Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфологическое исследование печени мышевидных грызунов из районов антропогенных воздействий

5 оа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЁНИЕ

ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ МОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

МОЛОДЫХ Ольга Павловна

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕЧЕНИ МЫШЕВИДНЫХ ГРЫЗУНОВ ИЗ РАЙОНОВ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск -1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор л.м.непомнящих доктор биологических наук еллушникова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор м.с.виноградова кандидат биологических наук в.г.селятицкая

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится " " ы^ляЛ/юТЯ 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета

Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тима-кова, 2; тел: 32-31-56).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан" 1996 г.

Ученый секретарь Совета доктор биологических наук

Е.Л.Лушникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительное усиление техногенного влияния на природные экосистемы в последние десятилетия обусловило разработку проблемы биологических эффектов, детерминированных комплексом физических и химических факторов на разных уровнях структурно-функциональной организации (Авцын А.П. и др., 1991; Москалев Ю.И., 1991; Непомнящих JI.M., 1991; Спитковский Д.М., 1992). Особую остроту эта проблема приобрела в связи с крупными техногенными катастрофами, а также выполнением программы ядерных испытаний, что вызвало загрязнение обширных территорий долгоживущими радионуклидами и химическими компонентами (Иванов В.И., 1991; Алексахин P.M., 1993; Поликарпов Г.Г., Ааркрог А., 1993; Зыкова A.C., Воронина Т.Ф., 1993; Киселев В.И. и др., 1994). В результате огромные кон-тингенты населения и биота постоянно или в течение длительного времени находятся в надфоновом радиационном поле и часто подвергаются действию химических раздражителей. Важно подчеркнуть, что это поле формируется как за счет внешнего у-излучения, так и за счет радионуклидов, попадающих в организм различными путями. Таким образом, живые организмы подвергаются хроническому сочетанному внешнему и внутреннему облучению спектром естественных и искусственных радионуклидов, которое в ряде случаев сопровождается контактом с большим количеством ксенобиотиков.

Учитывая то обстоятельство, что природный радиоактивный фон является одним из эволюционно значимых факторов (Алексахин P.M., 1986; Кузин A.M., 1991, 1995), можно полагать, что его изменения в относительно небольшом диапазоне, как и в случае других электромагнитных излучений, будут вызывать метаболические сдвиги и, как следствие, структурно-функциональную реорганизацию жизненно важных систем организма. Считается, что электромагнитные излучения имеют информационную природу и в большей степени воздействуют на регуляторные системы организма, определяя качество и интенсивность процессов жизнедеятель-

носги (Пресман A.C., 1974; Копанев В.И., Шакула A.B., 1985; Подколзин A.A. и др., 1994). Поэтому любые изменения электромагнитных потоков будут восприниматься живой системой как сигнал к изменению функционального статуса.

Изучение воздействия неблагоприятных факторов малой интенсивности проводится, как правило, раздельно, хотя следует оценивать весь комплекс факторов (Руднев М.И., 1993). Большинство исследований по комплексному воздействию химических факторов и радиоактивного излучения выполнены с высокими дозами агентов при наблюдении их аддитивного эффекта (Бахитова JI.M., Пашин Ю.В., 1990; Бутоло Н.В., Иванов В.Б., 1995). Исследования биологического действия малых доз ионизирующего излучения и других внешних воздействий стали проводиться относительно недавно. В настоящее время в этой области знаний проходит накопление научной информации и частичная систематизация данных. При этом современные концепции биологического действия малых и сопредельных с ними доз ионизирующего излучения базируются на закономерностях выхода хромосомных аберраций в различных клеточных культурах (Заичкина С.И. и др., 1992; Гераськин С. А., 1995).

Большое значение для оценки возможных биологических эффектов малых доз облучения и концентраций химических веществ имеет изучение диких животных, обитающих на территориях с, высоким уровнем техногенных загрязнений (Безель B.C., 1987; Ильенко А.И., Крапивко Т.П., 1989; Шишкина JI.H. и др., 1992; Зайнуллин В.Г. и др., 1994; Маслова К.И. и др., 1994). Интегральная оценка происходящих изменений может быть получена в морфологических исследованиях при анализе характера и направленности структурной реорганизации важнейших морфофункциональных систем организма и выяснении закономерностей организации регенераторных процессов в рассматриваемых условиях.

Печень является центральным органом метаболизма, играющим также большую роль в развитии адаптивно-компенсаторных процессов, чем объясняется большое внимание к ней при изучении последствий различных неблагоприятных

воздействий. Тем не менее многие вопросы, касающиеся особенностей и закономерностей морфофункциональной реорганизации печени диких животных, обитающих в экосистемах с высоким уровнем техногенных загрязнений, остаются не выясненными.

Цель и задачи исследования. Цель работы - сравнительный морфологический анализ печени мышевидных грызунов двух видов из природных экосистем с различным уровнем антропогенных загрязнений и выяснение структурных основ адаптивно-компенсаторной реорганизации печени в этих условиях.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1) провести сравнительный гистостереологический анализ печени мышевидных грызунов из природных экосистем с различным уровнем антропогенных загрязнений;

2) оценить с помощью методов кариометрического анализа степень полиплоидизации гепатоцитов у грызунов из разных экосистем;

3) определить особенности и закономерности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов мышевидных грызунов из природных экосистем с различным уровнем антропогенных загрязнений.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование (световая и электронная микроскопия, кариометрический и стереологический анализ) печени мышевидных грызунов двух видов из природных экосистем, характеризующихся различным уровнем антропогенных загрязнений, с выделением общих закономерностей тканевых, клеточных и внутриклеточных перестроек.

Показано, что в условиях хронического воздействия антропогенных загрязнений (комплексного влияния химических агентов и ионизирующего излучения малой интенсивности) в печени лесных мышей и обыкновенных полевок развиваются стереотипные морфофункциональные изменения - выраженные дистрофические изменения гепатоцитов и нарушения гемодинамики в виде венозного и синусоидального полнокровия. Выраженность морфофункциональных изменений

коррелирует с уровнем антропогенных загрязнений.

Впервые установлено, что к общим закономерностям изменения тканевой архитектоники печени у мышевидных грызунов из районов с высоким уровнем антропогенных загрязнений относятся уменьшение объемного и поверхностно-объемного отношения синусоидов к гепатоцитам и снижение объемного отношения стромы к паренхиме.

Впервые обнаружено, что у лесных мышей и обыкновенных полевок из экологически неблагополучных районов в популяции гепатоцитов реализуются разные стратегии клеточной регенерации: у лесных мышей усиливается поли-плоидизация гепатоцитов (возрастает доля клеток с 8п и 16п ядрами), у обыкновенных полевок уменьшается плоидность гепатоцитов (преобладают клетки с 2п и 4п ядрами). У грызунов обоих видов из этих районов общей закономерностью клеточной регенерации гепатоцитов является уменьшение числа двуядерных клеток. Установлена корреляция между увеличением числа высокоплоидных гепатоцитов и уменьшением относительной массы печени.

Впервые показано, что у грызунов обоих видов из природных экосистем, подвергнутых значительной антропогенной трансформации, происходят стереотипные ультраструктурные изменения гепатоцитов, ведущими из которых являются: гипергликогеноз и перераспределение основных цито-плазматических органелл в клетке.

Выявлена общая закономерность внутриклеточной пространственной реорганизации гепатоцитов в условиях хронического действия техногенных загрязнений - значительное снижение (более чем на 30%) объемной плотности митохондрий, гранулярной и гладкой эндоплазматической сети, которое носит преимущественно диспропорциональный характер.

Практическая значимость. Полученные результаты раскрывают закономерности тканевых, клеточных и внутриклеточных перестроек в печени мышевидных грызунов, подвергающихся длительному воздействию факторов техногенной природы (комплексному действию химических агентов и " ионизирующего излучения малой интенсивности) и могут

быть использованы при разработке морфофункциональных критериев экологического мониторинга природных популяций.

Результаты работы имеют фундаментальное значение в плане выяснения особенностей и закономерностей клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов в условиях хронического воздействия факторов техногенной природы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), 2-м Международном симпозиуме по проблемам саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма (Чолпон-Ата, 1995), Международной конференции по загрязнению окружающей среды (Санкт-Петербург, 1995), межлабораторном научном семинаре НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 170 стр. машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы - 1 глава, характеристики материала и методов исследования - 1 глава, собственных исследований - 3 главы, обсуждения полученных результатов - 1 глава, выводов и списка литературы (250 источников). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 42 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика исследованного материала. Анализ морфофункционального состояния печени мышевидных грызунов проводили в трех районах Алтайского края. Участки отлова животных различались по уровню техногенного загрязнения: два района - Угловский и Локтевский - располагались в зоне прохождения радиоактивных облаков от атмосферных ядерных взрывов на Семипалатинском полигоне и на протяжении ряда лет (с 1949 по 1962 г.) подвергались радиационному загрязнению (Киселев В.И. и др., 1994).

В Локтевском районе животных отлавливали в окрестностях с.Новенское (плотность загрязнения по 137Cs составила 105 мКи/км2). В Угловском районе для отлова были выбраны окрестности сел Топольное и Лаптев Лог (содержание 137Cs в почве более 158 мКи/км2) (Силантьев А.Н. и др., 1993). Кроме того, значительный вклад в экологическую обстановку Лок-тевского района вносит интенсивное развитие горнорудной промышленности и накопление вследствие этого в почве большого количества тяжелых металлов и их солей (Ядерные испытания..., 1993). Третий участок отлова - окрестности населенного пункта Ключи (Тюменцевский район) был взят в качестве района сравнения.

Влияние высокого уровня экологической напряженности изучали на двух видах мышевидных грызунов: лесйой мыши Apodemus sylvaticus и обыкновенной полевки Microtus arvalis. Всего отловлено 234 грызуна: лесных мышей - 171, полевок -63.

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Для гистологического исследования образцы печени из большой доли фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали по стандартной методике для получения парафиновых срезов. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, ставили PAS-реакцшо.

Для электронно-микроскопического исследования образцы печени размерами не более 1 мм3 первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегида (Уикли Б., 1975; Dykstra M.J., 1992), затем постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и после дегидратации заливали в смесь эпона и аралдита для получения полутонких и ультратонких срезов. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II, ставили PAS-реакцию. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB III и после контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе JEM 100С при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Для электронно-микроскопического и количественного морфологического анализа использовали печень половозре-

лых самцов (возрастная группа аёиШи), не пораженную гельминтами.

Методы морфометрического и стереологического анализа.

Морфометрический анализ включал определение абсолютной и относительной массы печени мышевидных грызунов по возрастным группам в каждом районе обследования.

Кариометрический анализ гепатоцитов проводили на полутонких срезах. Диаметр ядер гепатоцитов измеряли с помощью окулярного микрометра МОВ-1-15х в световом микроскопе МБИ-11. В каждой экспериментальной группе (один район обследования) оценивали по 1000 ядер гепатоцитов.

Для выделенных в результате параметрического анализа подсовокупностей (в каждом размерном распределении) определяли их численность и статистические параметры. Объемы ядер вычисляли на основании сферической модели. На основании совпадения кратности изменения объемов и плоидности ядер гепатоцитов (Бродский В .Я., Урываева И.В., 1981) производили установление плоидности каждой подсовокупности гепатоцитов.

Для каждого района обследования вычисляли также соотношение одно- и двуядерных гепатоцитов (на 1000 клеток для каждого района).

Тканевый стереологический анализ проводили на полутонких срезах с помощью многоцелевой тестовой системы, состоящей из коротких отрезков (Непомнящих Л.М. и др., 1984; Weibel Е.Я., 1969). Оценивали объемную и поверхностную плотность гепатоцитов, их ядер, синусоидальных гемо-капилляров, эндотелиальных клеток, а также клеток, волокон и основного вещества соединительной ткани. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные: поверхностно-объемные отношения основных тканевых компонентов печени, объемные и поверхностно-объемные отношения гемокапилляров к гепатоцитам и объемное отношение стромы к паренхиме.

Ультраструктурный стереологический анализ гепатоцитов проводили на негативах при конечном увеличении в 30000 раз (первоначальное увеличение - 10000). Оценивали объем-

ную плотность митохондрий, гранулярной эндоплаз-матической сети (ЭС), гладкой ЭС и цитоплазмы (сюда включали гликоген, липидные капли, лизосомы, собственно цитоплазматический матрикс), а также поверхностную плотность митохондрий и мембран гранулярной и гладкой ЭС. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные - объемные и поверхностно-объемные отношения основных ультраструктур.

Количественные данные обрабатывали с помощью методов математической статистики (Урбах В.Ю., 1963); средние значения сравнивали по критерию Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Масса тела у животных обоих видов из разных районов существенно не различалась, в то время как относительная масса печени у лесных мышей из экологически неблагополучных районов была уменьшена, а у полевок - увеличена (табл. 1).

Гистостереологический анализ печени мышевидных грызунов. У лесных мышей и обыкновенных полевок, отловленных в Тюменцевском районе, микроскопическое строение печени было близко к нормальному. Гепатоциты формировали балочные структуры и в основном равномерно окрашивались кислыми красителями; единичные клетки с эозино-фильной цитоплазмой встречались, как правило, вблизи портальных трактов. Гликоген выявлялся преимущественно в гепатоцитах, расположенных по периферии долек. У некоторых животных в гепатоцитах отмечались мелкие липидные включения. Нарушения гемодинамики зарегистрированы у отдельных животных.

Наиболее значительные изменения в микроскопическом строении печени обнаружены у животных обоих видов, отловленных в Локтевском районе, для которого характерно комплексное влияние факторов радиационной и химической природы. У большинства грызунов отмечалась выраженная гетерогенность гепатоцитов, обусловленная наличием клеток

Таблица 1. Масса тела и печени половозрелых особей мышевидных грызунов из разных районов Алтайского края (М ± ш)

Показатель _Районы обследования_

Тюменцевский Локтевский Угловский Лесные мыши

Масса тела, г 17.4 + 0.7 17.4 + 0.5 17.7 ±0.4

Масса печени, г 0.90 ± 0.05 0.82 + 0.04 0.86 ± 0.03

Относительная

масса печени, иг/г 52.2 ± 2.0 47.3 ± 1.7 49.0 ± 1.3

Полевки обыкновенные

Масса тела, г 28.2 ± 2.3 22.7 ± 2.2 30.3 ± 1.7

Масса печени, г 1.2 ±0.3 1.2 ±0.2 1.4 ±0.2

Относительная

масса печени, иг/г 42.6 ± 4.7 52.9 ± 5.7 47.4 ±6.5

с интенсивно эозинофильной цитоплазмой, расположенных преимущественно вблизи центральных вен, и клеток с обширными просветленными участками, регистрируемых чаще по периферии долек. В последних при постановке РАБ-реакции примерно у 30% животных наблюдались мощные отложения гликогена. Следует отметить, что в таких гепатоцитах ядро и цитоплазматические органеллы занимали незначительную часть клетки, а тинкториальные свойства гликогена были изменены - наблюдалась менее интенсивная РА8-положи-тельная окраска хлопьевидной цитоплазмы. У части животных (примерно в 30% случаев) в гепатоцитах регистрировались липидные включения, число и размеры которых возрастали по направлению к периферии долек.

У 40% полевок и 65% лесных мышей наблюдались нарушения гемодинамики - синусоидальное и венозное полнокровие. В некоторых случаях регистрировался лимфостаз и умеренный перипортальный склероз. Примерно у 30% животных отмечалась инфильтрация портальных трактов мононук-леарами, иногда значительная.

Общий характер морфофункциональных изменений печени, выявленных у мышевидных грызунов из Угловского

района, был таким же, как и в предыдущей группе, но выраженность отдельных изменений была иной. Гетерогенность гепатоцитов регистрировалась примерно у 40% животных. При этом значительные отложения гликогена выявлялись у трети животных, но его распределение по клетке было более равномерным, а тинкториальные свойства мало изменены. Примерно у трети лесных мышей обнаружены митозы гепатоцитов. Нарушения гемодинамики регистрировались у половины животных. Чаще (в 60% случаев) отмечалась умеренная мононуклеарная инфильтрация портальных трактов.

Выявленные морфологические изменения носят неспецифический характер и были обнаружены в печени животных при токсических и ионизирующих поражениях, а также у мышевидных грызунов, обитающих вблизи Чернобыльской АЭС (Саркисов Д.С., Туманов В.П., 1990; Пинчук В.Г. и др., 1991; Шишкина Л.Н. и др., 1992).

По данным стереологического анализа, наиболее существенные изменения тканевой архитектоники печени обнаружены у лесных мышей из Локтевского района и полевок из Угловского и Локтевского районов.

У лесных мышей из Локтевского района была достоверно увеличена объемная плотность гепатоцитов при сравнении с животными из Тюменцевского и Угловского районов. Одновременно отмечено значительное уменьшение (на 30%) объемной плотности синусоидальных гемокапилляров. Поверхностная плотность этих структур снижалась не столь значительно, что обусловило достоверное увеличение (на 33%) поверхностно-объемного отношения синусоидов. Разнонаправленные изменения объемной плотности синусоидов и гепатоцитов вызвали достоверное снижение (на 30%) их объемного отношения (рис. 1); поверхностно-объемное отношение этих тканевых компонентов было уменьшено незначительно (на 9%).

У лесных мышей из Локтевского района отмечено также уменьшение объемной и поверхностной плотности клеток соединительной ткани (соответственно на 36 и 44%, Р < 0,01) и объемной плотности основного вещества и волокон соеди-

0.18 0.16 0.14 -0.12 -0.1 0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0

т

" Щ

Щщ

ш

Лесная мышь

□ Тюменцевский район ЕЗЛоктевский район ВУгловский район

Полевка обыкновенная

Рис. 1. Объемные отношения синусоидов к гепатоцитам в печени мышевидных грызунов. * - р < 0,05, ** - р < 0,01.

0.2 -г 0.18 -0.16 -0.14 0.12 + 0.1 0.08 + 0.06 0.04 0.02 + 0

Лесная мышь

Полевка обыкновенная

Рис. 2. Объемные отношения стромы к паренхиме в печени мышевидных грызунов. ** - р < 0,01.

нительной ткани (на 20%). В результате у них было достоверно уменьшено (на 31%) объемное отношение стромы к паренхиме (рис. 2).

Изменения пространственной организации тканевого микрорайона печени полевок из Угловского и Локтевского районов носили однонаправленный характер и заключались прежде всего в уменьшении объемной плотности синусоидов (соответственно на 24 и 19%). У полевок из районов с высоким уровнем техногенного загрязнения заметно возрастала объемная плотность эндотелиальных клеток (на 42 и 114%), а также клеток соединительной ткани (на 31 и 51%).

У этих же животных отмечено уменьшение объемной плотности основного вещества и волокон соединительной ткани (на 26 и 23%). Это обстоятельство и снижение объемной плотности синусоидов обусловили уменьшение объемного отношения стромы к паренхиме (на 24 и 18%) (см. рис. 2). Примерно в такой же степени было снижено объемное отношение синусоидов к гепатоцитам (соответственно на 28 и 21%) (см. рис. 1).

Таким образом, изменения тканевой архитектоники печени у мышевидных грызунов из районов со значительным уровнем техногенных загрязнений носили однонаправленный характер и проявлялись прежде всего в уменьшении объемных и поверхностно-объемных отношений синусоидов к гепатоцитам. Это обстоятельство в значительной степени обусловливало снижение объемного отношения стромы к паренхиме. Исключение в данном отношении составили лесные мыши из Угловского района, у которых основные стерео-логические показатели печени незначительно отличались от таковых у животных из района сравнения.

Выявленные различия в степени изменений тканевой архитектоники печени у мышевидных грызунов разных видов определяются в большей степени их экологической принадлежностью и пищевыми связями, а не разными таксономическими группами. Полевки обыкновенные, ведущие преимущественно норный образ жизни и употребляющие в пшцу, наряду с зеленым кормом и семенами, корневища и

прикорневые части растений (Бобринский H.A. и др., 1965; Громов И.М., Поляков И.Я., 1977), продолжают испытывать на себе более выраженное радиационное воздействие, поскольку именно в почвах в настоящее время содержится большая часть долгоживущих радионуклидов (137Cs и 90Sr) (Криволуцкий Д.А., 1985; Силантьев А.Н. и др., 1993). Другими словами, эти животные с большей вероятностью подвергаются внешнему и внутреннему хроническому облучению.

В отличие от полевок лесные мыши являются обитателями биотопов с древесной и кустарниковой растительностью и ведут активный образ жизни над поверхностью почвы (Аргиропуло А.И., 1940). В результате чего на них в настоящее время большее воздействие могут оказывать другие техногенные факторы, поступающие из атмосферы, в частности, химической природы. Возможно также, что в результате развития горнорудной промышленности в Локтевском районе происходит постоянный вынос радионуклидов из почв и загрязнение ими растительного покрова от оседающей пыли, что и обусловило значительную тканевую реорганизацию печени у лесных мышей из этого района. Популяции обоих видов грызунов характеризуются открытостью и неизолиро-вапностью, но для рода Microtus отмечается более низкая подвижность по сравнению с родом Apodemus (Лукьянов O.A., 1993).

Кариометрический анализ гепатоцитов. Анализ гистограмм размерного распределения ядер гепатоцитов у грызунов обоих видов выявил полимодальность распределения, которая обусловлена как неоднородностью клеточной популяции вследствие полиплоидизации, так и присутствием на срезах различных профилей ядер, относящихся к одному размерному классу.

Методами математической статистики в популяции гепатоцитов лесных мышей выделено четыре субпопуляции, характеризующие ядра с 2, 4, 8 и 16 наборами хромосом (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что влияние комплекса техногенных факторов не вызывает существенного изменения диаметра ядер гепатоцитов лесных мы-

Таблица 2. Результаты кариометрического анализа популяции гепатоцитов мышевидных грызунов

Показатель

Диаметр ядер, мкм 2п 4п 8п 16п

Число ядер, %о 2п 4п 8п 16п

Число клеток, °/оо одноядерных двуядерных

Диаметр ядер, мкм 2п 4п 8п

Число ядер, %о 2п 4п 8п

Число клеток, %о одноядерных двуядерных

Районы обследования

Тюменцевский Локтевский Угловский

Лесные мыши

5.07 ± 0.05 6.50 ± 0.02 8.05 ± 0.03 9.27 ± 0.04

113 513 321 53

849 ±5 151 ±5

5.16 ±0.04 6.52 + 0.02 8.00 + 0.02 9.66 ± 0.08"

80 397 460 63

866 ±9 134 + 9

Полевки обыкновенные

4.79 ± 0.04 6.22 ±0.02 7.97 ± 0.04

138 650 212

859 ±6 141 ±6

4.85 ±0.03 6.01 ±0.02 7.70 ± 0.05

217 679 104

877 ±8 123 ±8

5.16 ±0.04 6.51 ±0.02 8.00 ±0.03 9.50 ± 0.06*

92 468 375 65

865 ±5 135 ±5

4.92 ±0.04 6.17 ±0.02 7.79 ± 0.06

133 775 92

862 ±8 138 ±8

Примечание. * - р < 0,05, ** - р < 0,01.

шей, относящихся к одному размерному классу, за исключением ядер с 16 наборами хромосом: отмечено небольшое, но достоверное увеличение среднего диаметра ядер у животных из Локтевского и Угловского районов (соответственно на 4 и 2 %).

У лесных мышей из Локтевского и Угловского районов выявлено преобладание в популяции гепатоцитов клеток с высокоплоидными ядрами: число 16п ядер увеличено соответственно на 19 и 23 %, 8п ядер - на 43 и 17 %, по сравнению с животными из Тюменцевского района.

В популяции гепатоцитов полевок обыкновенных выделено три субпопуляции, характеризующие ядра с 2, 4 и 8 наборами хромосом (см. табл. 2). У животных из экологически неблагоприятных районов выявлен сдвиг гистограмм размерного распределения ядер гепатоцитов в область меньших значений. Так, у полевок из Локтевского района число 2п и 4п ядер было увеличено на 57 и 4 %, соответственно, а в Углов-ском - число 4п ядер увеличено на 19 %.

Следует подчеркнуть, что у мышевидных грызунов обоих видов, несмотря на разнонаправленность изменений плоид-ности гепатоцитов по районам, обнаружена корреляция между увеличением числа высокоплоидных гепатоцитов и снижением массы печени (см. табл. 1 и 2).

В районах с высоким уровнем антропогенных загрязнений наблюдалось также снижение числа двуядерных гепатоцитов: у лесных мышей - на 11 %, у полевок обыкновенных -на 2 и 13 % (соответственно в Угловском и Локтевском районах).

Феномен полиплоидии по-разному трактуется в современной литературе - и как особая геномная мутация (Гильяно Н.Я., Малиновский О.В., 1984), и как специфическая форма регенерации (Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981). Усиление полиплоидизации гепатоцитов обнаружено при различных поражениях печени, в частности и при радиационных (Гильяно Н.Я. и др., 1988; Москалев Ю.И., 1989). Считается, что полиплоидные клетки более радиорезистентны, а феномен полиплоидизации представляет собой неспецифический меха-

низм защиты на тканевом уровне (Календо Г.С., 1993). При этом степень полиплоидизации гепатоцитов отражает напряженность регенераторных процессов и коррелирует с силой повреждающих воздействий.

В изученных популяциях мышевидных грызунов выявлена различная направленность изменения плоидности гепатоцитов, что может отражать как видовые особенности в организации регенераторных процессов на клеточном уровне, так и различный характер воздействия техногенных факторов на исследуемые клеточные популяции.

В области высоких доз нарастание средней плоидности гепатоцитов с увеличением дозы ионизирующего облучения сравнимо с таковой в процессе естественного старения (Гильяно Н.Я., Малиновский О.В., 1984). Однако показано, что усиление плоидности гепатоцитов в процессе старения, в частности у крыс, наблюдается до определенного возраста. Так, у 24-месячных крыс начинает проявляться другая тенденция - уменьшается число клеток с высокоплоидными ядрами и возрастает число клеток с диплоидными ядрами (Рябинина З.А., 1964). С этих позиций, снижение плоидности гепатоцитов у полевок из экосистем со значительным уровнем техногенных загрязнений можно рассматривать как феномен своеобразного "популяционного старения".

Экспериментально установлено, что регенерирующая печень утрачивает одну из своих важнейших функций - метаболизм токсических веществ (Саркисов Д.С., Туманов В.П., 1990). Поскольку полиплоидизация - процесс необратимый (Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981), и постоянная стимуляция гепатоцитов приводит к их дальнейшей полиплоидизации, то постепенно в печени лесных мышей преобладающей становится популяция гепатоцитов с ослабленной или инги-бированной детоксикационной функцией.

Выявленные различия в уровнях плоидности гепатоцитов у мышевидных грызунов из экосистем, подвергающихся техногенным загрязнениям, показывают, что на основании только этого морфофункционального критерия нельзя судить об интенсивности антропогенных воздействий. Требуется ком-

плексная оценка происходящих изменений на всех уровнях структурной организации.

Внутриклеточная организация гепатоцитов мышевидных грызунов из природных экосистем. Ультраструктура большинства гепатоцитов грызунов обоих видов, отловленных в Тюменцевском районе, в основном соответствовала таковой у других мелких грызунов (Алексеев В.А., Сечина Н.П., 1984; Калашникова М.М., Смирнова О.В., 1991). В умеренно плотной цитоплазме хорошо различались цистерны гранулярной ЭС, полиморфные митохондрии, везикулы гладкой ЭС; практически во всех клетках встречался хорошо развитый пластинчатый комплекс Гольджи. При этом митохондрии располагались в серединных зонах клеток и были наиболее многочисленными на синусоидальном пошосе. Гликоген был представлен в а-форме и в основном равномерно распределялся по клетке. В гепатоцитах полевок, чаще чем у лесных мышей, регистрировались липидные капли различных размеров; иногда отмечались их частичное истощение и мембранная трансформация. Эндотелиоциты синусоидов были преимущественно электронно-плотными, фенестрирован-ными; в просветах синусоидов и перисинусоидально часто встречались клетки Купфера.

У мышевидных грызунов из Локтевского и Угловского районов ультраструктурные изменения гепатоцитов проявлялись прежде всего в своеобразном гипергликогенозе - мощных отложениях гликогена в а-форме, которые занимали большую часть клеток. Электронная плотность гликогена была уменьшена, при этом часто отмечалась его секвестрация, а также очаговый или диффузный лизис. Остальные органеллы в таких гепатоцитах были как бы сжаты, сконденсированы, из-за чего их электронная плотность была увеличена. Наблюдалось перераспределение органелл по клетке - митохондрии и окружающие их цистерны гранулярной ЭС чаще располагались вблизи ядра или по периферии клеток. Следует отметить, что у грызунов из Локтевского района подобные изменения были более выраженными; в некоторых случаях наблюдался практически тотальный лизис гликогена с образованием

"пустых" пространств, в которых различались единичные ветвистые частицы р-гликогена. У животных обоих видов встречались гепатоциты, в цитоплазме которых содержались преимущественно везикулы гладкой ЭС и немногочисленные митохондрии, в результате чего цитоплазма таких клеток приобретала ячеистый вид.

Следует отметить, что в гепатоцитах грызунов из районов с высоким уровнем антропогенных загрязнений регистрировались ультраструктурные признаки снижения белоксинтези-рующей функции: сегрегация ядрышек на фибриллярную и гранулярную компоненты, редукция гранулярной и гладкой ЭС, а также пластинчатого комплекса Гольджи. Наблюдалось усиление процессов аутофагии с образованием остаточных телец (миелиноподобных структур), которые выводились в пространство Диссе и затем появлялись в просветах синусои-дов. На билиарном полюсе клеток часто встречались вторичные лизосомы с включениями липофусцина. Желчные капилляры, как правило, были расширены, в них регистрировались осмиофильные мембранные структуры.

В просветах синусоидов встречались клетки Купфера и лимфоциты, перисинусоидально - фибробласты, но у животных из Локтевского района число этих клеток было уменьшено. В пространстве Диссе между микроворсинками гепато-цитов иногда различались небольшие пучки коллагеновых волокон.

Стереологический анализ выявил в основном одинаковую направленность изменений количественных характеристик органелл гепатоцитов у мышевидных грызунов обоих видов из районов со значительным уровнем антропогенных загрязнений. В наибольшей степени изменялись количественные показатели митохондрий и гранулярной ЭС. У лесных мышей из Локтевского и Угловского районов объемная плотность митохондрий была уменьшена соответственно на 33 и 29% по сравнению с животными из Тюменцевского района, а у полевок - соответственно на 46 и 37% (рис.3). Поверхностная плотность митохондрий уменьшалась примерно в такой же степени, что способствовало сохранению их поверхностно-

450 у 400 -350 300 250 200 150 100 50 0

-- т

-- п

и

Т

Лесная мышь

Полевка обыкновенная

□ Тгоменцевский район □ Локтевский район ЕЗУгловский район

Рис. 3. Объемная плотность (мм3/см3) митохондрий в гепато-цитах мышевидных грызунов. * - р < 0,05.

80 т

70 60 + 50

40 + 30 20 -10 -0

Лесная мышь

Полевка обыкновенная

Рис. 4. Объемная плотность (мм3/см3) гладкой эндоплазма-тической сети. * - р < 0,05, ** - р < 0,01.

объемного отношения.

У лесных мышей из экологически неблагополучных районов отмечено снижение объемной (в среднем на 32%) и поверхностной (в среднем на 25%) плотности гранулярной ЭС. В то время как у полевок уменьшение (на 29%) объемной плотности гранулярной ЭС зарегистрировано только в Лок-тевском районе. Поверхностная плотность гранулярной ЭС в гепатоцитах полевок, наоборот, была увеличена (на 27 и 62% соответственно у животных из Локтевского и Угловского районов), что способствовало увеличению поверхностно-объемного отношения (соответственно на 44 и 50%) этого внутриклеточного компартмента.

У грызунов обоих видов значительно были уменьшены количественные показатели гладкой ЭС (рис. 4). У лесных мышей из Локтевского и Угловского районов объемная плотность гладкой ЭС была достоверно снижена соответственно на 66 и 56%, а поверхностная - на 48 и 13%. У полевок объемная плотность гладкой ЭС уменьшалась соответственно на 42 и 56%, а поверхностная плотность - на 54% у животных в обоих районах.

Заметно возрастала у грызунов из экологически неблагополучных районов объемная плотность цитоплазмы (в среднем на 30%) у лесных мышей и на 40% у полевок). Следует отметить, что увеличение этого показателя было обусловлено в основном увеличением объемной плотности гликогена, которая составляла от 30 до 50% от объемной плотности цитоплазмы. У животных из района сравнения на долю гликогена приходилось от 5 до 10% объема цитоплазмы.

Пропорциональное уменьшение объемной плотности митохондрий и гранулярной ЭС в гепатоцитах лесных мышей из экосистем, подвергнутых значительной антропогенной трансформации, способствовало сохранению объемного отношения этих компартментов. В то время как более значительное снижение объемной плотности митохондрий в гепатоцитах полевок вызывало снижение объемного отношения митохондрий к гранулярной ЭС на 42%.

Анализ объемного отношения митохондрий и гладкой ЭС

выявил, наоборот, значительное увеличение этого параметра у лесных мышей из экологически неблагополучных районов (соответственно в 2 и 1,6 раза в Локтевском и Угловском районах), что свидетельствует о более выраженном уменьшении объемной плотности гладкой ЭС. У полевок объемное отношение митохондрий к гладкой ЭС было увеличено (в 1,4 раза) только в Угловском районе.

Параллельно у животных обоих видов отмечено значительное увеличение (в 27 - 35 раз ) объемного отношения гликогена к митохондриям, что, вероятно, свидетельствует об изменении энергетического и углеводного обменов гепатоци-тов в рассматриваемых экологических условиях.

Накопление гликогена в гепатоцитах отмечено при некоторых наследственных заболеваниях (Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979; Струков А.И. и др., 1990), у больных хроническим гепатитом различной этиологии (вирусной, алкогольной, токсической) (Кудрявцева М.В., 1987), а также в экспериментальных условиях при избыточном потреблении фруктозы (Riede U.N., Sasse D., 1981). В гепатоцитах крыс, получавших фруктозу, обнаружено также значительное уменьшение объемной плотности митохондрий и гранулярной ЭС (Riede U.N. et al., 1975).

Пострадиационное увеличение содержания гликогена в печени и глюкозы в крови было показано в экспериментах по облучению организма в сублетальных и летальных дозах (Кендыш И.Н., 1974). На основании того, что экранирование печени при общем облучении не предотвращало гипергликемию. был сделан вывод о ведущей роли внепеченочных механизмов в реализации действия радиации на обмен углеводов, в частности гиперсекреции гшококортикоидов. Однако сравнительный анализ действия радиации и других стрессирую-щих факторов (охлаждения, гипоксии, введения адреналина) показал, что только облучение вызывает продолжительное и значительное увеличение концентрации углеводов в крови и печени.

В экспериментах с предварительным мечением тканей крыс 14С-глицином было показано, что после облучения

меченые субстраты накапливались в крови и печени, в которой происходила трансформация меченых метаболитов в гликоген. Эти данные рассматриваются как прямое доказательство активации глюконеогенеза из эндогенных метаболитов, появляющихся в крови в результате пострадиационной деструкции радиочувствительных тканей. Считается, что в механизме пострадиационного синтеза углеводов в печени первичным событием является глюконеогенез, посредством которого вторично стимулируется гликогенез (Кендыш И.Н., 1974).

Механизмы гипергликогенеза гепатоцитов при хроническом воздействии ионизирующего излучения в малых дозах не известны. Вероятно, в этих условиях стимуляция гликогенеза и глюконеогенеза или ингибирование гликолиза обусловлены в большей степени изменением функциональной активности соответствующих генов вследствие возможных изменений в конформационной структуре хроматина (Гераськин С.А., 1995).

Как правило, гликогенозы гепатоцитов сопровождаются перераспределением органелл в клетке, прежде всего митохондрии и гранулярной ЭС (Riede U.N., Sasse D., 1981). Подобное перераспределение органелл, например, локализация митохондрий вдоль латеральной и базалыюй плазматических мембран, наблюдалось и при других видах повреждений, в частности при аллергической альтерации гепатоцитов (Бархина Т.Г., Томилец В.А., 1984), что отражает некоторые общие закономерности реорганизации этих клеток при неблагоприятных воздействиях.

Выявленный феномен накопления большого количества гликогена и фундаментальной пространственной реорганизации гепатоцитов у мышевидных грызунов из экосистем со значительным уровнем антропогенных загрязнений представляет собой, вероятно, как наследственно закрепленные изменения, так и реакцию на персистирующие неблагоприятные факторы физической и химической природы.

выводы

1. Хроническое воздействие техногенных факторов на природные популяции лесной мыши и обыкновенной полевки вызывает комплекс морфофункциональных изменений в печени, которые затрагивают все уровни структурной организации: органный, тканевый, клеточный и внутриклеточный. При этом характер и выраженность тканевых и внутриклеточных изменений определяются экологической принадлежностью и не зависят от таксономической группы. Изменения на органном и клеточном уровне видоспецифичны.

2. В печени мышевидных грызунов в условиях хронического воздействия антропогенных факторов развиваются стереотипные морфофункциональные изменения - выраженные дистрофические изменения гепатоцитов и нарушения гемодинамики в виде венозного и синусоидального полнокровия. Выраженность морфофункциональных изменений коррелирует с интенсивностью антропогенных загрязнений.

3. Общим принципом тканевой реорганизации печени мышевидных грызунов из районов, подвергнутых антропогенной трансформации, является уменьшение объемного и поверхностно-объемного отношения синусоидов к гепатоци-там и снижение объемного отношения стромы к паренхиме.

4. В популяции гепатоцитов мышевидных грызунов из экологически неблагополучных районов реализуются разные (видовые) стратегии клеточной регенерации: у лесных мышей усиливается полиплоидизация гепатоцитов (возрастает доля клеток с 8п и 16п ядрами), у обыкновенных полевок плоид-ность гепатоцитов уменьшается (возрастает доля клеток с 2п и 4п ядрами). Общей закономерностью клеточной регенерации у грызунов обоих видов является уменьшение числа двуя-дерных гепатоцитов.

5. Усиление полиплоидизации гепатоцитов у лесных мышей из экологически неблагополучных районов коррелирует с уменьшением у них относительной массы печени; у обыкновенных полевок снижение плоидности гепатоцитов сопровождается увеличением относительной массы печени.

6. Ультраструктурные изменения гепатоцитов мышевидных грызунов обоих видов из экологически неблагополучных районов носят стереотипный характер и проявляются, прежде всего, в гипергликогенозе и существенном перераспределении органелл в клетке. Одновременно в гепатоцитах регистрируются ультраструктурные признаки снижения белоксинтези-рующей функции: редукция гранулярной и гладкой эндоплаз-матической сети и пластинчатого комплекса Гольджи, усиление процессов аутофагии.

7. Закономерностью внутриклеточной пространственной реорганизации гепатоцитов мышевидных грызунов в условиях хронического воздействия антропогенных загрязнений является значительное снижение (более чем на 30%) объемной плотности митохондрий, гранулярной и гладкой эндоплазматической сети. При этом изменения объемной плотности основных органелл гепатоцитов носят преимущественно непропорциональный характер.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сравнительный анализ популяции гепатоцитов у мышевидных грызунов из районов с разными экологическими условиями // 2-й съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1995. - Ч. 2. - С. 300 - 301 (соавт. Е.Л.Лушникова).

2. Гистостереологический анализ печени лесных мышей из районов с различными экологическими условиями // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма: Материалы II Международ, симпоз. - Бишкек, 1995. - Ч. 1. - С. 116 - 117 (соавт. ЕЛ.Лушникова).

3. Morphofunctional status of hepatocytes of wild rodents from the regions with difierent levels of anthropogenic pollution // ICEP'95 and ICONE'95. - St. Petersburg, 1995. - P. 149 (соавт.: E.L.Lushnikova, L.M.Nepomnyashchikh).

4. Кариометрический анализ популяции гепатоцитов лесных мышей из районов с разным уровнем техногенного за-

грязнения // Бюл. экспер. биол. - 1996. - N 2. - С. 223 - 227 (соавт. Л.М.Непомнящих).

5. Ультраструктурная реорганизация гепатоцитов мышевидных грызунов из экосистем с различной антропогенной модификацией // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1996. - С. 83.

6. Гистостереологический анализ печени мышевидных грызунов из районов с неблагоприятными экологическими условиями // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 1996. - С. 84 (соавт. Н.В.Ащеулова).

Соискатель •">'пР/жу О.П.Молодых

Подписано в печать 12.01.96 г. Формат бумаги 60x84/16

Печ. л. 1,0. Заказ N 17 . Тираж 100 экз. Оригинал-макет подготовлен в редакционно-издательском отделе НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН. Редактор- корректор Н.Ащеулова.

Типография СО РАМН, 1996 г. 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2