Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Морфометрические особенности бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга при острых миелоидных лейкозах.

На правах рукописи

КРАСНОВА ЛЮБОВЬ СЕРГЕЕВНА

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛАСТНЫХ КЛЕТОК В СТАНДАРТНЫХ ЦИТОЦЕНТРИФУГАТАХ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ

14.00.29 - гематология и переливание крови

003470962

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 8 Щщ

Москва 2009

003470962

Работа выполнена в учреждении Российской академии медицинский наук Гематологический научный центр РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского

Защита диссертации состоится июня 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.01 учреждения Российской академии медицинский наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д.4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан « » и СбСс 2009г.

Погорелов Валерий Михайлович

Булычева Татьяна Ивановна Чернов Вениамин Михайлович

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Гетерогенность популяции нормальных кроветворных предшественников по фенотипическим признакам и уровням дифференцировки, а также возможность опухолевой трансформации на любой стадии их развития отражается в значительном разнообразии лейкозных клонов. Выявление этой гетерогенности в первую очередь базируются на морфо-цитохимических особенностях лейкозных клеток.

Анализ морфо-цитохимических признаков позволил выделить и охарактеризовать типы бластных клеток и разработать классификации острых лейкозов (А.И.Воробьев и соавт., 1973; Ю.И.Лорие, 1974; ФАБ-классификация, 1976). Применение их в практической гематологии привело к достижению существенных успехов в области диагностики и лечения больных. Использование современных лечебных программ у больных острыми миелоидными лейкозами (OMJI) позволяет получить 62 - 85% полных ремиссий с 5-летней безрецидивной выживаемостью, достигающей 29 - 46% (В.Г. Савченко, E.H. Паровичникова, 2004). Однако, у части больных развиваются фатальные рецидивы заболевания, а эскалация доз цитостатиков не всегда оказывает терапевтический эффект.

Под воздействием естественной и «искусственной» (цитостатическая терапия) селекции в лейкозной популяции появляются новые варианты клеток. Давно отмечено, что с введением новых комплексов цитостатических средств, с появлением длительных ремиссий, сменяемых рецидивами, рефрактерными к ранее эффективным цитостатическим препаратам, в первую очередь проявляется изменчивость формы и величины ядер и цитоплазмы лейкозных клеток, причем изменения ядра морфологически более выражены (А.И. Воробьев, 1970; Г.И. Козинец и соавт., 1979).

В настоящее время оценка морфологических и цитохимических признаков бластных клеток при острых лейкозах, которые отражают степень их созревания и дифференцировки и лежат в основе современных классификаций (ФАБ-классификация, 1991; ВОЗ классификация, 2008), носит субъективный характер. Это подчеркивает необходимость перехода с обычного визуального анализа микроскопических изображений к применению методов количественной цитологии, позволяющих выявить и сравнить индивидуальную

и внутригрупповую вариабельность цитологических признаков лейкозных клеток.

Оценка современного состояния и внедрения технических достижений в медицинскую практику показывает, что анализаторы изображений клеток охватывают большую область применений, однако используются в основном, в отличие от проточных цитометров, при выполнении научно-исследовательских работ: метод предъявляет повышенные требования к приготовлению исследуемого материала и требует стандартизации этого процесса,

Стандартизация приготовления препаратов периферической крови осуществляется либо с помощью различных автоматических/механических устройств, либо с применением специальных цитоцентрифуг (Г.И. Козинец, 2002; В.М. Погорелов и соавт., 2005; B.C. Медовый и соавт., 2006, S. Leclair и соавт., 2004; S. Machin, 2008). Однако, нам не встретились опубликованные данные о возможности использования таких устройств для стандартизации пробоподготовки костного мозга с последующим компьютерным морфометрическим анализом его клеточного состава.

Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - определить морфометрические параметры бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами.

Задачи исследования:

1. Разработать протокол получения стандартных цитоцентрифугатов на предметных стеклах из проб периферической крови и костного мозга.

2. Выявить особенности расположения клеток в цитоцентрифугатах периферической крови и костного мозга в норме и при острых лейкозах.

3. Определить пригодность стандартных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга для компьютерного анализа изображения клеток.

4. Исследовать возможности компьютерной морфометрии для оценки морфологической гетерогенности бластных клеток при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

Научная новизна.

В работе впервые показано, что морфометрия изображений бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга

больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Полученными в диссертации достоверными результатами обосновано научное положение о том, что количественная цитология - средство выделения и объективного описания модальных устойчивых классов бластных клеток, характеризующих варианты острых миелоидных лейкозов.

Практическая значимость.

Разработанная в ходе настоящего исследования стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность препаратов исследуемого материала для объективной оценки с использованием компьютеризированных систем анализа клеточного изображения в научно-исследовательских работах и в практике клинико-лабораторного обследования гематологических больных.

Внедрение в практику:

1. Разработанная методика используется в лаборатории гемоцитологии Гематологического научного центра РАМН для проведения клинико-лабораторных и научных исследований.

2. Материалы диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на научных и научно-практических конференциях.

3. Результаты работы используются в учебном процессе при обучении аспирантов и научных сотрудников методам автоматизированного исследования бластных клеток.

4. Разработанную установку для автоматизированного компьютерного морфометрического анализа бластных клеток и комплекс методов, полученных в ходе проведения данной работы можно рассматривать как научно-методическую базу для проведения подобного рода исследований.

Положения, выносимые па защиту:

1. Стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность цитологических препаратов для объективного анализа.

2. Компьютерная морфометрия бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу

количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Апробация работы.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения».

Настоящее исследование является фрагментом темы, выполненной по плану НИР ГНЦ РАМН «Аналитическая цитохимия вариантов острых лейкозов» (№ Госрегистрации 01200101992).

Основные положения диссертации доложены на Российской научно-практической конференции «Технологии и инновации в лабораторной медицине» (Москва, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Объём и структура диссертапии.

Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и библиографического указателя, включающего 145 работ, из них 71 работа отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками, содержит 21 таблицу.

Работа выполнена в лаборатории гемоцитологии (руководитель - д.м.н., профессор В.М. Погорелов) ГНЦ РАМН (директор - академик РАН и РАМН А.И. Воробьев). Научное сотрудничество осуществлялось с сотрудниками ОАО Радиотехнический институт имени академика А.Л. Минца - И.А. Ивановой, к.ф-м.н. Н.В. Верденской, к.ф-м.н. А.Г. Виноградовым (руководитель - д.тех.н., профессор В.В. Сазонов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Основным материалом исследования являлись бластные клетки костного мозга при OMJI. Всего было обследовано 129 больных острыми лейкозами в дебюте заболевания, согласно стандартному протоколу. После морфо-цитохимической верификации острых лейкозов основную группу составили 86 больных различными вариантами OMJI (Таб. 1). Распределение больных OMJ1 по вариантам проведено в соответствии с критериями ФАБ - классификации (вариант ОМЛ МО подтвержден иммунофенотипированием).

В качестве контроля исследовали костный мозг 8 практически здоровых людей (доноры гемопоэтических клеток). Материал получен в НИИ трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии в структуре ГНЦ РАМН (руководитель - член. корр. РАМН, д.м.н., профессор В.Г.Савченко). Таблица 1. Распределение обследованных доноров гемопоэтических клеток (п=8) и больных острыми миелоидными лейкозами (п=86) по полу и возрасту.

Группы Количество Пол Возраст (годы)

человек М Ж Разброс Me M±SD

Доноры 8 8 - 18-36 23,5 25,3 ± 6,0

МО 9 4 5 47-69 56,0 58,2 ±7,7

Ml 18 8 10 25-80 47,5 49,0 ± 17,7

ОМЛ М2 15 6 9 22-57 48,0 46,6 ±8,5

мз 11 4 7 23-43 28,0 29,8 ±6,0

М4 26 11 15 25-76 53,5 52,0 ±11,9

М5 7 3 4 47-58 54,0 52,7 ± 3,9

Примечания: Ме-медиана; М-среднее значение; SD - стандартное отклонение.

Для получения стандартных препаратов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах нами была использована центрифуга DiffSpin 2 Slide Spinner (model M 701-22, StatSpin, USA). Протокол пробоподготовки отработан на периферической крови 20 практически здоровых людей (16 мужчин и 4 женщин) и 22 больных различными заболеваниями с анемическим синдромом (15 мужчин и 7 женщин). Специального отбора больных с анемическим синдромом не проводилось. Основным критерием служили полученные на автоматическом счетчике Cobas Micros 18 ОТ (Roche, Швейцария) сниженные показатели гемоглобина и количества эритроцитов.

Взятие венозной крови и костного мозга осуществляли по унифицированной методике в пластиковые пробирки с крышкой («Monovette») объемом 2 мл с антикоагулянтом К3ЭДТА. Пробы крови и костного мозга в пробирках выдерживали при комнатной температуре не более одного часа, подвергая постоянному перемешиванию на автоматической мешалке для предотвращения необратимой агрегации клеток.

Мазки периферической крови и костного мозга готовили на чистых обезжиренных предметных стеклах.

Приготовленные с помощью цитоцентрифуги DiffSpin 2 препараты крови и костного мозга были названы цитоцентрифугатами (ЦЦФ).

Протокол приготовления цитоцентрифугатов:

1. Обезжиренное тонкое стекло (SL72) поместить в пластиковый держатель и вставить в крепления ротора центрифуги;

2. В имеющиеся в держателе два отверстия автоматической пипеткой в каждое внести для крови 50-60 мкл, для костного мозга 60-70 мкл;

3. Выбрать режим вращения в 2 секунды на панели управления центрифуги;

4. Полученные цитоцентрифугаты высушивать, фиксировать и окрашивать. Исследование клеточного состава периферической крови и пунктата

костного мозга проводили с подсчетом гемограмм и миелограмм в мазках и ЦЦФ, окрашенных по Романовскому-Гимза. Анализировали бластограммы на 100 бластных клеток с подсчетом в процентах числа клеток с зернистостью, палочками Ауэра, соотношения ядер с правильной и неправильной формой. Оценку дисплазии элементов костного мозга проводили в соответствии с критериями, предложенными J. Goasquen с соавторами (1992).

Мазки и ЦЦФ окрашивали на определение активности миелопероксидазы, полисахаридов, а-нафтилацетат зстеразы и кислых мукополисахаридов в соответствии с методическими рекомендациями под редакцией Г.И. Козинца (1980) для цитохимического исследования.

Оценка цитохимических реакций проведена полуколичественным методом с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга и процента положительных клеток. Работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН к.б.н. O.A. Дягилевой и к.м.н. И.Н. Наумовой.

Для компьютерной морфометрии использован прибор «Автоматический скрининг периферической крови» («АСПЕК») и программное обеспечение, разработанные совместно сотрудниками лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН и Радиотехнического института имени академика А.Л. Минца (патенты: №212171,1998; №2147123,2000; №32279,2003).

Анализ клеточных изображений проводился в режиме исследовательской версии прибора «АСПЕК». Предметное стекло с окрашенным ЦЦФ помещалось на предметный столик микроскопа «LEICA DML S» (конденсор 0,90/1,25; объектив Planachromat 100/1,25 Oil) и в компьютер (ЮМ PC совместимый, Pentium 3/256 Mb RAM) вводились изображения 105 клеток для каждого случая при сплошной выборке (цветная видеокамера EDC-2000E "Electrim" (USA); C-mount 1,0х (Germany); 1 пиксель равен 0,076 мкм).

Накопленные изображения клеток сегментировались "вручную", т.е. путем обвода курсором на мониторе компьютера, или автоматически (процедура «волшебная палочка») и измерялись on line с использованием алгоритмов исследовательской версии анализатора. Автоматически вычислялись следующие геометрические параметры клетки:

1) площадь клетки/ядра (S) = N/k2, где N - сумма всех пикселов объекта, к] - коэффициент линейного разрешения (число пикселов на 1 мкм);

2) периметр клетки/ядра (Р) = Nb/kb где Nb- сумма пикселов границы клетки;

3) фактор формы 1 клетки/ядра (FF1) = 4Ш/Р2, что характеризует округлость клетки; чем ближе его значение к 1, тем форма клетки/ядра ближе к кругу;

4) фактор формы 2 клетки/ядра (FF2) = S/47tAB, где А и В - малый и большой радиус клетки/ядра, что характеризует изрезанность контура клетки/ядра: чем он ближе к 1, а форма клетки/ядра к эллипсу, тем более ровный контур;

5) ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС) - отношение площади ядра к площади цитоплазмы.

Конечные результаты измерений регистрировались в мкм или мкм2 и представлялись в виде гистограмм распределения, таблиц в формате программы Excel (Microsoft) и в виде галереи клеток.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом описательной статистики с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Office ХР». Для сравнения значимости различий между средними значениями выборок использовали параметрический критерий Стьюдента и непараметрический хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Стандартизация пробоподготовки.

Первоочередной задачей был подбор оптимального объема пробы и времени вращения центрифуги для получения монослойных препаратов периферической крови и костного мозга практически здоровых людей и больных различными заболеваниями.

Анализ качества и пригодности полученных ЦЦФ для морфометрического исследования проведен по внешнему виду, при микроскопии и по результатам автоматического сканирования на приборе «АСПЕК». Качество ЦЦФ определяли, используя следующие показатели:

• протяженность области монослоя клеток;

• однородность ЦЦФ (по количеству клеток в поле зрения);

• воспроизводимость количественных характеристик ЦЦФ по группе препаратов;

• сопоставление морфометрических параметров клеток в мазках и ЦЦФ. Для здоровых людей определен объем периферической крови в 50 мкл, а

для людей со сниженным количеством гемоглобина и эритроцитов объем крови составил 60 мкл, время центрифугирования во всех случаях равно 2 секундам (режим №5). Для получения стандартных препаратов костного мозга определен оптимальный объем в 60-70 мкл при времени вращения центрифуги в 2 секунды (режим №5). Пробоподготовка костного мозга с помощью вышеуказанной методики проведена впервые.

Микроскопия ЦЦФ периферической крови показала, что клетки лежат монослоем практически на всем протяжении препарата. Наложения эритроцитов друг на друга встречаются с частотой до 2-3 в поле зрения. Есть поля зрения без наложений. Только в последней трети мазка возрастает количество наложений эритроцитов друг на друга в виде «монетных столбиков». Лейкоциты в ЦЦФ располагаются отдельно от других клеток, равномерно на протяжении всего препарата, сохраняя структуру. При патологических состояниях хорошо видны характерные морфологические детальные признаки эритроцитов и лейкоцитов.

Начав работать с костньм мозгом, мы отталкивались от полученных данных для периферической крови. Все полученные ЦЦФ были монослойные, клеточные, мономорфные. Ддросодержащие клетки в них располагались отдельно друг от друга, равномерно по всей длине ЦЦФ, сохраняя структуру.

В работе впервые была проведена оценка полученных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга на приборе «АСПЕК», которая также показала однородное и равномерное распределение клеток на всем их протяжении с сохранением геометрии клеток, структуры, текстуры, количественного соотношения, оптической плотности, цвета и яркости.

Анализ однородности ЦЦФ на приборе «АСПЕК» выполнен на основе построенных карт путем определения среднего количества эритроцитов в кадре (поле зрения микроскопа) в автоматическом режиме по всей траектории ЦЦФ. Затем, карта ЦЦФ разбивалась на 12 зон (3 зоны по ширине и 4 зоны по длине ЦЦФ). Внутри каждой зоны оценивался коэффициент вариации для среднего

количества эритроцитов, который не превосходил 18%. Наименьшая толщина ЦЦФ определена в средней его трети.

Известно, что при приготовлении мазка крови общепринятым «ручным» методом клетки распределяются случайно. Для определения условий распределения ядросодержащих элементов в ЦЦФ проведен сравнительный подсчет лейкоцитарной формулы в 10 обычных мазках ив 10 ЦЦФ периферической крови одного донора (ШЗС=4,8х1012/л; НОВ=153г/л; НСТ=41%). Полученные данные количества лейкоцитов разных видов из мазков и ЦЦФ достоверно не различались и находились в пределах физиологических колебаний.

Сравнение гемограмм с отличными от нормы гематологическими показателями проведено по крови одного больного сублейкемическим миелозом в развернутой стадии (11ВС=2,95х1012/л; ШВ=73 г/л; НСТ=25,9 %). Кровь больного с данным диагнозом была выбрана из-за наличия большего, чем в других случаях, количества переходных форм клеток - от бластных до зрелых, удельный вес которых сильно варьирует. Оказалось что количество бластных клеток, метамиелоцитов трех линий, палочкоядерных нешрофилов и эозинофилов, а так же сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов и базофилов в сравниваемых препаратах достоверно не различалось (р > 0,05). В то же время, количество промиелоцитов и миелоцитов трех линий в ЦЦФ достоверно различалось (р<0,01). Это можно объяснить тем, что перечисленные форменные элементы в мазке либо остаются в его начале, либо сдвигаются в «усы», количество моноцитов в ЦЦФ было меньше незначительно. Отдельно можно отметить, что количество разрушенных клеток в ЦЦФ было на много меньше, чем в мазках (р < 0,001).

ЦЦФ костного мозга здоровых людей, полученные с помощью вышеуказанной центрифуги, также оказались пригодны для подсчета клеточного состава, так как полученные различия количества ядросодержащих клеток разных видов при подсчете миелограмм 10 мазков и ЦЦФ не значимы.

Было проведено контрольное измерение морфометрических показателей клеток в обычных мазках и ЦЦФ периферической крови и костного мозга на приборе «АСПЕК». Данное исследование эритроцитов периферической крови практически здорового человека достоверных различий в сравниваемых препаратах не выявило (р>0,05). Таким образом, геометрические параметры в

мазках и ЦЦФ являются в достаточной степени воспроизводимыми переменными.

Исследование геометрических параметров бластных клеток в обычных мазках и ЦЦФ костного мозга больных острыми миелоиднъши лейкозами выявило вариабельность формы клеток (р<0,01), ядер (р<0,01) и ядерно-цитоплазматического соотношения (р<0,03), что подтверждает морфологическую гетерогенность лейкозного клона и доказывает целесообразность их исследования методом морфометрического анализа при разных вариантах.

В связи с тем, что исследование бластных клеток с помощью компьютерной морфометрии является новым, не до конца оцененным методом, из-за отсутствия определенных данных не только при патологии, но и в норме, были получены нормативные морфометрические характеристики 840 бластных клеток взрослых здоровых людей при обследовании 8 доноров костного мозга (Таб. 2). Из-за очень малого процентного содержания бластных клеток в костном мозге гематологически здоровых людей, их отбор осуществлялся не менее чем из 5-7 ЦЦФ каждого донора.

Таблица 2. Средние значения морфометрических показателей бластных клеток в цитоцентрифугатах костного мозга практически здоровых людей (п=840).

Показатель Среднее М Станд. ошибка ±т Станд. отклон. ± SD Минимум min Максимум max Коэф. вариации СУ, %

Площадь клетки, мкм3 171,86 2,10 42,95 87,74 344,05 25,13

Периметр клетки,мкм 47,54 0,29 5,86 34,23 69,88 12,51

клетки 0,94 0,01 0,03 0,80 0,99 3,52

РР2 клетки 1,00 1,46 0,003 0,99 1,02 0,37

Площадь ядра, мкм2 123,88 1,37 28,17 65,80 264,36 22,17

Периметр ядра, мкм 41,52 0,23 4,77 29,56 59,70 11,04

РР1 ядра 0,89 0,02 0,05 0,69 0,97 5,87

РР2 ядра 1,00 2,93 0,006 0,99 1,04 0,62

ЯЦС 2,56 0,06 1,19 1,08 10,00 29,01

Примечания: ЯЦС - ядерно-цитоплазматическое соотношение; - фактор формы 1; РР2 - фактор формы 2.

Полученные морфометрические параметры властных клеток достоверно не отличались между выборками восьми человек (р > 0,05). Таким образом, сводная выборка морфометрических, параметров бластных клеток здоровых людей, несмотря на вариации внутри каждой отдельной выборки для площади клетки, ядра и ЯЦС, может быть использована в качестве контрольной.

Для разделения бластных клеток здоровых людей по площади клетки и ЯЦС за основу был взят интервал М ± БО (Таб. 3). По литературным данным такой интервал чаще применяется для анализа гетерогенной популяции клеток. Эти показатели (площадь клетки и ЯЦС) выбраны на основе морфологической характеристики бластных клеток. Клетки, лежащие по величине их площади в этом интервале, отнесены к группе клеток средних размеров, имеющие меньшую площадь - мелких размеров, большую - крупных размеров.

Таблица 3. Соотношение размеров бластных клеток костного мозга практически здоровых людей по площади (п=840).

Размер Интервал Абсолютное Относительное

клетки мкм2 количество количество, %

Мелкие 87,74 -128,90 112 13,3

ппп - (М - ББ)

Средние М±БО 128,91-214,81 604 71,9

Крупные (М + БО) - шах 215,82-344,05 124 14,8

Для разделения на группы по ЯЦС бластных клеток мы использовали термины: высокое ЯЦС - в пределах интервала (1,37 - 3,75), умеренное ЯЦС -меньше интервала (0,98 - 1,36), очень высокое - больше интервала (3,76 -10,0).

По нашим данным в норме в костном мозге преобладают бластные клетки средних размеров и их доля составляет 71,9%. При этом, 12,3% этих клеток имеют очень высокое ЯЦС, 74,8% - высокое ЯЦС и 12,9% - среднее ЯЦС. Среди бластных клеток мелких размеров преобладают клетки с высоким ЯЦС -58,9% и очень высоким - 39,3%. А в популяции крупных бластных клеток преобладают клетки с высоким и средним ЯЦС - 66,1% и 30,6% соответственно. Полученное соотношение этих признаков бластных клеток здоровых людей представлено графически на рисунке 1.

мелкие клетки средние клетки крупные клетки 13,3% 71,9% 14,8%

Рисунок 1. Ядерно-цитоплазматическое соотношение мелких, средних и крупных бластных клеток костного мозга здоровых людей (п=840).

Полученные морфометрические параметры бластных клеток костного мозга здоровых людей были использованы для анализа характеристик бластных клеток больных острыми миелоидными лейкозами.

На основании морфо-цитохимических данных бластные клетки при ОМЛ были подразделены с учетом ФАБ-классификации на следующие варианты: острый миелобластный лейкоз с минимальной миелоидной дифференцировкой (ОМЛ МО), острый миелобластный лейкоз без созревания (ОМЛ М1), острый миелобластный лейкоз с созреванием (ОМЛ М2), острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ МЗ), острый миеломонобластный лейкоз (ОМЛ М4) и острый монобластный лейкоз (ОМЛ М5).

Проведенный сравнительный анализ морфо-цитохимических особенностей различных вариантов острых миелобластных лейкозов выявил (Таб. 4), что по мере созревания лейкозной популяции увеличивается процент клеток, содержащих азурофильную зернистость и палочки Ауэра, а также усиливается активность гранулоцитарных ферментов. Содержание миелопероксидазы (1,76 ± 0,13 ед.) в миелобластах при ОМЛ М2 достоверно выше (р < 0,01), чем при ОМЛ М1 (0,28 ± 0,04 ед.), а в лейкозных промиелоцитах (2,76 ± 0,17 ед.) выше (р < 0,01), чем в миелобластах при ОМЛ М2, что соответствует исследованиям других авторов. Однако, в доступных нам литературных источниках мы встретили разные данные по количеству

выявленного в миелобластах гликогена с помощью ШИК-реакции и по количеству изоэнзимов неспецифической эстеразы. Некоторые авторы не выявили различий количества ШИК-положительного вещества в бластных клетках при ОМ Л МО - МЗ. В нашей работе количество ШИК-положительного вещества в бластных клетках при ОМЛ М1 и М2 (0,48 ± 0,13 и 0,68 ±0,15 ед.) было одинаковым, однако, в бластных клетках при ОМЛ МО (0,14 ± 0,04 ед.) достоверно меньше (р < 0,01), а в клетках при ОМЛ МЗ (91,71 ± 0,14 ед.) достоверно выше (р < 0,01), чем при ОМЛ М1 и М2. Содержание изоэнзимов неспецифической эстеразы было близким при М1, М2 и МЗ вариантах ОМЛ (0,43 ± 0,07 ед., 0,58 ± 0,13 ед. и 0,56 ± 0,15 ед.), а при МО (0,09 ± 0,01) достоверно ниже (р < 0,01).

Таблица 4. Результаты анализа морфо-цитохимических признаков бластных клеток костного мозга больных острыми миелобластными лейкозами (М0-МЗ).

Анализируемые признаки МО (п=9) М1 (п=18) М2 (п=15) МЗ (п=11)

Количество бластных клеток в костном мозге, % 67,8 ± 6,7 78,8 ± 7,1 76,3 ± 3,4 75,5 ± 4,8

Количество бластных клеток в крови, % 22,1 ±3,8 13,4 ±5,7 57,4 ±12,0 61,8 ±6,9

Количество ядер неправильной формы (морфология), % 15,6 ±2,8 26,2 ±5,3 32,3 ± 6,3 36,4 ±11,7

Количество ядер неправильной формы (морфометрия), % 12,2 ± 3,4 21,5 ±3,0 24,8 ±4,7 45,8 ±3,0

Наличие в бластных клетках азурофильной зернистости и/или палочек Ауэра, % единичные 8,9 ±1,4 35,8 ±3,8 78,4 ±2,9

Количество в бластных клетках МПО, единицы 0,01±0,01 0,28±0,04 1,76±0,13 2,76±0,17

Количество в бластных клетках ШИК, единицы 0,14±0,04 0,48±0,13 0,68±0,15 1,71±0,14

Количество в бластных клетках НЭ, единицы 0,09±0,01 0,43±0,07 0,58±0,13 0,56±0,15

Примечания: МПО - фермент миелопероксидаза; ШИК - полисахариды;

НЭ - фермент неспецифическая эстераза.

Цитохимическое исследование бластных клеток больных ОМЛ М4 обнаружило активность миелопероксидазы в 45,6% ± 19,8% клеток, при этом

СЦК равен 0,67 ± 0,24. PAS - позитивный материал выявлен в 38,4% ± 4,5% бластных клеток, в диффузном и диффузно-гранулярном виде, СЦК равен 0,48 ± 0,25. Реакция на неспецифическую эстеразу высоко активная в 68,1% ± 11,8% клеток, СЦК составляет 1,66 ± 0,25, в 33,3% ± 6,5% клеток ингибируется фтористым натрием, СЦК равен 0,61 ± 0,12.

Полученные данные для больных OMJI М5 выявили активность миелопероксидазы в среднем в 4,9% бластных клеток, при этом СЦК равен 0,06 ± 0,05. PAS - позитивный материал выявлен в 45,6% ± 7,9% бластных клеток, в диффузном или диффузно-гранулярном виде, СЦК равен 0,54 ±0,13. Реакция на неспецифическую эстеразу высоко активная в 100% клеток, СЦК составляет 2,01 ± 0,08, и подавляется фтористым натрием в 98,1% ± 0,7% клеток.

Морфометрия бластных клеток при острых миелоидных лейкозах.

Группа больных OMJI МО. Разделение 945 бластных клеток 9 больных этой группы по морфометрическим параметрам выявило преобладание средних -50% и крупных - 46,6% клеток. При этом, в популяции бластных клеток средних размеров выявлено приблизительно одинаковое количество клеток с высоким (56,8%) и умеренным (43,2%) ЯЦС, как и в популяции бластных клеток крупных размеров (51,6% и 48,4% соответственно). Властные клетки с очень высоким ЯЦС в данной группе больных не выявлены.

Группа больных OMJI Ml. По полученным морфометрическим параметрам 1890 бластных клеток в костном мозге 18 больных OMJI Ml клетки крупных размеров составили 41,3%, среди которых 88,4% со средним ЯЦС и 11,6% с высоким. В популяции бластных клеток средних размеров (36,4%) большая часть с высоким ЯЦС - 68,4% и 31,6% - со средним ЯЦС. Среди бластных клеток мелких размеров (22,3%) преобладают клетки с высоким - 48,1% и очень высоким - 35,4% ЯЦС.

Группа больных OMJI М2. Полученные нами морфометрические данные 1575 бластных клеток выделяют в популяции 15 больных этой группы преимущественно мелкие клетки - 46,2% с высоким (45,4%) и очень высоким (47,4%) ЯЦС и средние клетки - 44% с высоким (62,7%) и средним (29,7%) ЯЦС. На долю крупных клеток приходиться всего 9,8%.

Группа больных ОМЛ МЗ. Распределение полученных морфометрических характеристик 1155 бластных клеток 11 больных ОМЛ МЗ показало, что популяцию составляют клетки средних (56,3%) и крупных (42,5%) размеров. Среди бластных клеток средних размеров преобладают клетки с умеренным -58,2% и высоким - 39,7% ЯЦС. Среди крупных бластных клеток 92,7% — с умеренным и 7,3% - с высоким ЯЦС. Микрогенерации и клетки с очень высоким ЯЦС в популяции данной группы не превышают 2%.

Группа больных ОМЛ М4. Полученные морфометрические данные 2730 бластных клеток выделяют в популяции 26 больных данной группы преимущественно клетки средних размеров - 56,5%, из которых 65% с высоким и 26,9% с умеренным ЯЦС. Клетки мелких размеров составили 34,8%, из них 68,8% клеток с высоким ЯЦС и 29,2% - с очень высоким. На долю клеток крупных размеров приходиться всего 8,7%.

Группа больных ОМЛ М5. Морфометрический анализ 735 бластных клеток 7 больных ОМЛ М5 выявил, что в популяции наибольший процент (65,3%) принадлежит клеткам крупных размеров. При этом, 75% составляют клетки с умеренным и 24,5% с высоким ЯЦС. Среди клеток средних размеров, которые составляют 33,7% от популяции, почти в равных долях (48,5% и 49,5%) выявлены клетки с высоким и умеренным ЯЦС. Мелкие бластные клетки, а также клетки с очень высоким ЯЦС в популяции составляют 1% и 2% соответственно.

По полученным нами морфометрическим параметрам мы провели сравнительный анализ процентного соотношения миелобластов трех типов в соответствии с ФАБ-критериями в группах больных ОМЛ с вариантами МО - МЗ. Бластные клетки мелких и средних размеров с очень высоким и высоким ЯЦС отнесены к миелобластам 1-го типа, с умеренным ЯЦС - к миелобластам 2-го типа. Миелобласты 3-го типа - клетки крупных размеров с умеренным или высоким ЯЦС и с неправильной формой ядра (факторы формы ядра 1 и 2 менее 0,8).

Оказалось, что миелобласты при ОМЛ М2 и ОМЛ МЗ имеют свои характерные особенности, в то время как миелобласты при ОМЛ МО по этим параметрам сходны с миелобластами при ОМЛ М1 (Рис. 2).

М0(п=9)

М1 (п=18) М2 (п=15) МЗ (п=11)

Рисунок 2. Соотношение морфометрических типов миелобластов в костном мозге больных острыми миелобластными лейкозами (МО-МЗ).

В литературе сведения о процентном соотношении миелобластов при ОМЛ МО и М1 противоречивы и носят описательный характер, так как основываются на морфологическом исследовании. Одни авторы отмечают преобладание в популяции этих вариантов миелобластов 1-го типа, другие -миелобластов как 1-го, так и 2-го типа. Полученные нами морфометрические данные согласуются с последними исследователями. Миелобласты 1-го типа при ОМЛ МО и М1 составили 54,7% и 48,3% соответственно, миелобласты 2-го типа - 42% и 49%, а миелобласты 3-го типа -1,3% и 2,7%.

При ОМЛ М2 по нашим данным в клеточной популяции преобладали миелобласты 2-го типа (73,8%), а на долю миелобластов 1-го и 3-го типа пришлось 16,7% и 9,5% соответственно. Аналогичные данные приводятся в литературе при морфологическом и морфометрическом исследовании.

Большинство авторов говорят о том, что при ОМЛ МЗ основную долю в популяции при морфологическом исследовании составляют миелобласты 3-го типа. Однако, в нашей работе, на их долю пришлось 42,4%. Миелобласты 2-го типа в данной популяции выявлены в 33,2%, а миелобласты 1-го типа в 24,4%. Работ по изучению миелобластов при ОМЛ МЗ на основе морфометрического метода исследования мы не встретили.

Возможно, неоднородность этих результатов связана с тем, что недостаточно измерение только одних геометрических параметров бластных клеток и необходимо к морфометрическим характеристикам добавить цветные и текстурные.

Проведен сравнительный анализ полученных морфометрических значений для площадей бластных клеток всех вариантов ОМЛ с «контрольной группой», так как этот показатель является наиболее информативным геометрическим параметром для дискриминации клеток (Рис. 3). Средние значения площади бластных клеток костного мозга при вариантах МО и М1 по полученным нами данным увеличены в среднем на 16,5% по сравнению с бластными клетками здоровых людей, при варианте МЗ - на 18,6%, при варианте М5 - на 25,2%, а при вариантах М2 и М4 эти значения уменьшены на 13,4% и 11,1% соответственно. Средние значения площади ядер бластных клеток при варианте МО превышают средние значения ядер «контрольной группы» в среднем на 7,5%, при М1 - на 23,0%, при М5 - на 12,7%, а при М2 и М4 - имеют меньшие значения на 16,9% и 12,9%. Интересно отметить, что средние значения ЯЦС имеют достоверные различия при всех вариантах ОМЛ, кроме М4 (р < 0,05).

доноры МО М1 М2 МЗ М 4 М 5 костного мозга

Рисунок 3. Сравнение процентного соотношения бластных клеток по площади в исследуемых группах.

Сравнительный анализ средних значений площадей бластных клеток между группами больных ОМЛ показал отсутствие достоверных различий для вариантов МО и МЗ, а также М2 и М4 (р > 0,05). Это объясняется тем, что популяции бластных клеток вариантов МО и МЗ представлены в основном мезо- и макрогенерациями, а популяции М2 и М4 максимально гетерогенны по размерам бластных клеток. Однако, средние значения площадей ядер клеток и их факторов формы 1 и 2 этих вариантов достоверно отличались (р < 0,05).

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о значительной морфо-цитохимической гетерогенности бластных клеток при миелоидных острых лейкозах. Более того, отмечены выраженные индивидуальные различия комбинаций исследуемых признаков.

Метод компьютерной морфометрии бластных клеток доказал свою значимость. Компьютерный анализ изображения дает очень важную дополнительную информацию, которую трудно или невозможно получить при помощи других методов. При этом можно с высокой точностью измерять не только сдвиги кривой распределения бластных клеток по размерам, но и более тонкие изменения, в частности формы клеток, их ядер и ЯЦС, что увеличивает чувствительность и специфичность методики тестирования. Кроме того, получены морфометрические параметры бластных клеток костного мозга здоровых людей и больных острыми миелобластными лейкозами, что в будущем позволит применить их для аналитической цитохимии, а также оценить и понять индивидуальную и внутригрупповую вариабельность совокупности цитологических признаков лейкозных клеток.

ВЫВОДЫ:

1. Компьютерная морфометрия бластных клеток является средством определения и измерения их параметров. Обязательным условием для компьютерной морфометрии бластных клеток является цитохимическая верификация вариантов острых лейкозов и стандартная пробоподготовка исследуемого материала.

2. Разработан протокол пробоподготовки для получения стандартных монослойных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах с учетом объемов проб и режимов центрифугирования.

3. Установлено, что морфометрический анализ изображений бластных клеток костного мозга является объективным методом изучения морфологической гетерогенности клеточных популяций.

4. Выявлены с помощью компьютерной морфометрии геометрические параметры бластных клеток, характеризующие микро-, мезо- и макрогенерации при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

5. Результаты компьютерной морфометрии бластных клеток в цитоцентрифугатах костного мозга могут лечь в основу формирования базы объективных данных о морфологических особенностях клеточных популяций гемопоэза у практически здоровых людей и у больных острыми миелоидными лейкозами.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации.

1. Погорелов В.М., Дягилева O.A., Краснова JI.C., Иванова И.А., Козинец Г.И. Основные компоненты цвета как критерии автоматического распознавания клеток в аналитической цитохимии. // Проблемы гематологии и переливания крови. Материалы съезда гематологов и трансфузиологов 11-13 апреля. -Москва, 2006. - №1. - С. 60.

2. Краснова JI.C., Наумова И.Н., Дягилева O.A., Погорелов В.М., Козинец Г.И. Пригодность цитоцентрифугатов периферической крови для анализа клеточного изображения. П Проблемы гематологии и переливания крови. Материалы съезда гематологов и трансфузиологов 11-13 апреля. - Москва,

2006,- №1. -С. 41.

3. Краснова Л.С., Наумова И.Н., Дягилева O.A., Иванова И.А, Погорелов В.М., Козинец Г.И. Режимы приготовления цитоцентрифугатов, пригодных для анализа клеточного изображения. // В сб.: Новое в гематологии и трансфузиологии. - Киев, 2006. - Вып. 4 . - С. 41-44.

4. Красников A.B., Краснова Л.С., Погорелов В.М. Объективная оценка качества цитоцентрифугатов клеток крови на предметных стеклах. // Вестник гематологии. - Санкт-Петербург, 2007. - Том III. - №2. - С. 58.

5. Краснова Л.С., Красников A.B., Наумова И.Н., Дягилева O.A., Погорелов В.М., Козинец Г.И. Использование цитоцентрифуги для стандартизации пробоподготовки препаратов костного мозга. // Вестник гематологии. - Санкт-Петербург, 2007. - Том III. - №2. - С. 59.

6. Красников A.B., Краснова Л.С., Погорелов В.М. Морфометрический метод оценки качества цитоцентрифугатов клеток крови. // Сборник научных трудов, VI съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии». - Минск, 2007. - С. 167.

7. Краснова Л.С., Красников A.B., Дягилева O.A., Погорелов В.М. Стандартизация морфо-цитохимических исследований в гематологии. // Сборник научных трудов, VI съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии». - Минск,

2007.-С. 168.

8. Краснова JI.C., Красников А.В., Наумова И.Н., Дягилева О.А., Погорелов В.М. Стандартная пробоподготовка периферической крови для проведения морфоцитохимических реакций. // Клиническая лабораторная диагностика. -Медицина, 2007. - №9. - С. 54-55.

9. Красников А.В., Краснова Л.С., Погорелов В.М. Интегральная оценка качества и подбор оптимальных режимов цитоцентрифугирования клеток крови./Жлиническая лабораторная диагностика. - Медицина, 2007.-№9.-С. 54.

10. Погорелов В.М., Иванова И.А., Красников А.В., Краснова Л.С., Наумова И.Н., Дягилева О.А., Скедина М.А., Козинец Г.И. Распределение клеток в цитоцентрифугатах на предметных стеклах, полученных на центрифуге DiffSpin 2 Slide S pinner (model M 701-22, StatSpin, USA). // В сб.: Новое в гематологии и трансфузиологии. - Киев, 2008. - В. 8. - С. 148-154.

11. Краснова Л.С., Красников А.В., Погорелов В.М. (Krasnova L., Krasnicov A., Pogorelov V.) Standardization in morphologic and cytochemistry researches in hematology. // In Abstracts of the XXIst Intetnational Symposium on Technological Innovation in Laboratory Hematology (28 April-1 May 2008). // Int. J. Lab. Hematology, 2008. - Vol. 30. - Suppl. 1. - P. 92.

12. Погорелов B.M., Краснова Л.С., Красников A.B., Чаниева М.И. (Pogorelov V., Krasnova L., Krasnicov A., Chanieva M.) Erythrogramma in anemia patients. // In Abstracts of the XXIst Intetnational Symposium on Technological Innovation in Laboratory Hematology (28 April-1 May 2008). // Int. J. Lab. Hematology, 2008. - Vol. 30. - Suppl. 1. - P. 93.

13. Красников A.B., Краснова Л.С., Погорелов B.M. (Krasnicov A., Krasnova L., Pogorelov V.) Method of quantitative definition cytochemical reactions on myeloperoxidaze. // In Abstracts of the XXIst Intetnational Symposium on Technological Innovation in Laboratory Hematology (28 April-1 May 2008). // Int. J. Lab. Hematology, 2008. - Vol. 30. - Suppl. 1. - P. 70.

14. Краснова Л.С., Наумова И.Н., Красников A.B., Дягилева О.А., Погорелов В.М. Стандартная пробоподготовка крови для автоматического исследования. // Клиническая лабораторная диагностика. - Медицина, 2008. -№9.-С. 71-72.

15. Погорелов В.М., Краснова Л.С., Наумова И.Н., Дягилева О.А., Чаниева М.И., Красников А.В. Необратимые изменения эритроцитов в стандартных

цитоцентрифугатах периферической крови. // Клиническая лабораторная диагностика. - Медицина, 2008. - №9. - С. 72.

16. Погорелов В.М., Краснова JI.C., Чаниева М.И., Красников А.В., Козинец Г.И. Геометрия прегемолитических пойкилоцитов в стандартных центрифугатах крови на предметных стеклах. // Гематология и трансфузиология. - Медицина, 2008. - т. 53. - №6. - С.22-26.

Автор приносит искреннюю благодарность за помощь и совместную работу:

Г.И. Козинцу, В.М. Погорелову, О.А.Дягилевой, И.Н. Наумовой, О.В. Поповой, Т.Г. Сарычевой, А.В. Красникову, B.C. Каталиной, Д.А. Шмарову, И.Б. Капланской, В.В. Троицкой, Т.Ц. Гармаевой, З.Г. Шишкановой, В.В. Высоцкому, сотрудникам лаборатории гемоцитологии и других подразделений ГНЦ РАМН.

Подписало в печать: 21.05.2009

Заказ № 2117 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 . 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы исследования.

Гетерогенность популяции нормальных кроветворных предшественников по фенотипическим признакам и уровням дифференцировки, а также возможность опухолевой трансформации на любой стадии их развития отражается в значительном разнообразии лейкозных клонов. Выявление этой гетерогенности в первую очередь базируются на морфо—цитохимических особенностях лейкозных клеток [50].

Анализ морфо-цитохимических признаков позволил выделить и охарактеризовать типы бластных клеток и разработать классификации острых лейкозов [59, 74]. Применение их в практической гематологии привело к достижению существенных успехов в области диагностики и лечения больных. Использование современных лечебных программ у больных острыми миелоидными лейкозами (OMJT) позволяет получить 62 — 85% полных ремиссий с 5-летней безрецидивной выживаемостью, достигающей 29 - 46% [58]. Однако, у части больных развиваются фатальные рецидивы заболевания, а эскалация доз цитостатиков не всегда оказывает терапевтический эффект.

Под воздействием естественной и «искусственной» (цитостатическая терапия) селекции в лейкозной популяции появляются новые варианты клеток. Давно отмечено, что с введением новых комплексов цитостатических средств, с появлением длительных ремиссий, сменяемых рецидивами, рефрактерными к ранее эффективным цитостатическим препаратам, в первую очередь проявляется изменчивость формы и величины ядер и цитоплазмы лейкозных клеток, причем изменения ядра морфологически более выражены [59, 69].

В настоящее время оценка морфологических и цитохимических признаков бластных клеток при острых лейкозах, которые отражают степень их созревания и дифференцировки и лежат в основе современных классификаций (ФАБ-классификация, 1991; ВОЗ классификация, 2008), носит субъективный характер. Это подчеркивает необходимость перехода с обычного визуального анализа микроскопических изображений к применению методов количественной цитологии, позволяющих выявить и сравнить индивидуальную и внутригрупповую вариабельность цитологических признаков лейкозных клеток.

Оценка современного состояния и внедрения технических достижений в медицинскую практику показывает, что анализаторы изображений клеток охватывают большую область применений, однако используются в основном, в отличие от проточных цитометров, при выполнении научно-исследовательских работ: метод предъявляет повышенные требования к приготовлению исследуемого материала и требует стандартизации этого процесса.

Стандартизация приготовления препаратов периферической крови осуществляется либо с помощью различных автоматических/механических устройств, либо с применением специальных цитоцентрифуг [23. 41, 50, 103, 109]. Однако, нам не встретились опубликованные данные о возможности использования таких устройств для стандартизации пробоподготовки костного мозга с последующим компьютерным морфометрическим анализом его клеточного состава.

Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: определить морфометрические параметры бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами.

Задачи исследования:

1. Разработать протокол получения стандартных цитоцентрифугатов на предметных стеклах из проб периферической крови и костного мозга.

2. Выявить особенности расположения клеток в цитоцентрифугатах периферической крови и костного мозга в норме и при острых лейкозах.

3. Определить пригодность стандартных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга для компьютерного анализа изображения клеток.

4. Исследовать возможности компьютерной морфометрии для оценки морфологической гетерогенности бластных клеток при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

Научная новизна. В работе впервые показано, что морфометрия изображений бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Полученными в диссертации достоверными результатами обосновано научное положение о том, что количественная цитология — средство выделения и объективного описания модальных устойчивых классов бластных клеток, характеризующих варианты острых миелоидных лейкозов.

Практическая значимость работы.

Разработанная в ходе настоящего исследования стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность препаратов исследуемого материала для объективной оценки с использованием компьютеризированных систем анализа клеточного изображения в научно-исследовательских работах и в практике клинико-лабораторного обследования гематологических больных.

Апробация работы:

1. Разработанная методика используется в лаборатории гемоцитологии учреждения Российской академии медицинский наук Гематологический научный центр РАМН для проведения клинико-лабораторных и научных исследований.

2. Материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, докладывались на научных и научно-практических конференциях.

3. Полученные в процессе работы аппаратно-программные средства используются при обучении аспирантов и научных сотрудников методам автоматизированного исследования бластных клеток в лаборатории гемоцитологии Гематологического научного центра РАМН.

4. Разработанную установку для автоматизированного компьютерного морфометрического анализа бластных клеток и комплекс методов, полученных в ходе проведения данной работы можно рассматривать как научно-методическую базу для проведения подобного рода исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность цитологических препаратов для объективного анализа.

2. Компьютерная морфометрия бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на Российской научно-практической конференции «Технологии и инновации в лабораторной медицине» (Москва, 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и библиографического указателя, включающего 145 работ, из них 71 работа отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками, содержит 21 таблицу.

выводы.

1. Компьютерная морфометрия бластных клеток является средством определения и измерения их параметров. Обязательным условием для компьютерной морфометрии бластных клеток является цитохимическая верификация вариантов острых лейкозов и стандартная пробоподготовка исследуемого материала.

2. Разработан протокол пробоподготовки для получения стандартных монослойных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах с учетом объемов проб и режимов центрифугирования.

3. Установлено, что морфометрический анализ изображений бластных клеток костного мозга является объективным методом изучения морфологической гетерогенности клеточных популяций.

4. Выявлены с помощью компьютерной морфометрии геометрические параметры бластных клеток, характеризующие микро-, мезо- и макрогенерации при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

5. Результаты компьютерной морфометрии бластных клеток в цитоцентрифутатах костного мозга могут лечь в основу формирования базы объективных данных о морфологических особенностях клеточных популяций гемопоэза у практически здоровых людей и у больных острыми миелоидными лейкозами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Для определения морфометрических особенностей бластных клеток костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами нами проведена работа по оптимизации и стандартизации приготовления мазков.

Несмотря на успешное применение гемоанализаторов, микроскопия мазков крови остается независимым источником диагностической информации. Высокая трудоемкость и субъективность ручной микроскопии обусловили многочисленные попытки создания систем автоматизированной микроскопии (САМ) мазков крови [40, 48, 83, 109]. Появились САМ для анализа мазков крови, обладающие достаточными для медицинского применения характеристиками точности, надежности и скорости. Становясь основным инструментом количественной цитологии, и в том числе аналитической цитохимии, эти системы позволяют не только увидеть клетку, но и, измерив ее структуры, определить место этой клетки в гетерогенной клеточной популяции [23]. Существенным преимуществом аналитической цитохимии, способной определять более 50 характеристик клеток (геометрических, текстурных, цветояркостных и популяционных), является выделение устойчивых модальных классов клеток.

Опыт квалифицированных специалистов цитологов, дополненный результатами объективной оценки морфологических и других особенностей изучаемых клеток может быть положен в основу формирования базы знаний САМ. Однако, применение САМ и определенных методов, например, морфометрии предъявляет повышенные требования к подготовке исследуемого материала и требует стандартизации этого процесса [27, 40, 43, 49, 80,104,117,119].

Монослойные цитологические препараты позволяют применять цитологическую диагностику по видеоизображениям с использованием телекоммуникаций, использовать компьютерные технологии в оценке результата анализа. Однако, стандартизация в цитологии остается на сегодняшний день важной и трудной проблемой. Лабораторные цитологические методы имеют свои особенности, являясь преимущественно полуколичественными морфологическими методами, которые в отличие от классических лабораторных методов, носят описательный характер. Кроме того, «цитологический диагноз» (заключение) зависит от субъективного фактора: квалификация и практический опыт цитолога, способность оценить различные цитологические признаки [10, 42, 117].

В связи с вышесказанным, в диссертации была поставлена задача стандартизировать процесс приготовления препаратов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к унифицированным мазкам как для работы в лаборатории, так и для работы в исследовательской практике на автоматических анализаторах клеточных изображений. В результате проведенной работы разработана методика пробоподготовки периферической крови и костного мозга на предметных стеклах с помощью цитоцентрифуги DiffSpin 2 Slide Spinner (model M 701-22, StatSpin, USA).

Был осуществлен подбор оптимального объема и времени вращения центрифуги для получения монослойных мазков периферической крови 20 практически здоровых людей и 22 больных различными заболеваниями с анемическим синдромом, а также для костного мозга 8 здоровых доноров гемопоэтических клеток и 57 больных острыми лейкозами. Для здоровых людей определен объем периферической крови в 50 мкл, а для людей со сниженными гематологическими показателями объем крови составил 60 мкл, время центрифугирования во всех случаях равно 2 секундам (режим №5). Для получения стандартных препаратов костного мозга определен оптимальный объем в 60-70 мкл при времени вращения центрифуги в 2 секунды (режим №5). Пробоподготовка костного мозга с помощью вышеуказанной методики в нашей работе проведена впервые, так как нет литературных данных о применении специальных устройств для приготовления стандартных монослойных препаратов костного мозга.

В работе впервые была проведена оценка полученных цитоцентрифугатов (ЦЦФ) периферической крови и костного мозга путем микроскопии и на приборе «АСПЕК», которая показала однородное и равномерное распределение клеток на всем их протяжении с сохранением геометрии клеток, структуры, текстуры, количественного соотношения, оптической плотности, цвета и яркости. В то время как, в обычных мазках правильно оценить морфологию клеток и их ферментативную активность возможно только в самом тонком месте мазка (в так называемой «щеточке»), что является нарушением правил подсчета ядросодержащих элементов, так как для правильной их количественной оценки должен быть равномерно просмотрен весь мазок [47].

Показаны особенности расположения клеток при сравнении лейкоцитарной формулы в обычных мазках периферической крови и в ЦЦФ. Оказалось, что различия в количестве лейкоцитов разных видов из мазков и ЦЦФ здоровых людей находятся в пределах физиологических колебаний и клинического значения не имеют. Сравнение лейкоцитарной формулы одного больного сублейкемическим миелозом в развернутой стадии также не выявило различий в количестве бластных клеток, метамиелоцитов трех линий, палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов, а так же сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов и базофилов в обычных мазках и ЦЦФ (р>0,05). В то время как, средние значения числа промиелоцитов и миелоцитов трех ростков в ЦЦФ больного сублейкемическим миелозом были несколько больше средних значений этих элементов в обычных мазках, их количество достоверно различалось (р<0,01). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что перечисленные форменные элементы в ручном мазке остаются в его начале, либо сдвигаются в «усы». Количество разрушенных клеток в ЦЦФ достоверно меньше, чем в мазках (р<0,001).

ЦЦФ костного мозга здоровых людей, полученные с помощью вышеуказанной центрифуги также пригодны для подсчета клеточного состава, так как полученные различия количества ядросодержащих клеток разных видов при подсчете миелограммы с мазков и ЦЦФ клинически не значимы.

Сравнительный анализ цитохимической окраски не выявил различий между общепринятыми цитохимическими реакциями на мазках и ЦЦФ, что согласуется с результатами Leif и соавторов [104].

Было проведено контрольное измерение морфометрических показателей клеток в обычных мазках и ЦЦФ периферической крови и костного мозга на приборе «АСПЕК». В работе использована стандартно-измерительная программа, позволяющая оценить площадь, периметр и форму самой клетки, ее ядра, а также ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС). Данное исследование клеток периферической крови и костного мозга достоверных различий в сравниваемых препаратах не выявило (р>0,05). Следовательно, метод приготовления препаратов периферической крови и костного мозга здоровых людей с помощью вышеуказанной центрифуги пригоден, а полученные ЦЦФ могут быть использованы для морфометрического анализа.

Исследование геометрических параметров бластных клеток в обычных мазках и ЦЦФ костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами выявило вариабельность формы клеток (р<0,01), ядер (р<0,01) и ядерно-цитоплазматического соотношения (р<0,03), что подтверждает морфологическую гетерогенность лейкозного клона и доказывает целесообразность их исследования методом морфометрического анализа при разных вариантах.

В настоящее время метод автоматизированной морфометрии клеток находит все более широкое применение в гематологической практике [11, 20, 26, 27, 36, 40, 41, 49, 61, 80, 85, 109]. Из многочисленных работ, посвященных проблеме изучения морфологических свойств и функционального состояния клеток крови с помощью современных компьютеризированных анализаторов изображения очевидно их неоспоримое преимущество по сравнению с традиционными визуальными методами [3, 5, 9, 19, 24, 28, 53-56]. Кроме того, внедрение новых компьютерных систем позволяет не только ускорить проведение рутинных исследований, но и объективизировать полученные данные, а также открыть перспективы изучения новых, неизвестных в классической цитологии характеристик клеток и клеточной физиологии [80, 109, 137].

Можно выделить основные группы приборов для количественной цитометрии — проточные гематологические анализаторы, проточные цитометры-сортировщики клеток, универсальные анализаторы изображений, специализированные автоматы изображений. Каждая группа приборов имеет свои принципиально сильные и слабые стороны и не может полностью вытеснить другие группы приборов для проведения цитологических исследований.

Основное преимущество проточных систем — их высокая скорость измерения характеристик клеток, когда измеряются оптические и кондуктометрические параметры клеток [23, 86, 93]. Помимо анализа клеточных параметров, они обеспечивают подсчет количества клеток в единице объема крови, что не могут измерить компьютерные цитометры, анализирующие мазки, а не клеточные суспензии. Однако, недостатком проточных систем является весьма ограниченные возможности в измерении тонкой морфологии клеток. Отсутствие визуального контроля может приводить к затруднениям в интерпретации результатов анализа [35, 119, 121].

Анализаторы изображения измеряют меньшее количество клеток в единицу времени, но зато определяют другие параметры, которые могут оказаться более информативными и/или характеризуются более высокой разрешающей способностью. Их преимуществом является визуализация данных, а также возможность многократных повторных исследований отдельно взятых клеток и обмен данными с другими исследователями, используя для этого современные телекоммуникационные средства [41, 45].

Бластные клетки костного мозга являются родоначальниками соответствующих ростков кроветворения, что находит свое отражение в их морфологии. Однако, для бластных клеток человека пока не разработаны соответствующие критерии и программные алгоритмы их морфологической оценки с помощью компьютерного анализа изображения, которые позволяли бы определить понятие «морфологической нормы» [49, 50, 57].

Литературные данные исследований морфометрических особенностей бластных клеток хорошо изучены при различных вариантах острого лимфобластного лейкоза [64, 118], а при вариантах острого миелоидного лейкоза исследования немногочисленные и результаты их неоднозначны [51, 86, 87, 100, 101, 127, 129]. Поэтому, следующим этапом нашей работы было получение морфометрических данных бластных клеток в стандартных ЦЦФ костного мозга практически здоровых людей и больных различными вариантами острых миелоидных лейкозов до начала терапии.

В ходе нашей работы всего было обследовано 8 здоровых доноров гемопоэтических клеток и 129 человек с острым лейкозом (ОЛ) до лечения. Проведенное морфо-цитохимическое исследование бластных клеток костного мозга больных ОЛ верифицировало 89 больных с острым миелоидным лейкозом, среди них: 9 человек с острым миелобластным лейкозом с минимальной миелоидной дифференцировкой (ОМЛ МО), 18 - с острым миелобластным лейкозом без созревания (ОМЛ Ml), 15 — с острым миелобластным лейкозом с созреванием (ОМЛ М2), 11 — с острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ МЗ), 26 — с острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ М4), 7 - с острым монобластным лейкозом (ОМЛ М5), 2-е острым эритромиелозом (ОМЛ Мб) и 1 - с острым мегакариобластным лейкозом (ОМЛ М7).

Сравнительный анализ морфо-цитохимических особенностей вариантов острых миелобластных лейкозов (МО — МЗ) выявил, что по мере созревания лейкозной популяции увеличивается процент клеток, содержащих азурофильную зернистость и палочки Ауэра, а также усиливается активность гранулоцитарных ферментов. Содержание миелопероксидазы (1,76 ± 0,13 ед.) в миелобластах М2 достоверно выше (р < 0,01), чем в Ml (0,28 ± 0,04 ед.) при ОМЛ, а в лейкозных промиелоцитах (2,76 ±0,17 ед.) выше (р < 0,01), чем в миелобластах М2, что соответствует исследованиям авторов [16, 25, 32, 65, 78, 81, 84, 97, 139]. Однако, в доступных нам литературных источниках мы встретили разные данные по количеству выявленного в миелобластах гликогена с помощью ШИК—реакции и по количеству изоэнзимов неспецифической эстеразы. Некоторые авторы не выявили различий количества ШИК-положительного вещества в бластных клетках МО — МЗ вариантов ОМЛ [65, 94]. В нашей работе количество ШИК-положительного вещества в бластных клетках Ml и М2 вариантах ОМЛ (0,48 ± 0,13 и 0,68 ±0,15 ед.) было одинаковым (р > 0,01), однако в бластных клетках МО (0,14 ± 0,04 ед.) достоверно меньше (р < 0,01), а в клетках МЗ (91,71 ±0,14) достоверно выше (р < 0,01), чем в Ml и М2. Содержание изоэнзимов неспецифической эстеразы было близким при Ml, М2 и МЗ вариантах ОМЛ (0,43 ± 0,07 ед., 0,58 ± 0,13 ед. и 0,56 ± 0,15 ед.), а при МО (0,09 ± 0,01) достоверно ниже (р < 0,01).

Для получения морфометрических параметров из стандартных ЦЦФ в компьютер вводилось по 105 изображений бластных клеток для каждого человека, отобранных подряд. Из-за очень малого процентного содержания в костном мозге практически здоровых людей, бластные клетки отбирались ,не менее чем из 5-7 цитоцентрифугатов каждого донора. Результаты измерений представлялись в виде таблиц в формате программы Excel (Microsoft) и в виде каталога клеток. Для сравнения значимости различий между средними значениями выборок использовали t-критерий в случае нормального распределения и хи-квадрат в случае всех остальных типов распределения, а также дисперсионный анализ.

Для дискриминации бластных клеток костного мозга здоровых людей по площади и ЯЦС, за основу был взят интервал М ± SD, а эти два показателя выбраны на основе морфологической характеристики бластных клеток [65, 84]. По литературным данным отмечено, что именно такой интервал чаще применяется для анализа гетерогенной популяции клеток [61, 63]. Количественное выражение данных (М ± SD) имеет преимущество перед субъективной градацией (0, 1, 2) и позволяет сравнивать результаты, вводя такие понятия, как достоверность различий. Более того, воспроизводимость морфометрии выше воспроизводимости субъективной оценки [1, 50, 80].

По результатам исследования выявлено, что в норме в костном мозге преобладают бластные клетки средних размеров, которые составляют 71,9%. При этом, 12,3% этих клеток имеют очень высокое ЯЦС, 74,8% - высокое ЯЦС и 12,9% - среднее ЯЦС. Среди клеток мелких размеров преобладают клетки с высоким ЯЦС — 58,9% и очень высоким — 39,3%. А в популяции крупных клеток преобладают клетки с высоким и средним ЯЦС - 66,1% и 30,6% соответственно. Морфологическая гетерогенность размеров бластных клеток здоровых людей объясняется тем, что клетки находятся в разных фазах клеточного цикла [30, 69, 92, 140].

Результаты компьютерной морфометрии показали, что морфологическая гетерогенность бластных клеток костного мозга выявлена у всех больных ОМЛ, обследованных нами в первом остром периоде до начала полихимиотерапии. Более того, отмечены выраженные индивидуальные различия комбинаций исследуемых признаков.

Сравнительный анализ полученных морфометрических характеристик бластных клеток всех вариантов ОМЛ с «контрольной группой» показал, что почти все основные морфометрические параметры бластных клеток представленных групп имеют достоверные различия в средних значениях (р < 0,05).

Площадь бластных клеток является наиболее наглядным и информативным показателем из геометрических параметров, который отражает размер клеток [39, 43, 76, 93]. Средние значения площади бластных клеток костного мозга при вариантах МО и Ml по полученным нами данным увеличены в среднем на 16,5% по сравнению с бластными клетками здоровых людей, при варианте МЗ - на 18,6%, при варианте М5 - на 25,2%, а при вариантах М2 и М4 эти значения уменьшены на 13,4% и 11,1% соответственно. Средние значения площади ядер бластных клеток при варианте МО превышают средние значения ядер «контрольной группы» в среднем на 7,5%, при Ml - на 23,0%, при М5 - на 12,7%, а при М2 и М4 -имеют меньшие значения на 16,9% и 12,9%. Интересно отметить, что средние значения ЯЦС имеют достоверные различия (р < 0,05) при всех вариантах ОМЛ, кроме М4. Процент бластных клеток с неправильной формой ядра увеличивается по мере их созревания среди миелобластных лейкозов, а именно от МО варианта к МЗ, что в доступной нам литературе не описано.

Сравнительный анализ средних значений площадей бластных клеток между группами больных ОМЛ показал отсутствие достоверных различий (р > 0,05) для вариантов МО и МЗ, а также М2 и М4. Это объясняется тем, что популяции бластных клеток вариантов МО и МЗ представлены в основном мезо- и макрогенерациями, а популяции М2 и М4 максимально гетерогенны по размерам бластных клеток. Однако, средние значения площадей ядер клеток и их факторов формы 1 и 2 этих вариантов достоверно отличались (р < 0,05).

По полученным нами морфометрическим параметрам мы провели сравнительный анализ процентного соотношения миелобластов трех типов в соответствии с ФАБ-критериями в группах больных ОМЛ с вариантами МО — МЗ. Мие лоб ласты при ОМЛ М2 и ОМЛ МЗ имеют свои характерные особенности, в то время как миелобласты при ОМЛ МО по этим параметрам сходны с миелобластами при ОМЛ Ml.

Так, при ОМЛ М2 в клеточной популяции преобладали миелобласты 2-го типа (73,8%), а на долю миелобластов 1-го и 3-го типа пришлось 16,7% и 9,5% соответственно, что находит подтверждение в работах [16, 65, 87, 139].

При варианте МЗ миелобласты 3-го типа по нашим данным составили 42,4%, миелобласты 2-го типа — 33,2% и миелобласты 1-го типа — 24,4%. Большинство исследователей говорят о том, что при остром промиелоцитарном лейкозе основную долю в популяции составляют миелобласты 3-го типа [3, 16, 65, 73, 78, 84]. Однако, эти данные основываются на морфологическом исследовании, а значит носят описательный характер. Работ по изучению миелобластов при ОМЛ МЗ на основе морфометрическом методе исследования мы не встретили.

В литературе сведения о процентном соотношении миелобластов при ОМЛ МО также противоречивы и субъективны. Одни авторы отмечают преобладайте в популяции этого варианта миелобластов 1-го типа [8, 74, 78, 106], другие — миелобластов как 1-го, так и 2-го типа [66, 94]. Полученные нами данные согласуются с последними исследователями. Миелобласты 1-го типа при вариантах МО и Ml составили 54,7% и 48,3% соответственно, миелобласты 2-го типа - 42% и 49%, а миелобласты 3-го типа - всего 1,3% и 2,7%. Возможно, неоднородность этих результатов связана с тем, что недостаточно измерение только одних геометрических параметров бластных клеток и необходимо к морфометрическим характеристикам добавить цветные и текстурные.

Таким образом, компьютерный анализ изображения дает очень важную дополнительную информацию, которую трудно или невозможно получить при помощи других методов. При этом можно с высокой точностью измерять не только сдвиги кривой распределения бластных клеток по размерам, но и более тонкие изменения, в частности формы клеток, их ядер и -ЯЦС, что увеличивает чувствительность и специфичность методики тестирования. Полученные результаты исследования показали, что метод компьютерной морфометрии бластных клеток на стандартных препаратах костного мозга позволяет в цифровых значениях геометрических параметров клеток охарактеризовать микро-, мезо- и макрогенерации и установить их соотношения в норме и при различных вариантах острого миелоидного лейкоза. Проведена работа по получению морфометрических параметров бластных клеток костного мозга здоровых людей и больных острыми миелобластными лейкозами, которая в будущем позволит применить их для количественной цитохимии, а также оценить и понять индивидуальную и внутригрупповую вариабельность совокупности цитологических признаков лейкозных клеток.