Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические изменения печени при хроническом эндотоксикозе в условиях тиреоидного дисбаланса

На правах рукописи

Горячев Антон Николаевич

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ

ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЭНДОТОКСИКОЗЕ В УСЛОВИЯХ ТИРЕОИДНОГО ДИСБАЛАНСА (экспериментальное исследование) 14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 І МАР 2Ш

Москва -2012

005014768

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации; Государственном учреждении «Волгоградский медицинский научный центр»

Научный руководитель -доктор медицинских наук

Калашникова Светлана Александровна

Официальные оппоненты -доктор медицинских наук, профессор

Туманов

Владимир Павлович;

доктор медицинских наук, профессор

Смольянникова Вера Анатольевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт Морфологии человека РАМН»

Защита диссертации состоится «26» _маща_2012 года в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росз-драва по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан « 2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор

Л.В. Леонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Хронический эндотоксикоз (ЭТ) сопровождает множество заболеваний и синдромов, определяя тяжесть и прогноз инфекционных, эндокринных, онкологических заболеваний, болезней желудочно-кишечного тракта, почек, недостаточности кровообращения. Печень является многофункциональным органом, структурные изменения в котором имеют ключевое значение для течения и исходов хронического ЭТ [Мишнев О.Д., Щеголев А.И., 2003,2004; Савельев B.C., Гельфанд Б.Р., 2010; Wei S.D. et al., 2011].

. Современные представления и природе ЭТ основаны на синтезе роли эндогенной интоксикации (ЭИ), системного воспалительного ответа (SIRS) и нейро-иммунно-эндокринного дисбаланса как единого комплекса, определяющего в итоге тяжесть и динамику этого состояния [Мишнев О.Д., Щеголев А.И., 2003, 2004; Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005; Филатов В.В., с соавт., 2009; Макарова О.В. с соавт., 2009, 2011; Яковлев М.Ю. с соавт., 2011; Koch A. et al., 2009; Liu Y. et al., 2011].

Участию органов эндокринной системы в пато- и морфогенезе хронического ЭТ посвящен ряд работ отечественных и зарубежных авторов [Калашникова С.А., 2009; Яглова Н.В, 2011; Giménez-Llort L. et al., 2010; Wang H.J. et al. 2010; Perellô M. et al., 2011]. В щитовидной железе при хроническом ЭТ выявляется мозаичное повреждение тироцитов с развитием микрофолликулярной трансформации органа и гипертиреоидного состояния [Полякова Л.В., 2008; Xu L., Li C.S., 2007; Boelen A. et al., 2009].

Взаимоотношения между состоянием щитовидной железы и печени связаны, прежде всего, с наличием в ядрах гепатоцитов большого количества рецепторов к тиреоидным гормонам. Число и аффинность этих рецепторов может существенно меняться при патологических изменениях в печени [Di Meo S., 2010; Venditti P. et al., 2010]. При печеночной недостаточности происходит увеличение синтеза тиреоидных гормонов [Balazs А.Е. et al., 2007; Silveira M.G. et al., 2009; Kwakkel J. et al., 2010].

Таким образом, развитие сочетанной патологии печени и щитовидной железы при хроническом ЭТ не вызывает сомнений. В то же время сведения о модулирующей роли тиреоидного статуса на выраженность морфологических изменений в печени при этом процессе единичны и фрагментарны, что обусловливает актуальность данного исследования.

Цель работы - установить закономерности морфологических изменений в ткани печени при хроническом эндотоксикозе в зависимости от уровня тиреоидных гормонов.

Задачи исследования.

1. Установить особенности морфологических изменений в печени при хроническом эндотоксикозе, моделируемом на фоне гипертиреоза.

2. Выявить особенности морфологических изменений в печени при хроническом эндотоксикозе, моделируемом на фоне гипотиреоза.

3. Провести сравнительный анализ зональности патологических изменений в печени при хроническом эндотоксикозе, моделируемом на фоне гипер- и гипотиреоза, с использованием иммуногистохимических маркеров звездчатых макрофагоцитов (СБ68) и эндотелиоцитов (МЖ-З).

4. Установить участие ТКА1Ь-опосредованного апоптоза в морфологических изменениях печени при хроническом эндотоксикозе, моделируемом на фоне тиреоидного дисбаланса.

Научная новизна.

Впервые показано, что для хронического ЭТ, моделируемого на фоне гипертиреоза, по сравнению с базовой моделью, характерно более высокое содержание маркеров ЭИ в сыворотке крови, более интенсивное и раннее повреждение гепатоцитов, снижение их объемной доли преимущественно в перинортальных областях печеночных долек. Показано, что ги-пертирега при хроническом ЭТ способствует развитию более ранней и ярко выраженной макрофагальной реакции, индукции эндотелиальной нит-роксидсинтазы и усилению фиброгенеза в печени с выраженной зональностью повреждения на всех стадиях эксперимента.

Показано, что при хроническом ЭТ, моделируемом на фоне гипотиреоза, в печени преобладает липидная инфильтрация гепатоцитов, а уменьшение их объемной доли и развитие гепатофиброза происходит на более поздних сроках эксперимента с отсутствием признаков зональности повреждения.

Впервые выявлено модулирующее действие тиреоидных гормонов в отношении выраженности экспрессии в печени маркеров ТКА1Ь-опосредованного апоптоза, эндотелиальной нитроксидсинтазы и маркеров макрофагоцитов (СО-68): при гипертиреозе экспрессия иммуногистохимических маркеров усиливается, при гипотиреозе - уменьшается.

Научно-практическая значимость.

. Полученные данные расширяют современные представления о характере и динамике формирования патологии печени при хроническом ЭТ в условиях тиреоидного дисбаланса. Результаты исследования могут быть использованы в клинической и патологоанатомической практике для оценки степени повреждения печени и прогнозирования исхода патологического процесса у лиц с гипер- и гипотиреозом.

Иммуногистохимическое исследование зонального распределения CD68, NOS-3, TRAIL и каспазы-3 в печени может быть использовано для диагностики трудных случаев тяжелой печеночной патологии и комбинированных диагнозов в патологоанатомической практике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выраженность эндогенной интоксикации, интенсивность и сроки формирования морфологических изменений в печени при хроническом эндотоксикозе зависят от тиреоидного статуса.

2. Наличие гипертиреоза увеличивает скорость и интенсивность патологических изменений в печени при хроническом эндотоксикозе, наличие гипотиреоза - уменьшает скорость и интенсивность этих изменений.

3. TRAIL-опосредованнкш апоптоз является одним из основных механизмов гибели функционально активных клеток печени при хроническом эндотоксикозе, его интенсивность возрастает при фоновом гиперти-реоидном состоянии и ослабевает - при наличии гипотиреоза.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на V Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Кисловодск, 2004); Всероссийском симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика и принципы коррекции» (Волгоград, 2005); VII общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006); Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Д.А. Жданова (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Патология клетки» (Москва, 2010), X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), Всероссийской научной конференции "Регенеративная биология и медицина" (Москва, 2011).

Апробация работы осуществлена на совместной научно-практической конференции сотрудников кафедр патологической анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 24 декабря 2011 года.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 6 публикаций - в журналах действующего «Перечня ... ВАК».

Реализация и внедрение результатов исследования.

Работа была выполнена на кафедре патологической анатомии (зав. кафедрой - доктор медицинских наук, профессор A.B. Смирнов) ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (ректор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.И. Петров) и лаборатории клинической фармакологии (зав. лабораторией - доктор медицинских наук, профессор A.B. Разваляева) Волгоградского медицинского научного центра (директор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.И. Петров).

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр патологической анатомии и судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета, лаборатории клинической фармакологии Волгоградского медицинского научного центра.

Практические рекомендации используются в работе Волгоградского медицинского научного центра и областного бюро судебно-медицинской экспертизы.

Струкпгура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, иллюстрирована 43 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Список использованной литературы содержит 144 источника (45 на русском и 99 на иностранных языках).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 162 белых нелинейных крыс обоего пола (табл. 1).

Таблица 1

Общая характеристика материала исследования по сериям

Группы ЖИВОТНЫХ Характеристика серии Кол-во животных

Интактиые животные (группа сравнения) 30 - 90 сут 18

Хронический ЭТ 30 - 90 сут 36

Гипертиреоз 30 - 90 сут 18

Хронический ЭТ на фоне гипертиреоза 30 -90 сут 36

Гипотиреоз 30-90 сут 18

Хронический ЭТ на фоне гипотиреоза 30-90 сут 36

Всего животных 162

Все эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», их дизайн был согласован с Локальным независимым этическим комитетом (протокол №31-2008 от 21 апреля 2008 года). Все болезненные процедуры и выведение из эксперимента проводили с использованием нембугала (наркоз в дозах 30-50 мг/кг массы, эвтаназия - 100-150 мг/кг массы).

Моделирование хронического ЭТ осуществляли с использованием модели с преимущественным поражением печени (формирование хронического гепатита/гепатофиброза) путем введения тетрахлорметана и липо-полисахарида З.ЛурЫтигшт по схеме, разработанной и хорошо апробированной в нашей лаборатории [Писарев В.Б. с соавт., 2002].

Гипертиреоз воспроизводили введением Ь-тироксина (100 мг/кг/сут) в течение 7 дней. Поддерживающая доза 25 мг/кг 1 раз в 5 дней. Гипотиреоз моделировали введением тиамазола перорально (20 мг/кг) в течение 5 дней. Поддерживающая доза - 5 мг/кг 1 раз в 4 дня.

В качестве интегральных лабораторно-биохимических показателей ЭИ в сыворотке крови крыс определяли содержание ВСММ, их олигопеп-тидной фракции и малонового диальдегида. Исследование проводили на двухлучевом спектрофотометре «БЫтасЬи» (Япония).

Морфологическому исследованию были подвергнуты ткани органов-мишеней ЭТ: печени, почек, легких. Использованы общепринятые методики с окрасками гематоксилином и эозином, по Ван Гизон, Суданом 1П [Коржевский Д.Э., 2010]. Микроскопию и микрофотосъемку осуществляли на тринокулярном микроскопе Микмед-6 (ЛОМО, Россия) с камерой DCM300 (Япония).

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 2002]. В качестве показателей рассчитывали объемные доли (ОД) соединительной ткани и гепатоцитов, средний объем (СО) гепатоцитов и звездчатых макрофагоцитов раздельно в перипортальных, интермедиарных и центро-

лобулярных областях печеночных долек.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием наборов производства «Dako Cytomation» (Дания). Визуализировали ли-ганд ФИО - TRAIL, фермент общего пути апоптоза - каспазу-3, эндотели-альную нитроксидсинтазу - NOS-3 и CD-68, как маркер звездчатых макрофагоцитов. Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопе-

роксидазного метода [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].

Для подтверждения гипер- и гипотиреоза в сыворотке крови были определены гормоны: тиреотропный гормон (ТТГ), тироксин (Т4, общий и свободный), трийодтиронин (Тз, общий и свободный). Использован комплекс для твердофазного иммуноферментного анализа производства AWARENESS Technology (USA), тест-системы «Векгор-Бест» (Новосибирск, Россия) и «DRG» (Germany).

Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с помощью программного пакета EXEL 7.0 (Microsoft, USA). Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Платонов А.Е., 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При хроническом ЭТ, моделируемом на фоне гипертнреоза, в печени на 30-е сут в большинстве гепатоцитов обнаруживались белковые включения. В отдельных гепатоцитах, расположенных преимущественно перипортально, отмечались признаки вакуолизации. В ядрах отдельных гепатоцитов обнаружены явления пикноза и хроматолиза, а единичные

клетки в перипортальных областях, были некротизированы. К окончанию эксперимента выявлялись деформации балочных структур, сформированные под влиянием роста соединительной ткани в междольковом направлении, с образованием тонких междольковых септ.

При морфометрическом исследовании выявлено, что ОД гепатоцитов снижалась на всем протяжении эксперимента, при этом размеры самих клеток практически не изменялись (табл. 2).

Таблица 2

Морфометрнческне показатели печени у крыс с хроническим эндотоксикозом, моделируемом на фоне гипертиреоза (М±га)

Показатели Интактные животные Хронический эндотоксикоз на фоне гипертиреоза

30 сут. I 60 сут. 90 сут.

Перипортальная область

ОД гепатоцитов, % 80,17± 1,42 6736± 3,09* 58,18± 2,74** 46,03± 139**

СО гепатоцитов, мкм3 347,62± 15,29 369,03± 17,71 378,51± 21,09 380,72± 12,86

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 675,07± 14,89 751,36± 17,80* 754,90± 22,97* 764,57± 21,84*

ОД соединительной ткани, % 3,84± 0,08 6,06± 0,23* 14,01± 035** 21,68± 0,47*"

Интермедиарная область

ОД гепатоцитов, % 89J1± 1,96 78,42± 2,06* 72,26± 1,64** 67,29* 1,47**

СО гепатоцитов, мкм3 354,43± 12,11 361,93± 1031 383,47± 21,12 396,49± 23,80*

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 652,19± 20,18 702,96± 22,03 720,13± 22,12 736,46± 19,68

ОД соединительной ткани, % 1,15± 0,26 1,98t 0,65 4,93± 039* 9,04± 0,73

Цснтролобулярная область

ОД гепатоцитов, % 86,72± 1,19 7935± 1,91* 73Д0± 2,56** 71,88± 2,99*'

СО гепатоцитов, мкм3 361,28± 1739 38037± 14,79 383,29± 22,59 407,15± 1134

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 661,57± 19,07 686,59± 25,43 723,55± 16,51* 733,78± 1939

ОД соединительной ткани, % 1,67± 0,10 1,42± 0,61 1,66± 032 1,58± 0,90

* - достоверные различия с группой сравнения, р<0,05 - достоверные различия с базовой моделью хронического ЭТ, р<0,05

В перипортальных областях ОД гепатоцитов была в среднем в 1,5 раза меньше, чем у ннтактных животных (р<0,05), изменение данного показателя в центролобулярных и интермедиарных областях были недостоверными (р>0,05). ОД соединительной ткани увеличивалась неравномерно и максимально была выражена в перипортальных областях: на 60 сут эксперимента ОД соединительной ткани увеличивалась в 5,65 раза по сравнению с интактными животными (р<0,05), в интермедиарной области - в 7,86 раза, в то время как в центролобулярных областях достоверных различий с интактной группой различий не было установлено. Увеличение СО звездчатых макрофагоцитов также было максимальным в перипор-тальной области и минимальной - в центролобулярной.

Количество иммунопозитивных клеток к ИШЬ динамично увеличивалось по мере нарастания сроков эксперимента и к 90-м сут в перипор-тальной области было выше, чем у крыс с базовой моделью ЭТ на 12,9 % (р<0,05). Аналогичные данные получены и при изучении нарастания экспрессии каспаза-3-позитивных клеток. Количество клеток, экспрессирую-щих N08-3, динамично нарастало в течение всего эксперимента и к 90 сут в перипортальной области, на 13% превышало данный показатель у крыс с ЭТ(рис. 1).

При хроническом ЭТ, моделируемом на фоне гипотиреоза, в печени на 30-е сут эксперимента определялась выраженная жировая инфильтрация клеток. Клетки с жировой инфильтрацией цитоплазмы были равномерно диффузно распределены по всем областям печеночной дольки. Центральные вены характеризовались полнокровием, обнаружен выраженный отек пространств Диссе. В области портальных триад наблюдалась умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация и незначительный фиброз.

При проведении морфометрического исследования выявлялось незначительное уменьшение объемной доли гепатоцитов и нарастание ОД соединительной ткани, к окончанию эксперимента величина этого показателя в перипортальной области была только в 1,45 выше, чем у интактных животных.

При иммуногистохимическом исследовании выявлялся менее выраженный прирост числа клеток, иммунопозитивных к N08-3, в сравнении с ' моделируемом на фоне гипертиреоза (р<0,05). Также выявлена менее выраженная экспрессия маркеров ТИА1Ь-опосредованного апогггоза, в сравнении с результатами при ЭТ на фоне гипертиреоза. Так, на 30-е сут хронического ЭТ, моделируемого на фоне гипотиреоза, проценты клеток,

и

иммунопозитивных к TRAIL и каспазе-3, достоверно не различались с аналогичными показателями у интактных животных (рис. 1).

Таким образом, ведущим механизмом в повреждении печени при хроническом ЭТ, моделируемом на фоне гипотиреоза является жировая инфильтрация гепатоцитов и формирование жирового гепатоза. При этом развитие гепатофиброза происходит на более поздних сроках эксперимента, он носит диффузный характер, а зональность повреждения полностью нивелируется.

Полученные нами данные согласуются с имеющимися в литературе сведениями, согласно которым установлено, что длительное гипотиреоид-ное состояние может провоцировать развитие жирового гепатоза. Исследователи полагают, что жировая инфильтрация цитоплазмы гепатоцитов связана с липотропным действием тиреоидных гормонов, при снижении уровня которых происходит подавление липолиза и реципрокное увеличение синтеза триглицеридов [Inkinen J. et al., 2000; Liangpunsakul S., Chala-sani N., 2003; Grant N., 2007].

В тоже время недавние исследования показали, что изменения, возникающие в печеночной паренхиме на фоне гипотиреоза, при проведении длительной заместительной терапии тиреоидными гормонами могут носить обратимый характер [Loria Р. et al., 2009]. Данный факт подтверждается и результатами нашего исследования, так как при хроническом эндо-токсикозе, моделируемом на фоне гипотиреоза обнаруживались гнездныс скопления двуядерных гепатоцитов, что свидетельствовало о наличии регенераторных процессов.

Морфологические изменения в ткани печени при базовой модели хронического ЭТ по скорости своего развития и интенсивности занимали промежуточное положение между аналогичными изменениями, развивающимися при ЭТ на фоне гипо- и гипертиреоза.

По мере увеличения срока эксперимента нарастало количество гепатоцитов, содержащих плотные белковые гранулы, часть гепатоцитов находились в состоянии вакуолизации, при этом в некоторых клетках наблюдался кариопикноз и кариолизис. Выявлены скопления гипертрофированных звездчатых макрофагоцитов, с незначительным их преобладанием в перипортальной области. Эти участки соответствовали зонам новообразования соединительной ткани.

К окончанию эксперимента (90 сут) выявлено нарушение структуры печеночной долыш, в отдельных участках - с дискомплексацией балочной структуры.

TRAIL

ЗОсуг

аз сут

90 сут

0 Интактные 0 ЭТ на фоне гипотиреоза ■ Базовая модель ЭТ В ЭТ на фоне гипертиреоза

CD-68

30 сут

60 сут

90 сут

0 Интактные

И ЭТ на фоне гипотиреоза ■ Базовая модель ЭТ § ЭТ на фоне гипертиреоза

Caspase-3

30 сут

60 сут

90 сут

£3 Интактные И ЭТ на фоне гипотиреоза Я Базовая модель ЭТ Я ЭТ на фоне гипертиреоза

Nos-3

30 сут

60 сут

90 сут

В Интактные

И ЭТ на фоне гипотиреоза ■ Базовая модель ЭТ Я ЭТ на фоне гипертиреоза

Рис. 1. Динамика количественных иммуиогистохимических показателей в ткани печени при хроническом ЭТ, моделируемом в условиях тиреоидного дисбаланса.

- Проведенное исследование согласуется с полученными ранее данными Мишнёва О.Д. с соавт. (2003), которые в своих работах показали характерные зональные изменения в печени при остром эндотоксикозе.

Морфометрическое исследование показало, что интенсивность убыли гепатоцитов нарастает в ряду «центролобулярная область - интермеди-арная область - перипортальная область» (табл. 3).

Таблица 3

Морфометряческие показатели печени у крыс с хроническим эидотоксикозом (М±т)_

Показатели Интактныс животные Хронический эпдотоксикоз

ЗО сут. 1 60 сут. I 90 сут.

Перипортальная область

ОД гепатоцитов, % 80,17± 1,42 74,85± 3,93 68,28± 2,92* 61,73± 137*

СО гепатоцитов, мкм3 347,62± 15,29 358,28± 17,19 367,49± 20,48 374,49± 12,49

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 675,07± 14,89 729,48± 17,28* 723,20± 2230* 74230І 2130*

ОД соединительной ткани, % 3,84± 0,08 4,91± 0,22* 6,22± 034* 8,43± 0,46*

Интермедиарная область

ОД гепатоцитов, % 89,21± 1,96 83,43± 2,19* 79,00± 1,74* 71,59± 136*

СО гепатоцитов, мкм3 354,43± 12,11 35139± 10,01 37230І 2030 384,94± 23,11

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 652,19± 20,18 682,49± 2139 699,Ш 21,48 715,01± 19,11*

ОД соединительной ткани, % 1,15± 0,26 1,71± 0,63 2,07± 038* 3,82± 0,71*

Центролобулярная область

ОД гепатоцитов, % 86,72± 1,19 82,29± 2,03 83,19± 2,72 80,72± 3,18

СО гепатоцитов, мкм3 361Д8± 1739 369,29± 1436 372,13± 21,93 395,29* 11,01*

СО звездчатых макрофагоцитов, мкм3 661,57± 19,07 666,59± 24,69 702,48± 16,03* 712,41± 18,83*

ОД соединительной ткани, % 1,67± 0,10 13«± 0^9 1,61± 031 133± 0,87

* - достоверные различия с группой сравнения, р<0,05 -достоверные различия с базовой моделью хронического ЭТ, р<0,05

В перипортальной области при базовой модели хронического эндо-токсикоза ОД гепатоцитов снижалась, начиная с 30 сут эксперимента, и к 60 сут была достоверно меньше, чем ОД гепатоцитов у интактных живот-

ных, а к 90 сут данный показатель был ниже, чем у интактных животных на 23% (в 1,3 раза), р<0,05.

Параллельно снижению активно функционирующей паренхимы обнаружено увеличение ОД соединительной ткани, наиболее выраженное в перипортальной области. Так, на 30 сут эндотоксикоза ОД соединительной ткани была достоверно выше, чем у интактных животных, на 60 сут превышала таковой показатель в 1,61 раза, а к окончанию эксперимента - на 2,19 раза (р<0,05). Увеличение ОД соединительной ткани зонально совпадает с уменьшением ОД гепатоцитов, что, по-видимому, является компенсаторным процессом замещения активно функционирующей паренхимы соединительной тканью.

Аналогичные изменения, были описаны Шевалдиным А.Г. (2010) при хроническом гепатите. Автор указывает, на то, что разрастанию соединительной ткани предшествует, и во многом провоцирует, увеличение количества активированных резидентных макрофагов печени. Полученные нами данные иммуногистохимического исследования полностью совпадают, так как обнаруженные скопления иммунопозитивных клеток к CD-68, характеризующие активные звездчатые макрофагоциты, зонально совпадали с участками разрастания соединительной ткани.

При имуногистохимическом исследовании экспрессии маркеров TRAIL-опосредованного апоптоза выявлено увеличение количества иммунопозитивных клеток к TRAE, и каспазе-3 в центро-портальном направлении. Максимальное увеличение процента клеток, иммунопозитивных к TRAIL выявлено в перипортальной области, при этом не выявлено достоверных различий на 30, 60 и 90 сут эксперимента. В среднем, число TRAIL-позитивных клеток, по сравнению с интактными животными, было в 5,3 раза выше (р<0,05). Отмечено увеличение количества активированных макрофагов в перипортальной области в 2,3 раза на 90 сут экспериментального ЭТ (р<0,05).

Таким образом, к наиболее значимым морфологическим изменением при хроническом ЭТ на фоне гипертиреоза следует отнести относительно более раннее развитие гепатофиброза. Максимальное различие прироста соединительной ткани между хроническим ЭТ, моделируемом на фоне гипертиреоза, и базовой моделью наблюдалось на 60 сут эксперимента, а к 90 сут (окончанию эксперимента) объемная доля соединительной ткани при описываемых моделях не имела достоверных различий. Данный факт, на наш взгляд, объясняется тем, что на 60 сут происходит

суммация токсического влияния эндогенных токсических соединений, образуемых вследствие внутрикишечного распада тетрахлорметана, увеличения проницаемости кишечного барьера при введение бактериального ЛПС, и накопления метаболитов тиреоидных гормонов. Впоследствии, за счет активации компенсаторных механизмов происходит незначительное увеличение ОД соединительной ткани, в то время как при базовой модели развитие гепатофиброза происходит более плавно, без лавинообразного скачка на 60 сут эксперимента.

Выявленные морфологические изменения в печени в целом согласуются с имеющимися в литературе сведениями, согласно которым патогенетическим механизмом увеличения соединительной ткани и замещения ею активно функционирующей паренхимы, является относительная пери-венулярная гипоксия, обусловленная повышением потребности печени в кислороде, без сопутствующего повышения печеночного кровотока [Пе-тунина Н.А., Трухина Л.В., 2011; Malik R., Hodgson Н„ 2002; Di Meo S. et al., 2010].

Обнаруженные нами более выраженные морфологические изменения в печени у животных с ЭТ, моделируемом на фоне гипертиреоза, (по сравнению с животными базовой модели), представляются нам вполне логичными, так как гипертиреоидное состояние само по себе может рассматриваться как вариант эндогенной интоксикации, где в качестве эндогенных токсических соединений выступают тиреоидные гормоны и их метаболиты. При этом ряд авторов полагает, что описываемый спектр патологических изменений (от локального некроза - до развития цирроза), может быть связан с отсутствием коррекции тиреоидного статуса [Subudhi U. et

al., 2008; Di Meo S., 2010].

В преобладающем большинстве литературных источников указывается, что патологические изменения в печени, возникающие на фоне гипертиреоза, носят обратимый характер, вследствие их раннего распознавания и своевременного лечения [Malik R., Hodgson Н., 2002; Chat-topadhyay S. et al., 2010J. Однако полученные нами результаты не позволяют полностью согласится с ними и дают возможность предполагать, что обратимость морфологических изменений в печени при эндотоксикозе, возникшем на фоне гипертиреоза, во многом определяется длительностью интоксикации, и они обратимы лишь на ранних сроках.

Проведение корреляционного анализа стало дополнительным доказательством того, что тиреоидный дисбаланс при ЭТ во многом опреде-

ляет выраженность эндогенной интоксикации и степень повреждения ткани печени. Выявлены устойчивые связи между следующими группами: «тиреоидный дисбаланс - морфометрические показатели печени», «тирео-идный дисбаланс - маркеры эндогенной интоксикации». Наиболее сильные положительные корреляции обнаружены между уровнем тироксина в периферической крови и концентрацией ВСММ (11=0,91); между уровнем тироксина (свободной фракцией) и ОД соединительной ткани в печени

№=0,71).

Обращает на себя внимание формирование при хроническом ЭТ новых корреляционных связей, не имевшихся в группе интактных животных. Так, на 90 сут эксперимента формировалась новая, сильная отрицательная корреляционная связь между ОД гепатоцитов и ОД иммунопозитивных клеток к СО-68 (г=-0,64). Наряду с формированием новых корреляционных зависимостей было обнаружено разобщение уже имеющихся связей. Так, на 30 сут хронического ЭТ между ОД гепатоцитов и ОД иммунопозитивных клеток к ШБ-З была сильная отрицательная корреляционная связь (1^0,73), которая на 60 сут ослабевала (г=-0,61), и полностью исчезала к 90 сут эксперимента.

Показатель иммунопозитивных клеток к ШЯ-З напрямую коррелировал с показателем ОД соединительной ткани в печени. Данная зависимость представляется нам вполне логичной, так как ЫО-зависимая эндоте-лиальная дисфункция является существенным компонентом в развитии патологических изменений в печени при хроническом ЭТ.

При корреляционном анализе установлены сильные положительные корреляционные связи между уровнем периферических гормонов, маркерами ПШЬ-опосредованного апоптоза, маркером эндотелиальной дисфункции, маркером активированных макрофагов.

Маркеры ТЛА1Ь-опосредованного апоптоза имели сильную отрицательную Связь с показателем ОД гепатоцитов, что является косвенным доказательством того, что именно данный механизм является ведущим в гибели гепатоцитов при хроническом ЭТ. При этом обращает на себя внимание тот факт, что наибольшая корреляция обнаружена между количеством каспаза-3-положительных клеток и ОД гепатоцитов, так как именно кас-паза-3 является маркером, свидетельствующим о необратимости апоптоза.

Таким образом, проведенный корреляционный анализ подтвердил полученные нами данные о наличии тесной взаимозависимости между выраженностью эндотоксикоза, уровнем тиреоидных гормонов и интенсив-

ностью ПШЬ-опосредованного апоптоза при хроническом эндотоксико-зе. При этом установлено, что в динамике эксперимента происходило появление устойчивых связей и разобщение имевшихся ранее сильных связей у животных интактной группы.

Сопоставление гистологического, морфометрического, иммуноги-стохимического и биохимического исследований ткани печени при хроническом ЭТ свидетельствовали о наличии зональности повреждения с преимущественным поражением перипортальной зоны и наименьшим -центролобулярной зоны.

Ведущим компонентом в морфогенезе печени при хроническом ЭТ, у животных всех моделей являлся фибропластический компонент, обусловливающий развитие гепатофиброза. При этом сроки развития гепато-фиброза были различными, у животных с хроническим ЭТ, моделируемом на фоне шпертиреоза они были наименьшими (на 30-е сут), у крыс с ЭТ, моделируемом на фоне гипотиреоза гепатофиброз выявлен лишь к окончанию эксперимента (90-е сут). Возникновение и прогрессирование гепатофиброза напрямую коррелировало с увеличением экспрессии иммуно-положительных клеток к эндотелиальной нитроксидсинтазе, которая является стимулятором фибропластических процессов и способствует прогрессированию стромальной пролиферации. В свою очередь стромальную пролиферацию можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на замещение утраченного объема паренхимы.

Полученные нами результаты базируются па проведенных ранее исследованиях, согласно которым формирование органопатодогии при хронической эндогенной интоксикации происходит при непосредственном участие эндокринной системы, а гормональный дисбаланс, на фоне которого развивается патологический процесс, во многом определяет прогноз хронического эпдотоксикоза [Полякоиа Л.В., 2008; Калашникова С А 2009].

ВЫВОДЫ

1. Хронический эндотоксикоз, развивающийся на фоне гипертирео-за, сопровождается прогрессирующими изменениями в печени в виде обратимого и необратимого повреждения гепатоцитов (на 90 сутки эксперимента), уменьшения их объемной доли (в 1,74 раза), по сравнению с ин-тактными животными), увеличения количества звездчатых макрофагоцитов (в 1,13 раза), и соединительной ткани (в 5,64 раза). При этом четко выражена зональность повреждения гепатоцитов и формирование фиброза печени преимущественно в перипортальных областях.

2. Хронический эндотоксикоз, развивающийся на фоне гипотиреоза, сопровождается менее выраженным повреждением гепатоцитов с наличием жировой инфильтрации, снижением объемной доли гепатоцитов к 90 суткам (в 1,19 раза, в сравнении с интактными животными), умеренным увеличением объемной доли соединительной ткани (в 1,45 раза). При этом практически отсутствует зональность повреждения и разрастания соединительной ткани в печеночной дольке.

- 3- Увеличение числа иммунопозитивных клеток к CD-68 является характерным морфологическим феноменом при эндотоксикозе, и максимально выражено при его моделировании на фоне гипертиреоза, минимально - на фоне гипотиреоза. Выраженность прироста числа иммунопозитивных звездчатых макрофагоцитов нарастает в ряду: центролобулярная область < интермедиарная область < перипортальная область печеночной дольки.

4. Одним из ведущих механизмов в гибели гепатоцитов при хроническом эндотоксикозе, моделируемого на фоне тиреоидного дисбаланса, является TRAIL-опосредованный апоптоз, что подтверждается достоверным увеличением экспрессии его маркеров (TRAIL, caspase-З) в гспатоци-тах в ряду: эндотоксикоз на фоне гипотиреоза < эндотоксикоз без тиреоидного дисбаланса < эндотоксикоз на фоне гипертиреоза. Выраженность экспрессии маркеров TRAIL-опосредованного апоптоза максимальна в перипортальной области, минимальна - в центролобулярной, что коррелирует с морфометрическими показателями интенсивности зонального повреждения печеночной дольки.

5. Параллельно росту экспрессии маркеров Т11А1Ь-опосредованного апоптоза в печени по данным иммуногистохимического исследования происходит увеличение процента иммунопозитивных клеток к зндотелиаль-ной нитроксидсинтазе, преимущественно в перипортальной области. Расположение иммунопозитивных к N08-3 клеток совпадает с участками разрастания соединительной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Сведения о зональности повреждения печени и выраженности экспрессии маркеров TRAIL-опосредованного апоптоза при эндотоксикозе, моделируемом на фоне rano- и гипертиреоза, могут быть использованы для диагностики трудных случаев тяжелой печеночной патологии и комбинированных диагнозов в патологоанатомической практике.

2. Полученные данные могут быть использованы при экспериментальном моделировании сочетанной патологии печени и щитовидной железы и оценки влияния предшествующего тиреоидного статуса на выраженность морфологических изменений печени при хроническом эндотоксикозе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.В. Новочадов, В.Б.Писарев, А.Н. Горячев Корреляционный анализ морфометрических показателей печени и вегетативных структур при хроническом эндотоксикозе // Успехи современного естествознания. - 2004. - №2. - С.36-37.

2. В.В. Новочадов, А.Н. Горячев Радиальная и продольная морфо-метрия ткани печени при хроническом эндотоксикозе // Успехи современного естествознания. - 2005. - №10. - С.45-46.

3. С.А. Калашникова, А.Н. Горячев Гель-фильтрация и спектроскопия молекул средней молекулярной массы плазмы крови в оценке эндогенной интоксикации при хроническом эндотоксикозе // Новые технологии в медицине: Труды ВолГМУ, 2006. - Т. 61, вып. 1. - С. 293-295.

4. В.В. Новочадов, Л.В. Полякова, А.Н. Горячев, А.Г. Денисов, С.А. Калашникова Гормональный статус крыс с хронической эндогенной интоксикацией // Фундаментальные исследования. - 2006. -№5.-С. 96-97.

5. Л.В. Полякова, И.М. Кузнецов, А.Н. Горячев, С.А. Калашникова, В.В. Новочадов Радиальная морфометрия зндокриноцитов как способ оценки их функциональной активности // Бюл. Волгоградского научного центра РАМН. - 2007. - №3. - С. 50-51

6. С.А. Калашникова, А.Н. Горячев, Л.В. Полякова, Г.А. Скля-ренко Количественные методы в оценке нейроэндокринной регуляции при хроническом эндотоксикозе // Астраханский медицинский журнал. - 2007. - №2. - С. 84-85.

7. А. В. Симонян, В. В. Новочадов, М. А. Симонян, А.Н. Горячев Эффективность циквалона на модели хронического эндотоксикоза у крыс // Хнмико-фармацевтический журнал. - 2007. - Том 41. - N 9 . - С 9-11.

8. В.В. Новочадов, Н.В. Ермолаев, А.Н. Горячев, В.Б. Писарев, С.А. Калашникова Нейроморфология хронического эндотоксикоза: механизмы повреждения и защиты нейронов // Морфология. - 2008. -Т. 133, №2.-С. 96-97.

9. СЛ. Калашникова, В.В. Новочадов, А.Н. Горячев Математическое моделирование компонента тиреоидной дизрегуляции при хроническом эндотоксикозе // Вестник новых медицинских технологий. 2008. - №3. - С. 167-168.

10. А.Н. Горячев, С.А. Калашникова, Г.А. Скляренко Патомор-фология печени и почек при хроническом эндотоксикозе в условиях тирондного дисбаланса // Морфология. - 2008. - Т. 133, №4. - С. 63.

11. С.А. Калашникова, А.Н. Горячев, В.В. Новочадов, А.И. Щё-голев Тиреоидная модуляция ФНО-зависимого апоптоза и формирование хронической патологии печени при эндогенной интоксикации у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. -Т. Д47, №2.-С. 201-206.

12. С.А. Калашникова, А.Н. Горячев Межклеточные взаимодействия в ткани печени в условиях тиреоидного дисбаланса при хронической эндогенной интоксикации: /В сб. научн. Трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. - М.: МДВ, 2010. - С. 72-74

13. С.А. Калашникова, А.Н. Горячев, А.И. Щеголев Тиреоидная модуляция активности клеток Купфера и гепатофиброза при хроническом эндотоксикозе у крыс // Современные проблемы науки и образования. -2011,-№6.-С. 28.

Подп. в печать 20.02.12. Формат 60 х 84/16 Бум. пл. 65 г/м2. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2.0 Тираж 100. Заказ 12.

Волгоградский государственный медицинский университет, 400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1.