Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфологические особенности заживления кожных ран у крыс в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

; " Я Л "

9 И ЮЛ 1Я97 На правах рукописи

УДК 616.5-001. 4-08:546. 33. 131. 001. 6

КОВАЛЕВ Алексей Вячеславович

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЖИВЛЕНИЯ КОЖНЫХ РАН У КРЫС В 0,9%-ком ВОДНОМ РАСТВОРЕ

ХЛОРИДА НАТРИЯ (экспериментальное исследование)

14.00.23 —гистология, цитология и эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва —1997

Работа выполнена в Ивановской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор П. П. Иванищук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е. А. Ефимов, доктор медицинских наук Н. П. Омельяненко.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится 26 июня 1997 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 001.04. 01 НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН.

Автореферат разослан 20 мая 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к?шд. биол. наук

ЕМЕЛЬЯНЕНКО И. Н,

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Заживление ран является важнейшей общебиологической, медицинской и даже социальной проблемой (ЕЕСеров, А. В. Шехтер,1981).

, Изменение внешних условий над раневой поверхностью может вести к ускорению или замедлению процесса заживления кожной раны (Ю.Ф.Исаков и др. ,1990).

В связи с совершенствованием методов по поддержанию асептики во время лечения ран, возникло представление о среде, благоприятной для заживления ран (Б. М. Костюченок, К А. Карлов, 1990). Подбор оптимальных физических параметров среды для лечения ран имеет большое значение для медицины.

Восстановительные процессы связаны с состоянием клеток и тканей в области повреждения. Экспрессия генов, функциональная активность, дифференцировка, пролиферация и чувствительность к цитоки-нам клеток зависят от особенностей их микроокружения (М. 5. АсЫск, Н. Р. Ьогепг:,1994; .ЬбаИН, Я. А. Р. С1агк,1994). Изменение микроокружения клеток может стимулировать регенерацию, и именно такой подход позволяет достигать наибольших успехов в повышении регенераци-онной способности у позвоночных (Б. Карлсон, 1986).

Для низших позвоночных, ведущих водный образ жизни, характерно безрубцовое заявление наружного покрова после его травматических повреждений .(Е. А. Ефимов, 1975). Эта способность менее характерна для млекопитающих, ведущих наземное существование. При этом влияние агрегатного состояния среды, постоянно контактирующей с раневой поверхностью, на различные исходы регенерации кожи не изучалось.

Следует отметить, что восстановление наружного покрова у млекопитающих не всегда- заканчивается формированием соединительнотканного рубца, полноту посттравматической регенерации кожи теплокровных варьирует в зависимости от локализации раневого дефекта и вида животного (Е. А. Ефимов, 1993). Местное механическое и хими-

ческое воздействие способствует формированию органотипичных регенератов ( Т. К Крутова, Е. А. Ефимов, Д. Б. Кормак, 1084; Е. А. Ефимов, Т. В. Букина, 1990), что имеет большое практическое значение.

Учитывая, что смоченные физиологическим раствором салфетки предупреждают некрозы обнаженных анатомических образований во время операций (ЯЗолтан, 1986), 0,92-ный раствор натрия хлорида не обладает раздражавшим действием на ткани (М. Д. Машковский, 1993) и промывание таким раствором гнойных ран используется.в лечебных целях (А. И Красильников, 1995), этот раствор был выбран нами в качестве жидкой среды, в которую помещалась раневая поверхность до полной зпителизации.

Несмотря на большой опыт местного использования физиологического раствора натрия, хлорида в хирургии, морфология раневого процесса в условиях постоянного нахождения раневой поверхности дефектов кожи у млекопитающих в водном 0,9%-ном растворе натрия хлорида не изучалась.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования явилось изучение морфологических особенностей заживления послеоперационных пол-нос дойных, неосложненных инфекцией, кожных дефектов у крыс в условиях постоянного нахождения раневой поверхности в 0,9Х-ном водном стерильном апирогенном растворе натрия хлорида. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- разработать методики, обеспечивающие постоянное нахождение раневой поверхности в жидкой среде, с момента нанесения повреждения' до полной зпителизации дефекта, при его расположении на различных учаетн&х тела крысы;

- изучить особенности процесса зпителизации и изменения соотношения содержания одно- и двухспиральных нуклеиновых кислот в зпидермоцитах базального слоя в динамике заживления кожного дефекта при нахождении раневой поверхности в изотоническом растворе натрия хлорида;

- выявить морфологические особенности формирования грануляционной ткани и регенератов кожи в ходе заживления ран в 0,9%-ном

- 5 -

водном растворе натрия хлорида;

- исследовать влияние жидкой среды на полноту восстановления кожи у крыс с учетом локализации дефекта (на боковой поверхности туловиша. на дорсальной стороне и кончике хвоста);

- оценить возможность адаптации организма к повреждению, сопровождающемуся утратой части наружного покрова, и сохранения жизнеспособности тканей путем помещения раневой поверхности в 0,92-ный водный раствор хлорида натрия до полного заживления раны.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Диссертация является законченной научно-исследовательской работой, содержащей новое решение актуальной научной задачи, состоящей в комплексном анализе основных морфологических процессов, происходящих при заживлении кожных ран у крыс в жидкой среде. Проведенное исследование позволило впервые:

- разработать методики, обеспечивавшие длительное, круглосуточное, нахождение раневой поверхности при травматических дефектах кожи у млекопитающих в жидкой среде ln vivo;

- обнаружить, что у млекопитающих (крыс) в жидкой среде эпи-телизация полнослойного дефекта кожи (1,0x0,5 см) осуществляется путем напЬлэания эпителиального пласта на кровяной сгусток, который в последующем замещается соединительной тканью;

- выявить стимулирующее влияние изотонического водного раствора натрия хлорида на процессы эпителизации поверхности травматического дефекта кожи, обусловленное повышением синтетической активности базальных эпителиоцитов;

■ - установить с использованием количественных показателей, что процесс заживления кожного дефекта в условиях нахождения раневой поверхности в жидкой среде сопровождается усиленным развитием мик-роциркуляторного русла в грануляционной ткани и сформированном ре-гене pafe;

- показать, что длительное нахождение раневой поверхности заживающих ран в 0,9%-ном водном растворе натрия хлорида ведет к формированию регенератов кожного типа у лабораторных крыс;

- обнаружить, что омывание раневой поверхности жидкой средой

позволяет адаптировать организм к потере части наружного покрова и способствует проявлению регенерационной способности.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.- Данные об особенностях течения и исходах раневого процесса у млекопитающих (крыс) в условиях постоянного нахождения,раневой поверхности (до полной эпителиэации) в стерильном 0,92-ном водном растворе натрия хлорида могут быть включены в учебные программы морфологических и клинических кафедр медицинских вузов и медицинских факультетов университетов.

Шлученные результаты могут быть положены в основу разработки способов управления репаративными процессами путем изоляции раневой поверхности в специальных камерах с жидкой средой, состав и свойства которой будут изменяться в ходе лечения в зависимости от характера повревдения, стадии раневого процесса и индивидуальных свойств организма Открываются перспективы разработки новых составов жидких сред и режимы их воздействия на раневую поверхность с целью облегчения адаптации к повреждению, сохранения »макеспособности, повышения биологической резистентности обнаженных структур и усиления регенерационной способности органов и тканей. Исследования в этом направлении, по нашему мнению, могут значительно расширить возможности медицины в плане полноценного восстановления анатомических структур после травм, послужить экспериментальной основой для разработки новых способов лечения открытых повреждений и дефектов наружного покрова в особых, благоприятных для регенерации; условиях жидкой среды.

Разработан "Способ стимуляции посттравматической частичной регенерации конечностей, хвоста и кожи у млекопитающих" (патент К £053775, приоритет от 20.10.90 г.), основанный на длительном воздействии 0,9£-ного водного раствора натрия хлорида на раневую поверхность, позволяющий повысить полноту регенерации биологических структур.

Предложен "Способ временного вакрытия и подготовки ран различной этиологии к кожной пластике у млекопитающих", заявка Д

94045447/14 (045434) от 27.12.94 г., положительное решение о выдаче патента от 19.10. 96 г.. Его использование основано на заключении раневой поверхности в изолирующую от внешней среды капсулу, постоянно заполненную заменяемым стерильным, иаотоничиым плазме крови, раствором поваренной соли, при этом удается сократить сроки лечения ран и добиться лучших функциональных и косметических результатов.

Разработано и апробировано 4 способа и 4 устройства, позволяющих обеспечить длительное непрерывное нахождение раневой поверхности в жидкой среде, стандартизировать исходное повреждение, получить более качественные и удобные для морфометрии гистологические срезы: "Способы герметичного крепления различных устройств к коже млекопитающих" (рац. предл. Я 2094 от 19.12.94 и К 2107 от 26.05.95), "Устройства для обеспечения длительного непрерывного нахождения раневой поверхности в жидкой среде" (рац. предл. Я 2096 от 20.12.94, Я 2097 от 21.12.94 и N 2117 от 23.10.95) ', "Способ обеспечения длительного непрерывного воздействия растворов на раневую поверхность при травматических дефектах кончика хвоста у новорожденных крысят" (рац. предл. К 2092 от 16.12.94), "Устройство для создания стандартных полнослойньк дефектов кожи" (рац. предложение К 2108 от 26.05. 95), "Способ взятия материала у лабораторных млекопитающих" (рац. предл. N 2106 от 25.05.95).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В стерильном 0,9%-ном водном растворе натрия хлорида эпи-телизация небольших дефектов наружного покрова у млекопитающих (крыс) осуществляется путем наполэаиия эпителиального пласта на кровяной сгусток на дне раны, который затем замещается соединительной тканью. Наличие такой же последовательности течения процесса заживления ран у низших позвоночных, ведущих водный образ жизни, указывает на реализацию у крыс в условиях жидкой среды филогенетически более древнего способа посттравматической регенера-

ции наружного покрова.

2. Постоянное нахождение раневой поверхности в жидкой среде до полной эпителизации оказывает стимулируюшее влияние на течение восстановительных процессов у лабораторных крыс и ведет к органо-типической регенерации кожи с образованием ее производных (сальные железы, волосы).

3. Условия , постоянного нахождения раневой поверхности в 0,9%-ном водном растворе натрия хлорида позволяют адаптировать организм к утрате части наружного покрова, что способствует проявле- ' нию регенерационной способности у крыс.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Ивановского общества травматологов и ортопедов (Иваново, 1092), на научной конференции "Гистогенез и регенерация тканей" (Санкт-Петербург,1995) , на 3-й Всероссийской.научной конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных'Ч Волгоград, 1995), на республиканской научно-практической конференции "Актуальные вопросы патологической и нормальной морфологии" (Ижевск,1995), на научной конференции молодых ученых ИГМА (Иваново,1996), на научном совещании "Гистогенетический анализ изменчивости и регенерация тканей" (Санкт-Петербург,1997), на научной межкафедральной конференции ИГМА (Иваново, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 2И страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), главы II, содержащей характеристику материалов и методов исследований, главы III, с описанием собственных исследований, и главы IV, в которой приводится'обсуждение полученных результатов. Диссертация заканчивается ваюиочением и выводами, а также прилагается список литературы, который состоит из 3$С> источников. Из них 187 - отечественных и 163 - зарубежных авторов. Текст иллюстрирован и документирован 80 световыми и 88 сканируют«-■

ми электронными микрофотографиями, 5 таблицами, 10 графиками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использованы 302 белые беспородные крысы. Из общего количества: 208 животных - половозрелые самцы, исходной массой 160-190 г, и 94 - крысята обоих полов в возрасте 1-2 дней.

В соответствии с целью и задачами исследования животные были разделены на 5 серий, в каждой из которых выделялись опытная и контрольная группы. Всем крысам одной серии наносились одинаковые полнослойные раневые дефекты кожи. В первой серии эксперимента - на боковой поверхности тела, размером 0,5x1,0 см; во 2-й - на дорсальной стороне хвоста, размером 0,5x1.0 см, на расстоянии 3 см от его основания; в 3-й серии создавался травматический дефект кончика хвоста; в 4-й - скальпированный циркулярный дефект кожи хвоста шириной 0,5 см; в 5-й серии - обширный дефект кожи на брюшной, спинной и боковых сторонах тела, составляющий 20-22% от обшей площади наружного покрова. После операции раневая поверхность у особей опытных групп заключалась, до полной ее эпителизации, в изолирующую от внешней среды камеру, заполненную стерильным, апи-рогенным,' изотоничным 0,9%-ным водным раствором натрия хлорида Смена раствора проводилась 2-4 раза в сут до полной эпителизации дефекта. При каждой смене жидкости полость капсулы промывалась физиологическим раствором. В пятой серии раневая поверхность находилась в жидкости в течение 7 сут.

В контрольной группе животных раневая поверхность не изолировалась от внешней среды и заживление происходило под струпом.

Все хирургические манипуляции производились под нембуталовым наркозом в условиях асептики. Забой животных осуществлялся в утренние часы (11.00-12.00 час) на 1,2,3, 4,5,8,12,30 и 60 сут путем передозировки эфирного наркоза. Во время проведения эксперимента соблюдались "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ Минвуза СССР от 13.11.84 К 724).

' Для светооптического анализа полученного экспериментального материала кусочки ткани с дефектом иссекали и фиксировали в забу-

ференном 101-ном нейтральном формалине или жидкости Карнуа. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации материал заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5 мкм на санном микротоме МРТУ 42, окрашивали гематоксилин-зозином и исследовали при помощи микроскдпов МБИ-6 и МЕИ-15.

На обзорных препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, измеряли с помощью окулярной линейки длину нарастающего эпителиального клина.' О выраженности посттравматического отека судили по кратчайшему расстоянию между верхним краем мышц брюшной стенки и Сазальной пластинкой эпидермиса края раны.

Выявление фибрина проводилось по способу Щуенинова.

Для цитоморфологического исследования грануляционной ткани и рубца готовили полутонкие срезы. Кусочки ткани сначала фиксировали в течение 2 часов в теплом (37 С°) 2,5Х-ном растворе глутарового альдегида, приготовленного на среде 199, а затем, после промывки, в IX-ном растворе четырехокиси осмия на 0,15 М натрий-кокадилатном буфере (рН 7,4), обезвоживали в этаноле восходящей концентрации, ацетоне и заливали в аралдит Ы (В. Е. Соколов и др., 1988).. Полутонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЬКВ-111. Для получения наиболее информативной картины препараты окрашивали методом двойной окраски метиленовым синим -азуром II и основным фуксином (ЕЕ. Соколов и др., 1988). На препаратах оценивали количественный состав клеток грануляционной ткани и рубца: число фибробластов, макрофа-• гов, тучных клеток, лимфоцитов и нейтрофилов. Для исследования использовали окулярную сетку С. Б. Стефанова, содержащую 10 квадратов со стороной 1 мм. Клетки подсчитьшались в 30 случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении хбОО. Данные количественного исследования рассчитывались на стандартную единицу плошдди измерительной сетки (Г. Н. Берченко, В. В. Берченко, 1986), а для тучных клеток ~ на 1 кв. мм площади среза.

Для количественной оценки микроциркуляторного русла в грануляционной ткани и рубце на парафиновых срезах определяли суммарную длину капилляров в одном кубическом миллиметре ткани (С.Ы. Блин-

ков, Г. Л. Моисеев, 1961).

Оценку синтетической активности клеток регенерирующего эпителия проводили, используя метод люминесцентной микроскопии, предложенный Rlgler (1966) в модификации Н. А. Карнауховой (1984). Парафиновые срезы после депарафинирования окрашивали акридиновым оранже-вьш и измеряли интенсивность люминесценции комплексов этого метах-роматического красителя с одно- и двухспиральными молекулами нуклеиновых кислот клеток базального слоя эпидермиса в области эпителиального клина или рубца с помощью люминесцентного микроскопа "ЛШАМ-ИЗ" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Окрашенные клетки люминесцируют с двумя максимумами излучения - в зеленой (530 нм) и красной (640 нм) областях спектра. При этом излучение с длиной волны 530 нм вызывают комплексы акридинового оранжевого с двухспиральными молекулами нуклеиновых кислот, а с длиной волны 640 нм -комплексы красителя с односпиральньгми молекулами. Показателем синтетической активности клеток служило отношение I 640/1 530,где I 640 - интенсивность люминесценции при 640 нм, I 530 - то же при 530 йм. .

Для изучения рельефа поверхности регенератов кожи, а тага® особенностей формирования волокнистых остовов новообразованной соединительной ткани использовали метод сканирующей электронной микроскопии (СЭЮ нативных препаратов (Я. Л Караганов и др. ,1986). Нативные препараты, высушенные путем перехода через критическую точку в СО^в аппарате "Hitachi" НСР-2 и подвергнутые ионному напылению палладия и платины в установке JFC, исследовали в сканирующем электронном микроскопе "Hitachi" S-405A.

Математическую обработку полученных результатов производили с помощью программ для микрокалькуляторов (Ю.И. Иванов, 0. Н. Пэгоре-люк,1990) и программы для статистической обработки результатов биологических исследований "Диалог" на компьютере типа IBM.

- 12 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние жидкой среды на процессы зпителизации и новообразования соединительной ткани после нанесения полнослойного дефекта кожи.

В 1 серии эксперимента установлено, что течение процесса заживления кожных дефектов в условиях омывания раневой поверхности изотоническим раствором натрия хлорида характеризуется слабо выраженной воспалительной реакцией. У крыс опытной группы, . в отличие от животных с заживлением ран под струпом, альтерация тканей в об- ' ласти краев и дна раневого дефекта менее выражена, нейтрофильная реакция угнетена и не образуется демаркационный лейкоцитарный вал, степень выраженности отека тканей края и дна раны достоверно ниже. Воспалительная реакция осуществляется главным образом макрофагами, что, как известно, стимулирует морфогенетические потенции Тканей СБ.Карлсон,1986). Выявленные нами особенности посттравматического воспаления в условиях постоянного нахождения раневой поверхности в растворе натрия хлорида нашли подтверждение в исследованиях К. Вгеитк и соавт. (1992).

, Меньшая выраженность лосттравыатического воспаления в ране у животных опытной группы, вероятно, обусловлена диффузией в жидкую среду биологически активных веществ, в том числе хеыоатрактантов и продуктов нарушенного обмена, которые удаляются из области повреждения при смене раствора.

Постоянное омывание раневой поверхности раствором ?едет в ускорению зпителизации кожного дефекта Так, полная эпителизация дефекта размером 1,0x0,5 см на боковой поверхности тела завершается у крыс опытной группы на 3,7±0,2 сут от момента повреждения, а у животных контрольной группы - на 6,740,4 сут. Различия в сроках зпителизации двух групп статистически достоверны с высоким уровнем значимости (р<0,001). Таким образом, сроки полной элители-вации небольших иолнослойных дефектов кожи (размерами 1,0x0,5 см) о иммобилизацией краев раны относительно ее дна, при прочих равных условиях, в жидкой среде на 45Х короче, чем при заживлении под

струттом. Определяя показатель синтетической активности базальных клеток регенерировавшего эпидермиса, нами было обнаружено, что в жидкой среде этот показатель достоверно выше в первые пять сут наблюдения и с 18 по 30 сут г после создания дефекта (р<0,05). Эти данные согласуются с результатами исследований Т. В. Ершовой с соавт. (1992). Повышение этого показателя в первые дни после операции, вероятно, отражает более раннее вступление в анаболический период раневого процесса клеток росткового слоя эпидермиса у крыс опытной группы.

Отсутствие струпа способствует быстрому наползанию эпителиального пласта на кровяной сгусток в дне раны, который при небольшом дефекте и иммобилизации края раны относительно ее дна в последующем замедается соединительной тканью. Такая последовательность процессов при заживлении ран характерна для низших позвоночных, ведущих водный образ жизни (Е. А. Ефимов, 1975). Для теплокровных, ведущих наземное существование, характерна иная последовательность течения процесса репарации ран под струпом, позволявшая лучше адаптироваться к повреждению в привычных условиях (Б. Карлсон, 1986). Однако, как показали наши исследования, постоянное (с момента повреждения) нахождение раневой поверхности в жидкой среде способствует реализации у крыс филогенетически более древней последовательности процессов при заживлении ран, свойственной Представителям надкласса Апастша

Эпителий, расположенный в условиях жидкой среды на замещаемом соединительной тканью фибриновом сгустке, образует,' в отличае от эпидермиса животных контрольной группы, два'типа выпячиваний: неглубокие, расположенные преимущественно по периферии, и немногочисленные глубокие, расположенные хаотично. Причем из последних, вероятйо, развиваются единичные кожные комплексы, позже обнаруживаемые в регенератах,кожи. Выпячивания эпидермиса сохраняются на протяжении всего периода наблюдений. С погружным ростом эпителия в пренатальном онтогенезе связано образрвание кожных дериватов (ЕЕ.Соколов и др. ,1988), поэтому появление способности к образо-

ваншо выпячиваний у регенерировавшего эпидермиса в жидкой среде расценивается наш как реализация морфогенетических потенций раневого эпидермиса в новых условиях.

Постоянное нахождение раневой поверхности в жидкой среде при посгтравмагических неосложненных полнослойных дефектах кожи не изменяет фазность течения раневого процесса, но динамика клеточных реакций имеет ряд особенностей. Установлено, что в первые 5 сут наблюдения в условиях изменения микроокружения абсолютное количество нейгрофилов в области повреждения у животных опытной группы' значительно ниже, чем у крыс контрольной группы: в конце 1 суп - в 2,7 раза (р<0,001), в конце 3 сут - в 2,2 раза (р<0,05). Причем максимальное количество нейгрофилов в условиях жидкой среды сохраняется в течение 2 сут с момента повреждения, тогда как при заживлении под струпом - не менее 3 сут. В этот же период раневого процесса увеличивается абсолютное количество макрофагов у.крыс опытной группы (к 3 сут - в 1,7 раэа, по сравнению' с контролем (р< 0,01)). Достижение максимальных значений числа макрофагов в области края ран, находящихся в растворе, наблюдается со 2 по 4 сут, а при заживлении под струпом - несколько позже - на 3-4 сут. В области дефекта в условиях жидкой среды происходило также достоверное увеличение числа фибробластов в период со 2 по 4 сут (более чем в 1^5 раза, по сравнению с контролем), далее различия исчезали. Таким образом, условия жидкой среды приводят к уменьшению • нейтрофильной инфильтрации, усилению макрофагальной реакции в стадию ' воспаления и ускоряют пролиферацию фибробластов. что способствует сокращению сроков заживления ран кожи.

В кожном' регенерате крыс опытной группы отмечаются более высокие значения абсолютных показателей количества тучных клеток и лимфоцитов (различия статистистически достоверны, р<0,05), причем для первых наибольшие различия выявлены в период с б по 8 сут, а для вторых - с 3 по 5 сут наблюдения.

По мнению НА. Юриной и АД Радостиной (1990), тучные клетки оказывает активное влияние на новообразование сосудов и неогенеа

волос. Более высокое содержание этих клеток, а также лимфоцитов в регенератах у животных опытной группы, вероятно, способствует полноте восстановления кожи у крыс. Известно, что лимфоциты контролируют процессы пролиферации и дифференцировки клеток (А. Г. Бабаева, Е. А-Зотиков, 1987), а изменение силы регулирующих воздействий лимфоцитов при колебании их количества могло явиться стимулом для реализации морфогенетических потенций при регенерации наружного покрова.

С расположением эпидермального пласта на кровяном сгустке в жидкой среде можно связать усиленное развитие микроциркуляторного русла в грануляционной ткани, его заметающей, и сформированном регенерате. Динамика изменений суммарной длины микроциркуляторного русла в грануляционной ткани и рубце в процессе заживления кожных ран во всех группах животных оказалась сходной: быстрое нарастание этого показателя через 3 сут после операции, достижение максимальных величин во . вторую стадию раневого процесса (между 5 и 8 сут после нанесения дефекта), затем плавное снижение до 30 сут. Соотношение показателей длины капилляров в исследуемых группах во все сроки наблюдений было постоянным: более высокие - в опытной группе животных. Наибольшие различия в степени развития микроциркуляторного русла у животных анализируемых групп отмечаются через 5 и 8 сут после нанесения дефекта. У крыс опытной группы к 60 сут наблюдения отмечалось достоверное (р<0,05) повышение значения показателя суммарной длины капилляров, по сравнению с крысами контрольной группы. По мнению Т. Е Букиной и Е. А. Ефимова (1991), большее количество капилляров в регенерате свидетельствует о большей степени полноты восстановления кожи.

Известно, что эпидермис обладает ангиогенной активностью Ь. Вагп1иП, Т. (?еап, 1982). В условиях опыта в течение первых суток с момента операции эпителий располагается на субстрате, лишенном кровеносных сосудов. Эпидермоциты, вероятно, будут испытывать в этом случае недостаток кислорода и выделять ' ангиогенные факторы, ■ индуцируквде новый интенсивный рост капилляров

(J. Folkman, M. Klasbrun, 1987). С другой стороны, фибрин и продукты его расщепления также стимулируют ангиогенез (0. Hudlicka, К. R. Tyler, 1984), чему способствует и выраженная макрофагальная реакция (О. КХ Турина и др. ,1985).

Особенности микроокружения при развитии соединительной ткани на месте дефекта влияют на тканевой уровень организации ее волокнистых структур в регенератах кожи у крыс.. Различия между волокнистыми остовами регенератов двух групп обнаруживается с первых и до последних сроков наблюдения. Так, новообразованные в условиях жидкой среды волокнистые остовы изначально отличаются менее плотной компановкой волокон, не имеющих четко выраженной ориентации в каком-либо направлении, и большим объемом межволоконного интерсти-циального пространства Причем волокона у крыс опытной группы имели преимущественно цилиндрическую и уплощенную форму' строения, а пространственную конформацию - спиральную, что в совокупности напоминало неориентированный тип остова интактной дермы. Архитектоника волокнистых структур, образованных в условиях жидкой среды, позволяет формировать подобие сосочкового слоя дермы и кожные складки в регенератах. - Новообразованные участки кожи у крыс опытной группы при пальпации более эластичны и менее плотны, чем у животных контрольной группы.

2. Влияние жидкой среды на полноту регенерации кожи у крыс.

Постоянное омывание раневой поверхности изотоническим раствором изменяет микроокружение клеток, что вместе с низкой плотностью распределения лейкоцитов в тканях области повреждения, находящейся в жидкой среде, способствует стимуляции органоТипичности регенерации и ведет к формированию более полноценного регенерата, подтверждая представления Б. Карлсона (1986) об условиях, благоприятных для проявления регенерационной способности у млекопитающих. Так, на боковой поверхности тела крысы вместо рубца, образование которого типично для данной локализации повреждения наружного покрова и вида животного, формируется регенерат, который, по классификации Е. А. Ефимова (1975), относится к коЖному типу. Большая

степень полноты восстановления кожи выражается в том, что соединительнотканная основа регенератов по расположению и вязи волокон имеет дермальный характер, образуются кожные складки и выпячивания эпидермиса в подлежащую ткань; в динамике прослежено образование единичных кожных комплексов, расположенных преимущественно по периферии регенерата.

Для оценки влияния условий жидкой среды на полноту восстановления кожи при иной локализации дефекта было изучено строение регенератов кожи на дорсальной поверхности хвоста (2 серия).

В контрольной группе животных раневая поверхность покрывается струпом, под которым естественным путем идет процесс закрытия дефекта. Через 2-3 месяца после операции центральная часть дефекта кожи представлена соединительнотканным рубцом, состоящим из плотно расположенных коллагеновых волокон, между которыми располагаются фиброциты. Эпителий утолщен, по сравнению с интактным, его базаль-ный слой более или менее ровный.

В опытной группе животных в этот же срок в центральной части раневого дефекта эпителий образует многочисленные выпячивания, вдающиеся в подлежащую соединительную ткань. Ближе к периферии верхние вздутия некоторых из выпячиваний удлиняются и колбовидно расширяются, а другие образуют структуры, в которые входят гланду-лощмы, сходные по своему строению с концевыми отделами сальной железа Нижнее вздутие образует эпителиальный тяж, соответствующий закладке волосяного фолликула. Однако, как правило, формирование полноценного волоса не происходит. Соединительнотканная основа такого участка регенерата по своему строению приближается к интакт-ной дерме.

Таким образом, через 2 и 3 месяца после операции на гистологических срезах регенератов кожи в опытной группе животных можно наблюдать последовательные . стадии образования кожных дериватов. Образованные сальные железы по своему строению являются простыми альвеолярными, либо с неразветвленным концевым отделов, либо, реже встречающиеся, с меньшей, по сравнению с интактными железами, сте-

пенью разветвления концевого отдела. Отсутствие волос в "регенерате кожи, вероятно, связано с тем, что нормальное развитие волосяного фолликула возможно лишь в случае закладки под эпидермальным зачатком дермального сосочка из клеток мезенхимы. Развитие эпителиальных придатков раневого эпидермиса в эксперименте у половозрелых животных опытной группы сходно с их формированием в период внутриутробного развития.

Известно, что кожа новорожденных млекопитающих не реагирует как на ингибируюпше клеточное деление вещества, так и на вещества, вызывающие злокачественные опухоли (S.Bertsch, F.Marks, 1974). Вопрос о возможности стимуляции регенерации у новорожденных животных при использовании жидкой среды обусловил выделение 3 серии эксперимента.- Общая картина активности клеток эпидермиса при эпи-телизации кожной раны после травматического дефекта кончика хвоста у крысят опытной группы удивительно напоминает процесс заживления ампутированной конечности у амфибий. Так, в течение первых часов После ампутации хвоста раневая поверхность покрывается фибринозным экссудатом, который вместе с излившимися клетками крови образует субстрат, обеспечивающий миграцию эпидермальных клеток. Выявленные в 1 серии эксперимента особенности раневого процесса характерны и для заживления ран у новорожденных крысят. Кровяной сгусток к 3-5 дню после травмы полностью замешается соединительной тканью, в последующем (ко 2 месяцу наблюдений) приобретающей сходство с ин-тактной дермой. Раневой эпителий образует многочисленные выпячивания, из части которых по периферии возникают кожные дериваты. Соединительнотканная основа регенерата имеет дермальный характер, что в целом позволяет его отнести к кожному типу. У крысят контрольной группы, при прочих равных условиях, на кончике культи хвоста образуется рубец, спаивающий наружный покров с подлежащими тканями.

При ампутации кончика хвоста у новорожденных крысят опытной группы происходит не только образование регенерата кожного типа на апикальной поверхности, но и полное восстановление травмированного позвонка, что в совокупности ведет к частичному отрастанию хвоста

Путь восстановления травмированного хвоста у крысят опытной группы приближается к элиморфозу, но таковым по сути не является. Подобным образом, без образования бластемы, осуществляется регенерация утраченной части дистальной фаланги пальцев у детей младшей возрастной группы. У них регенерация кончика пальца происходит без дополнительных воздействий при условии, что раневая поверхность не закрывается путем кожной пластики (Л. В. Полежаев, 1980).

Повышение полноты восстановления кожи в условиях постоянного нахождения раневой поверхности в водном растворе хлорида натрия нашло подтверждение при изучении особенностей заживления линейных ран кожи спины у крыс, кроликов и морских свинок (П. FL Иванищук, 0. Е Холмогорская, . 1993). Было продемонстрировано меньшее раавитие фиброзной ткани в области повреждения у животных опытных групп при заживлении в условиях жидкой среды.

Косвенным подтверждением представленных результатов являются данные, полученные при изучении регенерации нервной ткани головного мозга в условиях перфузии области дефекта физиологическим раствором (В.И.Зяблов, 1990). Отмеченное снижение степени развития глиального и соединительнотканного рубца авторы связывают с вымыванием из зоны травмы спинномозговой жидкости с ферментами, оказывающими растворяющее действие на ткань мозга.

3., Влияние жидкой среды на адаптацию крыс к повреждению наружного покрова.

В 4 серии эксперимента у всех контрольных животных участок хвоста, расположенный дистальнее циркулярного дефекта кожи, постепенно подвергался некрозу по типу сухой гангрена Этому предшествовало появление клинических признаков нарушения кровообращения и лимфооттока, а именно: со вторых-третьих сут после операции кожные покровы дистальной части хвоста приобретали цианотичную окраску, причем ее интенсивность в течение нескольких дней нарастала, диа-. метр этой части хвоста значительно увеличился, что явилось следствием отека и лимфостаза. Ткани хвоста, лишенные наружного покрова, подверглись последовательному некрозу, несмотря на нали-

чие защитного струпа и отсутствие признаков инфекционного воспаления. Грануляционная ткань не развивалась.

В опытной группе животных случаев отмирания хвоста не было, клинические признаки нарушения кровообращения в дистальной части хвоста и воспалительной реакции в области повреждения не наблюдались. Струп отсутствовал, клетки раневого эпидермиса мигрировали по поверхности кровяного сгустка. Полное закрытие циркулярного дефекта кожи шириной 0,5 см наступало на 18-20 день. На 35-40 сут после операции на месте циркулярного дефекта формировался регенерат шириной 1-2 мм, образующий характерные для данной локализации наружного покрова кожные складки. Большая часть циркулярного дефекта (60-80%) закрылась в результате внераневого вставочного роста, что удалось определить, используя метод тушевых меток. Визуально выделить регенерат по рельефу поверхности и цвету от ин-тактной Кожи весьма сложно, функциональный и косметический исход восстановления целостности наружного покрова оценен нами как хороший.

В 5 серии эксперимента поведение особей опытной группы после выхода из наркоза не создавало впечатления о выраженном у них болевом синдроме. Они занимали положение лежа на животе, вытянув тело, охотно потребляли пищу и могли самостоятельно передвигаться. При смене жидкости животные не проявляли агрессии и не мешали ее проведению.

ОСшее состояние крыс контрольной группы было значительно хуже. Животные занимали характерное положение - стоя на вытянутых лапах и несколько согнувшись. В первые суг наблюдения резкий звук, вспышка света или попытка насильственного изменения положения тела вызывали ответную реакцию агрессии. С каждым днем их состояние ухудшалось. Крысы постепенно отказывались от еды, становились вялыми, развивалось состояние, сходное с ожсгоеым истощением. Все животные контрольной группы погибли к 14 сут от момента нанесения дефекта (средняя продолжительность жизни составила 11,2^8,4 сут). За период существования после операции потери массы тела составля-

ла в момент гибели до 452 от исходной. Признаки краевой эпителиза-ции отсутствовали, грануляционная ткань на раневой поверхности, которая была покрыта струпом, не развивалась. Отмечалось наличие сухого некроза мышц брюшной стенки.

У всех крыс опытной группы на 70-80 сут от момента проведения операции произошло полное заживление дефекта. Причем в первую очередь закрылась раневая поверхность с брюшной стороны тела (это происходило уже к 18 сут с момента проведения операции), а с дорсальной стороны - позднее. Использование тушевых меток по краям раны показало, что у всех животных опытной группы закрытие 80-902 площади дефекта произошло путем контракции и внераневого вставочного роста. Кожный покров на месте большей части бывшего дефекта (около 852) отличается от интактной кожи меньшей плотностью расположения кожных комплексов и большим углом наклона продольной оси волосяных фолликулов к поверхности кожи. Кожный рисунок сохранен. Часть регенерата (около 152 от всей площади дефекта) представлена плотным соединительнотканным рубцом. Покрывающий его эпидермис лишен кожных придатков. Размер рубца, измеренный в направлении, параллельном продольный оси тела, на брюшной стороне достигает 0,15-0,3 см, а на спине -.2,0-4,0 см. Животные через 20-40 сут после восстановления целостности наружного покрова набирали исходную массу тела (в ходе опыта средняя потеря массы тела у них составляла 242). Несмотря на наличие обширного рубца, деформации тела у крыс не наблюдались, объем движений у них практически не был ограничен.

Таким образом, заключение раневой поверхности в жидкую среду сохраняет жизнеспособность обнаженных тканей, что позволяет, например, предотвратить некроз части конечности, а при обширных повреждениях - адаптировать организм к потере значительной части наружного покрова и, в целом, повысить регенерационную способность млекопитающих в плане заживления обширных дефектов кожи.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные способы и устройства позволяют обеспечить изоляцию раневой поверхности от внешней среды и длительное непрерывное нахождение в жидкой среде посттравматических дефектов наружного покрова на различных участках тела крыс.

2. Течение раневого процесса в условиях постоянного омывания поверхности послеоперационного дефекта кожи 0,9Х-ным водным раствором натрия хлорида отличается от заживления под струпом менее выраженной воспалительной реакцией на травму.

3. Постоянное нахождение раневой поверхности в 0,9Х-ном водном растворе натрия хлорида облегчает миграцию и повышает синтетическую активность базальных зпителиоцитов, что ведет к ускорению зпителизации'кожного дефекта.

4. В жилкой среде зпителизация небольших дефектов наружного покрова у крыс осуществляется путем наползания эпителиального пласта на кровяной сгусток, который эатем замешается соединительной тканью. Наличие аналогичной последовательности заживления ран у низших позвоночных, ведущих - водный образ жизни, указывает на реализацию у крыс в условиях жидкой среды филогенетически более древнего способа посттравматической регенерации наружного покрова.

5.' Процесс заживления кожного дефекта в условиях постоянного нахождения раневой поверхности в жидкой среде сопровождается усиленным развитием микроциркуляторного русла в грануляционной ткани и сформированном регенерате.

6. Изоляция раневой поверхности от внешней среды и ее помещение в 0,9%-ный водный раствор хлорида натрия ведет к органотипи-ческой регенерации кожи с образованием ее дериватов (сальные железы, волосы).

7. Эффект стимуляции регенерации в условиях жидкой среды проявляется .независимо от локализации дефекта и возраста животного, но его выраженность при этом может быть различна.

8. Заключение раневой поверхности в жидкую среду позволяет

адаптировать организм к повреждению, что способствует проявлению способности к восстановлению утраченного наружного покрова у млекопитающих (крыс).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Заживление экспериментальных ран кожи у крыс в условиях постоянного воздействия физиологического раствора// Деп. в ВИНИТИ 22.10.90 Г., N5436-В90. - 8 с. (соавт. П. П. Иванищук) •

2. Стимуляция регенерации хвостовых позвонков у крысят методом постоянного омывания культи физиологическим раствором // Морфология компенсаторных процессов: Сб. науч. тр. / ИГЫА. - Иваново,1991.-С. 85-87 (соавт. П. П. Иванищук).

3. Влияние жидкой среды на полноту восстановления кожи у крыс// Мэрфология.- 1993.- Т. 105, N11-12.- С. 78-81 (соавт. П. П. Иванищук).

4. Особенности регенерации наружних органов крыс в условиях омывания раневой поверхности физиологическим раствором //Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных: Tes! докл. Ill Всерос. науч. кбнф. - Волгоград, 1995. - С.55 (соавт. П. П.Иванищук).

5. К вопросу о заживлении обширных полнослойных ран кожи у Крыс//Гистогенез и регенерация тканей: Тез. докладов. - СШ.: BMA, 1995.-С. 82 (соавт. П. П. Иванищук, Т. Е Суракова).

6. Влияние степени увлажнения кожной раны на развитие микро-циркуляторного русла в грануляционной ткани и рубце// Актуальные вопросы патологической и нормальной морфологии: Мат. Всерос. науч. -практич. конф. с меддународ. участием. - Ижевск, 1Ö05. -С. 127 . (соавт. П. И Иванищук, Т. Е Суракова).

7. Способ стимуляции посттравматической частичной регенерации конечностей, хвоста и кожи у млекопитающих: описание изобретения к патенту N 2053775 // Бюллетень изобретений. - 1996. -1 N 4 (соавт. Е П. Иванищук).

8. №которые итоги изучения посттравматической регенерации наружных органов млекопитающих в условиях постоянного омывания раневой поверхности физиологическим раствором хлорида натрия// Вестник Ивановской медицинской академии.- 1996.- Т. 1, N 1.- С.28-31 (соавт. П. И Иванищук, 0. Е Холмогорская).

9. Особенности зпителизаши экспериментальных полнослойных дефектов кожи у крыс в жидкой среде (0,91 водном растворе хлорида натрия)// Вестник Ивановской медицинской академии.- 1997.- N 1-2. -С. - (соавт. П.П.Иванищук).

10. Влияние жидкой среды на синтетическую активность бавальных зпидермоцитов в процессе заживления кожных ран// Деп. в ВИНИТИ 07.04.97 г., N 1127-В97.- 7 с. (соавт. П.П. Иванищук, Т.В. Сурако-ва, С. Е Диндяев).

11. Особенности посттравматической регенерации кожи у крыс в условиях жидкой среды//Гистогенетический анализ изменчивости и регенерация тканей: Тев. докладов.-СПб.: ВМА, 1997.-0.26 (соавт. Е П. Иванищук).