Автореферат и диссертация по медицине (14.03.01) на тему:Морфология узлов чревного сплетения и его нейронов в постнатальном онтогенезе

На правах рукописи

Коновалов Владимир Валентинович

МОРФОЛОГИЯ УЗЛОВ ЧРЕВНОГО СПЛЕТЕНИЯ И ЕГО НЕЙРОНОВ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

14.03.01 - Анатомия человека

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 1 ОКТ 2013

Ярославль - 2013

005536493

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Маслюков Петр Михайлович Официальные оппоненты:

Шилкин Валентин Викторович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры анатомии человека. Катаев Станислав Иванович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой анатомии человека.

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт физиологии им. И.П. Павлова» Российской академии наук

Защита состоится «26» ноября 2013 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.119.02 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославской государственной медицинской академии

Автореферат разослан «_» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Румянцева Татьяна Анатольевна

Актуальность темы. Исследование структуры и функции узлов автономной нервной системы представляет интерес для нейробиологии. Это связано с тем, что в отличие от мозговых структур автономные узлы имеют более простые связи, а также, в связи с их периферическим расположением, более удобны для исследования. Тем не менее, по особенностям организации ганглии автономной нервной системы весьма разнообразны. Согласно последним данным, периферические узлы автономной нервной системы представляют собой не только промежуточную станцию на пути импульсов от ЦНС к внутренним органам, но и являются низшими интегративными центрами. Имеются данные о наличии в структуре узлов наряду с эфферентными еще и чувствительных клеток, а также интернейронов (И.А.Булыгин, 1964, 1976, 1978, 1979; А.Д.Ноздрачев, 1969, 1978, 1983; 2001; В.И.Скок, 1970; Н.Г.Колосов, 1972; Gabella, 1976; А.Г.Кнорре, И.Д.Лев, 1977;

A.Д.Ноздрачев, Ю.П.Пушкарев, 1980; В.И.Скок, А.Я.Иванов, 1989;

B.Н.Швалев с соавт., 1992; А.Д.Ноздрачев, А.В.Янцев, 1995; McLachlan, 1995; А.Д.Ноздрачев, Е.И.Чумасов, 1999; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002; Janig, 2006)

По сравнению с другими симпатическими узлами, в наибольшей мере функции ганглия как интегративного центра присущи превертебральным узлам чревного сплетения, где наличие не только эфферентных, но и афферентных нейронов доказано морфологическими и физиологическими методами (И.А.Булыгин, 1964, 1976, 1978, 1979; А.Д.Ноздрачев, 1978, 1983; Janig, 2006). Тем не менее, имеются существенные различия в анатомическом строении узлов чревного сплетения у крупных и мелких лабораторных животных (П.И. Лобко, 1976; А.Д.Ноздрачев, Е.Л.Поляков, 1998; 2001; Quinson et al., 2001). Однако сведения о морфологических особенностях узлов чревного сплетения у крыс разного возраста являются недостаточными.

В онтогенезе нейронная организация симпатических ганглиев сопровождается возрастными изменениями, сопровождающимися изменением морфологии нейронов, проявляющейся в увеличении размеров клеток и числа дендритов (Шевелева B.C., 1977; Purves, 1985; Masliukov, 2000), изменением нейрохимических особенностей (Masliukov, Timmermans, 2004; А.Д.Ноздрачев, П.М.Маслюков, 2011). В основном имеющиеся сведения касаются паравертебральных узлов. Однако данные об особенностях морфометрических и нейрохимических характеристик нейронов превертебральных узлов в литературе отсутствуют.

Достаточно подробно исследованы связи нейронов узлов чревного сплетения с внутренними органами, в частности с органами желудочно-кишечного тракта (П.И. Лобко, 1976; Boyd et al., 1996; Quinson et al., 2001; Hayakawa et al., 2007). Известно, что основные проекции нейронов узлов чревного сплетения направлены к желудку и тонкой кишке (Quinson et al., 2001; Hayakawa et al., 2007). Установлено, что в онтогенезе в паравертебральных узлах происходит изменение числа связей нейронов узлов с органами-мишенями (Masliukov et al., 2000). Тем не менее, в современной литературе имеется крайне мало данных о возрастных изменениях иннервации желудочно-кишечного тракта превертебральными узлами.

Цель исследования - выявление анатомических особенностей превертебральных узлов чревного сплетения крысы, связей нейронов узлов с органами желудочно-кишечного тракта, нейрохимического состава нейронов у крыс в процессе возрастного развития.

Задачи исследования:

1. Определить анатомические особенности, варианты отхождения ветвей узлов чревного сплетения у крыс в процессе возрастного развития.

2. Установить связи нейронов чревного сплетения крыс, иннервирующих желудок и кишку в постнатальном онтогенезе.

3. Выявить морфометрические характеристики нейронов узлов чревного сплетения, а также рассчитать число нейронов в узлах у крыс в постнатальном онтогенезе,

4. Определить иммуногистохимические характеристики нейронов узлов чревного сплетения у крыс разного возраста.

Научная новизна работы. В результате нейроанатомических исследований методом препаровки установлены основные анатомические варианты узлов чревного сплетения. Узлы чревного сплетения у крыс всех возрастных групп представлены тремя узлами: парными левым и правым чревными узлами и непарным краниальным брыжеечным. Чревные узлы в основном имеют эллипсовидную форму, в отдельных случаях у животных до 10 суток жизни встречается шаровидная форма. Форма краниального брыжеечного узла, начиная с 20 суток жизни, из эллипсовидной становится треугольной.

Размеры и объем левого и правого чревного узлов достоверно не отличаются друг от друга. Размеры краниального брыжеечного узла достоверно меньше по сравнению с левым и правым чревным узлом, начиная с 10 суток жизни. Однако в онтогенезе размеры узлов увеличивак гея гетерохронно. Наибольшие размеры и скорость роста, начиная с 20 суток жизни, отмечаются в левом чревном узле, наименьшие — в краниальном брыжеечном узле.

Наибольшие вариации в характере отхождения ветвей наблюдаются в левом чревном узле по сравнению с правым чревным узлом и краниальным брыжеечным узлом. Возрастных различий в характере отхождения ветвей не отмечено.

При определении морфометрических параметров нейронов узлов чревного сплетения крысы в постнатальном онтогенезе установлено, что размеры нейронов увеличиваются в несколько раз. После рождения происходит последовательное увеличение площади сечения нейронов и их максимального диаметра, что закономерно влечет уменьшение плотности нервных клеток на центральных срезах. Форма нейронов в процессе возрастного развития не меняется, остается овальной формы в сечении. Тем не менее, у старых крыс также отмечались клетки неправильной формы со сморщенными ядрами.

Параллельно возрастанию размеров происходит снижение средней плотности расположения нейронов на срезах ганглия. В онтогенезе рассчитанное число нейронов в левом и правом чревном узле, а также в краниальном брыжеечном узле достоверно не меняется.

Получены новые данные о том, что уже у новорожденных животных в узлах чревного сплетения большая часть нейроцитов содержит одновременно фермент синтеза катехоламннов - тирозингидроксилазу и нейропептид У. В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейронов увеличивается, в то время как доля кальбиндин-иммунопозитивных нейронов после первых 10 суток жизни значительно уменьшается до второго месяца жизни.

У животных всех возрастных групп обнаруживались нейроны, иммунореактивные к вазоинтестинальному пептиду, соматостатину и холинацетилтрансферазе. Число нейронов было очень мало и составляло доли процента. В процессе возрастного развития процент таких нейронов достоверно не менялся.

Уже с момента рождения наибольший процент нейронов, иннервирующих желудок и тонкую кишку, обнаруживается в чревном узле по сравнению с краниальным брыжеечным узлом. Число нейронов, иннервирующих указанные органы, возрастает в первые 10 суток жизни. Все нейроны, посылающие волокна к желудку и тонкой кишке, содержат фермент синтеза катехоламинов - тирозингидроксилазу. Примерно в половине из них, у животных различных возрастных групп, выявляется нейропептид У. Однако доля нейронов, иннервирующих указанные органы и содержащих кальций-связывающий белок кальбиндин, резко снижается в промежутке от момента рождения до первых 20 суток жизни.

Научная и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные, раскрывающие анатомические особенности узлов чревного сплетения и их ветвей, связей нейронов узлов, содержащих различные нейротрасмитгеры, с желудком и кишкой в постнатальном онтогенезе. Это представляет интерес для понимания закономерностей иннервации внутренних органов брюшной полости, а также механизмов регуляции эмбрионального и постнатального развития нервной системы, внутренних органов и тканей. Полученные морфологические характеристики ветвей и иммуногистохимические особенности нейронов узлов чревного сплетения могут использоваться в проведении морфологического и физиологического эксперимента, в учебном процессе и, с учетом видовых особенностей, экстраполироваться на человека. Конкретные результаты проведенного исследования могут использоваться как новые сведения о структуре и функции узлов чревного сплетения в учебном процессе на кафедрах анатомии и физиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анатомически узлы чревного сплетения крысы к моменту рождения являются сформированными.

2. Структура ветвей узлов чревного сплетения характеризуется вариабельностью, однако возрастной вариабельности не наблюдается.

3. Независимо от возраста, наибольший вклад в иннервацию желудка и кишки у крыс вносят чревные узлы по сравнению с краниальным брыжеечным узлом.

4. Популяции нейронов узлов чревного сплетения с различными нейрохимическими характеристиками развиваются гетерохронно.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 1-й совместной конференции ISAN/AAS (Бузиос, Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2011), XIV международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), V Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012), XI конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012), 10-й международной конференции по NPY-PYY-PP (Монреаль, Канада, 2012), 41 ежегодном съезде общества нейробиологов (Новый Орлеан, США, 2012), VIII всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 220-летию со дня рождения академика К. М. Бэра (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 - в журналах из Перечня периодических изданий, определенных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 161 наименований, в том числе 43 отечественных и 118 иностранных. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 41 рисунком.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 161 животном: 23 новорожденных крысятах массой 15-20 г, 23 десятидневных массой 20-30 г, 23 двадцатидневных массой 60-80 г, 23 одномесячных массой 100-150 г, 23 двухмесячных массой 150-200 г, 23 шестимесячных крысятах массой 250-300 г, 23 трехлетних крысах массой 300-450 г. Проведено четыре группы экспериментов с использованием методов: 1) анатомических, 2) гистологических, 3) иммуногистохимических, 4) ретроградного аксонного транспорта флуоресцентной метки.

При исследовании вариантов отхождения ветвей узла эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (] г/кг внутрибрюшинно). Препарирование осуществляли препаровальными иглами под контролем бинокулярной лупы с увеличением 24х.

При проведении морфометрического исследования под глубоким уретановым наркозом (2 г/кг, внутрибрюшинно) после препарирования узлов животных перфузировали транскардиально физиологическим раствором, а затем фиксирующей смесью 4 % параформальдегида. Забирали правый и левый узел для морфометрического исследования. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате.

Для установления размеров ганглия и вычисления его объема определяли под контролем бинокулярной лупы с увеличением 24х (объектив 4х, окуляр 6х) при помощи морфометрической сетки длину, ширину и толщину узла. На основании полученных данных, объем узла вычисляли при помощи компьютерной программы SolidWorks.

Для определения нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, нейропептид Y, кальбиндин, вазоинтестинапьный полипептид, соматостатин, холинацетилтрансферазу, каспазу 3, протеин Ki67 применялось двойное мечение антителами. Вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом FITC или СУЗ. Для определения морфометрических характеристик нейронов краниального шейного ганглия и общего количества нейронов использовался Neurotrace 530-615 (красный флуоресцентный краситель по Нислю).

При исследовании проекций нейронов узлов чревного сплетения к желудку и тонкой кишке использовался ретроградный аксонный транспорт Fast Blue, который вводился под серозную оболочку тела желудка и средней части тощей кишки с помощью микрошприца.

Анализ данных морфологических методов исследования проводился при помощи флуоресцентного микроскопа ЛОМО Микмед 2, вариант 12, снабженного соответствующим набором светофильтров и цифровой камерой. При подсчете оценивались только нейроны с четко идентифицированным ядром. Процент иммунореактивных нейроцитов рассчитывался как отношение нейронов, иммунопозитивных к данному маркеру на срезе, к общему числу нейронов на срезе. Установив площадь сечения нейронов, средний диаметр тел нейронов и их плотность распределения на 1 мм2 плоскости среза ганглия, по формуле Hoff и Rhines (Г.Г. Автандилов, 1990), находили количество нейронов в 1 мм3. Количество нейронов в 1 мм3 перемножали на объем ганглия и получали общее количество нейронов в узле.

Согласно рекомендациям Г.Ф. Лакина (1980), по правилу Старджеса, все нейроны были разбиты на 5 групп по их морфометрическим параметрам. Нейроны группировались согласно их площади сечения с шагом 200 мкм2.

Статистическая обработка результатов сводилась к определению средней арифметической стандартной ошибки. Для математической

обработки использовали пакет прикладных компьютерных программ '^аИ^са 6.0". Для оценки достоверности различий использовался дисперсионный анализ (однофакторный АЫОУА), критерий Стьюдента и и критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при уровне значимости р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенной работы выявлены анатомические особенности узлов чревного сплетения: левого и правого чревного узлов, краниального брыжеечного узла, морфометрические,

иммуногистохимические характеристики нейронов узлов чревного сплетения и особенности их связей с органами-мишенями у крысят в постнатальном онтогенезе.

Узлы чревного сплетения у крыс всех возрастных групп представлены тремя узлами: парными левым и правым чревными ганглиями (ЧГ) и непарным краниальным брыжеечным (КБГ). ЧГ в основном имеют эллипсовидную форму, в отдельных случаях у животных до 10 суток жизни, встречается шаровидная форма. Форма КБГ, начиная с 20 суток жизни, из эллипсовидной становится треугольной.

Размеры и объем левого и правого ЧГ достоверно не отличаются друг от друга. Размеры КБГ достоверно меньше по сравнению с левым и правым ЧГ, начиная с 10 суток жизни. Однако в онтогенезе размеры узлов увеличиваются гетерохронно. Наибольшие размеры и скорость роста, начиная с 20 суток жизни, отмечаются в левом ЧГ, наименьшие - в КБГ.

Наибольшие вариации в характере отхождения ветвей наблюдаются в левом ЧГ по сравнению с правым ЧГ и КБГ. В левом ЧГ от краниального края наблюдалось непостоянное отхождение от 1 до 4 тонких ветвей. Медиальные края правого и левого ЧГ либо соприкасаются, либо соединены друг с другом комиссурами. От ростро-латерального полюса

каждого узла отходил чревный нерв в составе 1 или 2 ветвей, проходящий через расположенные на его пути внутренностные узлы. В составе левого чревного нерва в большинстве случаев наблюдалось 2-3 внутренностных узла, в правом чревном нерве - 1-2. Наиболее часто чревный нерв присутствовал в виде толстой ветви, параллельно которой наблюдалась непостоянная тонкая ветвь. От латерального края чревных узлов отходит короткая ветвь, посылающая волокна к надпочечникам и почечной лоханке. Реже, помимо основной ветви, встречается дополнительная ветвь. От каудального полюса КБГ у всех животных наблюдались две ветви: 1) межбрыжеечный нерв, направляющийся к каудальному брыжеечному узлу, 2) ветвь, направляющаяся по ходу краниальной брыжеечной артерии, волокна которой участвуют в формировании брыжеечного сплетения. Возрастных различий в характере отхождения ветвей не отмечено.

При определении морфометрических параметров нейронов узлов чревного сплетения крысы в постнатальном онтогенезе установлено, что размеры нейронов увеличиваются в несколько раз. После рождения происходит последовательное увеличение площади сечения нейронов и их максимального диаметра, что закономерно влечет уменьшение плотности нервных клеток на центральных срезах. Параллельно возрастанию размеров происходит снижение средней плотности расположения нейронов на срезах ганглия. В онтогенезе рассчитанное число нейронов в левом и правом ЧГ, а также в КБГ достоверно не меняется.

Полученные данные находятся в соответствии с более ранними работами, в которых исследовались анатомические особенности звездчатого и краниального шейного ганглия кошки и крыс, где было показано, что основные варианты отхождения ветвей, присущие взрослым животным, уже сформированы к моменту рождения (П.М. Маслюков, 1997, М.Б. Корзина, 2008; A.A. Коробкин, 2011). Топография узлов чревного сплетения по отношению к окружающим органам не изменяется, в отличие от краниального шейного ганглия, который в первые 10 суток

после рождения смещается в краниальном направлении по отношению к бифуркации общей сонной артерии (A.A. Коробкин, 2011). Очевидно, указанные различия связаны с возрастными особенностями развития органов шеи, грудной и брюшной полостей.

Размеры и объем левого и правого ЧГ, КБГ возрастают в процессе возрастного развития вместе с увеличением длины и массы животного. Тем не менее, имеется асимметрия в развитии всех трех узлов, которые характеризуются различной скоростью развития. Длина левого ЧГ в ходе возрастного развития увеличивается в 3,5 раза, ширина — в 2,3 раза, толщина - в 2,2 раза, объем возрастает в 14 раз. Длина правого ЧГ в онтогенезе увеличивается в 2,7 раза, ширина - в 2,3 раза, толщина - в 2,4 раза, объем возрастает в 11,6 раз. Длина КБГ в ходе возрастного развития увеличивается в 2,8 раз, ширина — в 2,1 раза, толщина — в 1,6 раз, объем возрастает в 9,7 раз. Таким образом, наибольшей скоростью роста характеризуется левый ЧГ, наименьшей - КБГ.

Показано, что характеристики нейронов претерпевают изменения в постнатальном онтогенезе. Проведенные морфометрические и иммуногистохимические исследования свидетельствуют о неоднородности клеточного состава нейронов узлов чревного сплетения крысы уже к моменту рождения. Имеются отдельные популяции нейронов, различные по морфометрическим и нейрохимическим особенностям.

Исследование морфометрических параметров нейронов узлов чревного сплетения крысы в постнатальном онтогенезе позволило установить, что размеры нейронов увеличиваются в несколько раз: площадь сечения у новорожденных с 194+18 мкм2 в левом ЧГ, 189±8 мкм2 в правом ЧГ, 189+12 мкм2 в КБГ до 718+39 мкм2 в левом ЧГ, 663+59 мкм2 в правом ЧГ, 598+43 мкм2 в КБГ у шестимесячных, соответственно. Это соответствует данным полученным на разных животных: грызуне капибара, кошке, собаке, лошади (Masliukov, 2001; Ribeiro et al., 2004).

После рождения происходит последовательное увеличение площади сечения нейронов, что закономерно влечет уменьшение плотности нервных клеток на центральных срезах. У новорожденных животных плотность расположения нейронов равнялась 2112+312 на мм2 в левом ЧГ, 1987±246 на мм2 в правом ЧГ, 1685±334 на мм2 в КБГ, у шестимесячных -319+37 на мм2 в левом ЧГ, 364+41 на мм2 в правом ЧГ, 298±46 на мм2 в КБГ соответственно. Те же закономерности выявлены ранее в краниальном шейном, звездчатом узле крысят и котят разных возрастов (Т.А. Румянцева, 2004, М.Б.Корзина, 2008; A.A. Коробкин, 2011). После шести месяцев жизни размеры нейронов достоверно не менялись, однако плотность их расположения на срезах незначительно снижалась.

Наибольшее количество нейронов в узлах новорожденных крысят имели очень мелкие размеры (0-200 мкм2). К 10 суткам жизни процент очень мелких клеток уменьшался в 4-5 раз по сравнению с новорожденными. Очень мелкие нейроны отсутствовали во всех узлах чревного сплетения у шестимесячных и более взрослых животных. У крыс в возрасте 10 суток преобладали нейроциты с площадью сечения 201-400 мкм2, одновременно происходило увеличение процентного содержания популяций средних и крупных клеток (601-800 мкм2). Нейроны с площадью сечения свыше 1200 мкм2 встречались только у двухмесячных и более взрослых животных. Начиная с 10 суток жизни размеры нейронов левого ЧГ превосходят аналогичный параметр нейронов КБГ. Эти результаты частично совпадают с данными, полученными на звездчатом ганглии котят разных возрастов, но у кошки очень крупные нейроны появляются уже на четвертом месяце жизни (П.М. Маслюков, 2003).

Число нейронов в левом ЧГ варьировало от 20 до 22 тысяч, в правом ЧГ - от 21 до 25 тысяч, в КБГ - от 18 до 25 тысяч. В онтогенезе рассчитанное число нейронов в узлах чревного сплетения достоверно не менялось, что соответствует данным, полученным ранее на других симпатических узлах крысы: краниальном шейном и звездчатом

(М.Б.Корзина, 2008; A.A. Коробкин, 2011). Морфометрический подсчет количества нейронов хорошо согласуется с иммуногистохимическими данными, при применении антител к ферменту апоптоза - ферменту каспазе 3 не было выявлено значимого процента клеток, подвергающихся запрограммированной гибели. Также результаты другой серии экспериментов с использованием маркера пролиферации Ki67 свидетельствуют о незначительной пролиферации нервных клеток в возрасте до 10 суток жизни. Данные литературы свидетельствуют, что у новорожденных мышей процент пролиферирующих Ki67-иммунопозитивных клеток в краниальном шейном узле составляет 20, затем снижается и к концу третьей недели жизни только 0.4% клеток сохраняют способность к делению. При этом основная масса делящихся клеток представлена клетками глии, у новорожденной мыши и крысы выявляется лишь несколько процентов нейробластов, которые исчезают у более взрослых (Shi et al., 2008; A.A. Коробкин, 2011).

При старении организма в симпатических узлах происходят инволютивные изменения (М.Г.Гулямов, 1964; В.П.Карпенко, 1966; Т.Н.Башкова, 1970; Ю.И.Рогов, 1988). По мере старения в узлах нарастают явления склероза, дистрофии и гибели нейронов. В пожилом возрасте число нейронов в звездчатом узле уменьшается на 35,8%, в старческом — на 37,3% (Ю.И.Рогов, 1988). Многие клетки выглядят атрофичными, сморщенными, с неровными или нечеткими контурами. Наряду с этим, структура многих нейронов сохранена (Л.И.Корочкин, 1965; Д.С.Саркисов, 1970; Н.ЕЛрыгин, В.Н.Ярыгин, 1973; Э.Н.Попова с соавт., 1976). В настоящем исследовании мы также отмечали изменения морфологии нейронов старых крыс, проявляющиеся в наличии клеток неправильной формы, со сморщенными, вакуолизированными ядрами. Тем не менее, по нашим данным, число нейронов в узлах чревного сплетения у старых крыс не снижается.

Нейрохимические особенности нейронов изменяются в процессе возрастного развития, что было выявлено в процессе иммуногистохимических исследований. Это согласуется с литературными данными, указывающими на то, что параллельно с функциональным созреванием в нейронах симпатических узлов идет перестройка медиаторного состава, которая может происходить под влиянием целого ряда различных трофических факторов (Ernsberger, 2001). Тем не менее, набор нейротрансмиттеров, характерный для взрослого организма, присутствует в узлах чревного сплетения крыс уже с момента рождения.

Установлено, что так же как и у взрослых, у новорожденных основная масса нервных клеток содержит фермент синтеза норадреналина тирозингидроксилазу (ТГ) и имеется небольшая популяция клеток, не содержащая катехоламинов. Процентное содержание ТГ-позитивных нейронов в раннем постнатальном онтогенезе не менялось и составляло 98±0.7 % у новорожденных, 99±0.5% у 10-дневных, 98±0.6% у 20-дневных, 98±0.4% у 30-дневных и 98±0.7% у двухмесячных животных. Не было обнаружено достоверных различий по процентам ТГ-позитивных нейронов между исследованными узлами в каждой возрастной группе.

Часть же норадренергических нейронов содержит и другие нейротрансмитгеры. У новорожденных животных в левом и правом чревном, краниальном брыжеечном узле большая часть нейронов содержала одновременно тирозингидроксилазу и нейропептид Y. Это согласуется с данными, полученными на звездчатом узле взрослой собаки, кошки и крысы (Lindn et al., 1989; Moriartry et al., 1995; Richardson et al., 2006).

В первые 20 суток жизни процент НПУ-иммунопозитивных нейронов увеличивается с 63±2,1% до 82±3,1% в левом ЧГ, с 62±2,5% до 86±3,7% в правом ЧГ и с 64±1,9% до 86±3,6% в КБГ (Рис. 1). Это соответствует ранее полученным данным по увеличению процента нейропептид У-содержащих нейронов в звездчатом и краниальном шейном

симпатических узлах крысы в раннем постнатальном онтогенезе (Masliukov, Timmermans, 2004; М.Б.Корзина, 2008; A.A. Корсбкии, 2011). Очевидно, это можно объяснить ангиогенным эффектом нейропептида Y на возрастающее количество сосудов микроциркуляторкого русла в процессе онтогенеза (Morris et al., 2001). Также есть работы, свидетельствующие о трофической роли нейропептида Y в нервной и сердечно-сосудистой системе (Zukowska-Grojec et al., 1998; Hansel et al., 2001). Последние данные свидетельствуют о роли НИ Y и в процессах лифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в кардиомиоциты у новорожденных животных, а также у взрослых после инфаркта миокарда (Wang et al., 2010).

100 80 60

i«

40

20 0

Рнс. I. Процентное содержание нейронов, иммунореактивных к НПУ, в левом ЧГ, правом ЧГ и КБГ крыс разных возрастов, (р < 0.05, различия достоверны но сравнению с новорожденными и 10-суточными животными).

У новорожденных и 10-суточных крысят в узлах чревного сплетения выявляется достаточно большой процент КА-нммунорсактивных нейронов. В первые 10 суток жизни доля КА-позитивных нейронов значительно возрастает с 15±2,1% до 33±2,6% в левом ЧГ, с 20±1,4% до 30±2,1% в правом ЧГ и с 24*0,9% до 29*1.8% в КБГ. В последующие 10

ШИШ

1 сутки 10 сутки 20 суток J0 суток 60 суток 180 Згода

суток

[п Левый ЧГ ■ Прапыи ЧГ О КСГ |

суток процент КА-иммунопозитивных нейронов резко снижается до 15±0,7% в левом ЧГ, 14±0,9% в правом ЧГ и 16±0,8% в КБГ и далее достоверно не изменяется (Рис. 2). У новорожденных н 10-суточных животных большая часть нейропептид У- нммунореактивных нейронов содержит кальбиндин. В течение первого месяца жизни процент нейронов, содержащих нейропептид У и кальбнндин, значительно уменьшается во всех узлах чревного сплетения (рис. 3).

I сутки 10 сутки 20 сучок 3«

АО суток- 110 суток 3 года

ПЛевый ЧГ ■ Правый ЧГ ОКБГ

Рис. 2. Процентное содержание КА- нммунореактивных нейронов в узлах чревного сплетения крыс разных возрастов, (р < 0.05, различия достоверны по сравнению с новорожденными и 10-суточными животными).

Ранее было показано, что в симпатическом краниальном шейном узле процент кальбиндин-иммунопозитивных нейронов возрастает в онтогенезе в первые десять суток жизни, а затем снижается (А.А.Коробкин, 2011). Продемонстрированное нами значительное уменьшение доли кальбиндин-иммунопозитивных нейронов в первый месяц жизнн в узлах чревного сплетения крысы свидетельствует о сходстве изменения содержания кальций-связываюших белков в различных симпатических узлах в онтогенезе и важной рол« этих белков в развитии нейронов в раннем возрастном периоде.

* 30

40

20

10

0

Ш

Л

!ШДП , ШГтп . 1ШЯ~1 .

I Сутки 10 сутки СУТОК 30 суток 60 суток 180 сути* 1 ГОШ

fin Левый ЧГ ■ Правый ЧГ ПКБГ

Рис. 3. Процентное содержание НПУ-иммунореактивных нейронов, содержащих КА в узлах чревного сплетения крыс разных возрастов (р < 0.05, различии достоверны по сравнению с новорожденными и 10-суточными животными).

Возрастные изменения содержания кальбиндина могут быть связаны с его ролью в зашнте клеток от процессов апогтгоза (Bellido et al., 2000), протективной ролью в защите от кальций-опосредованной нейротокснчности (Lee el al., 2006). Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, важную роль играет поддержание определенной концентрации ионов кальция, которая может изменяться в пространстве и во времени и важная роль, в этом отводится кальбиндину (Siechen et al., 2009; Heiman, Shaham, 2010). Возрастное снижение экспрессии кальбиндина делает клетки более чувствительными к изменениям концентрации ¡юнов кальция (Chard et al., 1993).

С возрастом животных увеличивается доля средних и крупных нейронов, содержащих ТГ, и уменьшается процент мелких, и очень мелких. Средняя площадь сечения ТГ-, НПУ- и КА-иммунопозитивных нейронов в онтогенезе увеличивалась. В отличие от краниального шейного и звездчатого симпатического узлов, в узлах чревного сплетения средние

аюшади сечения ТГ-, НПУ - и КА-содержащих нейронов достоверно не

отличались. При этом достоверных различий не наблюдалось на протяжении всех исследованных возрастных периодов. Однако нейроны чревных узлов, содержащие ТГ и НПУ, имели достоверно большие размеры по сравнению с нейронами КБГ, обладающими аналогичными нейрохимическими особенностями.

У животных всех возрастных групп обнаруживались нейроны, иммунореактивные к ВИП, СОМ и ХАТ. Число нейронов было очень мало и составляло доли процента. В процессе возрастного развития процент таких нейронов достоверно не менялся.

Малое число К167-иммунопозитивных нейронов выявлялось в симпатических узлах чревного сплетения у новорожденных животных. Процент К]67-иммунопозитивных клеток значительно снижался в первые 10 суток жизни. Начиная с 20-суточного возраста, Ю67-иммунореактивные нейроны не выявлялись. Единичные каспаза 3-иммунореактивные нейроны выявлялись только у новорожденных животных и не наблюдались у более взрослых крыс. Можно предположить, что нейрональная пролиферация и апоптоз слабо выражены в узлах чревного сплетения лишь у новорожденных крысят и далее в онтогенезе не выявляются.

Основная часть ТГ, НПУ и КА-содержащих нейронов ЧГ и КБГ новорожденных крысят (70-80%) имела очень мелкие размеры (0-200 мкм2), оставшуюся часть представляли мелкие (201-400 мь I2) из них около 1% - средние клетки (401-600 мкм2). К 10 суткам жизнк процент очень мелких клеток значительно уменьшался по сравнению с но врожденными, и в этом возрасте преобладали нейроны с площадью сеченш 201-400 мкм2, одновременно происходило увеличение процентного содержания популяций средних и крупных клеток (601-800 мкм2). У 20-суточных крыс средняя площадь сечения большинства нейронов находилась в пределах от 401 до 600 мкм2. В этом возрасте определялись и клетки очень крупных размеров (801-1000 мкм2). У 30-суточных большинство нейронов во всех

изучаемых узлах имело размеры от 601 до 800 мкм2. Нейроны со средней площадью сечения 1001-1200 мкм2 выявлялись впервые у 30-суточных животных в правом и левом ЧГ и у двухмесячных крыс в КБГ. Нейроны с площадью сечения свыше 1200 мкм2 встречались только у двухмесячных и более взрослых животных.

Данные, полученные в ходе введения в органы желудочно-кишечного тракта флуоресцентной метки, показали, что связи симпатических нейронов узлов чревного сплетения с органами-мишенями (желудком и тонкой кишкой) сформированы уже с момента рождения. Большинство нейронов, иннервирующих вышеуказанные органы, расположены в чревном ганглии по сравнению с краниальным брыжеечным узлом. В первые 10 суток жизни происходит возрастание процента нейронов, иннервирующих желудок и тонкую кишку (рис. 4, 5). У кошек при исследовании связей нейронов шейно-грудного узла с органами-мишенями процентное соотношение меченых клеток возрастает между 10 и 20 днями жизни (МагНикоу а!., 2000). Можно предположить, что в этом периоде орган-мишень может влиять на нейротрансмиттерные свойства нейрона.

Все меченые нейроны, иннервирующие желудок и тонкую кишку, содержат фермент синтеза катехоламинов — ТГ. При этом часть из них являются НПУ и КА-иммунопозитивными. Доля НПУ -иммунопозитивных нейронов не меняется в онтогенезе, процент КА-иммунореактивных нейронов снижается в ходе возрастного развития.

Нейроны чревных узлов, содержащие ТГ и НПУ, имели достоверно большие размеры по сравнению с нейронами КБГ, обладающими аналогичными нейрохимическими особенностями. Симпатические нейроны узлов чревного сплетения, иннервирующие желудок и кишку, достоверно не отличались по своей средней площади сечения.

Таким образом, узлы чревного сплетения крысы уже с момента рождения являются функционирующим элементом симпатической

нервной системы. Анатомически у новорожденных крысят левый и правый чревные узлы, краниальный брыжеечный узел являются сформированным. В то же время клеточный состав ганглиев в этом возрасте является незрелым. В ходе постнатального онтогенеза происходит рост, дифференцировка нейронов, преобразование нейрохимического состава. Изменение морфо-функциональных характеристик нейронов происходит гетерохронно. Становление нейрохимических характеристик в узлах чревного сплетения крысы завершается к концу второго месяца жизни. Окончательно размеры нейроцитов стабилизируются к шести месяцам жизни.

ВЫВОДЫ

1. Узлы чревного сплетения у крыс всех возрастных групп представлены тремя раздельными узлами: парными левым и правым чревными ганглиями и непарным краниальным брыжеечным. Чревные узлы в основном имеют эллипсовидную форму, в отдельных случаях у животных до 10 суток жизни встречается шаровидная форма. Форма краниального брыжеечного ганглия, начиная с 20 суток жизни, из эллипсовидной становится треугольной. Размеры краниального брыжеечного узла достоверно меньше по сравнению с левым и правым чревными узлами, начиная с 10 суток жизни.

2. Наибольшие вариации в характере отхождения ветвей наблюдаются в левом чревном узле по сравнению с правым чревным ганглием и краниальным брыжеечным ганглием. В составе левого чревного нерва в большинстве случаев наблюдалось 2-3 внутренностных узла, в правом чревном нерве - 1-2. Возрастных особенностей в характере отхождения ветвей не наблюдалось.

3. В онтогенезе размеры нейронов узлов чревного сплетения возрастают с момента рождения до конца шестого месяца жизни. Начиная с 10 суток жизни, средняя площадь сечения нейронов и средний диаметр

нейронов левого чревного ганглия превосходят аналогичный параметр краниального брыжеечного узла. Параллельно возрастанию средней площади сечения нейронов происходит снижение средней плотности расположения нейронов на срезах ганглия. Среднее число нейронов в узлах чревного сплетения с возрастом достоверно не изменяется.

4. Группы нейронов узлов чревного сплетения с различными иммуногистохимическими характеристиками развиваются гетерохронно. С момента рождения до второго месяца жизни наблюдается линейное увеличение процентного содержания нейропептид У-иммунореактивных нейронов. Процент кальбиндин-иммунопозитивных нейронов после первых 10 суток жизни значительно уменьшается до второго месяца жизни. У животных всех возрастных групп обнаруживались нейроны, иммунореактивные к вазоинтестинальному пептиду, соматостатину и холинацетилтрансферазе. Число нейронов было очень мало и составляло доли процента. В процессе возрастного развития процент таких нейронов достоверно не менялся.

5. Иннервация желудка, тонкой кишки осуществляется нейронами узлов чревного сплетения уже с момента рождения. Большинство нейронов, иннервирующих вышеуказанные органы, расположены в чревных узлах. В первые 10 суток жизни происходит возрастание процента нейронов, иннервирующих желудок и тонкую кишку.

6. Все нейроны, иннервирующие желудок и тонкую кишку, содержат фермент синтеза катехоламинов - тирозингидроксилазу. При этом часть из них являются нейропептид У- и кальбиндин-иммунопозитивными. Доля нейропептид У-иммунопозитивных нейронов, иннервирующих желудок и тонкую кишку, не меняется в онтогенезе, процент кальбиндин-иммунореактивных нейронов снижается в ходе возрастного развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Masliukov P.M., Emanuilov A.I., Konovalov V.V., Nozdrachev

A.D. Development of calbindin-containing neurons in sympathetic ganglia of rats and cats // Theses of the 1st Joint meeting of the ISAN/AAS. -Бузиос, Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2011 / Clin. Auton. Res. - 2011. - V 21.-N4.-P. 248.

2. Коновалов B.B., Коробкин A.A., Емануйлов А.И., Филиппов И.В., Кребс A.A., Маслюков П.М. Возрастные изменения нейропептид Y-содержащих нейронов узлов автономной нервной системы // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. - 2011. - Т. XVIII. -№2. -С. 71-72.

3. Маслюков П.М., Емануйлов А.И., Коновалов В.В. Нейропептид Y-иммунопозитивные нейроны автономной нервной системы в онтогенезе // Тезисы XIV международного совещания и VII школы по эволюционной физиологии. СПб, 2011. С. 126.

4. Маслюков П.М., Емануйлов А.И., Коробкин A.A., Коновалов

B.В. Возрастное развитие симпатической иннервации сердца и сосудов у крыс в постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов V Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - Москва. - 2012.- С. 103-104.

5. Маслюков П.М., Коновалов В.В., Коробкин A.A., Емануйлов А.И. Возрастные преобразования нейрохимического состава нейронов симпатических узлов. Материалы докладов XI конгресса международной ассоциации морфологов // Морфология. - 2012. - Т. 141.-№3.-С. 99.

6. Маслюков П.М., Коробкин A.A., Коновалов В.В., Порсева В.В., Емануйлов А.И. Возрастное развитие кальбиндин-иммунопозитивных нейронов симпатических узлов крысы // Морфология. - 2012. - Т. 141. -№ 1,-С. 77-80.

7. Masliukov P.M., Emanuilov A.I., Konovalov V.V. Development of neuropeptide Y-containing neurons in the autonomic ganglia // Theses of the 10th International NPY-PYY-PP meeting. Montreal, Canada. - 2012. - P. 26.

8. Masliukov P.M., Emanuilov A., Konovalov V., Bairamova A.N. Development of neurons containing different types of calcium-binding proteins in the rat sympathetic ganglia // SfN abstracts, New Orleans (USA). - 2012. - 387. - 17/BBB40.

9. Masliukov P.M., Konovalov V.V., Emanuilov A.I., Nozdrachev A.D. Development of neuropeptide Y-containing neurons in sympathetic ganglia of rats. - Neuropeptides. - 2012. - V. 46. - N 6. - P. 345-352.

10. Коновалов B.B. Возрастные изменения состава нейропептид Y-иммунопозитивных нейронов узлов автономной нервной системы // Тезисы докладов VIII всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 220-летию со дня рождения академика К. М. Бэра. -СПб, 2012.-С. 110-111.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЧГ - чревные ганглии

КБГ - краниальный брыжеечный ганглий

КА — кальбиндин

НПУ - нейропептид У

ТГ — тирозингидроксилаза

ВИП - вазоинтестинальный пептид

СОМ - соматостатин

ХАТ - холинацетилтрансфераза

Подписано в печать 22.10.2013 г. Печ. я. 1. Заказ 1217. Тираж 100. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, ул. Советская, 14 а, тел. 30-56-63.