Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфология хронической болезни почек, обусловленной мочекаменной болезнью

На правах рукописи

005017216

Напшева Анета Мухамедовна

МОРФОЛОГИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК, ОБУСЛОВЛЕННОЙ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ

14.03.02-патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о Щ 2012

САРАТОВ - 2012

005017216

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Маслякова Галина Никифоровна. Официальные оппоненты:

Щеголев Александр Иванович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, кафедра патологической анатомии, профессор кафедры.

Федорина Татьяна Александровна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, кафедра клинической патологии: патологическая анатомия, клиническая патофизиология, заведующая кафедрой.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится 2012 г. ъ // часов на заседании

диссертационного совета Д 208.094.01 при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского» Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, д.112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Маслякова Галина Никифоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Хроническая болезнь почек (ХБП) занимает среди хронических неинфекционных болезней особое место, поскольку она имеет широкое распространение, приводит к резкому ухудшению качества жизни, высокой смертности и в терминальной стадии - к необходимости применения дорогостоящих методов заместительной терапии - диализа и пересадки почки. Термин ХБП появился в 2002 году, когда официально был опубликован новый раздел Рекомендаций DOQI (Dialysis Outcome Quality Initiative), названный Рекомендациями по хроническим болезням почек (Земченков А.Ю., Томилина Н.А., 2004). Появление этого термина стало необходимым, так как в нефрологии сложилась ситуация, когда развившееся осложнение заболеваний почек стало играть роль основного заболевания и потребовало соответствующих лечебных мероприятий.

У каждого десятого жителя Земли отмечаются признаки ХБП (Шилов Е.М., Швецов М.Ю., Бобкова И.Н. и соавт., 2011). На ранних стадиях болезнь диагностируется лишь у 1% населения. Согласно результатам крупного исследования NEORICA, проводимом в Великобритании, среди 40 097 200 обследованных жителей страны в возрасте старше 18 лет ХБП 3-5-й стадий выявлена у 3 547 654 человек, что составляет 8,8% (Stevens Р.Е., О' Donogue D.J., de Lusignan S. et al, 2007). Ежегодный прирост диализной ХПН (5-я стадия ХБП) составляет 100-150 человек на 1 млн населения. По мнению ряда исследователей, наблюдающийся в настоящее время прогрессивный рост числа пациентов с терминальной ХПН приобретает характер пандемии (Locatelli F. et al., 2000; Norris К., Vaughn С., 2003). В России, по данным Министерства здравоохранения и социального развития, в 2009 году впервые выявленная терминальная ХПН зарегистрирована у 6693 пациентов, в Саратовской области - у 135 пациентов. Согласно Регистру Российского диализного общества, ежегодный прирост таких больных составляет в среднем 10,5%.

Анализ данных литературы показал, что большинство работ посвящено изучению ХБП при таких заболеваниях, как гломерулонефрит, сахарный диабет, гипертоническая болезнь, атеросклероз и т.д., что даже обозначено в литературе термином «кардиоренальный континуум». При этом работ, посвященных изучению ХБП при МКБ, практически нет, тогда как МКБ в настоящее время является одним из самых распространённых урологических заболеваний и составляет в развитых странах от 0,5 до 5,3 %. В России на долю МКБ приходится до 38,2% всех урологических больных, наиболее часто данная патология поражает людей в самый активный период их жизни - 20-50 лет, что, несомненно, представляет огромную экономическую проблему современного здравоохранения. По данным Министерства здравоохранения и социального развития, в 2009 году в России среди взрослого населения зарегистрировано 193234 новых случая мочекаменной болезни, в Саратовской области - 3356 случаев.

В настоящее время ХБП посвящено много исследований, однако большинство из них рассматривают данное заболевание с клинико-лабораторных позиций. Работы, посвященные морфологии, единичны, и мы не нашли ни одного исследования, в котором были бы описаны структурные изменения почек в различные стадии ХБП, что, несомненно, представляет особый интерес для клиники.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель исследования: оптимизация морфологической диагностики ХБП, обусловленной МКБ, в различные стадии ее развития, и установление критериев раннего повреждения паренхимы и стромы почек на доклиническом этапе.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Провести морфологическое и морфометрическое исследования почек в различные стадии ХБП, обусловленной МКБ.

2. Осуществить анализ полученных данных, установить наиболее информативные морфометрические показатели почек, имеющие значимую

4

связь со скоростью клубочковой фильтрации (СКФ) и стадией ХБП, и определить степень корреляции этих параметров со стадией ХБП.

3. Выявить ранние морфологические признаки ХБП, характерные для первой стадии, на доклиническом этапе.

4. Определить морфологические признаки прогрессирования и необратимости ХБП.

5. С учетом полученных морфометрических показателей разработать математическую модель диагностики стадий развития ХБП.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Проведено морфологическое и морфометрическое изучение почек и их структурных компонентов при мочекаменной болезни в различные стадии ХБП. Выявлены ранние морфологические признаки ХБП на доклиническом этапе. Установлено наличие морфологических признаков компенсаторно-приспособительных процессов во вторую стадию развития ХБП. На основании морфометрического и иммуногистохимического исследований установлено, что третья стадия ХБП характеризуется развитием дисрегенераторных процессов и прогрессирующим разрастанием соединительной ткани, что является признаками необратимости заболевания.

На основании проведения пошагового дискриминантного анализа разработана оптимальная модель для определения стадии ХБП с использованием морфометрических показателей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В результате исследования уточнены ранее известные и получены новые данные о морфологии почек в различные стадии ХБП, обусловленной МКБ. Установлены морфометрические критерии изменений параметров структурных элементов почки в каждую из стадий ХБП, что может быть использовано при гистологической диагностике биопсийного материала. Разработанная математическая модель позволяет диагностировать клиническую стадию ХБП на основании морфометрических показателей.

Результаты исследования могут быть использованы в практике патологоанатомических отделений для диагностики ХБП и установления стадии ее развития, а также на кафедрах патологической анатомии и урологии при проведении практических занятий и чтении лекций по соответствующей тематике.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры патологической анатомии и урологии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития РФ, в научно-исследовательскую и практическую работу НИИ Фундаментальной и клинической уронефрологии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития РФ, а также практику патологоанатомического отделения ГКБ №3 им. С.Р. Миротворцева ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития РФ, ГУЗ «Областная клиническая больница» г. Саратова.

ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Структурные изменения в почке имеют стадийный характер развития и количественные показатели, соответствующие определенной стадии развития ХБП.

2. Ранние стадии ХБП морфологически проявляются снижением диаметра канальцев, гипертрофией стенки артерий, очаговой лимфоидной инфильтрацией. Вторая стадия ХБП характеризуется развитием компенсаторно-приспособительных процессов, проявляющихся в виде пролиферации клеток нефротелия и гипертрофии эпителиоцитов. "

3. Нарушение процессов регенерации и прогрессирующее развитие нефросклероза начинаются с 3-й стадии заболевания и свидетельствуют о необратимости ХБП.

4. Разработанная математическая модель с использованием морфометрических показателей позволяет определять стадию ХБП.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследования были представлены в докладах на конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии», посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук, профессора В.Б. Писарева (Волгоград, 2010); на 69-й, 70-й межрегиональных научно-практических конференциях студентов и молодых ученых «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2008, 2009); на Всероссийской конференции с международным участием молодых ученых «Татьянин день» (Москва, 2011); областном обществе патологоанатомов (Саратов, 2011).

СТУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 47 рисунками. Библиография содержит 166 источников (50 отечественных и 116 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужил послеоперационный материал, полученный от 154 больных, находившихся на стационарном лечении по поводу мочекаменной болезни в период с 2005 по 2010 годы в ГКБ № 3 им. С.Р. Миротворцева ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России.

Средний возраст больных составил 47,1 года. Количество мужчин - 63 (40,1%), женщин-91 (59,9%).

Из исследования были исключены пациенты старше 55 лет, а также пациенты с такими тяжёлыми фоновыми заболеваниями, влияющими на морфофункциональное состояние паренхимы почек, как сахарный диабет, генерализованный атеросклероз, декомпенсированная недостаточность кровообращения, диффузные заболевания соединительной ткани.

7

Диагноз МКБ устанавливали на основании данных анамнеза, субъективных и объективных клинических признаков, результатов УЗИ, других инструментальных и лабораторных методов исследований.

Стадию ХБП определяли по уровню скорости клубочковой фильтрации (СКФ) согласно последним рекомендациям NKF-K/DOQI (2005).

СКФ подсчитывали с использованием формулы Кокрофта-Голта, в которой учитывается уровень креатинина сыворотки крови, возраст и масса тела пациента.

По результатам подсчета СКФ согласно последним рекомендациям NKF-K/DOQI (2005) все пациенты были разделены на 5 групп (табл.1).

Таблица 1

Распределение больных в группах по полу н возрасту

_________ 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа 5-я группа

Количество больных 32 47 36 26 13

Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин, (Ме) 101,6 72,2 43,4 25,7 11,8

Возраст больных, (Ме) 48 46 48 45,5 48

Мужчины 5 17 18 14 8

Женщины 27 30 18 12 5

В качестве контроля использовали секционный материал, полученный во время проведения судебно-медицинской экспертизы 30 лиц, умерших от заболеваний, не связанных с патологией почек. Возраст группы контроля составил 31-52 года (Ме=44,0).

Всем пациентам выполняли стандартный объем исследования урологического больного. При проведении УЗИ органов мочевыделительной системы оценивали такие показатели, как положение почек, их контуры и размеры; при оценке состояния паренхимы почек определяли толщину, эхогенность, структуру, кортико-медуллярную дифференцировку и наличие объемных образований, их локализацию, размеры, состояние чашечно-

лоханочной системы, наличие в ее просвете дополнительных структур, состояние мочеточников и моченого пузьфя.

Результаты обследования заносили в индивидуальную карту больного.

Послеоперационный или биопсийный материал для гистологического исследования фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, обезвоживали в ацетон-ксилоловой батарее и заливали в парафин. После депарафинизации срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином-эозином для обзорного гистологического изучения. Для оценки степени разрастания соединительной ткани — пикрофуксиновой смесью по методу Ван-Гизон и трихромом по Массону, для выявления признаков дезорганизации соединительной ткани использовали гистохимический метод ОКГ (оранжевый Ж, кислотный красный, водный голубой), предложенный Марциусом и адаптированный Д.Д. Зербино и JI.JI. Лукасевич (1984) к отечественным красителям.

При проведении стандартного гистологического исследования оценивали клубочковый аппарат и состояние тубулоинтерстициальной зоны с использованием определенного алгоритма изучения нефробиоптата. Для определения размеров объектов использовали окуляр-микрометр, сетку Автандилова (Г.Г.Автандилов, 1994), а также морфометрическую систему Bio Vision и автоматизированную систему подсчета морфологических изменений ARIOL (США). Морфометрическое исследование выполняли в 30 полях зрения. Общий объем микроскопического исследования составил 800 гистологических препаратов.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к сосудисто-эндотелиалыюму фактору роста, рецепторам EGFR, к семейству цитокератинов: 8, 5/6, 34ßE, 10/13. Пролиферативную активность эпителиоцитов канальцев почек изучали иммуногистохимическим методом с применением моноклональных мышиных антител к Ki-67, а также с помощью выявления антигена ядра пролиферирующей клетки PCNA. Теорию эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток эпителия канальцев почек проверяли с использованием Е-кадгерина.

В качестве вторых антител был использован универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины. Для иммуногистохимических реакций парафиновые срезы помещали на предметные стекла, обработанные поли-Ь-лизином, и высушивали при температуре 35° С в течение суток. Проводили одноэтапный протокол с трипсинизацией - демаскировкой антигена по стандартной схеме проведения иммуногистохимического исследования (Петров C.B., Райхлин Н.Т., 2004). Клетки, давшие положительную иммуногистохимическую реакцию, окрашивались в коричневый цвет. Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67), оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения, выражая полученные результаты в процентах. Результаты реакций с антигенами, имеющими цитоплазматическую локализацию (СК-8, Е-кадгерин), оценивали по системе подсчета histochemical score. Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски 0 - нет окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 — сильное окрашивание.

Формула подсчета следующая: histochemical score = £ Р 0) х I, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; Р (i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Для обработки данных был использован пакет прикладных статистических программ BioStat 5.8.4.3 версия 2009 (AnalystSoft® Inc.) и STATISTIC А 10.0 (StatSoft® Inc.). Предварительная статистическая обработка данных заключалась в проверке соответствия формы распределения количественных признаков нормальному, для чего использовали критерий Шапиро-Уилка, а также равенства генеральных дисперсий с помощью F-

10

критерия Фишера. Учитывая, что этим условиям удовлетворяла лишь незначительная часть эмпирических распределений признаков, и количество сравниваемых выборок превышало две, проверку гипотезы о равенстве генеральных средних во всех случаях проводили с помощью Н-критерия Краскела-Уоллиса для оценки различий нескольких независимых групп. Нулевую гипотезу отвергали в случае р < 0,05. Парное межгрупповое сравнение проводили с использованием С?-критерия Данна. Выбор данного критерия был обусловлен количеством сравниваемых групп. Исследование взаимосвязи между количественными признаками осуществляли при помощи парного коэффициента линейной корреляции Спирмена, при этом определяли наличие связи, ее направление и силу. Значимость морфометрических

показателей выявляли с помощью дискриминантного анализа с измерением

/

уровня лямбды Уилкса.

Для каждого показателя в исследуемых группах вычисляли такие значения, как медиана (Ме), мода (Мо), минимум и максимум значений, межквартильный размах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сопоставление клинико-лабораторных и морфометрических

показателей почек при различных стадиях ХБП позволило обозначить ряд новых закономерностей прогрессирования ХБП (табл.2).

Так, для первой группы, в которую вошли пациенты со средним значением уровня креатинина 76,9 мкмоль/л, СКФ составила 90-98 мл/мин, что согласно рекомендациям ИКР-К/БОСЛ соответствует 1-й стадии ХБП. Анамнез заболевания для пациентов этой группы не превышает 10 лет, причем для подавляющего количества больных данный показатель соответствует 2-5 годам. При УЗИ изменения размеров почек не выявлено, расширения чашечно-лоханочной системы выявлены у 7 пациентов (21,8%).

Таблица 2

Сравнительная характеристика морфометрических показателей больных с разными стадиями ХБП

Группа контроля 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа 5-я группа

Количество больных в группе 30 32 47 36 26 13

Пол больных Муж. 19 5 17 18 14 8

Жен. 11 27 30 18 12 5

Средний возраст, Ме 38,4 48 46 48 45,5 48

Длительность заболевания, лет, Ме - 6 5 9 10,5 10

Креатинин сыворотки крови, Ме - 76,9 104 137 206 481

Мочевина сыворотки крови, Ме - 4,9 5,9 8.9 10,9 17,3

Скорость клубочковой фильтрации, Ме - 98 71 43.5 26.5 11

Размеры почек тр данным УЗИ, Ме - 11,5 11,5 11,7 11,55 9,4

Расширение ЧЛС почек,% - 21,8 68,08 83,3 92 100

Количество склерозированных клубочков,% 2,6 2,56 7,8 50* 85* 91*

Размер длинной оси клубочка, мкм, Ме 320 356 344 280* 180* 120*

Размер короткой оси клубочка, мкм, Ме 300 332 300 200* 150* 96*

Диаметр проксим. канальцев, мкм, Ме 112 77,5* 75,5* 58,5* 56* 21*

Диаметр дистальных канальцев, мкм, Ме 75 68* 56* 54* 34* 15*

Высота эпителиоцита, мкм, Ме 26 24 36* 13,5* 6* 4*

Толщина стенки артерий, мкм, Ме 33,5 56* 142* 112* 147* 166*

Количество клеток в инфильтрате коркового в-ва, Ме 15 25 100* 350* 500* 750*

Количество клеток в инфильтрате мозгового в-ва, Ме 7 25* 100* 275* 425* 500*

Примечание : "при р < 0,05.

При морфометрическом исследовании почек в данной группе наблюдения были обнаружены следующие изменения: размеры как длинной, так и короткой оси клубочка, не имели статистически значимых различий по сравнению с группой контроля и составили 321 - 375мкм. При изучении канальцевого аппарата отмечали статистически значимое уменьшение диаметра проксимальных извитых канальцев в среднем до 77,5мкм (Мо=77,5, Уо,25=72,5,У0,75=84, Мт=37, Мах=98) при контрольных значениях 112мкм, и дистальных - до 68мкм (Мо=68, У0,25=58,5, У0>75=78, Мт=18,7, Мах=91) при контрольных значениях 75мкм.

Высота эпителиоцитов статистически значимых различий по сравнению с группой контроля не имела и составляла от 15 до 26 мкм (Ме=24, Мо=24, У0,25=24, Vо175=26). Обнаруживались значительные изменения со стороны артериальной системы. Толщина стенки артерий составляла от 24 до 225 мкм (Ме=56, Мо=150, У0,25=26, У0,75=150), что в значительной степени превышало аналогичные показатели в группе контроля. В интерстициальной ткани отмечали отек и нежно-волокнистый фиброз стромы с незначительной очаговой клеточной инфильтрацией, локализующейся преимущественно в корковом веществе.

Во 2-ю группу наблюдения вошли 47 пациентов, что составило 30,5% от общего числа обследованных. Анамнез заболевания в данной группе наблюдения составлял от 3 до 13 лет (Ме = 5).

При биохимическом исследовании сыворотки крови уровень креатинина варьировал от 40 до 167 ммоль/мин (Ме=104). Уровень мочевины составил в среднем 5,9 ммоль/л. СКФ в данной группе составила в среднем 71 мл/мин, что соответствует 2-й стадии ХБП. По данным УЗИ, расширение чашечно-лоханочной системы выявлено у 32 пациентов (68,08%), во всех остальных случаях размеры не превышали нормальных.

При морфологическом исследовании с применением морфометрии установлено, что размеры клубочка как по длинной, так и по короткой оси

13

статистически значимо не отличались от 1-й группы и группы контроля. Отмечено дальнейшее уменьшение диаметра проксимальных извитых и дистальных извитых канальцев, которые составляли в среднем 75,5 мкм и 56 мкм соответственно (р<0,05). Обращало на себя внимание то, что высота эпителиоцитов в данной группе значительно превышала аналогичные показатели как в группе контроля, так и в 1-й группе, и варьировала от 30 до 50 мкм (Ме=36). В 17 случаях (36,1%) наряду с признаками повреждения клеток были обнаружены канальца с многорядным расположением эпителиоцитов на базальной мембране. Данные признаки мы расценили как проявление компенсаторно-приспособительных процессов. Нежно-волокнистый фиброз стромы носил преимущественно очаговый характер. По сравнению с 1-й группой достоверно увеличивалось количество клеточных инфильтратов в строме, которые располагались в перигломерулярной и подкапсульной зонах. Количество клеток в инфильтратах варьировало от 10 до 350 в корковом веществе и от 50 до 300 — в мозговом веществе. Морфометрия стенки артерий показала их утолщение за счет выраженной гипертрофии мышечного слоя - до 188 мкм в артериях среднего калибра.

В 3-й группе наблюдения анамнез заболевания в среднем составил 10 лет, что в 2 раза больше, чем у пациентов 2-й группы. В ряде случаев данный показатель достигал 21 года. При биохимическом исследовании сыворотки крови уровень креатинина варьировал от 91 до 283 мкмоль/л и составил в среднем 137 мкмоль/л (Мо= 137, Уо,25=121,5, У075=153,5); уровень мочевины - 8,9 мкмоль/л (Мо= 8,9, У0,25=6,6, У0,75=9,7, Мт=4,2, Мах=12,6). В данной группе наблюдения СКФ составила в среднем 43,5 мл/мин (Мо= 41, УО)25=40, Уо,75=48, Мт=31, Мах=59). Расширение чашечно-лоханочной системы по данным УЗИ выявлено у 30 пациентов (83,3%), во всех остальных случаях размеры не превышали либо незначительно превышали нормальные показатели. При гистологическом исследовании биопсийного материала почек больных 3-й группы стали отмечаться выраженные изменения как со стороны клубочкового аппарата, так и со стороны тубулоинтерстициальной

14

зоны. Количество склерозированных клубочков составляло 25-50%. Во всех случаях наблюдения клубочки были значительно уменьшены в размерах как по длинной, так и по короткой осям. Так, размеры длинной оси клубочка составили от 146 до 324 мкм (Ме=280, Мо= 300, У0 25=187, Уо,75=300), короткой оси - от 113 до 312 мкм (Ме=200, Мо= 200, Уо,25=140, У0,75=252). Диаметр проксимальных извитых канальцев в среднем составил 58,5 мкм (Мо= 60, Уо,25=37,5, У0,75=63, Мт= 25, Мах=90), дистапьных извитых канальцев - 54 мкм (Мо=54, У0,25=32, У0>75=60, Мт= 18,75, Мах=84), что достоверно ниже, чем во второй группе. Высота эпителиоцитов составляла в среднем 13,5 мкм (Мо= 5,4, У0>25=6,2, У0,75=21). В большинстве случаев наблюдения эпителиоциты приобретали вытянутую веретенообразную форму, плотно прилегая к базальной мембране. В 30% случаев обнаруживали выраженную лимфогистиоцитарную инфильтрацию, занимающую весь объем почечного интерстиция как коркового, так и мозгового слоев. При этом лимфоциты формировали структуры, подобные фолликулам. В интерстициальной зоне отмечался диффузный фиброз как в мозговом, так и в корковом веществе почки. Со стороны артериальной системы — гипертрофия стенки артерий.

В 4-й и 5-й группах наблюдения анамнез заболевания составил 3-21 год (Ме=10,5), однако больным 5-й группы ранее неоднократно проводилось оперативное лечение по поводу МКБ. Уровень креатинина возрастал с 206 мкмоль/л у больных 4-й группы до 481 мкмоль/л в 5-й группе. В 5-й группе наблюдения среднее значение СКФ составило И мл/мин, что по рекомендациям МКР-К/БОр! (2005) соответствует 5-й терминальной стадии ХБП, которую можно расценивать как терминальную хроническую почечную недостаточность.

Морфологически в почках обнаруживали закономерное прогрессирование патологических процессов в виде появления большого количества клубочков-рубчиков, достигавших 75-100% от общего их количества; выраженной атрофии эпигелш канальцев почек с уменьшением размера клеток до минимальных значений в 3,75 мкм. При этом большинство клеток приобретало

15

вытянутую веретенообразную форму, а в ряде случаев они становились едва отличимыми от тубулярной базальной мембраны. Увеличивались интенсивность лимфогистиоцитарной инфильтрации интерстиция, которая часто занимала всю площадь гистологического препарата, и рубцовая трансформация органа.

Таким образом, рассматривая последовательно развивающиеся патологические процессы в каждой из стадий ХБП, к морфологическим признакам ранних стадий ХБП можно отнести: выраженное утолщение стенки артерий, уменьшение диаметра проксимальных и дистальных извитых канальцев, появление очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрации, а также разрастание в интерстициапьной зоне нежно-волокнистой соединительной ткани.

Что же касается более поздних стадий ХБП, то они, к сожалению, имеют менее важное значение в прогностическом плане, однако именно морфологические проявления, развивающиеся на поздних стадиях, наиболее ярко демонстрируют ведущую роль изменений тубулоинтерстициальной зоны в механизме развития ХБП. Так, если размер клубочков в 5-й стадии по сравнению с 1-й уменьшался в среднем в 2,7-3,1 раза, то диаметр канальцев - в 5 раз. Следует отметить, что статистически значимое уменьшение размеров клубочков стали регистрировать лишь с 3-й стадии, когда в почке стали развиваться необратимые процессы.

Во 2-ю стадию ХБП в канальцах почек развиваются компенсаторно-приспособительные процессы в виде выраженного увеличения размеров эпителиоцитов в 1,5 раза и пролиферации эпителия канальцев.

Факт пролиферативной активности эпителиоцитов подтвержден нами и при проведении иммуногистохимического исследования с антигеном пролиферирующего клеточного ядра (РСЫА), который является мультифункциональным белком и экспрессируется в делящихся клетках. Площадь экспрессии в биопсийном материале почки пациентов 2-й группы

достигала 84% , в то время как в 1-й группе данный показатель соответствовал 7,8%, в 3-й группе-7%, в 4-й -3,5%.

Появление элементов компенсации является признаком обратимости ХБП и, надо полагать, возможности достижения положительного эффекта при проведении нефропротективной терапии.

Одной из теорий, объясняющих развитие тубулоинтерстициальных изменений, является теория эпителиалыю-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) клеток. Считается, что эпителиоциты теряют свою эпителиальную дифференцировку и начинают экспрессировать мезенхимальные факторы, которые способствуют развитию склеротических изменений. В нашем исследовании мы попытались определить наличие факта эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток по результатам определения уровня экспрессии Е-кадгерина, так как согласно данным ряда авторов (Kairaitis L.K., Harris D.C., 2001; Strutz F., Okada H„ Neilson E.G., 2001; Bradley W. Doble, James R. Woodgett., 2007) именно потеря Е-кадгерина свидетельствует о начале процесса ЭМТ.

Проведено иммуногистохимическое исследование с набором цитокератинов (340Е, 10/13, 5/6 и 8), выявляющих эпителиальные клетки, а также Е-кадгерином. По результатам определения экспрессии цитокератинов 34рЕ, 10/13, 5/6 сделать достоверные выводы о снижении уровня экспрессии при прогрессировании ХБП не представлялось возможным, поскольку и интенсивность экспрессии, и количество экспрессирующих клеток не имели никаких достоверных различий ни в одной из стадий ХБП.

Противоположный результат был получен при исследовании экспрессии цитокератина 8. По всей видимости, только цитокератин 8 специфичен для эпителия , почечных канальцев, на что и указывали некоторые авторы (M.Viberg, R.Moll, 2004). Согласно теории ЭМТ, мы должны были получить максимальный уровень экспрессии на первых двух стадиях и минимальный - в последних стадиях ХБП, чего не было в нашем исследовании. Во всех группах наблюдения отмечена ярко выраженная реакция, по результатам

17

подсчета histochemical score соответствующая положительной реакции и определенная нами как +++.

При дальнейшем проведении иммуногистохимического исследования мы получили достоверные данные, подтверждающие, что при прогрессировании ХБП в эпителиоцитах канальцев почек снижается экспрессия Е-кадгерина. Согласно результатам данного исследования, снижение экспрессии происходит постепенно от 2-й стадии до отрицательных результатов в 4-й и 5-й стадиях ХБП, что подтверждено получением статистически значимого уровня р=0,021. При этом снижение экспрессии антигена происходило именно в эпителиоцитах, уменьшенных в размерах, приобретающих вытянутую, веретенообразную форму уже со 2-й стадии ХБП, что свидетельствовало об исчезновении в них фенотипических признаков эпителиальной ткани. Мы считаем это морфологическим проявлением нарушения нормальной последовательности развития репаративных процессов: пролиферация -дифференцировка. И если во второй стадии мы регистрировали признаки компенсаторно-приспособительных процессов, то начиная с третьей стадии, морфологические изменения свидетельствовали о нарушении процесса дифференцировки клеток (что подтверждало исчезновение Е-кадгерина), и начиналось развитие склеротических процессов, что можно считать началом необратимости хронической болезни почек.

Таким образом, полученные в результате нашего исследования данные подтвердили стадийность изменений не только клинико-лабораторных показателей, но и морфологической картины в различные стадии ХБП; позволили выявить морфологические критерии каждой из стадий ХБП, в том числе и на первых стадиях развития заболевания, а также установить возможность развития компенсаторно-приспособительных процессов в почке во вторую стадию с последующим формированием необратимого нефросклероза.

В настоящее время в мировой литературе активно дискутируется вопрос о связи тубулоинтерстициальных изменений с уровнем креатинина сыворотки

крови и, соответственно, со стадией ХБП (ЫаЙ1 К.А., 1992; V/. Окоп, О. 8шо1еп5к1, 2007). В нашем исследовании мы подтвердили наличие корреляционной связи разного направления и силы между клинико-лабораторными и морфометрическими показателями как тубулоинтерстициальных компонентов, так и клубочков (табл. 3). Следует отметить, что, по результатам нашего исследования, снижение СКФ происходит задолго до появления морфологических признаков повреждения клубочков.

Это подтверждается тем фактом, что статистически значимые различия в морфометрических показателях изменения клубочкового аппарата по сравнению с группой контроля появляются только в 3-й стадии ХБП. Как известно, именно в третью стадию происходит значительное снижение СКФ, и, согласно рекомендациям ИКР-КЛЮСН (2005), уже с данной стадии можно говорить о наступлении хронической почечной недостаточности. При проведении корреляционного анализа установлено, что наиболее выраженную корреляционную связь как с уровнем креатинина и мочевины сыворотки крови, так и со СКФ, а соответственно и со стадией ХБП имеют такие показатели, как размеры длинной и короткой осей клубочка, количество клеток в инфильтратах мозгового и коркового вещества. Умеренную корреляционную связь показали такие параметры, как количество склерозированных клубочков, диаметр извитых канальцев, высота эпителиоцита, а также толщина стенки артерий. В зависимости от стадии ХБП сила и направление корреляционных связей меняется. Наиболее ранними морфометрическими показателями, уже на ранних стадиях реагирующими на изменения уровня креатинина сыворотки крови, являются толщина стенки артерий и количество клеток в лимфо-гистиоцитарных инфильтратах коркового и мозгового вещества. Кроме того, стоит отметить, что по результатам корреляционного анализа до 5-й стадии ХБП диаметр проксимальных канальцев не имеет зависимости от уровня азотемии и СКФ, в отличие от диаметра дистальных канальцев, показывающих умеренную зависимость уже на 2-й стадии ХБП.

19

Таблица 3

Характер н сила корреляционных связей между полученными параметрами_

1 -я стадия 2-я стадия 3-я стадия 4-я стадия 5-я стадия

Креатинин сыворотки крови СКФ Креатинин сыворотки крови СКФ Креатинин сыворотки крови СКФ Креатинин сыворотки крови СКФ Креатинин сыворотки крови СКФ

%,склерози- рованных клубочков - - 0,246 т,=0,08 -0,248, тг = 0,08 0,445, шг = 0,07 -0,427 m, = 0,06 0,498, шг = 0,07 -0,574 тг = 0,06 0,507, m, = 0,07 -0,503 m, = 0,06

Длинная ось клубочка - - -0,333 тг = 0,07 0,327 тг = 0,06 -0,656 шг = 0,06 0,703 шг =0,06 -0,682 тг = 0,06 0,696, тг = 0,06 -0,731 m, = 0,05 0,707 mf = 0,06

Короткая ось клубочка - - -0,472 т, =0,07 0,58 тг = 0,06 -0,374 шг =0,08 0,449 шг = 0,06 -0,644 шг =0,07 0,719 тг = 0,06 -0,688 mr =0,06 0,716 inr = 0,05

Диаметр проксимальных канальцев - - - - - - - - -0,613 mr =0,06 0,621, mr =0,06

Диаметр дистальных канальцев - - -0,33 111, =0,07 0,47 т, =0,07 -0,464 шг =0,07 0,575 шг =0,07 -0,313 тг =0,07 0,296 тг =0,07 -0,696 mr =0,06 0,647 m, =0,06

Высота эпнтелиоцнта - - -0,48 т, =0,07 0,677, тг =0,06 -0,675 шг =0,06 0,771 шг =0,05 -0,647 тг =0,06 0,627 гпг =0,07 -0,525 m, =0,06 0,549 m, =0,07

Толщина стенки артерий - - 0,653 тг =0,06 -0,806 тг =0,048 0,206 шг =0,08 -0,243 ш, =0,08 0,688 тг =0,06 -0,658 тг =0,06 - -

Количество клеток в корковом веществе - - 0,419 тг =0,05 -0,607 nir =0,06 0,304 шг =0,08 -0,437 ш, =0,07 0,703 тг =0,06 -0,741 тг =0,06 0,479 mr =0,07 -0,366 m, =0,07

Количество клеток в мозговом веществе - - 0,447, тг =0,07 -0,685 шг =0,06 0,291, шг =0,08 -0,455 mr =0,07 0,727, тг =0,05 -0,749 т, =0,05 0,386 m, =0,06 -0,405 m, =0,07

Примечание : все показатели соответствуют уровню значимости р < 0,05; т, - ошибка коэффициента корреляции Спирмена (г)

Для проведения пошагового дискриминантного анализа были выбраны

наиболее значимые морфометрические параметры: для 2-й стадии ХБП -

высота эпителиоцита, толщина стенки артерий и количество клеток в мозговом

веществе; для 3-й стадии - толщина стенки артерий, количество клеток в

инфильтратах коркового и мозгового вещества; для 4-й и 5-й стадии - размеры

клубочков, высота эпителиоцитов, толщина стенки артерий и количество

клеток в инфильтратах.

Проведя пошаговый дискриминантный анализ со всеми возможными

вариантами, была создана оптимальную модель для определения стадии ХБП с

использованием морфометрических показателей. Для этого в группу

анализируемых признаков были включены все изученные параметры, имеющие

значимую корреляционную связь со скоростью клубочковой фильтрации во

всех исследуемых группах. Таким образом, в модель для определения скорости

клубочковой фильтрации вошли такие параметры, как средний размер длинной

и короткой осей клубочка, минимальная высота эпителиоцита, минимальная

толщина стенки артерий, максимальное количество клеток в инфильтратах

коркового вещества и минимальное количество клеток в инфильтратах

мозгового вещества. Следует отметить, что, несмотря на отсутствие в

статистически значимых параметрах размеров клубочков, они вошли в общую

модель, что связано, по нашему мнению, с выраженными изменениями

клубочкового аппарата, имеющими место в 3-4 стадию, чего нельзя не

учитывать для построения математической модели определения скорости

клубочковой фильтрации.

У=0,089Х1+0,1085Х2+1,036Х3+0,07X4+0,049Х3+0,0298Х6-46,86,

где У - значение скорости клубочковой фильтрации,

Х1 - средний размер длинной оси клубочка,

Х2 - средний размер короткой оси клубочка,

Х3 - минимальная высота эпителиоцита,

Х4 — минимальная толщина стенки артерий,

21

Х5 - максимальное количество клеток в инфильтрате коркового вещества,

Хб- минимальное количество клеток в инфильтрате мозгового вещества.

По вычисленной формуле на всем базовом материале по каждому случаю было подсчитано значение скорости клубочковой фильтрации и проведено сравнение с показателями клинико-лабораторного обследования больного. Расхождения между полученными результатами были выявлены только в 5-й группе наблюдения, что связано, на наш взгляд, с рубцовым сморщиванием почек. Во всех остальных группах наблюдения сопоставление полученных данных с истинным значением скорости клубочковой фильтрации, рассчитанной с использованием формулы Кокрофта-Голта, отмечается на уровне среднего значения скорости клубочковой фильтрации, что, по нашему мнению, является достаточным для определения стадии ХБП по морфологическим критериям.

Выводы

1. Морфологическое и морфометрическое исследования почек показали, что структурные изменения в почке имеют стадийный характер развития и количественные показатели, соответствующие определенной стадии развития ХБП.

2. Морфометрические показатели длинной и короткой осей клубочков, диаметр проксимальных и дистальных извитых канальцев, высота эпителия, количество клеток в строме органа, а также толщина стенки артерий имеют ярко выраженную корреляционную связь различной силы и направления со скоростью клубочковой фильтрации и, соответственно, со стадией ХБП.

3. Морфологическими признаками повреждения почек на ранних стадиях ХБП являются: снижение диаметра как дистальных, так и проксимальных извитых канальцев, выраженное утолщение стенки артерий уже на первой стадии ХБП, появление очаговых лимфогистиоцитарных инфильтратов. Вторая стадия ХБП характеризуется развитием компенсаторно-приспособительных процессов в

виде гипертрофии эпителиоцитов и пролиферации канальцевого эпителия, подтвержденной как при обычней окраске, так и при иммуногистохимическом окрашивании.

4. Постепенное уменьшение экспрессии Е-кадгерина в эпителиальных клетках извитых канальцев вплоть до полного исчезновения у пациентов в последней стадии ХБП свидетельствует о начинающемся дисрегенераторном процессе и развитии необратимых изменений в почечной ткани.

5. Предложенная математическая модель, основанная на морфометрических показателях, может быть использована для диагностики ранних стадий ХБП.

Практические рекомендации

1. Для определения стадии ХБП при морфологическом исследовании рекомендуется использование морфометрического метода, основанного на установлении таких параметров, как размеры клубочков, диаметр проксимальных и дистальных извитых канальцев, высота эпителиоцитов, толщина стенки артерий, количество клеток в инфильтратах.

2. На ранних стадиях заболевания целесообразно производить измерение таких параметров, как высота эпителиоцитов, толщина стенки артерий и количество клеток в инфильтратах.

3. Для определения значения скорости клубочковой фильтрации рекомендуется использование разработанной математической модели: У=0,089Х,+0,1085X2+1,036X3+0,07X4+0,049X5+0,0298X6-46,86,

где У - значение скорости клубочковой фильтрации, X] - средний размер длинной оси клубочка, Х2 — средний размер короткой оси клубочка, Х3 — минимальная высота эпителиоцитов, Х4 — минимальная толщина стенки артерий,

Х5 - максимальное количество клеток в инфильтрате коркового вещества,

Х6— минимальное количество клеток в инфильтрате мозгового вещества.

23

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Напшева, A.M. Функциональная гетерогенность почек: миф или реальность / А.М.Напшева // Аспирантские чтения: Материалы межрегиональной научно-практической конференции. — Саратов, 2008,- С.98-99.

2. Напшева, A.M. К эпидемиологии мочекаменной болезни / А.М.Напшева// Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием. - Саратов,

2008,- С. 92.

3. Напшева, A.M. Роль тубулоинтерстициальных изменений в развитии хронической почечной недостаточности / А.М.Напшева, Д.П.Аврамов // Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием. — Саратов,

2009,- С.275-276.

4. Напшева, A.M. Эпидемиология и морфология почек при мочекаменной болезни / А.М.Напшева, А.В.Наливаева // Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием. - Саратов, 2009.- С. 423-424.

5. Профибротические медиаторы в оценке тубулоинтерстициальных изменений при хирургическом лечении больных с мочекаменной болезнью/П.В.Глыбочко, А.Н.Россоловский, Г.Н.Маслякова, А.М.Напшева //Саратовский научно-медицинский журнал. — 2009. - Том 5.- №3.- С.428-433.

6. Напшева, A.M. Тубулоинтерстициальный фиброз как фактор прогрессирования хронической почечной недостаточности /А.М.Напшева // Докторантские и аспирантские чтения: инновации в медицинском образовании и науке: Материалы научно-практической конференции. - Саратов, 2010. -С.160-161.

7. Напшева, A.M. Тубулоинтерстициальные изменения при хронической болезни почек/ Г.Н.Маслякова, А.М.Напшева // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии: Материалы научно-практической конференции, посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук, профессора В.Б. Писарева. - Волгоград, 2010. - С.279-283.

8. Напшева, A.M. Методы моделирования экспериментального нефролитиаза /А.М.Напшева, Д.П.Аврамов // Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2010.-С.274-275.

9. Патоморфология хронической болезни почек /А.М.Напшева, А.В.Павлова, Н.П.Пышкина, А.В.Цыбулина// Молодые ученые — здравоохранению: Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2010.- С. 276-277.

10. Напшева, A.M. Патоморфология хронической болезни почек /Г.Н.Маслякова, A.M. Напшева// Материалы пленума правления российского общества урологов. - Краснодар, 2010. - С. 167.

11. Напшева, A.M. Роль тубулоинтерстициальных изменений при прогрессировании хронической болезни почек / А.М.Напшева// Татьянин день: Материалы итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием. - М., 2011. - С.96-97.

12. Напшева, A.M. Морфологические аспекты хронической болезни почек/ А.М.Напшева // Научные чтения: Материалы межрегиональной научно-практической конференции. - Саратов, 2011. - С. 44-46.

13. Напшева, А.М. Морфологическая характеристика структурных элементов почки в разные стадии ХБП / Г.Н.Маслякова, А.Н.Россоловский, А.М.Напшева // Саратовский научно-мсдицинский журнал. - 2011. - Том 7.- №2.- С.183.

14. Современные лабораторные методы в оценке повреждения почечной паренхимы при хирургическом леченин нефролитиаза /П.В.Глыбочко, А.Н.Россоловский, Г.Н.Маслякова, А.М.Напшева // Саратовский научно-медицннскнн журнал. - 2011. - Том 7.- №2.- С.71-77.

15. Напшева, А.М. Клинико-морфологическая характеристика хронической болезни почек / А.М.Напшева//Аспирантский вестник Поволжья. - 2011. -№5-6.- С.256-260.

16. Напшева, A.M. Морфологические признаки ранних стадий ХБП /А.М.Напшева, Г.Н.Маслякова, Д.П.Аврамов // Современные проблемы науки и образования: электронный журнал. — 2011. -№ 6 [электронный ресурс]. URL: http://www.science-education.ru/100-4884 (дата обращения 9.11.2011).

17. Напшева, A.M. Морфофункциональные особенности хронической болезни почек, обусловленные мочекаменной болезнью / А.М.Напшева, Г.Н.Маслякова, А.Н.Россоловский // Актуальные проблемы фундаментальной уронефрологии: Сборник научных трудов НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ. - Саратов, 2011. - С. 110-117.

18. Напшева, A.M. Морфологические основы ранней диагностики хронической болезни почек /З.Н.Базарова, С.В.Овчинников, А.М.Напшева// Молодые ученые - здравоохранению: Материалы 73-й студенческой научно-практической конференции в рамках первой Всероссийской недели науки с международным участием, - Саратов, 2012,-С. 206-207.

19. Напшева, A.M. Сравнительная характеристика различных стадий хронической болезни почек / С.В.Овчинников, З.Н.Базарова, А.М.Напшева// Молодые ученые — здравоохранению: Материалы 73-й студенческой научно-практической конференции в рамках первой Всероссийской недели науки с международным участием. - Саратов, 2012,-С. 213.

Подписано в печать 13.04.2012. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз.

Заказ № 146.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28