Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Нарушения в системе крови, вызванные гербицидом-аминной солью 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты

На правах рукописи

РГ6 од

КАЮ М О В А

АЛИЯ ФАРИТОВНА

НАРУШЕНИЯ В СИСТЕМЕ КРОВИ, ВЫЗВАННЫЕ ГЕРБИЦИДОМ ■ АМИННОЙ СОЛЬЮ 2, 4 - ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ (экспериментальное исследование)

14. 00.16 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

ЧЕЛЯБИНСК-1996

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете и Челябинской государственной медицинской академии. -

Научные .консультанты: Академик АЕН РФ, 'доктор медицинских наук, профессор Ю. М. Захаров Чл. • корр. АН РБ, доктор медицинских наук, профессор Ф. X. Камилов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор' Б. Г. Юшков

Чл. - корр. АВШ, доктор медицинских наук, профессор В. Т. Долгих

Доктор медицинских наук, профессор В. П. Твердохлиб

Ведущая организация - Санкт - Петербургский научно - исследовательский институт гематологии и переливания крови.

Защита диссертации состоится "_"___. 1996 г. в "_"часов на заседании Специализированного учёного совета ( Д - 084.04.01 ) Челябинской медицинской академии по адресу : 454092 , РФ, Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской медицинской академии.

Автореферат разослан "Л?" 1996 г.

Учёный секретарь

специализированного учёного совета, доктор медицинских наук, профессор

Л. В. Кривохижина

• ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В России в последние десятилетия ежегодно увеличивалось применение гербицидов - производных хлорфе-ноксиуксусной кислоты в народном хозяйстве - в сельском хозяйстве, для борьбы с зарастанием дренажных и оросительных систем, рыбохо-эяйственных водоёмов, причём в последних случаях в количествах, в десятки раз превышающих вносимые на поля, что приводит к циркуляции гербицидов во внешней среде, попаданию их в атмосферу, воду, почву, продукты питания.

Интенсивное производство и применение производных хлорфе-ноксисоединений (2.4 - Д), занимающих 1 - 2 место среди других гербицидов по использованию в народном хозяйстве, требуют разработки профилактических рекомендаций, направленных на предупреждение возникновения не только острых и хронических отравлений, но и отдалённых последствий влияния 2,4 - Д на организм человека и животных.

Поэтому изучение реакций различных физиологических систем человека,

«

состояние его здоровья и популяции в целом при воздействии загрязнителей - 2,4 - Д, как и диоксинсодержащих экотоксикантов является одной из актуальных медико - биологических проблем современности ( В. С.' Румак, 1993 ). Как известно, нарушение здоровья человека является " барометром " экологического и социального неблагополучия (Л. Н. Бадаева и соавт., 1992).

Соединения 2,4 - Д ( 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота, её соли и эфиры) использующиеся в качестве гербицидов являются среднетоксич-ными при попадании в пищеварительный тракт, оказывают выраженное кожно - реэорбтивное действие при местном воздействии, обладают местно - раздражающим действием на легочную ткань при их ингаляционном применении ( В. С. Гуменный, 1977; Е. И. Маковская и соавт., 1983 ; Н. X. Абдуллаев и С. И. Клейнер, 1986 ; Г. ?. Писько и соавт., 1986; 3. А. Алексашина и H.A. Каган, 1989; В. С. Румак, 1993).

В настоящее время усилия ряда исследователей направлены на более глубокое изучение состояния крови и кроветворных органов, как клеточно - тканевой системы, являющейся одной из наиболее легкоранимых систем, а также её метаболического гомеостазиса при воздействии различных токсических веществ. Особый интерес представля-

ют в этом плане производные 2,4 - Д. Это связано с тем, что у работающих в контакте с гербицидами группы 2,4 - Д обнаружена значительная распространённость анемических состояний, лейкопений и ( или ) лейкоцитозов, тромбоцитопений, снижение содержания иммунокомпе-тентных клеток в центральных и'периферических органах иммунопоэза ( Е. Н. Буркацкая и соавт., 1978 ; В. Н. Карпенко, 1981 ; В. С. Румак, 1993). Сходные нарушения в системе крови вызывает интоксикация 2, 4, 5 • трихлорфенолом и 2, 3, 7, 8 - тетрахлордибензо - п - диоксином (В. Н. Карпенко, 1981 ; Zober et al., 1983). Эти нарушения сохраняются длительно, обнаруживаясь у пострадавших спустя 20 - 30 лет после острой интоксикации. Однако механизмы этих нарушений в системе крови остаются нерасшифрованными. Остаётся неизученным как природа анемии, так и характер изменений количественных и качественных характеристик лейкоцитов, вызванных интоксикацией животных различными дозами гербицида аминной соли 2,4 • Д, сохранность компенсационных реакций кроветворной ткани при этих состояниях. Комплексно не исследовано также взаимоотношение этих изменений в системе крови и воздействия гербицидов 2,4 - Д на морфофункциональное состояние внутренних органов (почки, печень, лёгкие, желудок, тонкий и толстый кишечник).

В связи с вышесказанным наши исследования осуществлялись по системному принципу с использованием физиологических, биохимических, морфологических, гистохимических, элекгронномикроскопических методов. Изучалась реакция целостного организма, морфо - функциональное состояние отдельных систем и органов, тканей, включая клеточный и субклеточный уровень организации последних на поступление в организм крыс различных доз аминной соли 2,4 - дихлорфеноксиуксус-ной кислоты и взаимосвязь этих изменений с функциональным состоянием системы крови.

Цель исследования. Экспериментальный анализ развития анемии, состояния миелопоэза, функций лейкоцитов, их реакции на альтерацию тканей организма, а также компенсаторных возможностей кроветворения у животных, подвергнутых интоксикации гербицидом - аминной солью 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Задачи исследования.

1. Разработать экспериментальную модель интоксикации животных

гербицидом 2,4 - ДА, с целью выявления доз интоксиканта, вызывающих репрезентативные изменения в системе крови.

2. Исследовать динамику показателей периферической крови, индексы красной крови (среднее содержание и концентрацию гемоглобина в одном эритроците, цветовой показатель); объём циркулирующей крови, , плазмы и эритроцитов ; митотическую активность эритробластов и со-. хранность организации эритропоэза в эритробластичеоких островках ; миелограммы, слленограммы и парциальные миелограммы у крыс при воздействии различных доз 2,4 - ДА.

3. Сопоставить изменения периферического. отдела эритрона с динамикой количественных и качественных изменений ЭО костного мозга при воздействии 2,4 - ДА ( изучить характер волн амплификации эритробластов и их созревание в ЭО; темп вовлечения КОЕэ в эритро-идную дифференциацию в ЭО ; характер реконструкции эритропоэза в инволюцирующих ЭО ). Исследовать зависимость между активностью эритропоэза в островках и функциональным состоянием ЦМФ ЭО по изменению состояния лизосом макрофагов ЭО и характеру повторного вовлечения макрофагов ЭО в эритропоэз.

4. Исследовать характер кроворазрушения по устойчивости эритроцитов к гемолитикам, отложению железа в тканях органов экспериментальных животных, получавших разные дозы 2,4-ДА.

5. Исследовать эритропоэтическую активность сыворотки крови,компенсационные возможности эритрона у животных, подвергнутых воздействию '2,4 - ДА при воспроизведении острой постгеморрагической анемии.

6. Определить параметры нуклеологенеза, характер интерфазной гибели (апоптоза), метаболическую активность лимфоцитов перифери-. ческой крови у экспериментальных животных, в зависимости от дозы и времени экспозиции 2,4-ДА.

7. Изучить в динамике показатели функциональной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови экспериментальных животных, гранулоцитарный резерв их костного мозга в зависимости от дозы и времени экспозиции 2,4 - ДА.

8. Исследовать морфологические, гистохимические, электронно-микроскопические характеристики внутренних органов ( почек, печени, лёгких, желудка, тонкого и толстого кишечника) при воздействии 2,4 -ДА.

9. Исследовать характер распределения и накопления в тканях различных органов продуктов метаболизма 2.4 - ДА.

Новизна исследования. На основании полученных данных вскрыты механизмы развития гематологических нарушений (гемопатии ), сопровождающей интоксикацию организма крыс гербицидом 2,4 - ДА. Показано, что у животных подвергнутых интоксикации аминной солью 2,4 - Д развиваются дозозависимые по выраженности и времени развития гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением эритроцитов, торможением их новообразования в костном мозге, и, как следствие, развитием истинной анемии, умеренным абсолютным нейтрофильным лейкоцитозом, абсолютным моноцитозом и лимфоцито-зом с признаками активации иммуноцитов в тканях.

Впервые представлены материалы, характеризующие изменения в центральном звене эритропозза - эритробластических островках костного мозга, оценена кинетика дифференциации КОЕэ в проэритробласты. характер амплификации созревания эритробластов. реконструкция эритропозза в. ЭО на базе вовлечения в формирования ЭО ЦМФ созревших ЭО, а также парциальных эритрограмм костного мозга при интоксикации крыс гербицидом 2,4 - ДА. Эти материалы доказывают, что основой нарушенного новообразования эритроцитов в костном мозге является заторможенная комплексация КОЕэ с резидуальными макрофагами костного мозга и центральным макрофагом инволюциирующих ЭО, замедляющая формирование ЭО в костном мозге, а также торможение созревания эритроидных элементов в " короне " ЭО.

Впервые вскрыта взаимосвязь между этими изменениями в центральном звене эритрона и его периферическим отделом. Оценена интенсивность кроворазрушения после введения крысам 2,4 - ДА, показавшая увеличение кроворазрушения у этих животных, что доказывается сниженной кислотной и осмотической резистентности их эритроцитов, усиленным отложением гемосидерина в их селезёнке.

Оценены компенсаторные возможности кроветворения у крыс, подвергнутых подострой интоксикации гербицидом 2,4 - ДА в различных дозах, выявившие замедленное восстановление " красной" крови после кровопотери вследствие нарушенных клеточно - клеточных зритропоэти-ческих взаимодействий в костном мозге и, наоборот, усиление нейтро-фильной и лимфоцитарной реакций кроветворной ткани на пирогенал у этих животных.

Впервые оценена функциональная и метаболическая активность лейкоцитов животных, подвергшихся интоксикации 2.4 - ДА в дозовре-менной зависимости. Впервые доказано, что .интерфазная активность ядрышкообразующих районов хромосом лимфоцитов и характер их интерфазной гибели (апоптоза ), сроки появления, выраженность и длительность циркуляции лимфоцитов с признаками ядрышковой сегрегации в периферической крови, находятся, в прямой зависимости от введённой животным дозы и времени экспозиции 2,4 - ДА. Доказано, что интоксикация 2,4 - ДА понижает функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов.

Оценён характер накопления и патоморфологические изменения внутренних органов при введении разных доз 2.4 - ДА. Выявлено, что 2,4 - ДА обладает способностью легко проникать практически во все ткани организма и метаболизироваться в них. Интоксикация вызывает у крыс обширные морфофункциональные нарушения тканей, различных органов, характеризующиеся альтерацией и нарушением тканевого метаболизма, развитием иммунного воспаления в местах отложения 2,4 - ДА, которые имели прямопропорционапьную зависимость от вводимой дозы препарата.

Установлено, что состояние системы крови тесно взаимосвязано с патомЪрфологическими изменениями внутренних органов, вызванных интоксикацией 2,4 - ДА.

Теоретическое и практическое значение работы. Вскрыты закономерности ответа центрального и периферического звена системы крови на интоксикацию организма возрастающими дозами 2.4 - ДА (от малых доз 1/200 ЛД ьо до ЛД ьи), вскрыты закономерности патологических и компенсаторных реакций в системе крови при этих состояниях. Дано обоснование прогнозу сохранности резервных возможностей в системе крови и в целом организма, подвергнутого интоксикации 2,4- ДА.

Выяснение черт и механизмов развития гематологических нарушений, сопровождающих у человека и животных интоксикацию гербицидом 2.4 - ДА может послужить основанием для разработки охранных и профилактических мер в здравоохранении, сельском хозяйстве, химической промышленности, направленных на предупреждение поражений людей этим гербицидом, а также своевременного распознавания интоксикации при применении гербицида в сельском хозяйстве и в процессе его производства.

Положения, выносимые на защиту.

1. Интоксикация животных аминной солью 2,4 - дихлорфеноксиук-сусной кислоты вызывает ответы в системе крови, выразившиеся в развитии анемии, нейтрофилии, лимфоцитозе и моноцитозе. и нарушении клеточно - клеточных взаимодействий, регулирующих эритропоэз в костном мозге.

2. Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов, торможением формирования эритробластических островков костного мозга, торможением созревания в последних эритроидных элементов. Компенсационные внутрисистемные возможности центрального звена эритрона у интоксицированных животных резко снижены.

3. Интоксикация 2,4 - ДА формирует реактивный лейкоцитоз и лим-фоцитоз, возникающие в ответ на альтерацию тканей внутренних органов, вызванную введением 2,4 - ДА. Одновременно интоксикация понижает функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов, увеличивает объём апоптоза лимфоцитов, вызывает сдвиги метаболизма в лейкоцитах.

4. Выявлен дозозависимый характер ответов системы крови на введение 2.4 - ДА в возрастающих дозах : 1/200 ЛД50 . 1/20 ЛД50 . 1/4 ЛД5„. 1/2 ЛД50 и ЛД50.

Внедрение результатов работы в практику. По материалам диссертации оформлены методические рекомендации. Результаты работы внедрены в учебную и научно - исследовательскую работу кафедры физиологии человека и животных Башкирского государственного университета: кафедры патологической физиологии Челябинской медицинской академии ; кафедры терапии ФУВ, патологической физиологии Башкирского государственного медицинского университета ; кафедры физиологии животных и биохимии Башкирского государственного аграрного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены:

1) на международном симпозиуме " Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма". Чолпон^Ата. 1993.

2) на III съезде физиологов России. Пущино. 1993.

3) на III съезде анатомов, гистологов, эмбриологов Российской Федерации, Тюмень, 1994.

4) на I международном конгрессе по иммунореабилитации, Дагомыс, 1994.

5) на 14 международном симпозиуме "Диоксин", Япония, Киото, 1994.

6) на конференции " Диоксины : экологические проблемы и методы анализа", Уфа, 1995.

7) на III всероссийской конференции по экологии .челорека, Волго-. град, 1995.

S) на региональной научной конференции молодых учёных - морфологов Урала, Уфа, 1995.

9) на II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1995.

10) на III международном конгрессе по иммунореабилитации, Турция, 1996.

11) на международной медицинской конференции "Новые технологии в медицине" г. Трёхгорный. 1996.

12) на III конгрессе Ассоциации морфологов (АГЭ ). Тверь. 1996.

13) на совместном заседании кафедр нормальной и патологической физиологии ЧМА. 1996

14) на 16'международном симпозиуме " Диоксин' 96 Нидерланды. Амстердам, 1996.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы.

Структура и объём диссертации. Работа представлена на -З/Остр. машинописного текста, иллюстрирована 46 таблицами, 10 рисунками, 22 микрофотографиями и 4 электронными микрофотографиями. Состоит из введения, обзора литературы, главы " Материал и методы", 5 глав изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 184 отечественных и 127 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В экспериментах было использовано 758 беспородных половозрелых крыс ( самки и самцы ), массой 180 -220 г., 100 крыс-самцов линии " Вистар", массой 150-180 г. и 35 мышей - самцов линии С57 BI, массой 18-20 г. Экспериментальную

интоксикацию гербицидом вызывали путём введения в желудок подопытным животным с помощью специального зонда водного раствора аминной соли 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты ( 2.4 - ДА ) в дозах ЛД 6о, 1/2 ЛД so, 1/4 ЛД so, 1/20 ЛД 5о и 1/200 ЛД 5U. Величина ЛД ьо аминной соли 2,4-Д для крыс составляет 1200 мг/кг(С. Ю. Буслович. 1§6'3; Л. И. Медведь, 1969, 1974 ).

Подострое отравление гербицидом 2.4 - ДА в эксперименте вызывали путём ежедневного введения в желудок крысам водного раствора 2.4-ДА в течение 26 дней в суммарных дозах ЛД50, 1/2 ЛДз0, 1,'4 ЛД^, 1/20 ЛД so и 1/200 ЛД so- Ежедневно вводимые подопытным животным дозировки гербицида в подостром эксперименте соответственно составляли 40 мг/кг. 20 мг/кг,-10 мг/кг, 2 мг/кг и 0,2 мг/кг.

Контрольной группе подопытных животных вводили в желудок взамен гербицида дистиллированную воду.

Время экспозиции при подостром эксперименте составило 1 час, 1. 7, 14,21 и 28-е сутки для каждой группы животных.

Постгеморрагическую анемию вызывали под эфирным наркозом путём забора крови из ретраорбитального пространства в объёме ? % от массы тела животного, подвергнутых воздействию 1/2 ЛД50. 1/20 ЛД;о и 1/200 ЛД so в течение 28 - и дней. Исходы постгеморрагической анемии исследовались через 24 часа, на 3. 7. 14, 18 и 21 -е сутки после кро-вопотери.

Для исследования характера распределения и накопления в тканях органов продуктов метаболизма 2.4 - ДА производили ¿ - х месячную за-1 райку крыс в дозах ЛД so и ¡/20 ЛД 50. Исследовались печень, почки, селезёнка, лёгкие, сердце, тимус, надпочечники, семенники, мышечная и жировая ткань, сыворотка крови.

Для оценки накопления в тканях 2,4 - ДА и её производных использовался метод жидкостной хроматографии.

Из показателей периферической крови у животных определяли число эритроцитов и лейкоцитов, концентрацию гемоглобина и показатель гематокрита. лейкоцитарную формулу, а также количество ретику-лоцитов традиционными гематологическими методами. Рассчитывали : цветовой показатель кроси ( ЦП ), сроднее содержание гемоглобина ( ССЭ ) и среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците (СКЭ)(Й. Тодоров, 1968).

Для исследования костномозгового кроветворения проводили подсчет миелограмм в мазках - отпечатках, окрашенных по Романовскому - Гимзе, насчитывая 500 клеток, количественный и качественный анализ ЭО - по методу 10. М. Захарова и соавт. ( 1984, 1990 ) и дополняли расчетными показателями, включающими: общее количество КОЕэ, вступивших в эритроидную дифференцировку; показатель вовлечения КОЕэ в дифференцировку, а также показатель повторного вовлечения ЦМФ ЭО в эритропоэз (Л. В. Воргова, Ю. М. Захаров, 1990).

Определение общей активности лизосом в ЦМФ ЭО проводилось по методу А. Г. Рассохина и соавт. ( 1992) в витальных препаратах ЭО после их адгезии на покровных стёклах.

Определение митотической активности эритроидных клеток в " короне" ЭО и вне ЭО проводили по О. К. Гаврилову и соавт. (19S5 ).

Определение объёма циркулирующей крови ( ОЦК ), плазмы { ОЦП ) и эритроцитов ( ОЦЭ ) проводили по А. Г. Рассохину ( 1984 ).

Эритропоэтическая активность плазмы крови животных исследовалась по A. J. Erslev ( 1986 ).

Выявление отложения железа в тканях органов проводили по методу Перлса.

Определение кислотной резистентности эритроцитов проводили методом эритрограмм. предложенным И. И. Гительзоном и И. А. Терсковым (1959).

Осмотическую резистентность эритроцитов ( ОРЭ ) определяли по методу. Waugh и Asherman ( 1938 ) в модификации Н. Л. Василевской (1955).

Подсчёт спленограмм проводили в мазках - отпечатках, окрашенных по Романовскому Гимзе.

Оценку лейкоцитарного резерва костного мозга проводили при однократном в / м введении пирогенала в дозе 1 мг / кг. Замер температуры производили ректально электротермометром за 30 минут, через 1 час и б часов после введения пирогенала.

Оценка параметров нуклеологенеза ( Ад - ЯОР реакция ) проводилась по Goodpasture и Bloom ( 1975 ) в модификации В. М. Погорелова (1990 ).

Иссгедовзние фагоцитарной активности нейтрофилов ( фагоцитарное число ( ФЧ ) и фагоцитарный индекс ( ФИ )) проводили по В. А. Ал-мазову и соавт. ( 1953 ).

Оценку метаболической активности нейтрофилов проводили по ' стимулированному НСТ - тесту.

Цитохимические исследования лейкоцитов проводили по оценке ак-< тивности пероксидазы ( П ), щелочной ( ЩФ) и кислой фосфатазы ( КФ), сукцинатдегидрогеназы ( СДГ ) и а - глицерофосфатдегидрогенаэы (а - ГФДГ) {Ф. Г. Дж. Хейхоу, Д. Кваглино, 1983).

Было проведено морфологическое и электронномикроскопическое исследование тканей желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, почек, лёгких ( электронный микроскоп - ^т - 7 А ( Япония ), ультратом -1.КВ-3).

Гистохимическое исследование вышеперечисленных органов включало оценку активности щелочной фосфатазы методом азосочетания, сукцинатдегидрогеназы по Нахласу, неспецифической эстеразы методом Пирлса, кислых гликозаминогликанов методом Хейла.

Статистическая обработка проводилась с использованием пакетов ЭТАП - БТАТ2, Ехсе1. Достоверность различий оценивали критерием Стъюдента и принимали её значимой при вероятности р < 0,05. Степень взаимосвязи между признаками оценивали методом корреляционного анализа.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью персонального компьютера 1ВМ - 386 ОХ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Хараетер общетоксического действия разных доз аминной соли 2,4-ДА на организм крыс.

Клиническое наблюдение за животными показало, что проявления интоксикации у крыс нарастали по мере увеличения количества введённого крыс-ам интоксиканта.

Так. первые признаки интоксикации обнаруживались в группах ЛД 50, 1/2 ЛД 50 и 1/4 ЛД 50 к 14-м суткам от начала опыта, но более всего они были выражены в группе ЛД 50 ( У животных снижался аппетит, шерсть была тусклая и взъерошенная, резко уменьшалась двигательная активность, понижался тонус мышц хвоста). Указанные признаки интоксикации сохранялись на 21-е сутки опыта в группах с дозами ЛД 50, 1/2 ЛД50 и 1/4 ЛД 50 и частично начинали проявляться с группах 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД 50.

К 28-м суткам наблюдения в группах 1/2 ЛД so. 1/4 ЛД so, 1/20 ЛД so и 1/200 ЛД so наступило некоторое улучшение клинического состояния крыс - улучшился аппетит, возросла их двигательная активность.

Группа с дозой ЛД so к 28 - му дню наблюдения разделилась на две части - у одной из них сохранялись признаки интоксикации, но улучшился аппетит, возросла двигательная активность, у второй (" больные крысы ") отчётливо обозначились признаки разных ■ заболеваний - отмечалось увеличение лимфатических узлов, воспаление среднего уха, инфицирование хвоста. #

У животных, получавших 2,4 - ДА в дозах 1/20 ЛД so, 1/200 ЛД so и ЛД so к 28-м суткам отмечалось снижение массы тела по сравнению с исходной ( 228,8 + 9,93 гр.) и составило 199,2 ± 4,73 гр. при 1/20 ЛД 5о; 193,3 ± 5,43 ф. при 1/200 ЛД so и при ЛД so y группы крыс "здоровых " -218,8 ± 13,3 ф. и "больных"-179,0±2,45 ф.

I.2. Характер распределения и накопления в тканях различных органов крыс продуктов метаболизма 2,4-ДА.

Во всех взятых для исследования органах крыс после введения 2,4 - ДА в течение 2-х месяцев выявлено присутствие соединений 2,4 -Д кислоты и общей хлорорганики (табл. 1 ).

Таблица 1

Распределение соединений 2,4-Д кислоты и общей хлорорганики в органах и тканях экспериментальных крыс в зависимости от дозы 2,4-ДА.

• ЛД 50 1/20 ЛД so

соеди- соедине- соедине- соеди- соедине- соедин<

нения ния ния нения ния ния

Органы масса 2.4-Д. общей общей масса 2,4-Д общей общей

г кисло- хлор- хлор- г кисло- хлор- хлор-

ты орга- орга- ты орга- орга-

мг / кг ники ники мг / кг ники ники

мг мг / г мг мг/г

Печень 67,3 0, 035 12,46 0,185 60,9 0, 02 4, 858 0, 079

Лёгкие 22,5 0,014 9, 456 0, 420 16,3 0, 007 2,068 0, 126

Сердце 10,7 0, 087 6, 206 0, 582 9,06 0, 093 4, 635 0,511

Селезёнка 14,9 0, 079 4,964 0, 334 15,3 0, 057 2, 884 0, 188

Почки 17,6 0, 192 2,402 0,136 22,9 0, 036 2,477 0. 108

Надпочечники 3, 29 0, 467 0, 901 0, 274 3,01 0, 394 0, 770 0, 255

Мышцы 10,1 0, 439 2, 343 0, 231 7, 42 0, 081 1,552 0,218

Головной мозг 18,3 0, 134 1,453 0, 078 16, 1 0, 044 0,212 0,013

Продолжение табл. 1.

Тимус 3, 97 1,748 1,678 0, 422 3, 22 0, 606 0, 720 0, 224

Семенники 3,48 0, 530 1,994 0,572 6,31 0,104 0, 348 0,055

Сыворотка крови 20,0 0,161 1,108 0, 055 22,0 0,136 1,207 0, 054

Примечание : навески органов контрольных крыс не содержат метаболитов 2,4 - ДА.

Обращает на себя внимание, что наибольшее содержание общей

хлорорганики при ЛД 6о выявлено в печени, лёгких, сердце, селезёнке, почках и мышцах, составляя 12,5 мг ( печень)- 2,3 мг (мышцы). При расчёте соединений общей хлорорганики на 1 грамм массы крысы, выявлено наибольшее количество в сердце, семенниках, лёгких, селезёнке, что составляло от 0,58 мг / г (сердце) до 0,33 мг / г (селезёнка).

При определении соединений 2,4 - Д кислоты на кг массы тела выявлено, что наибольшее их количество сосредоточилось в тимусе ( 1,748 мг/кг) и семенниках ( 0,53 мг / кг), наименьшее в печени ( 0,035 мг/кг) и лёгких(0,014 мг/кг), что, вероятно, связано с разной метаболической активностью этих тканей в отношении аминной соли 2,4 - Д.

При введении экспериментальным животным 2,4 - ДА в течение 2-х месяцев в дозе 1/20 ЛД 50 расчёт содержания соединений общей хлорорганики и 2,4 - Д кислоты показало, что наибольшее количество приходилось в основном на те же органы, что и у ЛД5о-

Анализ полученных данных демонстрирует прямопропорциональное накопление метаболитов 2,4 - ДА в органах и тканях экспериментальных животных в зависимости от дозы введённого в организм гербицида. Этого нельзя сказать о содержании их в сыворотке крови. Независимо от введённой дозы 2,4 - ДА крысам, концентрация соединений общей хлорорганики и соединений 2,4 - Д кислоты в сыворотке крови не имела существенных различий в обеих группах.

1.3. Морфологические, электронномикроскопические и гистохимические особенности изменения внутренних органов крыс при различных дозах 2,4-ДА.

С целью исследования реакции тканей различных внутренних органов на накопление в них 2,4 - ДА и её метаболитов мы изучили особенности их морфологических, гистохимических и электронномикроскопи-ческих характеристик.

Исследования морфологического субстрата подострой интоксикации 2,4 - ДА показало, что под воздействием этого препарата не остаётся интакгной практически ни одна ткань крысы.

Вокруг крипт тонкого кишечника при ЛД 60 обнаруживается диффузное расположение лимфоидной ткани, достигающее больших размеров и распространяющееся в окружающие тканевые структуры слизистой оболочки. Такие скопления лимфоидной ткани, располагаясь в собственной пластинке слизистой оболочки, раздвигают крипты. Часть лимфоцитов, инфильтрируя эпителиальный слой слизистой оболочки, даже выходят на её поверхность.

На гистологических препаратах печени данной группы экспериментальных животных обнаруживаются небольшие участки печёночных долек с признаками разрушения гепатоцитов. Наряду с обычными печёночными клетками встречаются гепатоциты с полиплоидными ядрами. В ряде участков печёночных долек отмечаются диффузные кровоизлияния. В периваскулярной зоне центральной вены дольки печени можно видеть скопления иммунокомпетентных клеток ( лимфоидно - гистиоци-тарные инфильтраты ) ; в некоторых случаях достигающих большого размера и. суживающих просвет кровеносного сосуда. В ряде случаев скопления лимфоидных клеток занимают достаточно обширные, зоны, располагаясь даже вдоль кровеносных сосудов.

В лёгких подопытных крыс также выявляются значительные морфологические изменения. В межальвеолярных пространствах, вокруг артериальных сосудов обнаруживаются различной плотности скопления лимфоидной ткани. В таких зонах кровеносные сосуды переполнены, наблюдается застой крови, при этом перибронхиальные и периваску-лярные пространства отёчны и содержат лейкоциты. В целом мы видим микроскопическую картину, характерную для межуточной пневмонии. На фоне венозного застоя в лёгких наблюдаются участки геморрагического инфаркта с кровоизлияниями в альвеолы.

Морфологическое строение почек у подопытных животных не выявило существенных изменений, вместе с тем, в соединительной ткани капсулы, особенно в непосредственной близости от паренхимы органа, обнаруживаются небольшие скопления лимфоцитов, чаще всего вдоль кровеносных сосудов. В паренхиме почек видна расширенная капиллярная сен,.

Морфологические изменения тканевых структур органов выражены в меньшей степени при 1/2 ЛД и <1/4 ЛД ¡о, чем в группе животных, получавших дозу ЛД бо-

При введении 2,4 - ДА в дозе 1/20 ЛД ¡о в соединительной ткани слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника отмечается неравномерная инфильтрация лимфоцитами. Наряду с нормальными гистологическими структурами лёгкого выявляются зоны, когда кровеносные капилляры альвеол сильно расширены, в паренхиме обнаруживается скопление лимфоидной ткани различных размеров и конфигурации.

При введении 1/200 ЛД 50 выраженных гистоструктурных изменений в органах не обнаружено.

Нарушения тонкой структуры тканей после введения 2,4 - ДА в дозе ЛД ц были исследованы с помощью электронной микроскопии. В цитоплазме эпителиоцита тонкого кишечника в непосредственной близости от нормальных митохондрий, располагаются митохондрии с деструкцией крист и просветлением матрикса. Ядра эпителиоцитов имеют небольшие выпячивания и углубления на поверхности, количество хроматина увеличено. Канальцы и цистерны цитоплазматической сети местами расширены. Между органеллами встречаются аутофагические вакуоли с электронноплотным содержанием и остатками мембран разрушенных структур клетки.

В гепатоцитах также встречаются митохондрии с признаками набухания, просветления мембраны, а также деструкцией крист. В цитоплазме гепатоцитов достаточно часто встречаются первичные и вторичные лизосомы, а также остаточные тельца. В некоторых гепатоцитах количество лизосом было увеличено. Можно допустить, что увеличение количества лизосом в клетках является признаком, указывающим на повышенную функциональную активность гепатоцитов.

Электронномикроскопическое исследование строения проксимального отдела канальцев почки выявило изменение конфигурации, толщины и гомогенность базальной мембраны, что указывает на признаки дистрофического процесса в ней.

Итак, напряжённая функциональная активность клеток и тканей организма крыс после поступления в него 2,4 - ДА в целом прежде всего проявляется перестройкой внутриклеточных обменных процессов с определёнными изменениями базальной мембраны кровеносных сосудов, митохондрий, ядра и лизосом клеток.

В работе мы попытались проанализировать особенности процессов повреждений во внутренних органах крыс при экспериментальном воздействии 2,4 - ДА в дозе ЛД 50 с помощью гистохимических методов исследования.

Комплексные гистохимические исследования дали возможность в определённой мере оценить отдельные особенности метаболизма тканевых структур. В тканях исследованных органов опытной группы по сравнению с контрольной отмечалось снижение активности СДГ, неспецифической эстеразы, количества кислых ГАГ и щелочной фосфатазы.

Таким образом, под влиянием гербицида 2,4 - ДА изменяется основной процесс выработки энергии в клетке - окислительное фосфо-рилирование. На основе изложенного можно сказать, что в основе токсического действия 2,4 - ДА лежит влияние его на мембранные структуры клетки и локализованные в них ферментные системы, которые становятся доступными для 2,4-ДА в связи с проникновением экотоксикан-та в клетки и накоплением его в них. Итак, гипоксия тканей, усиление перекисного окисления липидов в мембране клеток этих тканей ( И. С. Довжанский и соавт., 1996 ; В. О. Щепанский, 1996 ), формирование в последних комплексных или модифицированных антигенов (С. Д. Жамсаранова, Г. Л. Тумуров, 1986 ) имеют место при интоксикации организма 2,4 - ДА и являются вероятными причинами наблюдавшейся нами деструкции тканей разных органов. Инфильтрация тканей лимфоцитами, моноцитами - макрофагами в какой - то степени носит приспособительный характер, являясь мерой защиты против по- • вреждений тканей органов, вызванных воздействием гербицида 2,4 - ДА и формирования в них модифицированного антигена " 2,4 - Д + белок " (С. Д. Жамсаранова, Г. Л. Тумуров, 1986).

II. ИЗМЕНЕНИЯ В ЦЕНТРАЛЬНОМ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОМ ЗВЕНЕ ЭРИТРОНА У КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗАХ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ИХ ИНТОКСИКАЦИИ АМИННОЙ СОЛЬЮ 2,4-Д.

В результате воздействия гербицида 2,4 - ДА у крыс развивалась анемия, сопровождавшаяся снижением количества эритроцитов, гемоглобина, показателя гематокрита, увеличением абсолютного и относительного количества ретикулоцитов, повышением цветового показателя, и, в ряде групп животных, увеличением СКЭ. Степень анемии и изменений в показателях периферической крови прямопропорционально за-висило от дозы вводимой 2,4 - ДА.

Быстрота развития анемии уже сутки спустя после введения 2,4 -ДА в дозах ЛД 5о, 1/2 ЛД 5о и 1/4 ЛД50 заставляло предполагать усиление кроворазрушения ( эритроцитов ) под влиянием введённого препарата и, следовательно, гемолитический её характер. Специальная проверка этого предположения подтвердило его.

Проведённые нами исследования кислотной и осмотической резистентности, а также среднеклеточной хрупкости ( СКХ ) эритроцитов (процент концентрации хлорида натрия, вызывающий 50 % - й гемолиз у подопытных животных) в первые недели интоксикации 2,4 - ДА обнаружили снижение стойкости мембраны эритроцитов крыс к воздействию гемолитиков: в ранние сроки наблюдения отмечался подъём левой ветви кривой кислотных эритрограмм (рис. 1), отражающей токсическое повреждение мембраны эритроцитов у крыс.

Эти изменения, видимо, могли явиться следствием как прямого воздействия 2,4-ДА и её метаболитов на мембрану эритроцитов, так и опосредованного. Так, кроме прямого воздействия на мембрану эритроцитов 2,4-ДА, усиливающего перекисное окисление фосфолипидов этих клеток, в организме под влиянием 2,4 - ДА накапливаются продукты ПОЛ, понижается антиоксидантная активность крови и тканей ( И. С. До-вжанский и соавт., 1996 ; В. О. Щепанский, 1996), что также оказывает повреждающее действие на мембрану эритроцитов. Перекисное повреждение мембран эритроцитов, сокращая срок их жизни, способствует разрушению эритроцитов системой фагоцитирующих мононуклеаров.

На интенсивный характер гемолиза эритроцитов у крыс, получавших 2,4 - ДА, указывают также наши морфологические исследования, направленные на выявление железа в кроворазрушающих клетках селезёнки.

Нами обнаружена прямая зависимость между количеством макрофагов с гранулами железа в их цитоплазме от дозы и сроков введения гербицида 2,4 - ДА. Это доказывает, что макрофагические клетки селезёнки отвечают усилением фагоцитоза железосодержащих продуктов, разрушаемых эритроцитов после поступления в организм 2,4-ДА.

Ликвидация анемии к концу опыта (28-е сутки) во всех экспериментальных группах (вывод делался на основании анализа числа эритроцитов и гемоглобина в 1 л крови) позволила предположить, что замедленная активация эритропоэза в костном мозге в первые недели после введения 2,4 - ДА сменилась адаптацией эритрона к умеренному

эис. I. Типичные формы

кислотных эритрограмм при различных дозах 2,4-0А на 14-е сутки (а) и 28-е сутки (б) спыта.

гемолизу, а, возможно, и прямому токсическому действию 2,4 - ДА на костный мозг, и усилением воспроизводства им эритроцитов, приводящему к полному восполнению их дефицита в крови. Так, в поздние сроки наблюдения отмечался подъём правого " крыла" эритро-граммы, указывающий на усиливающийся процесс регенерации красной крови, и нарастание в крови количества эритроцитов устойчивых к ге-молитикам (сдвиг вправо левого крыла ) ( рис. 1 ). Однако, анемия у животных, получавших 2,4 - ДА в дозе ЛД и и на 28-й день обследования носила истинный характер, отсутствие же различий в содержании эритроцитов и гемоглобина в единице объёма крови у опытных и контрольных крыс было связано с параллельным уменьшением ОЦП и ОЦЭ у опытных крыс. Снижение ОЦП и ОЦЭ у этих животных привело к достоверному снижению у них ОЦК. Эта же тенденция к снижению ОЦП была чёткой у всех других обследованных групп крыс и, возможно, также маскировала наличие истинной анемии у этих животных. Можно предположить, что уменьшение объёма плазмы было связано с экссудацией части её в ткани ( вследствие в них воспаления ). Возможно также, что повышенный выход жидкости в ткани у этих животных связан с понижением онкотического давления в плазме, вызванного развитием гипоальбуминемии из - за снижения белковообразовательной функции печени под влиянием пестицидов 2,4-Д. (А. А. Баширов, 1969 ).

Из этих наблюдений следует, что анемия, во всяком случае у группы ЛД 5о, и к 28 - му дню наблюдения всё ещё носит истинный характер, и не компенсируется воспроизводством эритроцитов эритроид-ным ростком костного мозга, то есть у этих животных имела место простая гиповолемия, характеризующаяся одновременным уменьшением ОЦЭ и ОЦП. На замедленную дегенерацию эритропоэза этой группы, в частности, указывает отсутствие роста количества ретикулоцитов в ОЦК у группы ЛД50, несмотря на имеющую место истинную анемию, а также отмеченные выше у этих животных явления гистотоксической гипоксии и пневмонии ( гипоксии гипоксической ), способных активировать эритро-поэз.

Длительное введение 2,4 - ДА крысам не влияло на продукцию эритропоэтина^очками в группах ЛД 5о, 1/2 ЛД 5о, 1/4 ЛД 50 и 1/20 ЛД50. При этом сыворотка крови крыс, интоксицированных 2,4 - ДА не обла-' дала и ингибирующими эритропоэз свойствами. Следовательно, баланс " эритропоэтин - ингибитор эритропоэза " в крови опытных .групп крыс к

концу эксперимента не нарушается. Возможно, сохранность воспроизводства эритропоэтина у опытных крыс связано с особенностью интоксикан-та - он мало, по сравнению с другими тканями накапливается в почках животных, а в корковом веществе их почек, являющимся основным районом этого органа, продуцирующим эритропоэтин (F. Н. Epstein et al., 1994) нами обнаружена высокая активность СДГ. Сохранность же энергообразующих структур митохондрий клеток коркового вещества почек является физиологической основой функционирования как кислородного сенсинга, так и механизма усиления продукции эритропоэтина почками (Н. Acker, 1994).

Исследование состояния эритропоэза в ЭО костного мозга у групп животных с аналогичной продолжительностью интоксикации и количеством введённого экотоксиканта подтвердило предположение о замедленной регенерации эритроидного ростка костного мозга у группы крыс, получавших 2,4 - ДА в дозе ЛД 50 • Так, сниженному ОЦЭ, состоянию истинной анемии у группы ЛД соответствует сниженное на 1/4 по сравнению с контролем, содержание ЭО в костном мозге.

Интересно, что в группе 1/200 ЛД 51) абсолютное количество ЭО на 28-е сутки также оказалось достоверно сниженным до 292,3±16,6x10 / бедро против 417,1 ± 31,3 х 10 3 / бедро, характерных для интактных крыс. Это могло бьггь следствием постепенного накопления экотоксиканта в организме, выразившегося угнетающим эффектом на формирование ЭО. С другой стороны, увеличенное количество ЭО в группах 1/2 ЛД so и 1/4 ЛД so по сравнению с контролем позволило предположить, что увеличение ЭО могло отразить не только нарастание их формирования в костном мозге, но могло быть и следствием торможения созревания эритроидных элементов в их короне. Последнее обстоятельство также приводит к накоплению ЭО в гемопозтической ткани и увеличению их количества (И. Ю. Мельников, 1988 ). Для уточнения этого вопроса нами исследовалось распределение ЭО по классам зрелости, вовлечение КОЕэ в дифференциацию в проэритробласты в ЭО и темп вовлечения КОЕэ в формирование ЭО. Действительно, анализ процентного распределения ЭО у экспериментальных групп крыс обнаружил ( табл. 2 ) статистически достоверное снижение пролиферирующих ЭО I и II класса, и ЭОрек. в группе ЛД 60 по сравнению с контрольными животными. Эта же тенденция изменений в составе ЭО была характерной для групп 1/2 ЛД so и 1/4 ЛД so . Одновременно с торможением волны

Таблица 2 .

Распределение эритробластических островков разных классов зрелости костного мозга (%) у крыс различных групп на фоне интоксикации 2,4-ДА к 28-м суткам (М±т, р).

Группы Процентное распределение ЭО различных классов зрелости

крыс Э01 ЭО II ЭО III ЭО рек. ЭОинв.

Контроль (10) 4,410,3 16,6±1,1 14,6±1,9 16,6±1,8 46,4±2,5

•/« LDso (10) 2,0+0,5 р<0,01 12,8±1,2 р<0,05 13,6±1,7 12,011,6 59,8±2,9 р<0,01

Чг LDjo (10) 2,210,5 р<0,01 15,8Ю,9 18,2±3,7 12,4±2,0 51,4±3,8

LDso "здоровые" (4) "больные" (5) 0,010,0 р<0,01 11,510,5 р<0,02 6,5±3,3 3,0±0,6 р<0,001 79,0±3,8 р<0,01

0,010,0 р<0,01 13,6±2,9 15,2±5,4 5,611,9 р<0,01 65,6±8,7

Примечание:

р рассчитано по отношению к данным контрольной группы; в скобках - количество животных в исследуемой группе.

амплификации и созревания эритробластов в пролиферирующих классах ЭО у этих групп крыс была резко заторможена дифференциация КОЕэ в проэритробласты в ЭО, что иллюстрирует сниженная величина вовлечения КОЕэ в эритроидную дифферекцировку в группах ЛД50.1/2 ЛД50 и 1/4 ЛД (о по сравнению с контролем, также как и сниженное количество КОЕэ, вступившее в дифференциацию в ЭО. Можно полагать, что замедлено было не только взаимодействие КОЕэ с резидуальными макрофагами (на что указывает сниженное количество ЭО I у животных, подвергавшихся интоксикации), но и реконструкция эритропоэза в созревающих ЭО (на это указывает резко сниженный показатель повторного вовлечения МФ ЭО в эритропоэз у интоксицированных животных). Замедленная реконструкция эритропоэза в ЭО сочеталась с изменением функциональной активности эритропоэтинактивных макрофагов костного мозга, на это указывает как изменение функциональных свойств их ли-зосомально - пластинчатого комплекса, так и снижение их способности к реконструкции эритропоэза в инволюцирующих ЭО.

Проведённый анализ парциальных эритрограмм у крыс, подвергшихся интоксикации 2,4 - ДА также позволяет утверждать, что характерным признаком эритропоэза у них оказывается торможение созревания эритроидных элементов в костном мозге и формирования материнских эритроидных клеток ( проэритробластов и базофильных эритробластов I порядка).

Итак, анализ количественных и качественных характеристик ЭО, парциальных эритрограмм у животных, подвергшихся интоксикации 2,4 -ДА, позволяет утверждать, что характерным признаком эритропоэза у них оказывается торможение амплификации и образования новых ЭО и реконструкции эритропоэза в созревающих ЭО, торможение созревания, эритроидных элементов в ЭО костного мозга. Формирование материнских эритроидных клеток ( проэритробласты и базофильные эритроблас-ты I порядка) у этих животных оказывается уменьшенным.

Таким образом, рассматривая в целом изменения в системе эри-трона у животных, подвергшихся воздействию 2,4 - ДА, можно сказать, что эти изменения носят фазный характер.

I фаза изменений в эритроне отличается выраженной активацией гемолиза эритроцитов, который сочетается с торможением эритропоэза в костном мозге, не покрывающем убыль эритроцитов.

II фаза изменений в эритроне при продолжающейся интоксикации характеризуется повышением устойчивости производимых костным мозгом эритроцитов к гемолитикам, что уменьшает дефицит эритроцитов. Однако, одновременно наблюдается сохранение торможения формирования эритроцитов костным мозгом, что приводит к сохранению их дефицита в периферическом русле. Наиболее выражение эти изменения представлены в группе животных, получавших ЛД 60. Они приводят к развитию у них истинной анемии (уменьшение ОЦЭ). Эта же тенденция отчётливо прослеживается во всех остальных группах. |

Создаётся впечатление (табл. 3 ), что для развития острой анемии 1 после введения 2,4 - ДА крысам нужно наличие следующих условий : или вводимая доза препарата должна быть не меньше 21,4мг/кг или ане-мизирующему эффекту 2.4 - ДА должен предшествовать некий период \ " сенсибилизации" системы крови в отношении этого препарата. Если при первом условии, вероятно, ведущим в кроворазрушении оказывается прямое действие препарата на клетки крови и, возможно, активация эритрофагоцитоза через механизмы активации ПОЛ мембраны этих клеток (И. С. Довжанский и соавт., 1996; В. О. Щеланский, 1996), понижение антиоксидантной активности ( В. О. Щепаиский, 1996), то во вто- | ром случае, возможно, могла иметь место индукция обеих процессов и активация системы фагоцитирующих мононуклеаров, в ответ на формирование в тканях искусственного антигена" 2.4 - Д + белок" (С. Д. Жамса-ранова, Г.. Л. Тумуров, 1986 ), с последующей активацией фагоцитоза пониженностойких эритроидных клеток.

Внутрисистемная, внутриклеточная компенсационная перестройка в эритроне следовала во всех случаях за пиком анемии по признакам периферической крови (нарастала продукция стойких к гемолитическому эффекту эритроцитов).

Таким образом, полученный материал позволяет понять известную противоречивость о выраженности анемизирующего эффекта вводимой в эксперименте 2,4 - ДА животным в работах разных авторов (А. И. Горизонтов. 1970 ; Л. В. Боброва, 1980).

Как мы показали, проявление анемизирующего эффекта 2,4 - ДА зависит от количества первоначально введённой дозы, так и продолжительности введения препарата.

Таблица

Степень выраженности дефицита эритроцитов в гемоглобина (в л крови), количество (суммарное) введенного 2,4-ДА в организм крыс при разных дозах и сроках наблюдения.

Доза 2,4-ДА Эритроциты (х 10|2/л) Гемоглобин (г/л) 2,4-ДА(мг/кг)

1 7 14 21 28 1 7 14 21 28 1 7 14 21 28

1ЛЭЯ 0,62 0,77 0,59 0,43 0,07 14,6 15,3 15,6 8.7 +0,1 42,8 229,6 599,2 898,8 1200

'/2 ЬОИ 0,58 0,49 0,58 0,56 0,0 14.2 9,7 8.6 9.4 0.4 21,4 149,8 299,6 449,4 600

'/« из* 0,04 0,42 0,41 0,28 +0,03 5.7 14,4 10,6 7.4 0.4 10.7 74.9 149,8 224,7 300

'/*> 1ЛЭя 0,09 0,13 0,54 0,45 +0,03 +2,9 +1.4 8;6 10,6 +2,9 2.14 14,9 29,9 44,9 60

Чт 1Х>и 0,05 0,01 +0,02 0,59 0,02 0.1 2,3 +2,0 8.1 +1.7 0,21 1.47 2,94 4,41 6

Примечание: степень выраженности дефицита эритроцитов и гемоглобина дано по отношению к данным контроля.

1, 7, 14, 21, 28 - сроки наблюдения. Знаком "+" обозначен прирост показателя по сравнению с контролем.

III. ИЗМЕНЕНИЯ В ЦЕНТРАЛЬНОМ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОМ ЗВЕНЕ ЭРИТРОНА У КРЫС ПОСЛЕ 2 % КРОВОПОТЕРИ НА ФОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ 2,4-ДА

Целью предпринятого исследования было выяснение характера компенсационного эритропоэза в ответ на 2 % кровопотерю у крыс на фоне воздействия различных доз 2,4 - ДА через 24, 48 часов, 3 - и, 7 - е, 10-е, 14-е, 18-е, 21-е сутки.

Анализ этих опытов показал, что скорость восстановления показателей периферической крови зависила от дозы интоксикации гербицидом 2,4 - ДА крыс. Общей особенностью для всех исследованных групп была замедленная регенерация потерянных в связи с 2 % кровопотерей эритроцитов, то есть эритропоэз, развивающийся в ЭО в ответ на 2 % кровопотерю зависил от того, на фоне какой интоксикации была она произведена. Доза ЛД м вызывала ослабленный ответ эритропоэза во все сроки исследования на кровопотерю, а 1/20 ЛД 50 в ранние сроки после кровопотери не препятствовала компенсаторному усилению формирования 30, но в поздние сроки этот процесс формирования ЭО в костном мозге был снижен, что также указывает на сужение компенсаторных резервов эритрона.

С целью выяснения причин сниженного компенсаторного ответа костного мозга крыс, подвергшихся интоксикации 2,4 - ДА на острую кровопотерю, мы исследовали характер эритропоэтических межклеточных взаимодействий и кинетику эритропоэза в ЭО костного мозга этих животных, в разные сроки после кровопотери. Для эксперимента были избраны группы крыс, получавшие интоксикант в дозе ЛД80 и 1/20 ЛДы , контролем служили интактные крысы.

Определение абсолютного количества ЭО показало, что при интоксикации организма 2,4 • ДА происходит замедление образования ЭО в костном мозге после кровопотери в сравнении с контрольными животными.

Оценка митозов эритробластов содержащихся в "короне" ЭО, и не связанных с ЭО, показало, что введение' 2,4 - ДА не нарушает правильной организации эритропоэза в гемопоэтической ткани костного мозга, то есть у интоксицированных крыс эритропоэз по прежнему протекал в ЭО, поскольку увеличения количества делящихся эритробластов вне ЭО у них. не происходило. У крыс, получавших гербицид 2,4-ДА (группа крыс, получавшая дозу 1/20 ЛД «а ), повышалась чувствительность

эритробластов ЭО к кровопотере: в ответ на неё интенсивность митозов эритробластов в " короне" ЭО крыс, получавших 2,4 - ДА, была более выражена, чем у контрольной группы (табл. 4).

Нарастание числа митозов эритробластов после кровопотери у крыс на " фоне" интоксикации 2,4 - ДА, указывает на изменение выраженности реакции молодых клеток ( эритробластов ), возникающей под влиянием этого препарата, на раздражитель (эрнтропоэтин, метаболические сдвиги в костном мозге, возникающие в ответ на гипоксию). Возможно, аналогом этого процесса является более интенсивное новообразование лимфоцитов у интоксицированных 2,4 - ДА животных в ответ на введение пирогенала.

Детально проанализировать изменения эритропоэза в ЭО после 2 % кровопотери позволили расчётные показатели ( рис. 2). Они отчётливо свидетельствовали об угнетении формирования новых ЭО на 1 -14-е сутки в группе животных, получавших ЛДИ. Одновременно в эти сроки(достоверно на 2-е, 7-е и 14-е дни) был снижен темп вовлечения КОЕэ в эритроидную дифференцировку, что свидетельствовало о замедлении темпа дифференцировки КОЕэ, взаимодействующих с макрофагами - резидентами костного мозга, в п роэритробласты на фоне интоксикации 2,4 - ДА. Резкое угнетение повторной реконструкции эритропоэза на основе ЦМФ инвопюцирующих ЭО в группе ЛД ю наблюдалось на 7 -14 - е сутки после кровопотери. Доза 1/20 ЛД {а в ранние сроки после кровопотери не препятствовала компенсаторному усилению формирования ЭО, но в поздние сроки после неё этот процесс формирования ЭО костного мозга был также снижен.

Анализ распределения ЭО по классам зрелости (рис. 3) у иссле-. дуемых групп животных показал, что у групп ЛД 5о и 1/20 ЛД *о после кровопотери до 14-го дня включительно было снижено содержание ЭО I класса и до 3 - го дня - ЭО II класса. Однако, одновременно в 1-е и 2 - е дни после кровопотери у этих крыс содержание ЭО III класса и ЭОинв. не отличалось от величин, регистрируемых у контрольных животных. На 7 -14 - е дни содержание ЭО III в костном мозге у. обеих групп было выше, чем в контроле.при одновременно одинаковых значениях величин ЭОинв. во всех трёх группах. Подобные изменения в формуле ЭО расцениваются как торможение созревания их эритроид-ной короны (И. Ю. Мельников, 1988; Б. В. Медяник 1993 ; Ю.М.Захаров, 1996).

Таблица 4.

Митотичесш активность эритроидньос клеток ЭО к вяе ЭО у контрольных я ннтокснциров&нных различными дозами 2,4-ДА крыс в динамике кровопоТери (М±т)

Срок кровопотери Показатели Ивтактные крысы (п=3) Экспериментальные' группы 1 сутки (П=5+4+5) 2 сутки (п=5+4+4) 3 сутки (П=*+4+4) 7 сутки (11=5+4+5) 14 сутки (п*5+4+5)

Митозы эритрощщьп клеток ЭО на 100 ЭО 43,0112,5 Контроль п 1/20 ЫЭ 50 п 1$50 и •> •> |30,2±28,б 0,01 169,0±19,4 0,01 75,618,3 <0,01 83,2110,2 0,01 120,0117,<1 0,01 98,5130,8 8»,4±16,4 116,5118,4 0,05 126,3124,9 71,75±18,6 183,519,7 0,01 0,01 62,2113,0 <0,01 38.815.6 <0,05 40.516.7 50,415,6

Митозы эрктроидных клеток вне ЭОна 100 ЭО 6,313,2 Контроль Г1 1/20 ЬЛ 50 п Ь&О и. и ■I 4,6±1,3 3.5Ю.95 4,810,66 2,0±0,63 2,511,5 3,811,4 3,8±0,73 3,0±0,91 3,011,2 2,810,75 1,810,8 2,<Ж>,45 <0,05 1,210,2 <0,05 о,о±о,о <0,05 0,8410,4 <0,01

Примечание: рг дано в сравнении с ннтагтной группой;

рз дано в сравнения с контролем на кадцые сутки после кровопотерк.

р] дано в сравнении между 1/201ЛЭ50 и Ш50 на каждые сутки после кровопотери

В таблице на сроках кровопотери указано в скобках количество животных 3 групп.

eso

570

J90 330

А

jm.

Контроль

то loso

LD50

Q t сутки H2 супа» аз супа» П7 сутки Я14 cynot !

165

140 -

iis 4-ю

1S

I

Контроль

1720 LD50

□ 1 cynai П2 сутки

□ Э сутки

□ Тсуга

014 супя

1,2 1

0.S

0.6 -j— 0.4 0,2 4-

EL

Контроль

1/20 LOSO

LOSO

□ 1 суп»

B2cyim . □Эсулм

□ 7 супм

□ 14 суп»

Рис. 2. Количество КОЕэ, вступивших в дифференциацию в ЭО (х 1000/бедро) - А; величина вовлечения КОЕэ в эритроидную днфференцировху (х 1000/бедро) -¡а; повторное вовлэтение МФ ЭО в эритропоэз (усл. ед.) - В у крыс различных групп в динамике после 2% хровопотери. Выделенные обрамлением столбцы - достоверность в сравиепии с результатами контрольной группы на 1 день.

16 14 12 10 8 6 4 2 0

А

Fl

ß

Г«' ¡i

ш

im

et

1 суши

2 сутки

3 сутки

Теуим

14супи

q Контроль

Q1/20 LD50

□ LOSO

22 19 16 13 10 7

4

Б

1 день

2 день

3 день

7 день

14 день

О Контроль

01/20 LD50

□ LD50

1 день

2 день

3 день

7 день

Ja

14 день

■ Контропь

Q1/20 L050

□LD50

Рис. 3. Распределение ЭО I класса (А); II клас& (Б); III класса (В); Эр„. (Г) и ЭОшп. (Д) костного мозга (%) у крыс различных групп в динамике после 2% кровопотери. Выделенные обрамлением столбцы - достоверность результатов.

Продолжение рис. 3.

38

1 день 2 день 3 день 7 день

■ Конгрогъ

□ 1/20 LD50

□ LD50 .

81

21 д

ш

1 день 2 день ' 3 день 7 день 14 день

| □ Контроль □ 1/20 LOSO □ LD50 |

Таким образом, у животных группы ЛД 50 и 1/20 ЛД 5о имело место торможение созревания нормобластов на участке перехода 30 III- в ЭОйнв.

Учитывая, что одновременно, у крыс после кровопотери, произведённой на фоне 2,4 - ДА в первые дни после неё ретикулоцитоз выражен слабее по сравнению с контролем, можно полагать, что и созревание ЭОинв., являющихся основным источником ретикулоцитов, поступающих в кровь, у этих животных заторможено.

Большее, чем в контроле, содержание ЭОрек. у крыс групп ЛД ¡о и 1/20 ЛДбо на 1,3-и сутки после кровопотери, равная цифрам контроля, их содержание на 7 - е сутки после неё свидетельствует, что пополнение пула вновь формирующихся ЭО в костном мозге в эти сроки идёт за счёт большего присоединения КОЕэ к макрофагам ЭОинв., чем к резидуальным макрофагам костного мозга этих животных. В последнем случае это поддерживало бы рост количества ЭО I. Однако, абсолютное количество ЭО, формирующихся на основе эритропоэза в ЭО I в кроветворной ткани бедренной кости интоксицированных крыс было снижено, по сравнению с контролем.

Таким образом, интоксикация организма крыс аминной солью 2,4 - Д оказывает разнообразное действие на эритропоэз: под влиянием 1/20 ЛД 5о повышается митотическая активность эритробластов ЭО, но снижается интенсивность контактов КОЕэ и макрофагов, уменьшающая формирование ЭО, замедляется созревание эритробластов в " короне" ЭО и освобождение из них ретикулоцитов. 2,4 - ДА, введённая в дозе ЛД ¡о, оказывается уже способной не только нарушать поддерживающие эритропоэз клеточно - клеточные взаимодействия в костном мозге, но и понижает митотическую активность эритробластов " короны" ЭО, формирующуюся в ответ на эритропоэтический стимул.

Следствием указанных перестроек в эритроне крыс, получавших 2,4 - ДА оказывается замедление регенерации эритроцитов после 2 % кровопотери.

IV. СОСТОЯНИЕ БЕЛОЙ КРОВИ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ВВЕДЕНИЯ 2,4-ДА.

В ходе экспериментов выявлено, что во всех экспериментальных группах определялся статистически значимый лейкоцитоз. Причём при ЛД 5о, 1/2 ЛД 50 и 1/4 ЛД50 максимальный лейкоцитоз у крыс более всего проявлялся на 7-е сутки, а при 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД50-на 14-е

сутки, хотя некоторое увеличение их количества в 1 л крови отмечалось при последних через 24 часа после введения 2,4 - ДА. Указанный характер изменений в составе белой крови после введения 2,4 - ДА позволяет предполагать, что они развиваются в ответ на нарастающее повреждение тканей внутренних органов и,. возможно, формирование в последних искусственного антигена" 2,4 - Д + белок". Возможность образования этого соединения показана С. Д. Жамсарановой и Г. Л. Тумуро-'вым (1986).

Отмеченный лейкоцитоз в опытных группах был связан как с увеличением абсолютного количества нейтрофилов, так и лимфоцитов в крови, на что указывают показатели миелограмм: у крыс имело место в первые 2 недели опыта ускоренное созревание и выход нейтрофилов на периферию. К 28 - м суткам опыта отмечалось снижение сегменто-ядерных нейтрофилов и увеличение молодых форм клеток в нейтро-филограмме костного мозга, однако при этом, нарастания процента миелобластов и промиелоцитов в ней не обнаруживалось, что, возможно, указывает на торможение новообразования молодых клеток ней-трофильной серии в костном мозге, как и их созревания в поздние сроки наблюдения под влиянием интоксикации 2,4 - ДА.

Лимфоцитоз также сопровождался отчётливыми изменениями в содержании лимфоидных элементов в костном мозге и селезёнке - в костном мозге уменьшалось количество лимфобластов, пролимфоцитов и лимфоцитов во все сроки наблюдения, имело место усиление трансформации лимфоцитов костного мозга в плазматические клетки, в селезёнке снижалось количество лимфобластов.

При постоянном лимфоцитозе в течение эксперимента к 28 - м суткам при морфологическом исследовании обнаружена лимфоцитарная инфильтрация ткани тонкого и толстого кишечника, в ней регистрировались очаги размножения лимфоидных клеток. Вероятно, с одной стороны, уменьшение количества лимфоидных элементов в костном мозге и селезёнке, отражает их выход в кровь и концентрирование в различных повреждённых тканях. С другой стороны, уменьшение материнских лимфоци-тарных клеток в костном мозге и селезёнке могло быть следствием депрессивного эффекта 2,4 - ДА и её производных на эти клетки. Косвенным указанием на такую возможность является обнаруженное нами снижение активности СДГ и а - ГФДГ, нарастание апоптоза в лимфоцитах после введения 2,4 - ДА.

Что касается эозинофильных лейкоцитов, то в первые 14 дней изменения их абсолютного количества почти у всех обследовавшихся групп ив отмечалось, а к концу эксперимента эозинофилия была характерным признаком, для всех наблюдавшихся групп, кроме ЛД 50 ( возможно последнее отражает более глубокие проявления интоксикации в системе крови у этой группы животных) и 1/200 ЛД 8о и, вероятно, отражало участие эозинофиль-ной серии костного мозга в реакции против искусственного антигена "2,4 - Д + белок" в тканях.

Обращает на себя внимание, что ответ белой крови в первые сутки на введённый интоксикант в малых количествах (1/20 ЛД50 и 1/200 ЛД5о) характеризовался абсолютной нейтрофилией, изменение же абсолютного количества лимфоцитов в этот период в данных группах отсутствовало до 7 - х суток наблюдения. В последующем в этих группах, также как и в группах, получавших интоксикант в больших дозах, развивался нейтрофиль-ный лейкоцитоз и лимфоцитоз. Можно думать, что зарегистрированные нами изменения лейкоцитов в группах 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД 5р на первые сутки после введения препарата отражают формирующуюся общую неспецифическую реакцию ( стресс - реакцию ) в системе крови на введение малых доз гербицида.

Отсутствие этих характерных признаков стресс - реакции у животных, получавших ЛД 50, 1/2 ЛД бо в первые сутки после введения препарата, равно как и меньшая выраженность нейтрофипьного лейкоцитоза у этих животных, позволяет связать это с депрессивным эффектом больших доз 2,4 - ДА на нейтрофильно - гранулоцитарный ряд, подтверждением этого вывода может служить и сниженное количество материнских клеток нейтрофильной серии в миелограммах животных, получивших большие дозы 2,4-ДА.

Развитие воспаления в органах, характеризуемого выраженным представительством в них гистиоцитарных инфильтратов объясняет, на наш взгляд, регистрируемый в периферической крови животных абсолютный моноцитоз. Взаимосвязь между этими феноменами считается установленной ( Р. А. СазэНсЛ, 1986 ; М. А. исМтап, 1986).

Выходу лейкоцитов в ткани, поврежденные отложением 2,4 - Д и её метаболитов, способствовало увеличение проницаемости сосудов легких, почек, печени, толстого и тонкого кишечника. Именно в этих органах в результате токсического действия 2,4 - ДА гистохимическими методами отмечалось уменьшение активности кислых ГАГ, что расценивается как сниже-

ние содержания протеогликанов в базапьной мембране микрососудов, вызывающей повышение их проницаемости (В. В. Серов и А. Б. Шехтер, 1981; Л. И. Слуцкий, 1984 ).

Воздействие 2,4 - ДА в подостром эксперименте вызывает помимо существенных изменений в количестве клеток крови (лейкоцитоз, ней-трофилёз, лимфоцитоз, моноцитоз ) и изменения в их метаболизме. Выявляется преимущественно снижение активности окислительно - восстановительных ферментов - СДГ и а - ГФДГ лимфоцитов на 14 - 21 - е сутки после введения 2,4-ДА в больших дозах и наоборот, повышается активность гидролитических ферментов (кислой фосфатазы лимфоцитов и щелочной фосфатазы нейтрофилов, а также пероксидазы ней-трофилов при этих же дозах введённого препарата).

Результаты цитохимических методов исследования клеток крови совпадают с результатами гистохимических исследований фермента СДГ в тканях органов экспериментальных крыс. Следовательно, снижение активности окислительно - восстановительных ферментов отражает уменьшение интенсивности энергетических процессов в митохондриях клеток тканей разных исследовавшихся нами органов крыс, нарушение функционирования в них глицерофосфатного шунта, усиление катаболических процессов ( Г. И. Белоскурская и Р. М. Бапмахаева, 1982 ). Эти наблюдения позволяют заключить, что природа изменения активности ферментов, обеспечивающие энергообразовательные процессы, под влиянием 2,4 - ДА не зависило от тканевой специфичности, но определялась химическими свойствами 2,4 - Д и её метаболитов.

Активность гидролитических ферментов (КФ лимфоцитов и ЩФ нейтрофилов), напротив, возрастает. Основной причиной, определяющей высокую активность ЩФ в нейтрофилах в ходе эксперимента является возрастание выхода сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга в кровь и их реакцией на повреждение тканей, вызванные введением 2,4 - ДА. Подобное повышение активности ЩФ нейтрофилов при деструктивных патологических процессах в тканях ( острый аппендицит, пневмония, перитонит, холецистит и др.) описаны М. Г. Шубич, Б. С. Нагоевым (1980).

Увеличение активности кислой фосфатазы, являющейся маркерным ферментом лимфоцитов, также отражает степень гипоксического повреждения тканей и дестабилизации лизосомальных мембран их клеток у опытных крыс (С. А. Козлов, 1980).

Действительно, в наших экспериментах исследование фагоцитарной реакции клеток крови у крыс, получавших 2,4 - ДА, показало, что введение препарата в токсических и субтоксических дозах оказывает угнетающее влияние на фагоцитоз нейтрофилов уже в ранние сроки, то есть на 7 - е сутки. При продолжающемся введении препарата 2,4 - ДА наблюдалось повышение функциональной активности нейтрофилов { к 14-м суткам). Однако, затем отмечалось вторичное снижение фагоцитоза нейтрофилами при всех исследовавшихся нами дозах 2,4 - ДА к 21-м суткам. Восстановление показателей фагоцитарной активности нейтрофилов наблюдалось к концу эксперимента.

Снижение как фагоцитарного числа, так и индекса фагоцитоза, характеризует депрессивное влияние 2,4 - ДА на фагоцитарную активность зрелых нейтрофилов в крови. Поэтому, можно предположить, что сниженная функциональная активность сегментоядерных нейтрофилов периферической крови, компенсировалась поступлением в периферическую кровь из костномозгового депо молодых нейтрофилов, обладающих сохранной фагоцитарной активностью к 14 - м и 28 - м суткам.

Нами изучена активность НАДФН - оксидазы нейтрофильных лейкоцитов крови по показателю спонтанного НОТ - теста. Окислительный метаболизм нейтрофилов, судя по НСТ - реакции, в ранние сроки (7-е сутки ) наблюдения снижался синхронно уменьшению фагоцитарной активности этих клеток, в последующем (14-21 - е сутки ) повышался во всех опытных труппах. К 28 - м суткам в группах крыс, получавших малые дозы 2,4 - ДА наблюдалось достоверное синхронное повышение фагоцитоза и окислительного метаболизма, а при токсических дозах к этому сроку у животных отмечалось повторное снижение НСТ - показателя, хотя фагоцитарная активность клеток восстанавливалась.

Следовательно, 2,4 - ДА, введённая животным во всех концентрациях воздействует на метаболизм фагоцитирующих клеток. При длительном введении (до 28-ми суток) 2,4-ДА в высоких концентрациях угнетается окислительный метаболизм ( НСТ - показатель резко снижен ), а применение малых доз 2,4 - ДА в этот срок приводит к повышению метаболической активности нейтрофилов, превышавшей показатель контроля.

Полученные данные являются ещё одним доказательством способности 2,4 - ДА в больших дозах проявлять иммунотоксические свойства,

что связано со снижением интенсивности окислительного метаболизма в фагоцитах.

Снижение при воздействии 2,4 - ДА способности нейтрофилов к восстановлению нитросинего тетразолия свидетельствует об угнетении гексозомонофосфатного шунта в этих клетках. Угнетение оксидазных систем, генерирующих бактерицидные начала (Н202, Ö2,i02), может обусловить в конечном итоге угнетение киллинговой системы и переваривающей способности нейтрофилов (А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский, 1989). Данное предположение подтверждается сочетанием компенсаторного нейтрофильного лейкоцитоза у опытных крыс со снижением окислительного метаболизма и эффективности фагоцитоза, то есть резервных способностей нейтрофилов. Известно, что клетки крови ( нейтрофилы, макрофаги) располагают антиоксидантной системой, усиливающей внутриклеточный метаболизм супероксида, перекиси водорода и других ок-сидантов, то есть способной предупреждать чрезмерное накопление ок-сидантов в клетках крови и повреждение ими здоровых тканей (С. F. Nathan, 1985; H.W. Murray et al„ 1985; A. Bartocci et al„ 1987 ). Эта система представлена супероксидисмутазой, глютатионом, глютати-онпероксидазой, глютатиондисульфидредуктазой, каталазой и пероксида-зой. Поэтому, отмеченное нами значительное повышение активности пероксидазы нейтрофилов на фоне сниженного оксидативного метаболизма, обеспечивающего функцию защитного " цитотоксического механизма " этих клеток, также понижает оксидативную цитотоксичность нейтрофилов.

Недостаточность оксидазных систем в нейтрофилах у животных, затравленных 2,4 - ДА, по - видимому, компенсируется в определённой степени мобилизацией бескислородных путей метаболизма, свидетельством чего является активация в них гидролитических ферментов.

Анализ интерфазной активности рибосомных генов лимфоцитов крыс, получавших 2,4 - ДА, проведённый с помощью Ад - ЯОР реакции выявил снижение доли Ад - негативных клеток ( Ад - лед ), увеличение значений нуклеолярного коэффициента ( NK ), размеров Ад - положительных ядрышкообразующих районов хромосом (К 2, SAg ) в нуклеолах лимфоцитов подопытных животных по сравнению с лимфоцитами крыс контрольной группы. В тоже время у опытных крыс отмечалось снижение количества Ад - положительных ЯОР ( NAg ) в лимфоцитах.

Изменения вышеназванных параметров лимфоцитов опытных крыс имели разную степень выраженности и время проявления, что определялось дозой вводимого животным вещества - 2,4 - ДА. Так, применение дозы ЛД so, 1/2 ЛД so и 1/4 ЛД 50 приводило к выявлению этих изменений уже через час после начала опыта, сохраняясь вплоть до конца эксперимента. При использовании малых доз ( 1/20 ЛД5о и 1/200 ЛД50) изменения в морфологии лимфоцитов обнаруживались через сутки после введения препарата ( NAg ), некоторых показателей - на 14-е сутки (Кг, NK) и даже на 21-е сутки ( Ад - пед ). Указанные изменения в лимфоцитах сохранялись в этих группах крыс до 28-х суток.

Обнаруженные нами изменения морфологии нуклеолярного аппарата лимфоцитов после введения 2,4 - ДА животным является неспецифическим отражением ядрышковой сегрегации. В результате последней транскрипционная активность в нуклеолах клеток не увеличивается - они отличаются от обычных лимфоцитов только особенностями нуклеологе-неза (В. М. Погорелов, 1992).

Снижение доли ( % ) Ад - негативных клеток, то есть увеличение в периферической крови количества лимфоцитов с Ад - положительными ядрышкообразующими районами хромосом в'нуклеолах, можно объяснить компенсаторной активацией резервных лимфоцитов и подключением к биосинтетическим процессам в этих клетках дополнительных копий рибосомных генов (Л. И. Барановская, 1989; H.A. Ляпунова, H.A. Еголи-на, 1990).

Возможно, что такие изменения нуклеологенеза лимфоцитов на начальных этапах действия 2,4-ДАна клетки крови носят компенсатор- ный характер. Однако, функциональная активность " сохранных " клеток в конечном итоге истощается и постепенно наступает их необратимая деструкция и гибель.

Ядрышковая сегрегация, повышенная аргентофильность структур ЯОР являются результатом тех изменений, которые необходимы дляп поддержания повышенной метаболической активности клетки без клеточного деления, то есть восстановления ДНК и сопутствующего разрыхления структуры хроматина (Z. Somosy, A. Pikli, Т. Kubasova et al., 1985). Все эти события, происходящие в клетке, являются симптомами её повреждения и в последующем гибели клетки по типу апоптоза.

Таким образом, в проведённых исследованиях выявлено, что в результате воздействия на экспериментальных животных 2,4-ДА в токск-

ческих и субтоксических дозах, у этих животных увеличивается доля лимфоцитов, которые проходят все стадии запрограммированной клеточной гибели ( апоптоза ). В результате апоптоза происходит элиминация повреждённых клеток. В связи с этим можно полагать, что отмеченное снижение активности окислительно - восстановительных ферментов -СДГ и а - ГФДГ и, наоборот, нарастание активности гидролитических ферментов, были следствием не только прямого действия 2,4 - ДА и его метаболитов на эти структуры лимфоцитов, но могли быть также и отражением фаз апоптоза лимфоцитов.

Оценка лейкоцитарного резерва при воздействии 2,4 - ДА в дозах ЛД 50, 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД 50 на 14-е и 28-е сутки опыта проводилась по реакции кроветворной ткани на пирогенал. Через 1 час после введения пирогенала в дозе 1 мг / кг массы тела, как в контрольной, так и во всех опытных группах, наблюдался подъём I ° - на 2,6 ° у контрольных и 2,8°-3°С-у подопытных крыс, до введения пирогенала 14 дней получавших 2,4 - ДА. Через 6 часов после введения пирогенала у контрольной группы регистрировался уже достигнутый уровень ректальной температуры, но в опытных группах крыс отмечалось её повышение по сравнению со значениями, обнаруженными через 1 час после инъекции пирогенала.

У крыс, в течение 28 - ми дней получавших 2,4 - ДА, их температурная реакция на пирогенал была ещё более выраженной, по сравнению с контрольными животными - подъём 1° у ЛДбо, 1/20 ЛД 5о и 1/200 ЛД 50 достигал соответственно 33,0 " ± 0,12 0 С, 33,1 ° ± 0,1 ° С, 32,6 0 ± 0,230 С ( контроль - 31,2 ° ± 0,18 0 С ) через час после введения пирогенала. Столь выраженная температурная реакция у групп ЛД 50 и 1/20 ЛД 50 сохранялась и через 6 часов после инъекции пирогенала.

Количество лейкоцитов в контрольной группе составило 15,9 + 0,95 х109/л до введения пирзгенапа, а через 6 часов после инъекции-39,2±3,16 х 109/л, то есть выросло в 2,6 раза.

На 14-е сутки введения гербицида 2,4-ДА в группах с дозами ЛД 50, 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД 50 до инъекции пирогенала уже наблюдался умеренный лейкоцитоз - 21,5 ± 1,44 х 10 '/л ; 26,6 ± 1,24 х 10 9 / л и 22,7 ± 1,44 х 10 9 / л соответственно дозам гербицида.

Через 6 часов после введения пирогенала происходило увеличение количества лейкоцитов в периферической крови этих групп крыс почти в 2 раза - соответственно до 50,4 ± 4,94 х 10 5 / л ; 50,1 ± 2,15 х 10 9/ л и

54,5±2,88х 109/л. На 28-е сутки наблюдался более выраженный лейкоцитоз (67,0+5,74x10®/л; 66,0+2,58x10® /л и 69,2+3,76x10® /л соответственно опытным группам), то есть количество лейкоцитов на 1/3 было больше в периферической крови, чем при тех же дозах на 14-е сутки, и почти в 1,8 раза выше, чем у контрольных животных ( 39,2 ± 3,16 х 10 ®/л ). Этот лейкоцитоз у подопытных животных формировался за счёт абсолютных нейтрофилии и лимфоцитоза.

Остальные клетки лейкоцитарного ряда ( эозинофилы, моноциты, базофилы) существенных изменений а их содержании в крови на введение пирогенапа не обнаруживали.

Таким образом, исследования с пирогенапом позволяют утверждать, что животные, подвергающиеся интоксикации 2,4 - ДА сохраняют значительный функциональный костномозговой резерв нейтрофилов. Одновременно отмечается не только повышенная активность нейтро-фильного, но и лимфоцитарного резерва, большая выраженность температурной реакции у опытных групп животных на пирогенный раздражитель в сравнении с интактными крысами

Наши опыты показали, что организм располагает значительными компенсационными возможностями при поступлении в него 2,4 - ДА: при его интоксикации даже в дозах ЛД 5о, 1/2 ЛД 50 и 1/4 ЛД 5о. это выра-. жается в улучшении клинического состояния животного, его соматического статуса, компенсационных реакций его крови, несмотря на продолжающееся поступление интоксиканта в организм. Однако," плата " за эту временную стабилизацию функций, стабилизацию гомеостазиса оказывается резкое умёньшение функциональных резервов систем организма. Доказательством этого является замедленное восстановление красной крови после кровопотери, увеличение объёма апоптоза лимфоцитов, понижение фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов, Нарушение реактивности терморегуляторных центров гипоталамуса, приводящей к выраженной пирогенной реакции на поступление пирогенала.

Можно думать, что неоднократно отмеченная разными авторами склонность к анемизации или появление, анемии у людей, подвергшихся . воздействию гербицидов, вторичные иммунные дефициты, повышенная склонность к остро протекающим воспалительным заболеваниям, затяжное течение хронических заболеваний связано с отмеченными выше изменениями реактивности организма и его систем под воздействием интоксикации гербицидами группы 2,4 - Д.

. I • • - „

В ходе наших исследований установлена четкая зависимость между глубиной сдвига в системе крови и интоксикацией 2,4 - ДА. Этот же параллелизм был отмечен между нарушением структуры внутренних органов, характером в них метаболических сдвигов и выраженностью воспалительных реакций с одной стороны и количеством введенного в организм ин-токсиканта с другой. Можно сказать, что лишь введение интоксиканта в большой дозе вызывает быстрый, остроразвивающийся ответ со стороны крови, проявляющийся развитием гемолитической анемии, с присоединяющимся позже нейтрофильным лейкоцитозом, лимфоцитозом и моно-цитозом. Малые дозы интоксиканта ( 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД 5о) проявляют анемизирующий эффект и вызывают развитие лейкоцитоза, также ней-трофильного и лимфоцитарного, а также моноцитоза много позже. Компенсационные резервы системе крови при введении 1/20 ЛД 50 и 1/200 ЛД ¡я интоксиканта оказываются более сохраненными по сравнению с интоксикацией вызванной большими дозами препарата (1/2 ЛД ¡о). Таким образом, в ходе проведенных экспериментов удалось разработать экспериментальную модель нарушений в системе крови, вызванной интоксикацией гербицида 2,4 - ДА в разных дозах. Следует указать, что подобных аналогов моделей для работы с интоксикантом - аминной солью 2,4 - дихлорфенокси-уксусной кислоты в доступной нам литературе мы не обнаружили.

Общие черты, механизма нарушений в системе крови, их взаимосвязь с нарушениями функций других систем и компенсаций в системе крови этих сдвигов представлены нами в нижеследующей схеме.

2,4 - ДА и ее метаболиты

Формирование искусственного антигена

Экссудация жидкой части плазмы в ткани(7)

Повреждение эритроцитов

I

Торможение ютеточно-клеточных эритропоэтических взаимодействий в костном мозге

Гемолиз эритроцитов, избыток отложения Ге** _в тканях_

Торможение формирования ЭО,

торможение созревания _эрятробласгов в ЭО_

кроветворная ткань ^/Лимфоцитоз

> Гипоальбумннемия Анемия

у '

1 Уменьшение ОЦП 1 1 Уменьшение ОЦЭ 1

Уменьшение продукции _эритроцитов__

/

Усиление апоптоза, нарушение метаболизма _лимфоцитов_

Снижение неспецифической резистентности организма и иммунитета

—> Нейтрофияия

Моноцитоз

Функциональная недостаточность нейтрофилов

Функциональная недостаточность махрофагов\моноцитов ***

Компенсация

~ 1)- Формирование эритроцитов

устойчивых к действию 2,4-ДА и •—метаболитов.

, Снижение продукции трансхо-I баламииов(7)

Инфильтрация тканей лимфоцитами и _макрофагами

Гиперхро»<ня эритроцитов

Нарушение транспорта витамина Вц (7)

2). Увеличение костно-мозгового резерва нейтрофилов.

3). Повышение реактивности лимфоидной ткани к бактериальному эндотоксину.

4). Более выраженная лихорадха при действии пирогенов на .организм.

Л

О

♦ - Жамсаранова С. Д., ТумуровГ. Л. (1986). -Баширов А. Л. (1969).

- Материалы получены Имельбаевой Э. А. в совместных исследованиях (1995).

и м

ВЫВОДЫ

1. Изменения количественных и качественных параметров клеток крови, быстрота проявления этих нарушений у крыс зависит от дозы и экспозиции 2,4 - ДА. Быстро возникающие (через сутки после введения препарата ) репрезентативные изменения в системе красной крови ( анемия), с последующим присоединением нейтрофильного, лимфоцитарно-го и моноцитарного лейкоцитозов вызывает введение 2,4 - ДА в дозе 21,4-42,8 мг/кг массы тела крысы. Малые дозы (1/20 ЛД50 и 1/200 ЛД50) обнаруживают анемизирующий эффект после введения суммарной дозы 2,4-ДА 4,41-29,9 мг/кг, лишь после предварительной 2-3 недельной сенсибилизации организма животного введением этого препарата. На введение 2,4 - ДА в малых дозах белая кровь отвечает в первые дни поступления интоксиканта в организм как признаками стресс - реакции в системе крови, так и ответом, связанным с повреждающим действием 2,4-ДА на ткани и клетки крови. При введении интоксиканта в больших дозах преобладает ответ лейкоцитов на повреждающий ткани эффект 2,4-ДА.

2. У животных, подвергнутых интоксикации аминной солью 2,4 - Д развиваются дозозависимые по выраженности и времени развития гематологические нарушения, характеризующиеся ускоренным разрушением эритроцитов, торможением их новообразования в костном мозге, умеренным абсолютным нейтрофильным лейкоцитозом, абсолютным моноцитозом и лимфоцитозом с признаками активации иммуноцитов в тканях.

3. Анемия при интоксикации крыс 2,4 - ДА носит фазовый характер. Б I фазе её резко выраженным оказывается процесс кроворазрушения, протекающий на фоне сниженной компенсационной реакции костного мозга на анемию. II фаза анемии характеризуется формированием костным мозгом популяции эритроцитов устойчивых к действию гемоли-тиков, в. её развитии ведущим оказывается пониженное воспроизведение эритроцитов костным мозгом, анемия носит истинный характер.

4. Увеличение кроворазрушения у животных, подвергнутых действию интоксиканта, доказывается снижением кислотной и осмотической резистентности эритроцитов, усиленным отложением гемосидерина в селезёнке. Основой нарушенного новообразования эритроцитов в кост-

ном мозге является заторможенная комплексация КОЕэ с центральным макрофагом ЭО, замедляющая формирование ЭО в костном мозге, торможение созревания эритроидных элементов в "короне" ЭО.

5. Интоксикация 2,4 - ДА в дозах 1/2 ЛД 5о и 1/20 ЛД 5о ограничивает функциональные резервы костного мозга при кровопотере, восстановление эритроцитов и гемоглобина после неё у крыс на фоне интоксикации 2,4 - ДА оказывается резко замедленным. Основой этого феномена является сохраняющееся и после кровопотери нарушение клеточ-но - клеточных эритропоэтических взаимодействий в костном мозге ин-токсицированных крыс. Компенсационные резервы системы крови на кровопотерю при интоксикации 2,4 - ДА оказываются более сохранёнными при введении малых доз (1/200 ЛДм) интоксиканта.

6. Интоксикация 2,4 - ДА понижает функциональную активность воспроизводимых костным мозгом нейтрофильных лейкоцитов, что доказывается синхронными фазовыми изменениями их фагоцитарной активности и окислительного метаболизма, активности щелочной фосфатазы и пероксидазы. Эти изменения отражают компенсационные, внутрисистемные реакции нейтрофильной серии клеток на интоксикант и зависят от его введенной в организм дозы.

7. Сроки появления, выраженность и длительность циркуляции в периферической крови лимфоцитов с признаками ядрышковой сегрегации, являющейся неспецифическим отражением интерфазной гибели клеток - апо'гггоза, находятся в прямой зависимости от дозы вводимого препарата 2,4 - ДА крысам.

8. Характеристики нуклеолярного аппарата ( количество, размеры и распределение ядрышек и Ад - ЯОР) изменяются уже в пределах первых суток после введения 2,4 - ДА и могут быть использованы для раннего выявления интоксикации организма препаратами 2,4-Д.

9. Введение интоксиканта усиливает реакцию депонированных в костном мозге нейтрофилов и лимфоидной ткани на пирогенап.

10.Накопление 2,4 - Д и её производных в различных тканях, в том числе защищенных гисто - тематическими барьерами изолирующего типа (головной мозг, семенники ), указывает на способность 2,4 - ДА легко проникать практически во все ткани организма и метаболизироваться в них.

11 .Интоксикация крыс аминной солью 2,4 - Д вызывает у животных обширные морфофункционапьные нарушения тканей различных внут-

ренних органов, характеризующиеся накоплением в них 2,4 - Д и её хлорорГанических производных, альтерацией и 'нарушением тканевого метаболизма, развитие иммунного воспаления в местах отложения 2,4-Д. Наиболее выраженный характер этих нарушений имеет место в лёгких, печени, тонком и толстом кишечнике, наименьший - в почках. Явление альтерации тканей, накопление в них гербицида прямопропорционапьно зависило от вводимой дозы 2,4 - ДА.

12.Накопление 2,4-ДА в организме повышает реактивность термо-регуляторных центров по отношению к пирогенам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При воспроизведении гематологических нарушений в эксперименте у животных, подвергнутых воздействию гербицидов группы 2,4 - Д, необходимо учитывать дозозависимый и временной характер этих изменений в системе крови.

Для суждения о глубине и истинности анемии, вызванной введением 2,4 - ДА необходимо исследовать кроме показателей периферической крови, её объёмные характеристики - ОЦК, ОЦЭ и ОЦП.

При исследовании направленных на сохранение и поддержание компенсационных резервов эритропоэза у животных, подвергнутых воздействию 2,4 - ДА, необходимо исследовать кпеточно - клеточные эритропоэтические взаимодействия в костном мозге.

С целью ранней диагностической оценки возможного действия 2,4-ДА на организм животного и человека, важно исследовать ядрышкообра-зующие районы лимфоцитов, как наиболее быстро отвечающие структуры в системе крови на поступление в организм даже малых доз гербицида.

Полученные материалы делают необходимым заострить внимание врачей на замедленное восстановление ОЦЭ у людей, подвергнутых интоксикации 2,4 - ДА после кровопотери, возможного усугубления тяжести анемии разного генеза в случае предшествующей интоксикации больного 2,4 - ДА, возможность выраженных лихорадочных реакций, лейкоцитозов у больных, контактировавших с гербицидом группы 2,4 - Д.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Каюмова А. Ф., Каюмов Ф. А. Структурно - функциональные сдвиги периферической крови при экспериментальной анемии. II Проблемы са-ногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма. - Чолпон - Ата, 1993.- с. 36.

2. Каюмов Ф. А., Каюмова А. Ф. Цитохимическая характеристика лейкоцитов периферической крови в аспекте адаптации. II Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. -1993. - Т. 105. - Вып. 9. - с. 92.

3. Каюмова А. Ф., Гиэатуллин А. Г. Влияние факторов малой интенсивности на организм. // Преподавание в медицинском вузе вопросов профилактики и здоровья и его реабилитации. - Пермь. -1994.-с. 36 - 37.

4. Камилов Ф. X., Каюмова А. Ф., Имельбаева Э. А., Гиэатуллин А. Г.

»

Экспериментальное исследование реакции системы крови на диоксинсо-держащие гербициды. // Успехи физиологических наук. -1994. - Т. 25. - N 3. - с. 28.

5. Захаров Ю. М., Каюмова А. Ф., Камилов Ф. X. Кроветворение и возможные механизмы его токсических поражений. II Здравоохранение Башкортостана. - 1994. - N 4. - с. 67 - 81.

6. Каюмова А. Ф., Хабирова А. А., Мурзабаев X. X. Некоторые гематологические и цитохимические показатели клеток крови у экспериментальных животных при действии гербицида 2,4 - ДА. II Материалы региональной научной конференции молодых морфологов Урала. - Уфа,-1995,- с. 36.

7. Каюмова А. Ф., Гиэатуллин А. Г. Влияние факторов малой интенсивности на эритропоэз в эритробластических островках костного мозга. Матер. II Съезда Физиологов Сибири и Дальнего Востока. • Новосибирск. - Ч. I,- 1995,- с. 193 - 194.

8. Имельбаева Э. А., Каюмова А. Ф., Камилов Ф. X., Теплова С. Н. Влияние аминной соли 2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-ДА) на состояние клеток макрофагической системы. // Матер. II Съезда Физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск,-1995. - Ч. I.- с. 182 -183. *

9. Камилов Ф. X., Имельбаева Э. А., Каюмова А. Ф., Каюмов Ф. А. Материалы по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств диоксинсодержащего гербицида. II Диоксины : экологические проблемы и методы анализа. Матер, конф. - Уфа. - 1995. - с. 285 - 288.

10. Каюмова А. Ф., Каюмова Д. Ф., Камилов Ф. X. Динамика изменений параметров нукпеологенеэа лимфоцитов крыс, подвергшихся воздействию диоксинсодержащего гербицида. II Проблемы экологии Южного Урала. - 1995. - N 2. - с. 33 - 38.

11. Каюмова А. Ф., Каюмов Ф. А. Гистоморфологическое исследование органов и тканей экспериментальных животных при воздействии хлорированных феноксикислот. II Здравоохранения Башкортостана. - • 1996,- N1,- с. 13-17.

12. Kayumova A. F„ Kamilov F. Kh., Zakharov Yu. M., Rassokhin A. G. Effect of Dioxin Derivatives on Erithrjpoiesis in Erythroblastic Islands of Bone Marrow. II 1481 Inter. Symposium on Chlorinated Dioxins, Japan.-Kyoto.- 1994.- vol. 21.- p. 291 - 295.

13. Kamilov F. Kh., Kayumova A. F., Imelbaeva E. A., Gizatullin A. G. Indices of nonspecific body resístanse in animals following dioxincontaining ecotoxycological factors effect II International Journal of Immunorehabilitation.-

1994.-N1.- P. 152- 153.

14. Kayumova A. F., Kamilov F. Kh., Kayumova D. F. 2,4 - D Effect of values of nucleoly organizing region in rats lymphocytes. // International Journal of Immunorehabilitation. -1994,- N 1.- P. 159.

15. Каюмов Ф. А., Мурзабаев X. X., Каюмова А. Ф., Батыршина Г. Ф., Киясова В. И. Морфофункционапьные особенности клеток крови и некоторых внутренних органов белых крыс при воздействии хлорпроизвод-ных феноксиуксусной кислоты. // Матер. Ill - й Всероссийской научной конф. по экологии человека,- Волгоград,-1995,- с. 65.

16. Каюмова А. Ф„ Каюмов Ф. А. Состояние цитохимических показателей клеток крови экспериментальных животных при воздействии диоксинсодержащего гербицида. И Проблемы экологии Южного Урала.-

1995,-N4,- с. 23-30.

17. Kayumova A. F„ Zakharov Yu. М„ Rassokhin A. G., Kamilov F. Kh., Kayumov F. A. Erythron Response to 2,4 - DA Intoxication. // International Journal of Immunorehabilitation. - 1996.- N 2,- P. 425.

18. Хабирова А. А., Каюмова А. Ф„ Мусин Д. P. Морфологические изменения некоторых внутренних органов крыс в динамике при воздействии различных доз 2,4 - ДА. // Материалы 61 - й научной конф. студентов и молодых учёных БГМУ,- 1996.-4.I.-с. 13.

19. Рассохин А. Г., Калайджиева В., Каюмова А. Ф„ Мельников И. Ю., Захаров Ю. М. Новые подходы к оценке эритропоэза с помощью изуче-

ния эритробластических островков костного мозга у человека и животных. II Материалы международной медиц. конф. " Новые технологии . в медицине". - Трёхгорный.-1996,- с. 93-95.

20. Каюмов Ф. Д., Хабирова А. А., Каюмова А. Ф., Мурзабаев X. X. Морфофункциональные особенности лейкоцитов крори при применении витамина Е на фоне интоксикации гербицидом 2,4 - ДА. II Морфология (Архив АГЭ ). - 1996,-т. 109.- N 2,- с. 58.

21. Хабирова А. А., Каюмов Ф. А., Каюмова А. Ф., Мурзабаев X. X. Структурно - функциональные изменения внктренних органов крыс при воздействии гербицида 2,4-ДА. // Морфология (Архив АГЭ ). -1996,- т. 109.-N2,-с. 100.

22. Каюмова А. Ф., Рассохин А. Г., Захаров Ю. М. О резервных возможностях костного мозга у крыс, подвергнутых интоксикации амин-ной солью 2,4 - Д. // Вестник Тюменской науки, серия " Биология ". -1996. -Т. 1.-N 1.-С.53-60.

23. Каюмова А. Ф., Имельбаева Э. А., Каюмов Ф. А., Камипов Ф. X. Комплекс цитохимических и иммунологических методов исследования состояния лейкоцитов крови при экспериментальной интоксикации химическими соединениями. Методические рекомендации. - Уфа, 1996.- 16 с.

24. Kayumova A. F., Kayumova D. F., Kamilov F. Kh. State of Nucleolar Apparatus and Ribosome Genes Activity of Peripheral Blood Lymphocytes in Rats Effected by 2,4 - DA. //16 Inter. Symposium on Chlorinated Dioxins, "Dioxin' 96", Netherlands. - Amsterdam. - 1996. - vol. 29. - p. 343 - 346.