Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфологическое исследование ранних проявлений некробиоза мышечных клеток сердца методом фотохимического флюорохромирования

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МВДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОЛОГШШСКОЙ МОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

ЦИММЕРМАН Владимир Гербертович

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ ПРОЯВЛЕНИЙ НЕКРОБИОЗА МЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК СЕРДЦА МЕТОДОМ ФОТОХИМИЧЕСКОГО ФЛЮОРОХРОМИРОВАНИЯ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолопетеских наук

НОВОСИБИРСК 1994

Работа выполнена в Институте цитологии XI генетики СО РАН и в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патологической морфологии СО РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук АД. ГРУЗДЕВ

Заслуженный деятель науки России

доктор медицинских наук, профессор я.м. непомнящих

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук г.г. Князев кандидат биологических наук л.в. колесникова

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет

Защита диссертации состоится 1994 г.

в О часов на заседании Диссертационного совете Д 001.40.01 в Институте региональной патологии и патологической морфологии Сибирского отделения РАМН (630117 Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 32-31-56)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Автореферат разослан

" ИГ" К^Зи^Л 1994 г.

Ученый секретарь совета доктор биологических наук

ЕЛЛУШНИИШ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования характера и динамики морфологических изменений кардиомиоцитов (КМЦ) при разнообразных экспериментальных воздействиях позволили свести многообразные и семантически многозначные определения дистрофических и некробиотических изменений мышечных клеток сердца (Хехт А., 1975; Korb G., Totovic V., 1963) к единообразной схеме форм острой патологии клетки (Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., 1972; Семенова Л.А., Целлариус Ю.Г., 1978; Непомнящих Л.М., 1981, 1991). Формы альтерации КМЦ описываются как состояния их миофибриллярного аппарата, привязанные, в значительной мере, к их поляризационно-оптическому отображению. Основой схемы является выделение четырех первичных и самостоятельных типов повреждений КМЦ: миоцитолизис, контрактуры миофибрилл, первичный глыбчатый распад и цитолиз с не ходом в колликвациош'шй или коагуля-ционный некроз (Целлариус Ю.Г., Семенова JI.A., Непомнящих Л.М., 1980).

Изложенная трактовка морфологических проявлений ранних повреждений КМЦ является в сущности описанием картины качественной упорядоченности или дезориетированности их миофибриллярного аппарата - состояния двулучепреломления миофибриллярного аппарата продольно ориентированных мышечных клеток сердца. Этот метод накладывает ограничения как на выявление и исследование поперечно срезанных мышечных клеток сердца, так и на анализ количественных характеристик состояния КМЦ.

При исследовании срезов тканей было обнаружено, что после облучения коротковолновым ультрафиолетом (КУФ), многие гистологические структуры начинают во много раз ярче светиться в видимой области спектра при возбуждении этого свечения длинноволновой ультрафиолетовой (ДУФ) частью спектра. Этот процесс был назван фотохимическим флюорохромированием (Целлариус Ю.Г., 1966) и показан на гистологических препаратах некоторых тканей и отдельных компонентах клеток (Груздев А.Д., Целлариус Ю.Г., 1966). Актуально изучение возможности фотохимического фяюорохромирования для исследования процессов повреждения КМЦ в сердечной мышце.

Обычно гистологические препараты обладают слишком слабой интенсивностью свечишя (аутолюминесценцией) в видимой части спектра. Достигнутая же в результате КУФ-облучегшя интенсивность свечения становится достаточной для визуального микроскопического исследова-1шя и количественной регистрации оптических характеристик свечения элементов препаратов.

Предыдущими исследованиями было установлено, что люминесценция в видимой области белков обнаруживается в некоторых случаях и зависит от строения, конформационного и агрегатного состояния (Черницкий Е.А., 1972; Красников В.В. и др., 1987; Longworth J.W., 1971)

и не имеет устоявшейся интерпретации. Люминесцентные свойства продуктов ультрафиолетовых фотохимических реакций биоорганических соединений весьма редко анализируются в публикациях. Исхода из данных но фотохимии биоорганических соединений (Владимиров Ю.А., 1965; Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Игаатенко A.B. и др., 1982; Каю-шик Л.П. и др., 1973; Красников В.В. и др., 1987; Мостовииков В.А. и др., 1988; Pokomyj et al., 1975; Tappe 1 A.L., 1973; 1981), можно полагать, что люминесцирующие хромофорные группы образуются в результате непосредственных, преимущественно окислительных, фотопреобразований белковых и липидных молекул и в результате карбогашаминных реакций КУФ-образонанных карбонильных групп с аминогруппами компонентов препарата. Еще меньше исследован процесс фотофлюорохроми-рования препаратов животной клетки.

Чувствительность процесса фотохимического флюорохромирования к состоянию облучаемого препарата и независимость свечения исследуемы х структур от ориентированности в поле препарата дало возможность предположить, что фотофлюорохромирование может быть чувствительным методом выявления состояния миофибриллярного аппарата мышечной клетки сердца для определения ранних проявлений некробиоза кар-диомиоцитов.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключается в выявлении основных особенностей процесса фотохимического флюорохромирования основных компонентов мышечной клетки сердца, изучении процесса фотофлюорохромировашш нормального и альтерированного КМЦ и выявлении отличий в их морфологической картине свечения.

Поставлены следующие задачи.

1. Выявить и оценить способность к фотофлюорохромированию основных аминокислот - составляющих белковой молекулы. Изучить кинетические и спектральные характеристики процесса фотофлюорохроми-рования отдельных белков, углеводов, нуклеиновых кислот и кофермен-тов - компонентов клеточных структур, а также смеси компонентов миокарда.

2. Изучить кинетические и спектральные характеристики процесс: фотофлюорохромирования нормальных и контрактурно поврежденные КМЦ ira гистологических препаратах сердечной мышцы.

3. Изучить и сопоставить морфологические картины свечения структур миокарда с соответствующими поляризационно- и свето-оптическими микроскопическими изображениями.

Научная новизна. В данной работе впервые исследована способности аминокислот, белков, животных углеводов, нуклеиновых кислот и кофер ментов пиримидинового ряда к образованию люминесцирующих продук тов при КУФ-облучении. Показана многоступенчатость и разветвлен ность фотохимических реакций основных компонентов клетки npj КУФ-облучении и существенность процессов фотоокисления при обра зовании люминесцирующих хромофоров. Показано, что при КУФ-облу

чепии компонентов клетки образуется с разной скоростью рад фотопродуктов с близкими по спектру люминесценции хромофорными группами.

Впервые описана и изучена кинетика и спектральные характеристики фотохимического флюорохромирования миокарда - процесса последовательного образования продуктов с хромофорными группами, спектры люминесценции которых смещаются в длинноволновую область спектра. Показана лимитирующая роль темноиых стадии в процессе образования люминесцирующих хромофорных групп irpji КУФ-облучсшш.

Впервые показано, что на фотофлюорохромпровашгом гистологическом препарате морфологическое состояние мышечной клетки сердца определяется картиной свечения его миофибриллярного аппарата. Определена кинетика фотофлюорохромировапия шггактных и альтерированных КМЦ, показано совпадение их спектров люминесценции, определены оптимальные условия: для достижения достаточно!! для детального мик-роскопировапия интенсивности свечения и повышения контраста свечения между интактными и поврежденными КМЦ на препарате.

Впервые измерено количество сухого вещества на единицу площади неповрежденного (иптактного) КМЦ (НКМЦ) и КМЦ с контрактурой миофибриллярного аппарата (ККМЦ), проведено измерение интенсивности люминесценции этих же участков клеток после КУФ-облучения.

Показано, что интенсивность люминесценции мышечной клетки сердца определяется количеством ее содержимого, т.е. интенсивность свечения с единицы поверхности КМЦ, отнесенная к массе клетки под той же единицей поверхности (удельная интенсивность люминесценции), одинакова для шггактной клетки и поврежденной клетки с контрактурой. Различия в интенсивности свечения иптактных и альтерированных КМЦ определяются локальным перераспределением кассы их сократительного аппарата - при локальном лизисе миофибрилл выявляются участки с пониженной интенсивностью свечения, участки контрактур сопровождаются повышением уровня люминесценции.

Предложено параллельное использование методов фотохимического флюорохромирования и полярпзационно-оптического исследования в качестве нового методического подхода для анализа начальных стадий некробиоза мышечных клеток сердна.

Практическое аиачеяие исследования. На основании проведенного исследования стало возможным применение фотохимического флюорохромирования для морфологической диагностики преднекротических изменений и некрозов .миокарда, что имеет важное значение в морфологической практике.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на Совещании по проблемам соединительной ткани (1966, Новосибирск), Всесоюзном симпозиуме "Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия" (1975, Ленинград), Втором всесоюзном симпозиуме "Острая ишемия органов и ранние иостшиемичсские расстройства" (1978, Москва), на Конференции "Естественные науки на службе здраво-

охранения" (1980, Новосибирск), Третьей конференции "Ультраструктурные основы патологии сердца и сосудов" (1985, Цхалту-бо), на семинаре лаборатории клеточной дифференцировки Института цитологии и генетики СО РАН (1994, Новосибирск), на межлабораторном семинаре Института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (1994, Новосибирск).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Объем н структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 149 страницах машинописною текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы - 2 главы, характеристики материала и методов исследования - 1 глава, результатов исследования - 3 главы, обсуждения -2 главы, выводов, списка литературы (428 источников). Текст иллюстрирован 3 таблицами, 32 схемами и графиками и 33 микрофотографиями.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика материала. Проведено исследование отдельных химических соединений и гистологических препаратов миокарда 124 сердец.

Изучение процесса фотохимического флюорохромирования производилось на твердых образцах аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, нуклеотидных коферментов и углеводов. Фотохимическое флюорохроми-рование миокарда, как результирующая фотофлюорохромирования химических компонентов ткани, производилось на порошке лиофилизиро-ванной мышцы сердца.

Микроскопическое инструментальное и морфологическое изучение ранних проявлений преднекротических и некротических состояний КМЦ производилось на фотофлюорохромированных гистологических препаратах. Использовали модели повреждения мышцы сердца экспериментальных животных окклюзией коронарной артерии (2 собаки и 39 мышей) и инъекцией новодрина или хлористого кобальта (46 крыс). Аутопсийный материал исследовали на фотофлюорохромированных препаратах миокарда людей при сердечной недостаточности (37 случаев).

Методы исследования. При фотохимическом флюорохромирования КМЦ, ткани миокарда и Химических соединений регистрировали изменение интенсивности люминесценции после КУФ-облучения, спектры люминесценции, вклад темновых стадий фотореакций, влияние кислорода и возбуждения на спектрально-кинетические характеристики фотопроцессов. Определяли влияние различных предобработок и сред КУФ-облучения на люминесцентные характеристики гистологических препаратов миокарда, отрабатывали оптимальные условия процедуры фотофлюорохромирования, достаточные для детального микроскопического исследования срезов в свете люминесценции.

Измеряли и сопоставляли интенсивности свечения НКМЦ и ККМЦ с массой (оптической разностью хода) мышечных клеток сердца, приходящейся на ту площадь, с которой регистрировали люминесценцию, до и

после фиксации, до н после КУФ-облучения, а также до и после экстракции водой облученного препарата. Сравнивали показатели преломления клеток в ходе этих процедур, исчислешше по результатам ингер-ферометрических измерений.

Для обработки результатов измерений использовали параметрические и непараметрические методы обработки дагашх.

На основе классификации повреждений миофибриллярного аппарата КМЦ проводили люминесцентное микроскопическое изучение фотоф-люорохромированных препаратов в сопоставлении с изображениями в поляризованном свете, фазовым и интерференционным цветовым контрастом и исследованием окрашенных препаратов в светлом поле.

Использовали криостатные нефиксированные к фиксированные формалином и этанолом срезы и срезы после стандартной формалиновой фиксации кусочков и заливки в парафин

Из методов окраски применяли сочетание: окрашивание гематоксилин-эозином в сочетании с предварительной постановкой реакции Пер-лса; комбшшрованное окрашивание - проведение ШИК-реакции, применение коллоидного железа по Хейлу и гематоксилин-оранжа; постановка (по прописи Мак-Мануса) ШИК-реакции с контрольной обработкой срезов амилазой; окраска гематоксилин-пикрофуксином по ван Ги-зону в сочетании с резорцин-фуксином по Вейгерту.

Для КУФ-облучешгя и регистрации спектрально-кинетических характеристик процесса фотофлюорохромирования объектов использовали три установки самостоятельной компоновки и изготовления.

Изучение гистологических препаратов в свете люминесценции проводили на микроскопе МЛ-2Б ЛОМО. Для измерений и фотографирования использовали насадки ФМЭЛ-1 и МФН-10 с заменой источника освещения более мощным и дополнительной стабилизацией светового потока.

Для интерференционных измерений, исследования в поляризовашюм свете, фазовом контрасте, светлом поле и фотографирования препаратов использовали микроскопы и принадлежности фирмы КДейсс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами проведено исследование процесса фотофлюорохромирования основных оргакохимических компонентов клеток: аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, коферментов и углеводов в твердом состоянии и изотропной смеси всех компонентов клеток - порошка лиофилизирован-ного миокарда.

У всех 20 аминокислот, за исключением триптофана, выявлена способность к образованию фотопродуктов с хромофорными группами, излучающими в видимой области при возбуждении свечения в ДУФ-обла-сти. Процесс фотофлюорохромирования характеризуется многоступенчатостью протекающих рекций с выраженными обратными, темновыми и

кислородо-зависимыми стадиями. Хромофорные группы: продуктов световых и темновых стадий КУФ-облучения чувствительны к возбуждению - общим является большая стабильность продуктов КУФ-облучения к возбуждению по сравнешпо с "выцветаемостью" образцов до облучения. Спектры люминесценции аминокислот состоят из полос разной интенсивности - общим является наличие у образующихся при КУФ-облуче-шш фотопродуктов, хромофорных групп, полосы излучения которых сдвинуты в длинноволновую сторону спектра относительно спектров люминесценции аминокислот до облучения.

Выявленная способность к фотофлюорохромированию аминокислот является фотохимической основой аналогичной способности белков приращивать в твердом состоянии интенсивность свечения в видимой области спектра после КУФ-облучения и рассмотрена на примере про-тамина - одного из простых белков без серусодержащих аминокислот и триптофана. Показана многокомпонентность и схожесть кинетических и спектральных характеристик "белкового" и "аминокислотного" процессов фотофлюорохромирования.

Процесс фотофлюорохромирования нуклеиновых кислот, кофермен-тов и углеводов рассмотрен на примере препаратов РНК, пурино-пири-мидинового динукдеотида - НАД и гликогена и показана их способность к образованию люминесцирующих фотопродуктов при КУФ-облучении в твердом состоянии.

Описанные данные показывают схожесть кинетических и спектральных характеристик фотофлюорохромирования основных химических компонентов клетки и являются фотохимическим обоснованием реализации принципа "преобладает свечение фотопродуктов того, чего изначально было больше" при КУФ-облучении порошка лиофилизированного миокарда. Примененный препарат является изотропной смесью всех химических компонентов клетки, где лиофилизация является методом, обеспечивающим максимальную гистохимическую сохранность клеток миокарда и отражает обобщенную картину протекания фотофлюорохромирования гастопрепаратов миокарда.

Особенностью процесса фотофлюорохромирования смеси является невыраженность периода автоускорения и смена периода быстрого повышения интенсивности свечения монотонным и длительным периодом незначительного, продолжающегося подъема уровня люминесценции - за 360 и 900 мин КУФ-облучения интенсивность свечения порошка миокарда повышается в 4 и 5 раз соответвенно.

Показана существенность темновых стадий в цепи фотореакций КУФ-облучения смеси - при выдержке препарата в темноте после каждой КУФ-дозы, тс» есть при дробном освещении, происходит ускоренное повышение интенсивности люминесценции, превышающей более чем в два раза уровень свечения непрерывно облученного в той же дозе препарата.

Спектры люминесценции порошка миокарда обнаруживают пик в районе 460 нм; в процессе КУФ-облучсния происходит постепенное смещение максимума спектра фотопродуктов в область 500 - 520 нм. Фотопродукты КУФ-облучсния смеси стойки к возбуждению - интенсивность люминесценции после доз КУФ-облучения, доведших препарат до замедленного прироста степени фотсфшоорохромированности, снижается за 6 мин возбуждения в 10 раз меньше, чем снижается за то же время возбуждения интенсивность первоначального свечения порошка.

Образовавшиеся фотопродукты порошка миокарда обладают выраженной стабильностью и сохраняют неизменную способность к свечению в течение десятков месяцев.

При исследовании процесса фотохимического флюорохромирования мышечных клеток сердца (табл. 1, 2) отмечена предпочтительность КУФ-облучения сухих гистологических препаратов на воздухе. Определена достаточная длительность КУФ-облученшг для достижения интснсивностей свечения, достаточных для детального микроскопического исследования.

Продемонстрирована повышенная интенсивность свечения ККМЦ, по сравнеютю с НКМЦ при сходстве кинетических кривых фотофлюорохромирования; продемонстрирована возможность некоторого допол-шггельного повышения кошраста свечения между НКМЦ и ККМЦ после дифференцировки препарата в воде.

Определена допустимость проведения интерферометрических и люминесцентных измерении в процессе фотофлюорохромирования.

Показано отсутствие достоверных изменений показателя преломления НКМЦ и ККМЦ при манипуляциях со срезом ткани в процессе фотофлюорохромирования и их неразличимость между этими двумя группами клетог'.

Выявлена достоверно большая оптическая разность хода ККМЦ по сравнению с НКМЦ - синхронная с регистрируемой большей интенсивностью свечения клеток.

Показано, что повышенная интенсивность свечения ККМЦ по сравнению с НКМЦ обусловлена не качественными фотофизическими изменениями миофибриллярного аппарата альтерированных КМЦ, а изменениями и перераспределениями количества вещества, приходящегося на единицу площади ихтучающей поверхности гистологического препарата, т.е. компартментализацией миофибриллярного аппарата ККМЦ при повреждении, что и выявляется в процессе фотофлюорохромирования.

При морфологическом изучении фотофлюорохромированных препаратов миокарда показано, что срезы сердечной мышцы собак, крыс и мышей и секционного материала не различаются визуально между собой по люминесцентным характеристикам и нет необходимости в нюансировке процедур осуществления методов в зависимости от видовой принадлежности препаратов.

Некробиотаческие показатели КМЦ выявляются на фотофлюорохромированных препаратах практически сразу после повреждающего воз-

Таблица 1. Усредненные данные интенсивностей люминесценции и оптических разностей хода кардиомиоцита (КМЦ)

До коротковолнового ультрафиолетового облучения

до фиксации после фиксации

1д Аг дбн 1л Аг ¿бн

НКМЦ 23.6; 1.05 76.5; 1.91 -51.6; 1.23 19.2; 0.83 66.7; 2.01 -44.4; 1.14

ККМЦ 39.8; 1.19 118.3; 4.50 -82.3; 2.98 32.0; 1.13 102.6; 4.04 -72.3; 2.80

После 180 мин коротковолнового ультрафиолетового облучения

до обработки водой после дифференцировки в вйде

1л Аг ¿бн 1л Дг Абн

НКМЦ 144.0; 8.10 69.2; 2.86 -52.7; 2.71 78.5; 6.68 53.7; 2.60 -42.4; 2.56

ККМЦ 182.7; 5.55 85.8; 2.07 -63.3; 1.57 110.9; 2.86 73.8; 2.19 -57.4; 1.41

Примечание. 1л - средняя и стандартная ошибки средней интенсивности люминесценции, нА; Дг, Абн - средняя и стандартная ошибки средней оптической разности хода в гептане (г) и монобромнафталине (бн), деление шкалы. Здесь и в табл. 2: НКМЦ - неповрежденный КМЦ, ККМЦ - контпактурный КМЦ.

Таблица 2. Показатели преломления и удельной интенсивности люминесценции кардиомиоцитов (КМЦ) в процессе фотохимического флюорохромирования

До КУФ-облучения После 180 мин КУФ-облучения

Показатель до фиксации после фиксации до обработки водой после дифференци-ровки в воде

НКМЦ ККМЦ НКМЦ ККМЦ НКМЦ ККМЦ НКМЦ ККМЦ

Интенсивность люминесценции клетки с площади зовда -1ЛКМЦ (нА)

23.6

39.8

19.2

32.0

-I

144.0 ф 182.7

78.5 * 110.9

Оптическая разность хода под площадью зонда - ДКМЦ (дел, шк.)_

76.5

118.3 I-

66.7 * 102.2

69.2 * 85.8 53.7 * 73.8 |-*-1

Показатель преломления клетки -Пд КМЦ

1.553 = 1.551 = 1.555 = 1.552 (0.0122) (0.0079) (0.0113) (0.0075)

1.545 = 1.547 = 1.547 = 1.548 (0.0303) (0.0232) (0.0236) (0.0163)

Коэффициент корреляции между 1ЛКМЦ и ДКМЦ - г

0.82

0.81

0.86

0.86

0.81

0.83

0.83

0.84

Удельная интенсивность люминесценции

1луд.=1лКМЦ/ДКМЦ

0.31 = 0.34 0.29 = 0.31 2.08 = 2.13 (0.013) (0.010) (0.011) (0.007) (0.143) (0.056)

1.46 = 1.50 (0.110) (0.059)

критические уровни значимости 5% и 0.1% - достоверное различие данных. КУФ

Примечание. В скобках - стандартные ошибки средних; принятые знак = означает достоверное отсутствие различий, знак ф коротковолновый ультрафиолет.

ф

ф

ф

действия на сердце и выражаются в топографической мозаичпости свечения КМЦ - в мозаичпости свсчения компартменталкзированного ми-офибриллярного аппарата альтерированных клеток. Выявлена совпадае-мость обнаружения преднекротических и некротических проявлений повреждения КМЦ по изображениям в свете люминесценции фотофлю-орохромированных препаратов и классифицированных по микроскопическим изображениям в поляризовашгом свете. При этом выявлена параллельность динамики развития альтераций, обнаруживаемых данными методами исследования, на моделях окклюзии коронарных артерий и: моделях метаболического и токсического повреждения сердечной мышцы экспериментальных животных.

Преимуществом фотофлюорохромирования по отношению к поляризационной микроскопии является более полная и быстрая оценка пора-женности сердечной мышцы, связанная с возможностью выявления альтераций и на поперечно срезанных волокнах; выявляются реактивные изменения соединительной ткани и процессы резорбции некротизиро-ванной ткани. Микроскопирование фотофлюорохромированных препаратов возможно проводить на фиксированном и нефиксировашшм материалах, что расширяет возможности применения на исследуемых образцах других гистохимических методов.

Выявлены случаи несовпадения картины альтерации КМЦ в свстс люминесценции и в поляризованном свете, связанные с процессом образования первичного глыбчатого распада, когда в поврежденной клетке протекают одновременно процессы коагуляции и лизиса миофибрилляр-ного аппарата. Изображение в поляризованном свете выявляет степень ориентированности и напряженности анизотропных молекул сократительного аппарата, тогда как изображение в свете люминесценции отражает картину компартментализации всей саркоплазмы клетки. Данные несовпадения не влияют на саму определяемость поврежденности клетки, а отражают различные стороны процесса ее альтерации.

В отличие от ультрафиолетовой люминесценции белков (Владимиров ТО .А., 1965), обусловленной ароматическими аминоацилами, видимая люминесценция белковой молекулы при КУФ-облучении опосредуется участием в фотореакциях всех ее составляющих. Сопоставление спектрально-кинетических характеристик исследованных соединений с данными по КУФ-облучению порошка миокарда говорит о существенной аддитивности вкладов химических соединений ткани препарата в спектрально-кинетическую картину фотофлюорохромирования миокарда, Привлечение измерений сухого вещества клеток и соотнесенных с ними интенсивностей люминесценции характеризуют уровень интенсивности свечения КМЦ как соответствующий его массе и белковому содержанию.

Спектр люминесценции миокарда характеризуется миогокомпопен-тностью, и в процессе наработки фогопродуктов при КУФ-облучении происходит постепенный сдвиг излучения в длинноволновую сторону.

Особенностью процесса фотофлюорохромирования миокарда и КМЦ является лимитированность наработки люминесцирующих фотопродуктов скоростями темновых стадий. При дробном (прерывистом) КУФ-об-лучении достаточные интенсивности свечения достигаются при меньших суммарных КУФ-дозах, а соответствующие спектры люминесценции менее сдвинуты в длинноволновую сторону.

Микроскопическое и инструментальное сопоставление люминесценции ККМЦ и НКМЦ после КУФ-облучсния препаратов миокарда ише-мически поврежденного сердца показали, что интенсивность свечения ККМЦ достоверно выше таковой НКМЦ; соотношение этих интенсив-ностей сохраняется при продолжающемся фотофлюорохромировании. Спектры люминесценции НКМЦ и ККМЦ не обнаруживают отличий между собой.

Введение индекса удельной шггенсивности люминесценции, равного частному от интенсивности свечения отграниченного участка клетки на оптическую разность хода этого участка, показывает, что величина этого индекса достоверно одинакова для НКМЦ и ККМЦ. Равность этого показателя между клетками сохраняется при фиксации, КУФ-облучении и дифференцировке препарата в воде после КУФ-облучения.

Это говорит о фотохимическом единообразии процессов фотофлюо-рохромироватшя для мышечных клеток сердца и является основой вывода о том, что различия интенсивностей свечения нормальных и альтерированных КМЦ определяются перераспределениями массы компар-тмента миофибриллярных структур в процессе повреждения клетки.

Изучение влияшгя условий проведения КУФ-облучения на параметры свечения препаратов миокарда позволило выбрать наиболее простой и доступный вариант процедуры фотофлюорохромирования и достижения интенсивности люминесценции, достаточной для детального микроскопического исследования клеток и других структур среза, безотносительно от видовой принадлежности мышечной ткани и пред-, пост-или нефиксированности. Стабильность свечения фотофлюорохромиро-?анных препаратов миокарда высока.

Микроскопические изображения в свете люминесценции КМЦ аль-терировахшого миокарда на препаратах после КУФ-облучсния сопоставлялись с изображениями в поляризованном свете на основе рубрикации альтераций миофибриллярного аппарата мышечных клеток. Для оценки стромалыгой реакции, необратимости некробиотических процессов повреждения КМЦ в результате плазматического пропитывания и т.п., использовались параллельные срезы миокарда после соответствующих окрасок.

Повреждения миофибриллярного аппарата КМЦ визуализируются при фотофлюорохромировании препаратов миокарда в форме мозаично-сти свечения - участки лизиса миофибрилл характеризуются пониженной интенсивностью свечения по сравнению с несокращенными саркоме-рами нормальных КМЦ; участки контрактурных сокращений обладают

повышенной интенсивностью свечения. Поперечная полосатость сократительного аппарата клеток выявляется на тонких срезах повышенной интенсивностью свечения А-полос.

Альтерации: миофибриллярных структур выявляются практически сразу после повреждающего воздействия - одиночные клетки с контрактурами обнаруживаются через 5 мин после нарушения кровоснабжения миокарда в эксперименте (Непомнящих Л.М., 1991).

Как установлено нашими исследованиями, выявляемость поврежденных КМЦ по картине альтераций миофибриллярного аппарата совпадает при микроскопическом изучении срезов в свете люминесценции и в поляризованном свете (Целлариус Ю.Г. и др., 1984). Динамика течения га-стопатологическнх процессов также определяется параллельной при использовании методов фотофлюорохромирования и поляризационной микроскопии.

Существенным преимуществом метода фотофлюорохромирования оказывается независимость обнаружения повреждений от ориентации клеток в срезе - метод поляризационно-оптической микроскопии позволяет анализировать только продольно ориентированные в срезе клетки.

Первичный глыбчатый распад является самым сложным, наименее исследованным, трудно интерпретируемым и прогностически самым тяжелым вариантом повреждения КМЦ, в котором в процессе альтерации протекают одновременно (или постулируются одномоментно протекающими) процессы очагового лизиса и контрактурного сокращения мио-фибрилл; обнаружение первичного глыбчатого распада совпадает с обнаружением плазматического пропитывания клетки.

Несовпадения люминесцентных и поляризационных изображений первичного глыбчатого распада могут быть сведены в два варианта: участкам с "понижением" анизотропии соответствует повышенная интенсивность свечения и участкам "повышения" анизотропии соответствует пониженная: интенсивность люминесценции. Эти картины несовпадений дополняются картинами первичного глыбчатого распада однонапгаштен-ных соответствий изображений.

Использование фотохимического флюсрохромирования для целенаправленного исследования процессов некробиоза КМЦ, результирующих-ся в первичный глыбчатый распад, в комплексе с другими (и инструментальными) методами микроскопического исследования, может быть новым подходом к изучению проблемы канализируемости и предопределенности процессов альтерации клетки.

В остальных вариантах альтераций миофибриллярный аппарат клетки реагирует однонаправленно в отношении повышения или снижения "общей" анизотропии и соответсттолоппту ь-алебаний интенсивности люминесценции.

Возможности одновременной оценки в свете люминесценции непо-ляризующих структур (реактивных изменений соединительной ткани, образования воспалительных инфильтратов, состояния кровоснабжения

мышцы) облегчает выявление повторных повреждений миокарда при использовании фотофлюорохромированных препаратов.

Развитие метода фотофлюорохромирования при использовании прерывистого КУФ-облутс! тя, ввиду достижения достаточной интенсивности свечения при меньшей фотомодификации вещества КМЦ, допускает после люминесцентной морфологической оценки состояния КМЦ возможность постановки гистохимических, иммунопатологических реакций и гистоблотгинга на тех же клетках.

Благодаря чувствительности и меньшей зависимости люминесцентных измерений от неоднородности распределения излучающего материала (Pollack G.H., Huntsman L.L., 1974; Manring А. и др., 1977) и лучшей корреляции между интенсивностью свечения и количеством излучающих объектов (по сравнению с фотометрическими измерениями) фотохимическое флюорохромирование открывает возможности доступной и удобной инструментальной оценки "напряженности" состояния миокарда при изучении влияний потенциальных повреждающих факторов на миокард животных и экологическом мониторинге на больших массивах материала.

Люминесцентные картины фотофлюорохромированного гистологического препарата миокарда в отличие от изображений в поляризованном свете легко поддаются а вто матич е с ко й обработке и встройке в системы компьютерного анализа типа "машина - эксперт".

ВЫВОДЫ

1. Основные химические компоненты клетки гистологического препарата - аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, коферменты пу-рино-пиримидинового ряда, углеводы и естественная смесь химических компонентов в состоянии максимальной гистологической сохранности (в виде порошка лиофилизировашюго миокарда) способны к фотохимическому флюорохромировашто. Люминесцирующие в видимой области фотопродукты исследованных соединений образуются при коротковолновом ультрафиолетовом облучении в ходе многоступенчатых цепей прямых и обратных, световых (частью кислородозависимых) и темновых реакций и стабильны по окончании облучения. Свечение ткани и кардио-миоцита на препарате определяется их белками.

2. Интенсивность свечения вьаделешюго участка кардиомиоцита на гистологическом препарате определяется количеством вещества этого участка до и после фиксации, после коротковолнового ультрафиолетового облучения и после дифференцировки облученного препарата в воде. В процессе коротковолнового ультрафиолетового облучения происходит увеличите интенсивности свечения, пропорциональное количеству вещества независимо от состояния клетки. Спектры люминесценции'кар-диомиоцитов независимы от состояния клетки и определяются дозой коротковолнового ультрафиолетового облучения.

3. При фотофлюорохромировании кардиомиоцитов на гистологическом препарате визуализируются состояния компартмента их сократительных структур, достаточные для детальной микроскопической оценки состояния клеток. Картины свечения некробиотических и некротических состояний кардиомиоцитов определяются перераспределениями массы компартмента сократительных структур клетки. Мозаичность люминесценции альтерации миофибрпллярною аппарата мышечных клеток характеризуется тем, что участки лизиса миофибрилл обладают пониженной (по сравнению с несокращенными саркомерами нормальных кардиомиоцитов) интенсивностью свечения, участки контрактур - повышенной. Картина альтерации кардиомиоцитов по типу первичного глыбчато-го распада оказывается в свете люминесценции более сложной (детальной), по сравнению с изображениями в поляризованном свете. Поперечная полосатость сократительного аппарата выявляется на тонких срезах повышенной интенсивностью свечения А-тюлос.

4. Альтерации миофибриллярного аппарата кардиомиоцитов визуализируются в свсте люминесценции практически сразу после повреждающего воздействия: одиночные клетки с контрактурами обнаруживаются через 5 миг после нарушения кровообращения миокарда.

Преимуществом фотохимического флгоорохромирования по отношению к поляризационной микроскопии является визуализация альтераций независимо от ориентации клетки в срезе миокарда, что даст возможность исследовать состояние клеток всего препарата, включая поперечно-срезанные мышечные волокна.

5. Выявляемость продольно-ориентированных в срезе повреждении) кардиомиоцитов по картине альтераций миофибриллярного аппарата совпадает при микроскопическом изучении миокарда в свете люминесценции и в поляризованном свете. Динамика течения гистопатологичсски: процессов также определяется параллельно при использовании метода! фотофлюорохромирования и поляризационной микроскопии. Фотофлю орохромированис позволяет полным образом быстро и доступно оцепи вать количество "выключенных" кардиомиоцитов и состояние сократи тельной способности миокарда.

6. При исследовании фотофлюорохромированных препаратов сердсч пой мышцы показаны возможности одновременной оценки в свете лю минесценции кардиомиоцитов и неполяризующих структур (реактивны изменений соединительной ткани, образования воспалительных инфиль тратов, состояния кровоснабжения), что облегчает и ускоряет характери стику острых изменений миокарда.

7. Усложненность люминесцентных изображений альтераций карди омиоцитов при первичном глыбчатом распаде является предпосылко использования фотофлюорохромирования в качестве нового подхода изучению сосуществования литических и коагулятивных процессов не! робиоза в пределах одной клетки.

Фотохимические особенности прерывистого коротковолнового ультрафиолетового облучения препаратов миокарда являются предпосылкой для разработки процедур, позволяющих после люминесцентной морфологической оценки состояний кардиомиоцитов постановку гистохимических, иммуногистохимическнх реакций и гастоблоттиига на тех же клетках.

Люминесцентно-микроскоплческие особенности фотофлюорохроми-рованных кардиомиоцитов допускают возможность использования метода для инструментальной оценки "напряженности" миокарда при изучении влияния повреждающих факторов на больших массивах данных, экологическом мониторинге при оценке состояния популяции кардиомиоцитов и для встройки в системы морфологического анализа типа "машина - эксперт".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Î. Целлариус Ю.Г., Пандакова В.Н., Груздев А.Д., Циммерман В.Г. Люминесцентные исследования коллагена // Соединительная ткань в норме и патологии. - Новосибирск, 1968. - С. 50 - 55.

2. Циммерман В.Г. Видимая люминесценция янтарной кислоты после облучения коротковолновым ультрафиолетом // Известия СО АН СССР. Сер. химия, наук. - 1976. - Вып. 1. - С. 132 - 136.

3. Циммерман В.Г., Целлариус Ю.Г. Выявление поврежденных клеток миокарда на гистологических срезах методом фотохимического флю-орохромирования // Арх. патол. - 1976. - N> 7. - С. 72 - 74.

4. Целлариус Ю.Г., Циммерман В.Г. Новые методы выявления поврежденных клеток в гистологических срезах миокарда // Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия. - Л., 1977. - С. 89 - 90.

5. Циммерман В.Г., Целлариус Ю.Г. Применение фотохимического флюорохромирования для выявления ранних стадий ишемических повреждений миокарда // Острая ишемия органов и рашше постишемичес-кие расстройства. Тезисы докл. П Всесоюз. симпозиума. - М., 1978. - С. 211 - 212.

6. Циммерман В.Г. Фотохимическое выявление поврежденных клеток миокарда // Естественные науки на службе здравоохранения. Тезисы докл. н.-техн. конфер. - Новосибирск, 1980. - С. 156 - 158.

7. Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Целлариус С.Ф., Золотарева А.Г., Мартышок P.A., Ерисковская Н.К., Метляева В.Г., Циммерман В.Г. Морфологическая характеристика ранних стадий ишемических повреж-дешш сердечной и соматической мускулатуры // Гипотермическая защита в кардиохирургии. Сб. научн. трудов. Ч. 2. - Новосибирск, 1980. - С. 210 - 211.

8. Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Целлариус С.Ф., Ерисковская Н.К., Золотарева А.Г., Леонтьева Т.А., Мартышок P.A., Метляева В.Г.,

Циммерман В.Г. Структурные основы функциональных перестроек и сократительной недостаточности сердечной и скелетной мускулатуры // Механизмы патологических реакций. - Томск, 1981. - С. 124 - 128.

9. Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М., Ерисковская Н.К., Леонтьева Т.А., Семенов Д.Е., Циммерман В.Г. Некоторые фундаментальные проблемы гистопатологии миокарда // Бюл. СО АМН СССР. - 1982. - № 3. - С. 22 - 29.

10. Применение фотохимического флюорохромирования для патоло-гоанатомической диагностики преднекротических изменений и инфаркта миокарда. Методические рекомендации / Разраб. и составит. Ю.Г.Целлариус, В.Г. Циммерман, ЛЖ.Непомнящих, Л.А.Семенова. - М., 1984. - 20 с.

11. Целлариус Ю.Г., Циммерман В.Г., Непомнящих Л.М., Семенова Л.А. Эффект фотохимического флюорохромирования в морфологическом выявлении острых повреждений миокарда // Бюл. СО АМН СССР. -1984. - № 5. - С. 72 - 79.

12. Циммерман В.Г. Дополнительное фотохимическое люминесцентное окрашивание импрегнированных срезов // Архив анат., гистол., эм-бриол. - 1985. - № 3. - С. 95 - 96.

13. Циммерман В.Г. Морфологическое исследование острых повреждений миокарда методом фотохимического флюорохромирования // Уль-траструкгурные основы патологии сердца и сосудов. Материалы Ш конференции. - Тбилиси, 1985. - С. 232 - 233.

14. Непомнящих Л.М., Семенов Д.Е., Циммерман В.Г. Влияние многократного полного голодания на количественные показатели популящп кардиомиоцитов белых крыс // Бюл. экспер. биол. - 1994. - № 6. - С. 65i -660.

Соискатель

у

В.Г.Циммерман

Подписано в печать 05.10.94 г. Печ. л. 1,0. Заказ N 63.

Типография СО РАМН, 1994 г. Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2

Формат бумаги 60x84/16. Тираж 100 экз.