Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние гепатопротекторов фосфолипидной природы на метаболические процессы при экспериментальном повреждении печени потенциально гепатотоксическими лекарственными средствами

УУ4612313

Коршунов Дмитрий Афанасьевич

ВЛИЯНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ ФОСФОЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ ПОТЕНЦИАЛЬНО ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ

СРЕДСТВАМИ

14.03.06 - фармакологии, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 1 НОЯ 2010

Томск-2010

004612313

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Венгеровский

заслуженный работник высшей школы РФ Александр Исаакович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Суслов Николай Иннокентьевич

Степовая Елена Алексеевна

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « /У » // ^^ 2010 года в >5* часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан « /к » С^Т^Р ^Ц 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Более 1000 лекарственных средств обладают потенциальной гепатотоксичностью (Gardiner S. et al, 2006; Скрыпник И.Н., 2008; Яковенко Э.П. и соавт., 2009). При лекарственном поражении печени активируется перекисное окисление липидов, нарушаются целостность мембран и функции дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов. В большинстве случаев острых лекарственных поражений печени достаточно отмены препарата для обратного развития патологических изменений. В ситуациях, когда требуется длительный курс лечения, высокоэффективные лекарственные средства, имеющие гепатотоксические эффекты, необходимо комбинировать с корректорами метаболических нарушений (Демина М.Б. и соавт., 2007). В частности, противотуберкулезное средство I ряда изониазид и ненаркотический анальгетик парацетамол без дополнительного назначения гепатопротекторов могут приводить к развитию гепатита и даже фульминантной печеночной недостаточности, при которой возникают экстренные показания к трансплантации печени (Рейзис А.Р. и соавт., 2009; Каратеев А.Е., 2010; Ghosh A. et al., 2009; Semfke A. et al., 2009; Bhadauria S. et al., 2010). Эти препараты являются активными прооксидантами, в гепатоцитах ковалентно связываются с белками и ферментами, истощают ресурсы восстановленного глутатиона, тормозят дыхательную функцию митохондрий и энергопродукцию. В результате этих метаболических нарушений изониазид и парацетамол активируют апоптоз и вызывают некроз гепатоцитов (Bhadauria S. et al, 2010; Kakarla S. et al., 2010).

Основными лекарственными средствами, восстанавливающими метаболизм и функциональное состояние печени, являются гепатопротекторы (Гуревич К.Г., 2007). К их числу относят препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды, растительные полифенолы, тиолы, аминокислоты (Новиков В.Е, 2005; Сачек М.М, 2010). Препараты фосфолипидной природы способствуют восстановлению целостности мембран гепатоцитов, регулируют активность мембраносвязанных ферментов и циторецепторов, поддерживают процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях, улучшают антитоксическую и экскреторную функции печени (Ерофеева С.Б., 2009; Пахомова И.Г. и соавт., 2010).

В связи с этим представляет интерес изучить терапевтический эффект гепатопротекторов фосфолипидной природы эссенциале (высокоочшценная фракция фосфатидилхолина из соевых бобов) и эплира (комплекс фосфолипидов, сульфолипидов, тиолов, каротиноидов илового осадка) (Саратиков А.С. и соавт, 2004) на биоэнергетику, процессы липопероксидации в печени и апоптоз при интоксикации изониазидом и парацетамолом.

Энергетический обмен является базисным процессом, обеспечивающим функционирование всех систем живого организма, поэтому нарушения в системе энергопродукции сопровождаются истощением энергетических ресурсов, развитием патологических реакций и заболеваний. Митохондрии могут служить центральным барометром для оценки жизнеспособности клеток (Seo A. et al, 2010). Многие лекарственные средства в терапевтических дозах воздействуют на систему энергопродукции.

Помимо создания ксенобиотической нагрузки, они ингибируют метаболические пути биоэнергетики (Jones D. et al., 2010). Регулятор энергетического обмена янтарная кислота, оптимизируя процессы энергообеспечения, повышает продукцию АТФ и препятствует деградации митохондрий (Кондрашова М.Н., 1991).

Учитывая различный механизм действия гепатопротекторов фосфолипидной природы и регуляторов митохондриального метаболизма, можно ожидать потенцирования их протективного действия при токсической гепатопатии, сопровождающейся истощением систем энергопродукции в печени.

Цель работы. Изучение влияния гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды, -эссенциале и эплира и их комбинаций с янтарной кислотой на функциональное состояние митохондрий, перекисное окисление липидов печени, процессы апоптоза при экспериментальной интоксикации изониазидом и парацетамолом.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние противотуберкулезного средства I ряда изониазида и ненаркотического анальгетика парацетамола в остром и отдаленном периодах интоксикации на функциональное состояние митохондрий, перекисное окисление липидов печени, апоптоз лейкоцитов, содержание в крови фактора некроза опухолей-а, интерлейкина-10, общего белка, билирубина, активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрасферазы и щелочной фосфатазы.

2. Оценить влияние гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды, - эссенциале и эплира и их комбинаций с янтарной кислотой на биоэнергетику, перекисное окисление липидов печени, содержание в крови общего бежа, билирубина, активность печеноспецифических ферментов в условиях экспериментальной интоксикации изониазидом и парацетамолом.

3. Исследовать влияние эссенциале, эплира и их комбинаций с янтарной кислотой на апоптоз лейкоцитов, содержание в крови фактора некроза опухолей-а и интерлейкина-10.

4. Сравнить терапевтические эффекты гепатопротекторов фосфолипидной природы и их комбинаций с янтарной кислотой при разных моделях повреждения печени и режимах применения.

Научная новизна. Впервые изучено влияние гепатопротективных средств эссенциале, эплира и их комбинаций с янтарной кислотой на функциональное состояние митохондрий печени крыс и активность апоптоза при экспериментальной патологии печени, вызванной изониазидом и парацетамолом. Эссенциале при обеих моделях патологии оказывает выраженный терапевтический эффект: в печени восстанавливает сопряженность митохондриального окислительного фосфорилирования, тормозит перекисное окисление липидов, в крови препятствует развитию апоптоза лейкоцитов, снижает содержание фактора некроза опухолей-а, повышает уровень интерлейкина-10.

Комбинация эссенциале с янтарной кислотой уменьшает ингибирующее действие парацетамола на кинетические параметры дыхательной активности митохондрий печени.

При токсическом действии изониазида янтарная кислота не усиливает терапевтическое действие эссенциале.

При интоксикации изониазидом эплир лишь умерено восстанавливает биоэнергетику и тормозит процессы липопероксидации в печени, препятствует активации апоптоза, нормализует содержание общего белка, общего и непрямого билирубина, активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в крови. При интоксикации парацетамолом гепатопротективное влияние эплира проявляется в большей степени, чем действие эссенциале. Комбинация эплира и янтарной кислоты обладает наилучшим терапевтическим эффектом на обеих моделях поражения печени: оптимизирует кинетические характеристики функционального состояния митохондрий, нормализует сопряженность окислительного фосфорилирования, тормозит до нормы перекисное окисление липидов, снижает активность апоптоза, восстанавливает биохимические показатели крови.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснована целесообразность включения гепатопротекторов в комплексную терапию лекарственных поражений печени, вызванных изониазидом и парацетамолом. При патологии, вызванной изониазидом, для защиты печени рационально применение эссенциале и комбинации эплира с янтарной кислотой. В условиях токсического действия на печень парацетамола максимально выраженное протективное действие оказывает комбинация эплира и янтарной кислоты. Для диагностики сложных случаев токсического поражения печени и контроля над терапией возможно определение в крови числа лимфоцитов и гранулоцигов в состоянии апоптоза, содержания фактора некроза опухолей-а и шггерлейкина-10.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Противотуберкулезное средство изониазид является активным прооксидантом; при экспериментальном поражении печени изониазидом и ненаркотическим анальгетиком парацетамолом в митохондриях гепатоцитов разобщается окислительное фосфорилирование, изониазвд неадекватно повышает интенсивность дыхания, парацетамол тормозит дыхательную функцию митохондрий.

2. При модели гепатопатии, вызванной изониазидом и парацетамолом, в крови усиливается апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов, повышается содержание активатора апоптоза фактора некроза опухолей-а, снижается количество противовоспалительного фактора интерлейкина-10.

3. Гепатопротекторы фосфолипидной структуры эссенциале и эплир, как эффективные антиоксиданты, при токсической гепатопатии, вызванной изониазидом или парацетамолом в эксперименте, улучшают биоэнергетику печени, уменьшают гипербилирубинемию и гиперферментемию, препятствуют апоптозу лейкоцитов, росту в крови содержания фактора некроза опухолей- а, повышают уровень интерлейкина-10.

4. Комбинация эплира и регулятора энергетического обмена янтарной кислоты оказывает наиболее выраженный протективный эффект при патологии, вызванной изониазидом или парацетамолом, в условиях токсического действия изониазида значительный терапевтический эффект оказывает также эссенциале.

Апробация работы.

Материалы работы обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета и лаборатории физиологии, молекулярной и клинической фармакологии отдела клинической фармакологии с клиникой НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН (2007-2010), X конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009), 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Екатеринбург, 2009), XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010). Материалы диссертации опубликованы в 8 'научных статьях и материалах конференций, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, характеризующей результаты экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 157 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисунками. Библиография включает 183 источников, из них 75 - зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в зимне-весенний период на 260 беспородных белых крысах-самцах массой 200-220 г, полученных из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН. Животные находились в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (2005).

Для моделирования экспериментального лекарственного поражения печени животным вводили в желудок в виде суспензии на 1% крахмальной слизи: изониазид в дозе 542 мг/кг в течение 6 сут (ЛД15), парацетамол в дозе 2,5 г/кг в течение 2 сут (ЛДю).

Препараты фосфолипидов и янтарную кислоту вводили крысам на протяжении 12 сут в желудок в виде суспензии на 1% крахмальной слизи в эффективных терапевтических дозах. Эссенциале Н (раствор в ампулах; Авентис, Германия) применяли в дозе 80 мг/кг, эплир - в дозе 30 мг/кг, янтарную кислоту - в дозе 50 мг/кг (Кондрашова М.Н., 1991; Саратиков A.C. и соавт., 2004).

! При интоксикации изониазидом фосфолипидные гепатопротекторы и янтарную кислоту вводили с профилактической и лечебной целями, при патологии печени, вызванной парацетамолом, применяли только лечебный вариант. Для получения профилактического эффекта крысам сначала вводили эссенциале или эплир самостоятельно или в комбинации с янтарной кислотой и через 1 ч вводили изониазид. Лечение эссенциале и эплиром и их комбинацией с янтарной кислотой токсического поражения печени начинали после завершения интоксикации изониазидом и парацетамолом с 7-х и 3-х сут соответственно. Контрольные животные получали 1% крахмальную слизь в эквиобъемных количествах.

Эссенциале - гепатопротектор, содержащий до 93% фосфатидилхолина, этерефицированного полиеновыми жирньми кислотами (линолевой, линоленовой, олеиновой). Раствор в ампулах эссенциале содержит 250 мг фосфатидилхолина в 5 мл.

Эплир содержит фосфолипцды (20%), каротиноиды (8%), сульфолипиды (2%), тиоцикланы (7%), тиоалканы (5%). Среди фосфолипидов идентифицированы фосфатидилхолин (11%), фосфатидилэтаноламин (3%), кислые глицерофосфатиды (6%). По гепатопротективной активности при экспериментальной модели острой и хронической патологии печени, вызванной тетрахлорметаном, эплир превосходит эссенциале (Саратиков А.С. и соавт., 2004).

Крыс декапитировали под легким эфирным наркозом через сутки после последнего введения препаратов. Для исследований использовали гомогенат печени и сыворотку крови.

Функциональное состояние митохондрий гомогената печени крыс исследовали полярографическим методом (полярограф Эксперт-001, Россия) по скорости потребления кислорода в различных метаболических состояниях по В. Chance (Chance В. et al., 1961). В качестве субстратов окисления использовали M0J M и 5-10"3 M сукцината, по З-Ю"3 M глутамата и малата. Для анализа вклада реакций переаминирования и ФАД-зависимого дыхания применяли аминооксиацетат (2-Ю"3 М), активатор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) изоцитрат (1,5-10*3 М) и ее ингибитор малонат (2-Ю"3 М).

Регистрировали скорость дыхания митохондрий до (V4n), после (V4o) и во время цикла фосфорилирования добавленной в количестве 130 мкмоль АДФ (V3). Во всех измерениях абсолютные значения скоростей потребления кислорода митохондриями представлены в нг атомарного кислорода в мин на мг бежа (нг ат. [0]/минмг бежа). Для оценки энергетического статуса рассчитывали коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О) (Chance В. et al, 1955).

Содержание в сыворотке крови общего белка определяли биуретовым методом, общего и конъюгированного билирубина - модифицированным методом Йевдрашика-Грофа. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) измеряли дшштрофенилгидразиновым методом, щелочной фосфатазы (ЩФ) - по расщеплению /i-нитрофенилфосфата в глициновом буфере (Камышников B.C., 2000).

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) исследовали в гомогенате печени по скорости образования спонтанного и аскорбатзависимого малонового диальдегида (МДА), содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа (Владимиров Ю.А. и соавт., 1972).

Количество лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови в состоянии апоптоза (гиподиплоидные клетки) определяли методом проточной цитофлуориметрии непосредственно после выделения и после инкубации лейкоцитов в течение 24 ч в культуральной среде (Хавдуков C.B. и соавт., 2007; Буеверов А.О. и соавт, 2009).

Количество сывороточного интерлейкина-10 (ИЛ-10) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью набора «IL-10» («BioSource

International», США). Содержание фактора некроза опухолей-a определяли в сыворотке крови с помощью набора реагентов «альфа-ФНО-ИФА-Бест» («Векгор-Бест», Новосибирск).

Результаты обрабатывали методом парных сравнений по критерию Манна-Уитни. В практике медико-биологических исследований общеприняты 1 % и 5% уровни значимости, характеризующие достоверные отличия между группами, которым соответствуют вероятности ошибочного вывода р<0,01 и р<0,05 (Хафизьянова Р.Х. и соавт, 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В печени изониазид ацетилируется N-ацетилтрансферазой с образованием N-ацетилизониазида, который затем превращается в изоникотиновую кислоту и моноацетилгидразин. Моноацетилгидразин подвергается N-гидроксилированию системой цитохрома Р-450. В этой реакции появляется гидразин с высоким гепатотоксическим потенциалом. Изоникотиновая кислота заменяет никотиновую кислоту в реакциях синтеза никотинамидадениндинуклеотида (вместо НАД образуется изо-НАД), с нарушением дыхательной активности митохондрий (Loehle J. et al, 2006; Lee S. et al, 2010).

Парацетамол (ацетаминофен) метаболизируется преимущественно в печени. При передозировке парацетамола или повышенной чувствительности к нему, обусловленной индукцией цитохрома Р-450, истощением запасов восстановленного глутатиона, ослаблением процессов глюкуронирования и сульфатирования, развиваются гепатотоксические эффекты. Парацетамол инициирует ПОЛ, активируя продукцию свободных радикалов и производных оксида азота. Свободные радикалы снижают трансмембранный потенциал митохондрий, вызывают формирование гигантских пор в их мембране, увеличивают образование ядерного фактора (NF-kB) (Ghosh A. et al, 2009). Последний стимулирует продукцию цитокинов - интерлейкина-1, фактора некроза опухолей- а, хемоаттрактанта-1 макрофагов (Jaeschke Н. et al, 2006).

Токсическое действие изониазида к 6 сут сопровождалось ростом в крови активности маркеров цитолиза печени АлАТ и АсАТ в 1,4-1,9 раза относительно активности в норме. Активность ЩФ повышалась на 20%, содержание общего билирубина увеличивалось в 3,8 раза, свободного билирубина - в 10,9 раза. Коэффициент глюкуронирования билирубина уменьшался до 0,37 (в норме - 0,90). Содержание в крови белка становилось на 16% ниже, чем у ингактных животных (табл. 1).

Интоксикация изониазидом приводила к активации ПОЛ. Образование спонтанного МДА ускорялось в гомогенате печени в 1,8 раза, аскорбатзависимого МДА - на 48% относительно нормальной скорости продукции этих вторичных продуктов ПОЛ. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа становилось на 45-77% больше, чем у интактных животных (табл. 1).

Влияние гепатопротекгоров на биохимические показатели крови и перекисное окисление липидов печени при экспериментальной

интоксикации изониазидом спустя 6 сут . (Х± т, п = 10)

Исследуемые параметры Интактные животные Изониазид спустя 6 сут Эссенциале Эссенциале + янтарная кислота Эплир Эплир + янтарная кислота

+ Изониазид

Кровь

АлАТ, мккат/л 0,06±0,01 0,15±0,021 0Д0±0,011,2 0Д1±0,011,2 0Д1±0,011,2 0,08±0,011,2,4,5

АсАТ, мккат/л 0,06±0,01 0,17±0,02' 0,10±0,01и ОД 2±0,011,2,3 0Д2±0,011,2 0,08±0,011,2,4,5

Щелочная фосфатаза, Е/л 269,8± 17,5 324,1±4,4' 295,2±2,91,2 304Д±5,11,2,3 300,7±7Д1,2 гв^пд2,4,5

Общий белок, г/л 69,7±1,1 58,4±0,5' 65,2±1,31,2 66Д±0,81,2 64,8±1,61,2 68,4±0,82,4,5

Общий билирубин, мкмоль/л 14,0±1,1 57,4±1,11 54,0±1,61,2 50,2±1,41,2,3 21,2±1,21,2,3 19,5±1,31,2,5

Непрямой билирубин, мкмоль/л 1,5±0,9 35,9±1,41 20,2±1,41,2 23Д±1,11,2 9,6±0,61,2,3 9,5±1,01,2'5

Гомогенат печени

МДА аскорбатзависимый, нмоль'мг белка-мин 4,0±0,б 5,9±0,1' 4,9±0,41,2 5ДЗ±0Д1,2 5Д4±0Д1,2 4,5±0,32,4'5

Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов 0,9±0Д 1,7±0,9* 1,2±0,51,2 1,3±0Д1,2 1,3±0Д1,2 ЬЬОД2,4,5

Основания Шиффа, нмоль'мг липидов 1,2±0Д 1,8±0,3' 1,4±0Д1,2 1,5±0Д1,2 1,4±0,32 1,2±0,22'5

Примечание. Статистически значимые отличия при р < 0,05: 1 - по отношению с интактными животными; 2 - по сравнению с интоксикацией изониазидом; 3 - по сравнению с эссенциале; 4 - по сравнению с эплиром; 5 - по сравнению с эссенциале + янтарная кислота

Под влиянием гепатопротектора эссенциале и его комбинации с янтарной кислотой активность аминотрансфераз снижалась на 24-43% по сравнению с активностью ферментов при интоксикации изониазидом. Активность ЩФ уменьшалась на 6-9% (р<0,05). Содержание общего билирубина становилось меньше на 6-13% (р<0,05), свободного билирубина - на 36-44%. Коэффициент глюкуронирования билирубина составлял 0,54-0,62. Содержание в крови белка увеличивалось на 12% по сравнению с содержанием у животных, не получавших эссенциале. В печени интенсивность ПОЛ снижалась, но полностью не нормализовалась. Образование в гомогенате печени спонтанного и аскорбатзависимого МДА протекало соответственно на 30-38% и 14-17% медленнее, чем при интоксикации изониазидом. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа снижалось на 14-27% (табл. 1).

Применение эплира для коррекции нарушений, вызванных изониазидом, снижало в крови активность АлАТ, АсАТ и ЩФ соответственно на 26, 31 и 7% (р<0,05) относительно показателей цитолиза гепатоцитов у нелеченных животных. Содержание общего и свободного билирубина уменьшалось на 63-73% по сравнению с содержанием у животных с патологией печени, вызванной изониазидом. Коэффициент глюкуронирования билирубина увеличивался до 0,55. Содержание в крови бежа возрастало на 12% (табл. 1).

Эплир как эффективный антиоксидант подавлял ПОЛ. Продукция в гомогенате печени спонтанного и аскорбатзависимого МДА замедлялась соответственно на 32 и 14% относительно скорости у нелеченных животных. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа становилось на 21-24% меньше, чем у животных с интоксикацией изониазидом (табл. 1).

Применение эплира совместно с янтарной кислотой эффективнее, чем другие виды гепатопротективной терапии, тормозило выход ферментов из печени в кровь. Активность АлАТ и АсАТ в крови уменьшалась на 49-53% относительно активности, выявленной у нелеченных животных. Активность ЩФ нормализовалась. Содержание общего билирубина уменьшалось на 66%, свободного билирубина - на 73%. Коэффициент глюкуронирования билирубина возрастал до 0,55. Содержание в крови белка было таким же, как у интактных животных. Продукция в гомогенате печени спонтанного и аскорбатзависимого МДА, количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа нормализовались (табл. 1).

При интоксикации изониазидом к 12 сут активность в крови маркеров цитолиза гепатоцитов АлАТ и АсАТ становилась в 1,5 раза больше, чем в норме. Активность ЩФ увеличивалась на 13%, содержание общего билирубина повышалось в 2,3 раза, свободного билирубина - в 6,7 раза относительно показателей у интактных животных. Коэффициент глюкуронирования билирубина уменьшался до 0,40. Содержание в крови бежа снижалось на 25%. Активность ПОЛ при интоксикации изониазидом в отдаленный период повышалась в меньшей степени, чем при интоксикации спустя 6 сут. Генерация спонтанного МДА увеличивалась в гомогенате печени на 63%, аскорбатзависимого МДА - на 23% относительно скорости в норме. Количество диеновых конъюгатов возрастало на 67%, оснований Шиффа - на 44% (табл. 2).

Влияние гепатопротекторов на биохимические показатели крови и перекисное окисление липидов печени при экспериментальной

интоксикации изониазидом спустя 12 сут („У± т, п = 10)

Исследуемые параметры Интактные животные Изониазид спустя 12 сут Изониазид +

Эссенциале Эссенциале + янтарная кислота Эплир Эплир + янтарная кислота

Кровь

АлАТ, мккат/л 0,06±0,01 0,133 ±0,012' 0,09±0,01''2 0,08±0,01 и 0,07±0,012 0,08±0,0112

АсАТ, мккат/л 0,061±0,01 0,15±0,01' 0,11±0,01и 0,12±0,011,2 ОДШОДП2'3 0,07±0,012'5

Щелочная фосфатаза, Е/л 269,8± 17,5 304,1±5,3' 299,8±6,1' 305,3±4,б' 270,4± 6,12,3 277,2±4,82'5

Общий белок, г/л 69,7±1,1 52,1±1,1' 63,7±1,4и 64,2±0,5'-2 67,4±0,82,3 68,3±1,22'5

Общий билирубин, мкмоль/л 14,0±1,1 38,8±2,2' 34,1±1,3''2 25,1±1,41,2'3 17,4±1,31ДЗ 14,2±0,92'4'5

Непрямой билирубин, мкмоль/л 1,5±0,9 23,2±1,4' 19,0±0,51,2 8,9±0,41,2'3 5,2±0,41,2'3 4,3±0,4г5

Гамогенат печени

МДА аскорбатзависимый, нмоль/мг белка-мин 4,0±0,6 4,9±0,2' 4,3±0,12 4,5±0,21Л 4,4±0,22 4,3±0,22'5

Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов 0,9±0,1 1,6*0,1' 1,0±0,12 1,1±0,1и 0,9±0,12 1,0ь0,12

Основания Шиффа, нмоль/мг липидов 1,2±0,2 1,7±0,1' 1,4±0,11'2 1,3±0,12 1,2±0,12'3 1,3±0,12

Примечание. Статистически значимые отличия при р < 0,05: 1 - по сравнению с интактными животными; 2 - по сравнению с интоксикацией изониазидом; 3 - по сравнению с эссенциале; 4 - по сравнению с эплиром; 5 - по сравнению с эссенциале + янтарная кислота

При коррекции эссенциале и его комбинацией с янтарной кислотой токсического влияния изониазида активность АлАТ и АсАТ в крови снижалась на 28-48%, активность ЩФ не изменялась. Содержание общего билирубина становилось соответственно на 12 и 35%, свободного билирубина - на 18 и 62% меньше, чем у животных с нелеченой патологией печени, вызванной изониазидом. Коэффициент глюкуронирования билирубина составлял 0,44-0,65. Содержание в крови бежа увеличивалось на 22% (табл. 2).

Продукция в гомогенате печени спонтанного и аскорбатзависимого МДА замедлялась соответственно на 25-34% и 8-13% (р<0,05) по сравнению с его образованием у животных, получавших только изониазид. Количество диеновых коньюгатов и оснований Шиффа снижалось на 21 -3 5% (табл. 2).

Терапевтический эффект эплира на фоне гепатотоксического действия изониазида проявлялся нормализацией в крови активности АлАТ, АсАТ и ЩФ, содержания общего белка и свободного билирубина. Уровень общего билирубина уменьшался на 55% относительно количества данного пигмента в крови животных с патологией печени, вызванной изониазидом спустя 12 сут. Коэффициент глюкуронирования билирубина достигал 0,70 (табл. 2).

Эплир эффективно ингибировал ПОЛ. Все показатели липопероксидации нормализовались (табл. 2).

Лечебное применение эплира совместно с янтарной кислотой при интоксикации изониазидом полностью нормализовало все исследованные нами показатели крови и активность ПОЛ в печени (табл. 2).

Цитолигическое действие парацетамола сопровождалось выходом в кровь из паренхимы печени АлАТ и АсАТ с ростом активности в 3,2-4,1 раза. Развивался также синдром холестаза с увеличением в крови содержания общего билирубина в 4,1 раза, свободного билирубина - в 5,8 раза, активности ЩФ - в 1,4 раза. Коэффициент глюкуронирования билирубина уменьшался до 0,67 (в норме - 0,90). Содержание в крови бежа становилось на 16% ниже, чем у интактных животных (табл. 3).

При интоксикации парацетамолом образование спонтанного МДА ускорялось в 2,9 раза, аскорбатзависимого МДА - в 1,3 раза. Содержание в гомогенатах печени диеновых коньюгатов и оснований Шиффа увеличивалось в 3,2-3,3 раза (табл. 3).

Терапия эссенциале и эссенциале совместно с янтарной кислотой нормализовала в крови активность АлАТ, содержание свободного билирубина и белка. Активность АсАТ снижалась на 37-60%, ЩФ - на 18%, уровень общего билирубина уменьшался на 70% по сравнению с показателями у животных с интоксикацией парацетамолом. Коэффициент глюкуронирования билирубина повышался до 0,90 (табл. 3).

Эссенциале и этот гепатопротектор в комбинации с янтарной кислотой тормозили активацию ПОЛ при экспериментальном поражении печени парацетамолом: образование спонтанного и аскорбатзависимого МДА замедлялось на 34-45%, количество диеновых коньюгатов и оснований Шиффа снижалось на 45-65% (табл. 3).

Влияние гепатопротекгоров на биохимические показатели крови и перекисное окисление липидов печени при экспериментальной

интоксикации парацетамолом (А'± т, п = 10)

Исследуемые параметры Интактные животные Парацетамол Парацетамол +

Эссенциале Эссенциале + янтарная кислота Эплир Эплир + янтарная кислота

Кровь

АлАТ, мккат/л 0,06±0,01 0,26±0,04* 0,06±0,012 0,06±0,012 0,06±0,012 0,06±0,012

АсАТ, мккат/л 0,06±0,01 0,31±0,01' 0,19±0,01'-2 0,13£0,01и'3 0,20±0,021,2 0,09±0,011,2'4'5

Щелочная фосфатаза, Е/л 269,8± 17,5 378,1±15,11 312,9±20,31д 301,9±15,81,2 315,1±10,11,2 290,2±12,22'4

Общий белок, г/л 69,7±1,1 58,6±3,7' 67,8±1,22 66,3± 1,21-2 68,1±1,72 69,1±1,115

Общий билирубин, мкмоль/л 14,0±1,1 60,6±1,0' 18,1 ±2,21,2 20,9± 1,01,2 23,4±1,51,2'3 17,1±1,51,2'4'5

Непрямой билирубин, мкмоль/л 1,5±0,9 20,3±2,1' 1,7±2,12 2,6±0,82,3 3,2±0,12 1,5±0,81,2

Гомогенат печени

МДА аскорбатзависимый, нмоль/мг белка-мин 4,0±0,6 8,6±0,5' 4,5±0,21,2 4,9±0,71,2 4,8±0,11'2 4,2±0,22'4'5

Диеновые кош>югаты, нмоль/мг липидов 0,9±0,1 з.иод1 1,4±0,8''2 1,2±0,071,2'3 1,5±0,1 1,2 1,1±0,42'4

Основания Шиффа, нмоль/мг липидов 1,2±0,2 3,8-ьО, 11 2Д±0,41,2 1,3±0,22'3 2,2±0,21,2 1,4±0,12'4

Примечание. Статистически значимые отличия при р < 0,05: 1 - по сравнению с интактными животными; 2 - по сравнению с интоксикацией парацетамолом; 3 - по сравнению с эссенциале; 4 - по сравнению с эплиром; 5 - по сравнению с эссенциале + янтарная кислота

Применение эплира для коррекции нарушений, вызванных парацетамолом, уменьшало в крови активность АсАТ на 33%, ЩФ - на 17%, общего билирубина - на 61% относительно показателей у нелеченных животных. Остальные показатели крови соответствовали норме (табл. 3).

При коррекции эплиром экспериментальной интоксикации парацетамолом тормозилось ПОЛ. Продукция в гомогенатах печени спонтанного и аскорбатзависимого МДА становилась на 38-44% меньше, чем у нелеченных животных. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа снижалось на 42-50% (табл. 3).

Применение эплира совместно с янтарной кислотой нормализовало функциональные пробы печени. Активность АсАТ и содержание общего билирубина превышали норму, но значительно, на 72% снижались относительно показателей, выявленных у животных с интоксикацией парацетамолом. Коэффициент глюкуронирования билирубина возрастал до 0,91. Образование в гомогенате печени аскорбатзависимого МДА, содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа нормализовались (табл. 3).

При интоксикации изониазидом снижалась эффективность работы митохондрий печени и, как следствие, развивались компенсаторные механизмы.

При окислении экзогенного сукцината в концентрации, близкой к физиологической (1 мМ), по отношению к нормальным показателям возрастали скорости дыхания в состояниях У4л и У3 на 18%, в состоянии У4о - на 9% (р<0,05) (рис. 1). Коэффициент АДФ/О становился меньше, чем у ингактных животных на 11% (рис. 2). При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата) в митохондриях печени крыс, получавших изониазид, скорость дыхания в состоянии У3 увеличивалась на 12% (р<0,05). Коэффициент АДФ/О снижался на 37%. В тесте с внесением в среду инкубации митохондрий печени, окисляющих смесь НАД-зависимых субстратов, ингибитора СДГ малоната скорости дыхания У4п, У3 и У4о увеличивались соответственно на 33, 14 и 16% (р<0,05) относительно скоростей у ингактных животных (рис. 1). Коэффициент АДФ/О снижался на 14% (рис. 2).

Профилактическое введение эссенциале при интоксикации изониазидом обеспечивало функционирование митохондрий с небольшими отклонениями от нормы. Большинство показателей отличалось от показателей, выявленных при токсическом действии изониазида через 6 сут после окончания введения.

После добавления в среду инкубации экзогенного сукцината скорость дыхания митохондрий в состоянии У3 снижалась на 13% (р<0,05), в состоянии У4о - повышалась на 8% (р<0,05) по отношению к скоростям, регистрируемым при интоксикации изониазидом. Скорость дыхания митохондрий в присутствии НАД-зависимых субстратов в состоянии У4о повышалась 15%, скорость дыхания в состоянии У3 снижалась на 11% (р<0,05) (рис. 1). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 27% (рис. 3). Малонат повышал скорость дыхания в состоянии отдыха на 10% (р<0,05) (рис. 1).

Применение эссенциале совместно с янтарной кислотой с профилактической целью при экспериментальной интоксикации изониазидом обеспечивало умеренное улучшение биоэнергетики.

В эксперименте при окислении сукцината (1 мМ) скорости дыхания повышались в состояниях У4п и У4о на 42%, скорость дыхания в состоянии Уз возрастала на 16% (рис. 1). Коэффициент АДФ/О снижался на 20% (рис. 2). При окислении смеси малата и глутамата митохондриями печени скорости дыхания в состояниях У4п и У4о повышались на 42%, скорость дыхания в состоянии Уз увеличивалась на 16%. После добавления ингибитора СДГ малоната скорости дыхания в состояниях У4ш Уз и У4о увеличивались на 16-31% (рис. 1). Коэффициент АДФ/О снижался на 8% (р<0,05) (рис. 2).

2 с

Я)

ю

I

5

I-

х

м

а б в

■ Инт \/4п ■ Инт Уз ■ Инт Ч/4о Ш Изо У4п □ Изо Уз □ Изо \/4о Ш Эсс У4п И Эсс Уз В Эсс \/4о ВЭсс+ЯкУ4п ВЭсс+Як Уз 0Эсс+ЯкУ4о □ Эп \/4п ОЭпУз □ Эп У4о РЭп+Як У4п пЭп+ЯкУз аЭп+ЯкУ4о

Рис. 1. Влияние гепатопротекторов и их комбинаций с янтарной кислотой при профилактическом введении в течение 12 сут на скорости дыхания митохондрий печени крыс в состояниях покоя (У4п), фосфорилирования (У3) и отдыха (У4о) при экспериментальной интоксикации изониазидом. Инт - интактные животные; Изо -изониазид; Эсс - эссенциале; Эп - эплир; Як - янтарная кислота.

Здесь и на рис. 2-6: а - сущинат; б - манат и глутамат; в - малат и глутамат с добавлением малоната; • — стапшстически значимые отличия при р <0,05 по сравнению с интактньши животными, + - по сравнению с интоксикацией.

■ Интактные

□ Изониазид

Ш Эссенциале

а Эссенциале +

янтарная кислота ОЭплир

Рис. 2. Влияние гепатопротекторов и их комбинаций с янтарной кислотой при профилактическом введении в течение 12 сут на сопряженность окисления и фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях печени крыс при экспериментальной интоксикации изониазидом.

Профилактическое введение эплира для коррекции патологии печени, вызванной изониазидом, лишь незначительно улучшало биоэнергетику.

После добавления в среду инкубации сукцината скорость дыхания в состоянии У3 снижалась на 8% (р<0,05), в состоянии У»0 - повышалась на 8% (р<0,05) относительно скоростей у нелеченных животных. При окислении смеси НАД-зависимых субстратов в митохондриях печени крыс скорости дыхания в состояниях У41Ь У3 и У4о повышались соответственно на 42, 8 и 17% (р<0,05). В тесте с внесением в среду инкубации митохондрий печени малоната с НАД-зависимыми субстратами скорости дыхания в состояниях У4п, У3 и У4о снижались соответственно на 16, 8 и 26% (р<0,05) (рис. 1).

При введении с профилактической целью эплира совместно с янтарной кислотой в течение 12 сут на фоне интоксикации изониазидом в митохондриях печени активировался быстрый метаболический путь окисления субстратов, что полноценно обеспечивало гепатоциты энергией.

При окислении митохондриями печени крыс 1 мМ сукцината скорость поглощения кислорода в состоянии У4п снижалась на 12% (р<0,05), остальные показатели достоверно не отличались от значений, регистрируемых у нелеченных животных. При окислении НАД-зависимых субстратов скорости дыхания митохондрий увеличивались в состояниях У4п и У3 на 13-22% по сравнению со скоростями у нелеченных животных (рис. 1). Коэффициент АДФ/О повышался на 32% (рис. 2). При внесении малоната в среду инкубации митохондрий печени с НАД-зависимыми субстратами скорости дыхания в состояниях У4п и У4о снижались в среднем на 16% относительно скоростей при патологии, вызванной изониазидом (рис. 1). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 20% (рис. 2).

Функционирование митохондрий печени при интоксикации изониазидом в отдаленный период (через 12 сут) переходило по сравнению с ранним периодом (через 6 сут) в более тяжелое состояние - дыхательная активность ещё больше возрастала, развивался декомпенсированный низкоэнергетический сдвиг при НАД-зависимом дыхании. Такие нарушения указывают на необратимое повреждение митохондрий.

В митохондриях печени крыс через 12 сут после последнего введения изониазида при окислении 1 мМ сукцината скорости поглощения кислорода в состояниях У4п и У3 увеличивались на 20%, скорость У4о становилась на 18% больше, чем в норме (рис. 3). Регистрировалась тенденция к снижению коэффициента АДФ/О (рис. 4). Окисление НАД-зависимых субстратов сопровождалось ростом скорости дыхания митохондрий в состояниях У4П и Уз на 25%, У4о - на 33% по сравнению со скоростями у интактных животных. Коэффициент АДФ/О снижался на 11% (рис. 4). Скорости дыхания при внесении ингибитора малоната в среду инкубации митохондрий печени с НАД-зависимыми субстратами превышали скорости в норме в состояниях У4п и У3 на 43%, в состоянии У4о - на 72% (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 14% (рис. 4).

При введении эссенциале в течение 12 сут после интоксикации изониазидом снижались кинетические параметры функционального состояния митохондрий. Такие изменения указывают на ограничение энергозатрат в печени крыс.

■ Инт У4п □ Изо У4о а Эсс+Як\/з

а

б

■ Инт \/з ■ Инт \/4о

■ Эсс \/4п 1 Эсс \/з ШЭсс+Як \/4о ОЭп\/4п

о Изо \/4п Я Эсс \/4о ПЭп ^з

в

И Изо Уз ШЭсс+Як \/4п ПЭп и4о

Рис. 3. Влияние гепатопротекторов и их комбинаций с янтарной кислотой при лечебном введении в течение 12 сут на скорости дыхания митохондрий печем крыс в состояниях покоя (У4п), фосфорилирования (У3) и отдыха (У4о) при экспериментальной интоксикации изониазидом. Инт - интактные животные; Изо - изониазид; Эсс - эссенциале; Эп - зппир; Як - янтарная кислота.

■ Интактные

Е§ Изониазид

В Эссенциале

Ш Эссенциале +

янтарная кислота □ Эплир

ЕЗЭплир + янтарная а б в кислота

Рис. 4. Влияние гепатопротекторов и их комбинаций с янтарной кислотой при лечебном введении в течение 12 сут на сопряженность окисления и фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях печени крыс при экспериментальной интоксикации изониазидом.

После добавления в среду инкубации экзогенного сукцината (1 мМ) скорости дыхания митохондрий в состояниях У3 и У4о становились на 8% (р<0,05) меньше, чем скорости, регистрируемые у нелеченных животных (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 15% (рис. 4). При окислении смеси НАД-зависимых субстратов скорости дыхания в состояниях Уз и У4о снижались на 11-16% (р<0,05) по отношению к скоростям, определенным у нелеченных животных. В присутствии малоната скорости дыхания Уз и У4о снижались на 21-26% (рис. 3).

Лечебное применение эсеенциале совместно с янтарной кислотой для коррекции патологии печени, вызванной изониазидом, вызывало гиперактивацию системы энергопродукции с увеличением разобщения процессов окисления и фосфорилирования.

Добавление сукцината (1 мМ) повышало скорости дыхания в состояниях V4n и V40 соответственно на 11 и 29% (р<0,05) относительно скоростей, характерных для токсического действия изониазида (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 15% (рис. 4). НАД-зависимые субстраты окислялись в митохондриях печени в состояниях V4lb V3 и V4o соответственно на 21, 10 и 31% быстрее, чем у нслеченных животных. Коэффициент АДФ/О снижался на 9% (р<0,05. Внесение в среду инкубации ингибитора СДГ малоната интенсифицировало дыхание в состоянии V4n на 15% (рис. 3), коэффициент АДФ/О уменьшался на 12% (рис. 4).

При введении эплира в течение 12 сут на фоне интоксикации изониазидом тканевое дыхание осуществлялось преимущественно через НАД-зависимый путь окисления субстратов. После внесения в среду инкубации митохондрий печени экзогенного сукцината в физиологической концентрации скорости дыхания в состояниях V4n и V3 становились на 11-13% (р<0,05) больше, чем скорости, регистрируемые у нелеченных животных (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 10% (р<0,05) (рис. 4). При окислении малата и глутамата скорости дыхания в состояниях V4n и V3 повышались соответственно на 28 и 21%, превышая при этом нормальные скорости на 51-61%. Малонат увеличивал потребление кислорода митохондриями печени в состояниях V4n и V3 на 20-35% (рис. 3).

Применение эплира совместно с янтарной кислотой для коррекции патологии печени, вызванной изониазидом в отдаленном периоде, обеспечивало гиперактивацию системы энергопродукции с сохранением сопряженности окисления и фосфорилирования на высоком уровне.

После добавления в среду инкубации экзогенного сукцината в концентрации 1 мМ скорость дыхания в состоянии V3 повышалась на 8% (р<0,05), в состоянии V4o -уменьшалась на 10% (р<0,05) по отношению к скоростям у нелеченных животных (рис. 3). При окислении смеси НАД-зависимых субстратов в митохондриях печени крыс скорость дыхания в состоянии V4o снижалась на 19% (р<0,05). В тесте с внесением в среду инкубации малоната скорости дыхания V4n и V4o снижались на 16-26% (рис. 3). Коэффициент АДФ/О повышался на 8% (р<0,05) (рис. 4).

Интоксикация парацетамолом сформировала в печени состояние деэнергизации митохондрий по кинетическому типу, для которого характерно несоответствие динамики расхода и синтеза макроэргов в условиях повышенной нагрузки на систему энергопродукции.

В эксперименте с окислением экзогенного сукцината скорость дыхания в состоянии V3 значимо не отличалась от нормы, скорости дыхания в состояниях V4„ и V4o возрастали на 19% (рис. 5). Коэффициент АДФ/О снижался на 16% (рис. 6). При окислении НАД-зависимых субстратов митохондриями поврежденной парацетамолом печени скорость дыхания V4n повышалась на 35%, V3 - на 15%, V4o - на 30% по сравнению со скоростями у

интактных крыс (рис. 5). Коэффициент АДФ/О снижался на 18% (рис. 6). В тесте с добавлением ингибитора СДГ малоната увеличивались скорости дыхания в состояниях У4п и У4о на 60%, в состоянии У3 - на 16% относительно скоростей в норме (рис. 5). Коэффициент АДФ/О снижался на 24% (рис. 6).

а

■ Инт 4п ■ Инт з В Эсс 4п И Эсс з □ Эп4п ПЭпз

б в

■ Инт4о ИПара4п ОПара з ОПара 4о

ШЭсс4о 0Эсс+Як4п ЕЭсс+Якз ОЭсс+Як4о

ОЭп 4о ПЭп+Як 4п РЭп+Якз ПЭп+Як4о

Рис. 5. Влияние гепатопротекторов и их комбинаций с янтарной кислотой при введении в течение 12 сут на скорости дыхания митохондрий печени крыс в состояниях покоя (У4п), фосфорилирования (У3) и отдыха (У4о) при экспериментальной интоксикации парацетамолом. Инт - интактные животные; Пара - парацетамол; Эсс - эссенциале; Эп -эплир; Як - янтарная кислота.

■ Интактные

И Парацетамол

нЭссенциале

Ш Эссенциале + янтарная кислота

□ Эплир

□ Эплир + янтарная а б в кислота

Рис. 6. Влияние гепатопротекторов и их комбинации с янтарной кислотой при введении в течение 12 сут на сопряженность окисления и фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях печени крыс при экспериментальной интоксикации парацетамолом.

Применение эссенциале на фоне интоксикации парацетамолом повышало сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях печени крыс, хотя кинетические параметры тканевого дыхания значительно не изменялись относительно значений, регистрируемых у нелеченных животных.

При окислении митохондриями печени крыс сукцината скорость поглощения кислорода в состоянии У4о повышалась на 9% (р<0,05) (рис. 5). Коэффициент АДФ/О становился больше на 11% (рис. б). При окислении НАД-зависимых субстратов скорость дыхания митохондрий печени увеличивалась в состоянии У4о на 11% (р<0,05) (рис. 5). Коэффициент АДФ/О повышался на 14%, после добавления малоната - на 23% (рис. 6).

При совместном введении эссенциале с янтарной кислотой снижалось ингибирующее влияние парацетамола на дыхательную активность митохондрий в различных функциональных состояниях.

В среде инкубации с сукцинатом скорость дыхания митохондрий в состоянии У4п снижалась на 9% (р<0,05), скорости дыхания в состояниях Уз и У4о возрастали соответственно на 18 и 9% (р<0,05) относительно скоростей, регистрируемых у нелеченных животных, получавших парацетамол (рис. 5). Скорость окисления митохондриями печени НАД-зависимых субстратов в состоянии У4о превышала на 18% скорость дыхания у животных с интоксикацией парацетамолом (рис. 5). Коэффициент АДФ/О повышался на 28% (рис. 6). В тесте с внесением малоната регистрировался рост потребления кислорода митохондриями печени в состояниях У3 и У4о на 10-13% (р<0,05) (рис. 5). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 18% (рис. 6).

При введении эплира в течение 12 сут на фоне интоксикации парацетамолом биоэнергетика печени улучшалась.

После добавления в среду инкубации экзогенного сукцината в концентрации, близкой к физиологической (1 мМ), скорости дыхания митохондрий в состояниях У4п, Уз и У4о становились соответственно на 19, 12 и 23% (р<0,05) меньше, чем скорости, определенные у нелеченных животных (рис. 5). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 17% (рис. 6). При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата) митохондриями печени скорости дыхания в состояниях У4п и У3 снижались на 15%, в состоянии У4о - на 34% по отношению к скоростям, измеренным у нелеченных животных (рис. 5). Коэффициент АДФ/О повышался на 24% (рис. 6). При добавлении малоната скорости дыхания У4ш У3 и У4о уменьшались соответственно на 27, 11 и 40% (р<0,05) (рис. 5). Коэффициент АДФ/О возрастал на 15% (рис. 6).

Применение эплира совместно с янтарной кислотой при патологии печени, вызванной парацетамолом, повышало эффективность функционирования митохондрий печени.

После добавления в среду инкубации сукцината скорости дыхания в состояниях У4п и У4о уменьшались на 12% (р<0,05), скорость дыхания в состоянии Уз повышалась на 14% (р<0,05) относительно скоростей при патологии печени, вызванной парацетамолом (рис. 5). Коэффициент АДФ/О возрастал на 17% (рис. 6). При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов в митохондриях печени скорости дыхания в состояниях У4п и У4о снижались соответственно на 8 и 25% (р<0,05) относительно скоростей у нелеченных животных (рис. 5). Коэффициент АДФ/О становился на 9% (р<0,05) выше, чем при патологии, вызванной парацетамолом (рис. 6). Малонат тормозил дыхание в состояниях У4о и У4п на 12 и 24% (р<0,05) (рис. 5). Коэффициент АДФ/О повышался на 22% (рис. 6).

При поражении печени возникает распространенный апоптоз не только гепатоцитов, но и клеток крови. Установлена выраженная корреляция между количеством гепатоцитов в состоянии апоптоза и числом лейкоцитов крови, подвергшихся апоптозу (Буеверов А.О. и соавт., 2009).

Интоксикация изониазидом спустя 6 сут с момента последнего введения увеличивала количество лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови в состоянии апоптоза непосредственно после выделения и после инкубации в течение 24 ч в культуральной среде. Изменения уровня цитокинов указывают на развитие условий для активации апоптоза. Процентное содержание лимфоцитов и гранулоцитов в состоянии апоптоза повышалось соответственно в 4,7 и 1,3 раза, после инкубации - в 2,9 и на 1,7 раза относительно уровня клеток с активацией апоптоза у интактных животных (табл. 4). Количество активатора апоптоза ФНО-а повышалось в 2,2 раза, противовоспалительного ИЛ-10 - снижалось в 1,7 раза (табл. 5).

При терапии гепатопротекторами эссенциале и эплиром снижалась активность апоптоза по сравнению с активностью, регистрируемой у животных с патологией печени. Процент лейкоцитов в состоянии апоптоза уменьшался после выделения и после инкубации в течение суток в среднем на 40-70% (табл. 4). Содержание ФНО-а снижалось на 50-60%, количество ИЛ-10 в крови увеличивалось в среднем вдвое относительно концентраций, регистрируемых у животных, отравленных изониазидом (табл. 5).

Сочетание гепатопротекгоров с янтарной кислотой ингибировало активацию апоптоза в лейкоцитах в среднем в 1,7 раза (табл. 4). Содержание ФНО-а снижалось в 1,6 раза, концентрация ИЛ-10 увеличивалась в 2,2-2,6 раза (табл. 5).

При интоксикации изониазидом спустя 12 сут с момента последнего введения количество лейкоцитов периферической крови в состоянии апоптоза увеличивалось, но в меньшей степени, чем при интоксикации изониазидом к 6 сут. Содержание цитокинов в крови мало отличалось от их количества в раннем периоде интоксикации изониазидом. Процент лимфоцитов, находившихся в состоянии апоптоза, увеличивался на 60-80%, гранулоцитов - на 16-35% (табл. 4). Концентрация ФНО-а возрастала в 2,6 раза относительно нормы, продукция ИЛ-10 - снижалась на 77% (табл. 5).

При введении гепатопротекгоров процент лимфоцитов и гранулоцитов в состоянии апоптоза уменьшался в различные сроки на 32-76% относительно уровня гиподиплоидных клеток крови у нелеченных животных (табл. 4). Концентрация ФНО-а уменьшалась в среднем на 56%, ИЛ-10 увеличивалась в 1,5 раза (табл. 5).

Сочетание гепатопротекгоров с янтарной кислотой уменьшало активацию апоптоза лимфоцитов непосредственно после выделения и инкубации в среднем на 80%, гранулоцитов - на 40-60% (табл. 4). Содержание ФНО-а снижалось на 60%, концентрация ИЛ-10 увеличивалась вдвое (табл. 5).

Токсическое действие парацетамола характеризовалось массивной гибелью лейкоцитов периферической крови путем апоптоза. Концентрации цитокинов, участвующих в регуляции апоптоза, значительно изменялись. Процент лимфоцитов, поврежденных по

типу апоптоза, увеличивался в 8,7 раза, после инкубации - в 4,6 раза, процентное содержание гранулоцитов увеличивалось вдвое, после инкубации - на 94% относительно содержания лимфоцитов в состоянии апоптоза у интакгных животных (табл. 4). Продукция ФНО-а повышалась в 2,4 раза, концентрация ИЛ-10 снижалась на 74% относительно нормы (табл. 5).

Таблица 4

Апоптоз лейкоцитов периферической крови, %(Х± т, и = 10)

Экспериментальная группа Время инкубации

Лимфоциты Гранулоциты

0ч 24 ч 0ч 24 ч

Интактные животные 1,1±0,2 2,8±0,4 6,3±0,3 18,4±1,3

Изониазид в течение 6 сут +

Крахмальная слизь с первого дня в течение 6 сут 6,3±0,5' 10,8±0,3' 14,7±1,2' 31,5±1,7'

Эссенциале с первого дня в течете 12 сут 2,7±0,Зи 3,9±0,41,2 7,8± 1,41,2 23,5±1,5и

Эссенциале + янтарная кислота с первого дня в течение 12 сут 2,1±0,Зи'3 3,5±0,4и 7,2±1,32 20,1±1,52

Эплир с первого дня в течение 12 сут 1,6±0,2и'3 3,8±0,31,2 7,3±0,51,2 22,3± 1,61,2

Эплир + янтарная кислота с первого дня в течение 12 сут 1,4±0,12'5 3,4±0,22'4 7,1±1,12 19,5±1,42,4

Крахмальная слизь с 7 дня в течение 12 сут 11,4±1,1' 17,5±1,2' 19,8±1,3' 36,5±2,3'

Эссенциале с 7 дня в течение 12 сут 3,4±0,3и 5,7±0,51,2 9,1± 1,41,2 24,8±1,5и

Эссенциале + янтарная кислота с 7 дня в течение 12 сут 2,7±0,41,2'3 4,7±0,3'-" 8,5± 1,01,2 22,5± 1,4 й

Эплир с 7 дня в течение 12 сут 2,5±0,41АЗ 4,6±0,61,2'3 8,7±1,21,2 22,6±2,01,2

Эплир + янтарная кислота с 7 дня в течение 12 сут 1,9±0,21А4-5 4,1±0,41А5 7,1±1,114 19,8±1,6г5

Па рацетамол в течение 2 сут +

Крахмальная слизь с 3 дня в течение 12 сут 10,7±0,8г 15,б±1,11 18,7±1,2' 35,7±1,9'

Эссенциале с 3 дня в течение 12 сут 3,8±0,3и 5,5±0,4'-2 8,3±1,31,2 25,3±1,6и

Эссенциале + янтарная кислота с 3 дня в течение 12 сут 3,2±0,31,2,3 4,1±0,5из 8,7± 1,51,2 22,7±1,2и

Эплир с 3 дня в течение 12 сут 2,3±0,6и'3 4,3±0,41,2'3 7,1±1,62 22,7±1,9и

Эплир + янтарная кислота с 3 дня в течение 12 сут 1,7± ОД1-2-4'5 3,8±0,31А5 6,5±1,015 20,4±1,72

Примечание. Статистически значимые отличия при р < 0,05: 1 - по сравнению с интактными животными; 2 - по сравнению с интоксикацией;3 - по сравнению с эссенциале;4 - по сравнению с эплиром;5 - по сравнению с эссенциале + янтарная кислота

Таблица 5

Концентрация цитокинов в периферической крови, пг/мл (Х±т,п = 10)

Экспериментальная группа ИЛ-10 ФНО-а

Интактные животные 28,8±2,4 26,3±2,3

Изониазид в течение 6 сут +

Крахмальная слизь с первого дня в течение 6 сут 7,4 ± 1,3' 84,5 ± 3,4'

Эссенциале с первого дня в течение 6 сут 17,9 ± 1,5й 38,7 ± 3,6й

Эссенциале + янтарная кислота с первого дня в течение 6 сут 23,5 ± 1,41,2'3 34,9 ± 2,5й'3

Эплир с первого дня в течение 6 сут 22,7 ± 1,6й'3 32,3 ± 2,71,2'3

Эплир + янтарная кислота с первого дня в течение 6 сут 26,4 ±1,52 28,4 ±2,12,4

Крахмальная слизь с 7 дня в течение 12 сут 6,5 ± 0,8' 95,4 ± 5,б1

Эссенциале с 7 дня в течение 12 сут 14,7 ± 1,5й 44,1 ± 3,9 й

Эссенциале + янтарная кислота с 7 дня в течение 12 сут 16,4 ± 1,3 й 40,2 ± 2,8й

Эплир с 7 дня в течение 12 сут 17,6 ± 1.41'2'3 39,7 ± 3,81'2

Эплир + янтарная кислота с 7 дня в течение 12 сут 19,8 ± 1,71,2'5 34,5 ± 2,71,2'4

Парацетамол в течение 2 сут +

Крахмальная слизь с 3 дня в течение 12 сут 7,6 ± 1,2' 88,7 ± 4,2'

Эссенциале с 3 дня в течение 12 сут 15,7 ± 1,52 45,3 ± 3,2й

Эссенциале + янтарная кислота с 3 дня в течение 12 сут 18,1 ± 1,7й 39,7 ± 2,51'2'3

Эплир с 3 дня в течение 12 сут 17,3 ± 1,4й 38,1 ± 2,61АЗ

Эплир + янтарная кислота с 3 дня в течение 12 сут 21,7 ± 2,0й'4 29,5 ± 3,02'4'5

Примечание. Статистически значимые отличия при р < 0,05: 1 - по сравнению с интактными животными; 2 - по сравнению с интоксикацией;3 - по сравнению с эссенциале; 4 — по сравнению с эплиром;5 - по сравнению с эссенциале + янтарная кислота

Терапия гепатопротекторами эссенциале и эплиром уменьшала в сторону нормы процентное содержание лейкоцитов с гиподиплоидным ядром в различные сроки на 30-80% (табл. 4). Продукция ИЛ-10 увеличивалась в 1,5-2 раза относительно концентрации, регистрируемой у животных, отравленных парацетамолом. Концентрация ФНО-а уменьшалась на 55% (табл. 5).

Сочетание гепатопротекторов с янтарной кислотой снижало активацию апоптоза лимфоцитов непосредственно после выделения и инкубации в среднем на 70-80%, гранулоцитов - на 35-65% относительно значений при интоксикации парацетамолом (табл. 4). Концентрация ИЛ-10 увеличивалась вдвое. Содержание ФНО-а снижалось на 55-65% (табл. 5).

Таким образом, максимальное протекгивное действие при интоксикации изониазидом оказывает комбинация эплира и янтарной кислоты. Эплир в отличие от эссенциале содержит не только фосфатидилхолин, но также фосфатидилэтаноламин, сульфолипиды, каротиноиды с высоким антиоксидантным потенциалом, предшественники тиолов. Эплир полноценно восстанавливает барьерную и матриксную функции мембран гепатоцитов, включая мембраны митохондрий. Янтарная кислота прямо активирует дыхательную цепь митохондрий, повышает синтез АТФ. Энергия расходуется в том числе для детоксикации изониазида. Более слабый гепатопротективный эффект при экспериментальной интоксикации изониазидом оказывают эплир и эссенциале, введенные самостоятельно. На фоне поражения печени мощным донатором свободных радикалов парацетамолом, введенным в токсической дозе, эссенциале и эплир проявляют терапевтическое действие в одинаковой степени. Добавление к терапии янтарной кислоты усиливает лечебный эффект. Важно, что гепатопротекторы препятствуют развитию апоптоза. Этот эффект установлен в отношении лимфоцитов и гранулоцитов, что отражает способность препаратов фосфолишщной структуры противодействовать гибели гепатоцитов. Протективное действие подтверждается снижением содержания в крови ФНО-а и повышением количества ИЛ-10.

выводы

1. Противотуберкулезное средство изониазид и ненаркотический анальгетик парацетамол при экспериментальной интоксикации в печени усиливают перекисное окисление липидов, в крови повышают количество лимфоцитов и гранулоцитов в состоянии апоптоза, содержание фактора некроза опухолей-а, уменьшают количество интерлейкина-10, общего белка, увеличивают уровень общего и непрямого билирубина, активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы.

2. При экспериментальной интоксикации изониазидом через 6 дней после его последнего введения в митохондриях печем разобщаются процессы дыхания и фосфорилирования, неадекватно увеличивается потребление кислорода, спустя 12 дней усиливается разобщение дыхания и фосфорилирования при окислении НАД-зависимых субстратов.

3. Парацетамол при экспериментальной интоксикации снижает сопряженность окислительного фосфорилирования и ингибирует дыхательную активность митохондрий печени.

4. Гепатопротекторы фосфолипцдной структуры эссенциале, эплир и их комбинации с янтарной кислотой при экспериментальной интоксикации изониазидом и парацетамолом в печени препятствуют активации перекисного окисления липидов, в крови снижают количество лейкоцитов в состоянии апоптоза, уровень фактора некроза опухолей-а, повышают содержание интерлейкина-10, количество общего белка, уменьшают в сторону нормы уровень общего и непрямого билирубина, активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы.

5. Эссенциале и эплир на фоне экспериментальной интоксикации изониазидом повышают сопряженность окислительного фосфорилирования и уменьшают чрезмерное потребление кислорода митохондриями печени; янтарная кислота усиливает терапевтический эффект гепатопротекторов за счет активации дыхательной цепи и сукцинатдегидрогеназы в митохондриях печени.

6. Эссенциале и эплир при экспериментальной интоксикации парацетамолом уменьшают разобщение окисления и фосфорилирования, в сочетании с янтарной кислотой устраняют ингибирующее действие парацетамола на кинетические параметры дыхательной цепи митохондрий печени.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние природных фосфолипидов и митохондриальных субстратов на перекисное окисление липидов и окислительное фосфорилирование в печени при экспериментальном токсическом гепатите // Вятский медицинский вестник. - 2007. -№4.-С. 111-112.

2. Влияние гепатопротектора эссенциале на биоэнергетику печени при ее экспериментальном поражении парацетамолом // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. - 2009. - № 1. - С. 231.

3. Влияние изониазвда и парацетамола на биоэнергетику печени в эксперименте // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: материалы 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Екатеринбург: УГМА, 2009. - С. 571-573.

4. Влияние комбинации эссенциале с янтарной кислотой на биоэнергетику крыс при экспериментальном поражении печени парацетамолом // 63-я итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (MHO). - Ростов-на-Дону: РостГМУ, 2009. - С. 179.

5. Состояние биоэнергетики печени при токсическом действии изониазида и совместном применении с эссенциале // Науки о человеке: материалы X конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ, 2009. - С. 86-87.

6. Влияние эссенциале и янтарной кислоты на биоэнергетику печени при интоксикации парацетамолом в эксперименте // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - Т. 8, № 4.

7. Состояние системы энергопродукции печени и головного мозга крыс при острой и хронической интоксикации этанолом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 2. - С. 169-173 (соавт. Петрова З.В., Удут В.В. и др.).

8. Влияние гепатопротектора фосфолипидной природы и его комбинации с янтарной кислотой на биоэнергетику печени крыс при экспериментальном поражении, вызванном парацетамолом // Науки о человеке: материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ, 2010. - С. 74-75.

-С. 70-74.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ИЛ - интерлейкин

МДА - малоновый диальдегид

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

ПОЛ - перекисное окисление липидов СДГ - сукцинатдегидрогеназа ФАД - флавинадениндинуклеотид ФНО - фактор некроза опухолей ЩФ - щелочная фосфатаза

Тираж 100 экз. Заказ 960. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.