, в том числе за гидролиз структурных фосфолипидов мембран клеток и сурфактанта (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987; Шаронов A.C., 2007). Однако анализ активности маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы в лимфоцитах крови при РДСН и состояние липидного спектра мембран лимфоцитов, основой которого, как и сурфактанта, является фосфатидилхолин, не проводился. Поэтому представляется весьма актуальным изучение ферментативной активности лизосом и липидного спектра мембран лимфоцитов для уточнения патогенетических аспектов развития РДСН.

Цель исследования: Определить у недоношенных новорожденных патогенетическую значимость изменений структурно-метаболических параметров клеток иммунной системы при разном гестационном возрасте и респираторном дистресс-синдроме.

Задачи исследования:

1. Изучить метаболические параметры (СДГ, КФЛ, КФГ) в лимфоцитах и гранулоцитах пуповинной крови недоношенных новорожденных с учетом гестационного возраста и в венозной крови их матерей.

2. Исследовать спектр структурных липидов мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с разным гестационным возрастом и у их матерей.

3. Изучить активность метаболических параметров, в том числе характеризующих активность лизосом, у недоношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом.

4. Определить особенности липидного спектра мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом.

5. Выявить корреляционную зависимость между активностью ферментов клеток иммунной системы и структурными липидами мембран лимфоцитов с учетом гестационного возраста у недоношенных новорожденных.

Научная новизна

Впервые снижение активности митохондриального фермента СДГ в клетках иммунной системы недоношенных новорожденных и их матерей рассматривается как следствие нарастающей иммунной супрессии при недоношенности.

Впервые изучен липидный спектр мембран лимфоцитов у недоношенных новорожденных с разным гестационным возрастом и у их матерей, в сравнении с доношенными новорожденными; выявлены изменения в липидном бислое мембран, которые связаны с обогащением мембран холестерином; повышением процентного содержания ЛФХ, СМ и снижением ФХ по мере снижения гестационного возраста новорожденного.

Проведено изучение маркерного фермента лизосом лимфоцитов и гранулоцитов - кислой фосфатазы у недоношенных детей с РДСН. Обнаружено статистически значимое повышение активности кислой фосфатазы клеток иммунной системы у недоношенных детей с РДС11 по сравнению с недоношенными;без РДСН.

Впервые изучено содержание структурных липидов мембран; лимфоцитов у . недоношенных; детей с РДСН, выявлено значительное нарастание процессов деполимеризации фосфатидилхолина мембран у недоношенных новорожденных при РДСН.

Практическая значимость В результате . проведенных исследований получены данные, позволяющие представить новую интерпретацию процессов формирования изменений метаболических параметров клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных, которые впоследствии могут влиять на состояние здоровья недоношенных детей.

Полученные данные о повышении функциональной активности . лизосом при РДСН могут быть использованы для формирования комплекса лечебных мероприятий по снижению активности лизосомальных ферментов в процессе предупреждения и лечения РДСН.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены, в практику работы МУЗ «Родильный дом №2» (г.Красноярск),. МУЗ «Родильный: дом №5» (г.Красноярск). Показатели- активности метаболизма и спектра липидов мембран клеток иммунной системы используются в научных исследованиях Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Однонаправленный характер изменений метаболических параметров клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных детей и их матерей — снижение активности митохондриального фермента сукцинатдегидрогеназы, рассматривается как проявление нарастающей супрессии иммунной системы при недоношенности. . • '■;'■. ' Ю

2. Выявленные: у недоношенных новорожденных показатели, свидетельствующие об усилении процессов1 деполимеризации фосфатидилхолина, являющегося основным; структурным компонентом мембран клеток и сурфактанта, позволяют заключить, что дефицит сурфактанта у недоношенных новорожденных обусловлен не только незрелостью, но и нарастанием процессов его деполимеризации.

3. Установлено повышение активности маркерного фермента лизосом у недоношенных новорожденных с РДСН, что свидетельствует о нарастании их функциональной активности; деполимеризация фосфатидилхолина в мембранных структурах может быть связана у недоношенных детей с РДСН с высокой активностью лизосом; содержащих ферменты, субстратом для катаболических процессов которых является фосфатидилхолин.

Личный вклад автора Лично автором проведено планирование работы, поиск и анализ литературы по теме диссертации; Автором проведено, обследование 205 человек. У 104 новорожденных изучены особенности; течения периода новорожденное™; у 101 их матери изучены особенности анамнеза, характер течения настоящей беременности и исходы родов. В ходе сбора материала для диссертационной работы автором были проведены клинико-анамнестические, цитохимические, хроматографические и иммунологические методы исследования, позволяющие оценить структурно-метаболические параметры клеток иммунной системы у недоношенных новорожденных и. их матерей. Автором самостоятельно проводилось выполнение расчетов, обработка и обсуждение результатов, оформление диссертации и автореферата.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены на: итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири (Красноярск, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-му юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИДОМ «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), на VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2006), на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы здравоохранения Сибири» (Красноярск, 2007), на XI межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008), на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы здравоохранения Сибири» (Красноярск, 2008), на XII межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 1 статья в центральной печати.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 161 странице печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической характеристики обследованных групп, 4-х глав собственных исследований, заключения и списка литературы. Работа включает 32 таблицы, 29 рисунков. Список литературы включает 308 источников, из них 225 работ отечественных и 83 зарубежных авторов.

126 ВЫВОДЫ

1. У недоношенных новорожденных выявлено статистически значимое снижение активности СДГ в лимфоцитах и повышение активности КФ в лимфоцитах и гранулоцитах пуповинной крови по сравнению с доношенными новорожденными. Подобное сочетание изменений показателей энергетических и катаболических процессов в клетке свидетельствует о неблагоприятном состоянии энзиматической активности клеток иммунной системы крови у недоношенных детей.

2. У матерей, родивших недоношенных детей, наблюдались те же закономерности изменений метаболических параметров клеток иммунной системы, которые были выявлены у недоношенных детей: статистически значимое снижение активности СДГ в лимфоцитах и повышение активности КФ в лимфоцитах и гранулоцитах венозной крови по сравнению с матерями, родивших доношенных детей, что может быть обусловлено нарастанием супрессии иммунной системы при недоношенности.

3. Не обнаружено статистически значимой разницы активности ферментов СДГ, КФЛ и КФГ в клетках пуповинной крови при сравнении групп недоношенных новорожденных с разным гестационным возрастом между собой. Это свидетельствует о том, что активность ферментов в клетках иммунной системы у недоношенных детей не столько зависит от срока гестации, сколько связана с развитием процессов, приводящих к недоношенности.

4. Соотношение структурных липидов мембран лимфоцитов пуповинной крови у недоношенных детей отличается от показателей у доношенных детей статистически значимым повышением содержания СМ и ЛФХ и снижением содержания ФХ по мере снижения гестационного возраста, особенно у недоношенных в третьей группе.

5. В проведенных исследованиях у матерей, родивших недоношенных детей, не обнаружено статистически значимых отличий в соотношении структурных компонентов мембран лимфоцитов по сравнению с матерями, родивших доношенных детей.

6. Выявленное в лимфоцитах крови у новорожденных с РДСН статистически значимое повышение активности маркерного фермента лизосом - КФ и снижение содержания ФХ - основного структурного компонента мембран клеток и сурфактанта, являющегося субстратом для лизосомальных ферментов, свидетельствует о вовлечении лизосом в патогенетические процессы развития респираторного дистресс-синдрома новорожденных.

7. Выявлено нарастание количества корреляционных связей между активностью ферментов клеток иммунной системы и структурными липидами мембран лимфоцитов по мере снижения гестационного возраста у недоношенных новорожденных.

Практические рекомендации

1 .Рекомендуется контроль за снижением активности СДГ в лимфоцитах крови недоношенных новорожденных, которое в дальнейшем может определять снижение функциональных возможностей клеток иммунной системы.

2.При диагностике степени тяжести и при прогнозе развития РДСН рекомендуется определять активность маркерного фермента лизосом - КФ в лимфоцитах пуповинной крови у недоношенных новорожденных.

3.При проведении лечебных мероприятий при РДСН рекомендуется обратить внимание на целенаправленное использование препаратов, способствующих снижению функциональной активности лизосом.