Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфологические и цитогенетические аспекты видовой резистентности к опухолевому росту

□□3485488

МАНСКИХ ВАСИЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВИДОВОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ОПУХОЛЕВОМУ РОСТУ

14.00.14 - онкология 03.00.25 - цитология, гистология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ДЕК 2009

Томск - 2009

003485488

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГОУ ВПО «Московский государственный университет им, М.В.Ломоносова»

Научные руководители:

доктор биологических наук,

профессор, академик РАН Скулачев Владимир Петрович

доктор медицинских наук,

профессор Перельмутер Владимир Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Удут Владимир Васильевич

доктор медицинских наук

Герасимов Александр Владимирович

Ведущая организация:

Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск

Защита состоится «_»__2009 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.032.01 при НИИ онкологии СО РАМН (634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Фролова И.Г.

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Несмотря на многоликость проблемы опухолевого роста, вряд ли вызывает сомнение существенная роль соматического мутагенеза в бластомогенезе. Не менее актуальным представляется вопрос о способности организма поддерживать генетический гомеостаз в популяциях соматических клеток. Эта проблема, на наш взгляд, имеет особый теоретический и практический интерес по двум причинам. Во-первых, бывшая длительное время очень популярной эволюционно-иммунологическая концепция M.F.Burnet (1971), приписывавшая ведущую роль в генетическом гомеостазе и канцерогенезе системе специфического иммунитета, вызывает большие сомнения, которые достигли особой остроты в настоящее время (В.М.Перельмутер, 1983; Р.М.Хаитов и соавт., 2001; В.М.Головизнин, 2001). Очень немногочисленны исследования, посвященные изучению сравнительных аспектов других механизмов генетического гомеостаза -репарации ДНК, программируемой гибели клеток и др. Изучение этих вопросов тем более необходимо, поскольку такой подход позволит не только дать адекватную оценку современным онкоиммунологическим и онко-генетическим концепциям, но и выявить новые способы управления канцерогенезом, что важно для рациональной профилактики и лечения злокачественных опухолей (Н.В. Васильев, 1988). Наиболее перспективным подходом для достижения указанной цели является исследование механизмов, обеспечивающих неодинаковую чувствительность разных видов животных к канцерогенным факторам. Такой подход может помочь в поиске путей управления канцерогенезом исходя из того, каким образом это было достигнуто в ходе эволюции некоторых видов животных, которые отличаются низкой частотой спонтанных опухолей и резистентностью к канцерогенным воздействиям в эксперименте. Эти данные могут значительно дополнить сведения, полученные при исследовании оппозитных линий мышей. Известно, что колебания частот спонтанных и экспериментальных опухолей у животных разных линий в настоящее время связывают с особенностями обмена, а также с присутствием в геноме определенных линий онкогенных вирусов и мобильных генетических элементов (Худолей В.В., 1979; Percy D.H., Barthold S.W., 2007).

Исследование канцерогенеза и механизмов регуляции цитогенетического гомеостаза у амфибий является весьма удобной моделью для решения указанных проблем, тем более, что земноводные представляют собой одно из ключевых звеньев филогенеза позвоночных (В.В.Худолей, 1992; 1993; 1995), а своеобразный характер таксономического распределния и эволюции противоопухолевой резистентности позволяет переносить полученные выводы на всех позвоночных. Известно, что разные семейства класса земноводных в различной степени поражаются опухолевым ростом -частоты опухолей у жаб (ceM.Bufoniae) 2-3 раза меньше, чем у настоящих

ля[ушек (сем. Raniae) (Pliss G.B. et al., 1982; Sakr S.A. et al.,1989; Худолей B.B., 1976, 1993, 1999). Причины, лежащие в основе этих различий, до настоящего времени не ясны (Худолей В.В., 1995, 1999). Исследование механизмов элиминации клеток с поврежденным геномом на модели двух видов, отличающихся по восприимчивости к опухолевому росту после действия генотоксического канцерогена способствует более глубокому пониманию стадии инициации канцерогенеза и механизма малигнизации предраковых состояний, что имеет большое фундаментальное и клиническое значение.

Помимо всего прочего, нужно заметить, что амфибии представляют собой идеальный объект для скрининговых исследований на мутагенность с помощью цитогенетических методов, например, микроядерного анализа (Ильинских Н.Н. и соавт., 1992; Hayes J. et al., 2009; Yin X.H. et al., 2009). Однако проблема образования микроядер в соматических клетках амфибий, как и вообще вопрос о механизмах микронуклеогенеза, остается дискуссионным.

Вполне естественным, с точки зрения вопроса о межвидовых различиях в восприимчивости к опухолевому росту у амфибий, является интерес к изучению частот и гистологического спектра спонтанных опухолей. Спонтанные новообразования у амфибий широко изучаются и в настоящее время имеется ряд обобщающих работ, посвященных этой теме (Balls М., Ruben R.H., 1974; В.В. Худолей, 1976; Tsonis Р.А. и Tsonis К., 1988 и др.). Внимание исследователей к этой группе животных связано, прежде всего, с перспективами использования низших позвоночных как объектов для изучения условий повышенного риска канцерогенеза, особенно в связи с проблемой индикации бластомогенных агентов во внешней среде, что очень важно в плане решения проблемы первичной профилактики рака (Г.Б. Плисс, В.В. Худолей, 1979; В.В. Худолей, 1975; 1993). Среди работ, посвященных этой проблеме, большинство выполнено на представителях класса костистых рыб, хотя имеегся и немало исследований, проведенных на амфибиях (Neucorrune S., 1973; Rose, 1976; Г.Б. Плисс, В.В. Худолей, 1979; В.В. Елисеев, В.В. Худолей, 1980; В.В. Худолей, С.П. Боговский, 1982; Г.Т. Кобзарь, С.А. Карлова, 1984; В.В. Худолей, 1993). Согласно полученным данным, имеется зависимость между содержанием нитрозоаминов, их предшественников и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) во внешней среде и частотой опухолей у обитающих в ней организмов. Кроме того, И.А.Велдре и соавт. (1982), а также В.В.Худолей (1981) было установлено, что низшие животные способны накапливать в тканях бластомогенные вещества, обнаружение которых во внешней среде классическими химическими методами представляет определенные трудности из-за низких концентраций. В связи с этим изучение спонтанных опухолей у бесхвостых амфибий имеет значение не только для эволюционной, но и для экологической онкологии.

Цель работы

Исследовать роль механизмов поддержания генетического гомеостаза в обеспечении межвидовых различий в восприимчивости к опухолевому росту на модели бесхвостых амфибий, а также получить морфологические данные о спонтанных опухолях у этих животных.

Задачи работы

1. Получить данные о спонтанных опухолях у двух видов бесхвостых амфибий с разной восприимчивостью к опухолевому росту (остромордая лягушка, Rana arvalis и серая жаба, Bufo bufo).

2. Выяснить, существуют ли различия в морфологических изменениях и интенсивности мутагенеза в печени и костном мозге при действии метилнитрозомочевины у трех видов бесхвостых амфибий, принадлежащих к семействам (настоящие жабы, Bufoniae и настоящие лягушки, Ratiiae), различающимся по частотам возникновения спонтанных и индуцированных опухолей.

3. Путем изучения динамики элиминации аберрантных клеток, а также ее связи с митотической активностью, интенсивностью фагоцитоза и содержанием макрофагов в селезенке после введения ломустина выявить роль и возможные механизмы генетического гомеостаза, обеспечивающие видовые различия в устойчивости к опухолевому росту.

4. Выяснить отношения между образованием микроядер, особенностями цитологического состава, морфологии клеточных элементов и митотической активностью в тканях печени и костного мозга жаб и лягушек в норме и при действии метилнитрозомочевины.

Научная новизна

1. Показано, что элиминация клеток с повреждениями метафазных хромосом у животных с меньшей видовой предрасположенностью к развитию опухолей (Bufo bufo) происходит гораздо быстрее, чем у более предрасположенного к опухолевому росту вида того же класса (R.arvalis).

2. Установлено, что макрофаги серой жабы активно поглощают клетки с цитогенетическими аберрациями и их число в селезенке, в отличие от макрофагов остромордых лягушек, находится в обратной зависимости с частотой клеток с микроядрами.

3. Показано, что гибель клеток с морфологическими признаками апоптоза не является механизмом, способным обеспечивать конститутивную противоопухолевую резистентность у амфибий.

4. Обнаружено, что микроядра у амфибий при действии алкилирующих агентов типа метилнитрозомочевины (широко используемых в клинике в качестве противоопухолевых препаратов

и в эксперименте - в роли канцерогенов) образуются преимущественно путем интерфазной деминуции хроматина;

5. Показано, что у амфибий с разной конститутивной восприимчивостью к опухолевому росту введение канцерогенов индуцирует разное число полиплоидов среди спленоцитов (у Rana arvalis их число было в 8 раз больше, чем у Bufo bufo).

6. В работе впервые исследованы причины, лежащие в основе межвидовых различий в противоопухолевой резистентности у бесхвостых амфибий, дано объяснение особенностям таксономического распределения поражаемости опухолевым ростом в эволюционном ряду. Оно исходит из закономерностей параллельной эволюции и позволяет говорить о сходстве механизмов противоопухолевого надзора у всех позвоночных, в том числе млекопитающих и человека, обладающих одинаковым уровнем конститутивной резистентности к опухолям, независимо от дивергентного положения;

7. Впервые описан ряд спонтанных опухолей у земноводных, одни из которых (пигментированная фибропапиллома у серой жабы) не имеют аналогов среди опухолей человека, другие (случаи хронического миелолейкоза у остромордой лягушки и эритромиелоза у серой жабы), напротив, заполняют пробел в сравнительной онкологии человека и низших позвоночных;

8. Показано, что у амфибий гельминтозная инвазия не играет роли в возникновении спонтанных опухолей легких у амфибий. Этот факт должен быть учтен концепциями, трактующими роль гельминтозной инвазии как важного фактора в развитии некоторых опухолей, в том числе у человека.

Практическая значимость

В работе впервые описано несколько новых гистологических типов опухолей, на диагностику которых необходимо обращать внимание при использовании земноводных для индикации канцерогенов во внешней среде, а также при проведении экспериментальных работ онкологической направленности на этих животных. Полученные данные об особенностях механизма образования микроядер у амфибий необходимы для правильной интерпретации данных микроядерного теста на мутагенность, который широко используется в качестве одного из экспресс-методов выявления потенциальных канцерогенов (Худолей В.В.,1999). Что касается данных о способности макрофагов серых жаб устранять клетки с цитогенетическими нарушениями, то будущие исследования должны определить сферу возможного приложения этих данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Большей устойчивости к канцерогенным воздействиям у животным одного филогенетического уровня (бесхвостые амфибии) соответствует более высокая эффективность элиминации аберрантных клеток.

2. Существуют отличия в реакции макрофагальной системы на клетки, содержащие цитогенетические нарушения у земноводных, различающихся по естественной (конститутивной) восприимчивости к возникновению опухолевого роста;

3. Гибель клеток с морфологическими признаками апоптоза не является механизмом, способным обеспечивать конститутивную противоопухолевую резистентность у амфибий.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 8 статей журналах, рекомендуемых ВАК и 1 монография.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов (заключения), выводов, списка использованной литературы, включающего 207 источников, в том числе 129 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками, в том числе 5 графиками, 6 схемами и 26 макро- и микрофотографиями.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные

В работе исследованы спонтанные опухоли, мутагенез у интактных животных и реакция на бластомогенное воздействие у 2 видов настоящих лягушек (Rana arvalis и Rana ridibunda) и 1 вида настоящих жаб (Bufo bufo). Первые два вида служили моделью чувствительных, а третий - резистентных к опухолевому росту животных.

Подвергнуты исследованию 413 лягушек и 310 серых жаб (в первой группе самок было 47, во второй - 35)

Забор материала

Животных тщательно осматривали с целью обнаружения кожных поражений. У всех животных забирали кровь для изготовления препаратов-

мазков. Забой животных производили декапитацией после анестезии ингаляцией эфира. Погибших или забитых в ходе опытов животных подвергали анатомическому исследованию. Все подозрительные на опухолевое поражение участки тканей вырезали и фиксировали в 12% формалине. Легкие животных исследовались на наличие гельминтов. Помимо этого, у части животных проведено цитологическое исследование внутренних органов (почки, печень, селезенка, костный мозг, гонады) на препаратах - отпечатках, фиксированных и окрашенных гематологическими методами. Для микроядерного анализа использовали цитологические мазки костного мозга, пульпы селезенки и паренхимы печени, фиксированные 96% этанолом. На протяжении большей части года и особенно весной в большинстве органов (печень, гонады, костный мозг) земноводных митотическая активность очень мала. Методика стимуляции пролиферации в гепатоцитах путем резекции печени дает очень непостоянные результаты. В связи с этим, для исследования повреждений в метафазных хромосомах изготовляли препараты из селезенки, где имеется относительно большое количество делящихся клеток в весеннее время года. После аккуратного измельчения селезенки с помощью глазных ножниц спленоциты освобождались от стромы путем промывания и пропускания через иглы шприцов уменьшающегося диаметра и использовались для приготовления препаратов метафазных хромосом.

Морфологические методы

Из фиксированного материала после заливки в парафин изготовляли гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и гематоксилином-пикрофуксином по Ван-Гизон. При обнаружении паразитов в легочной ткани из нее изготовляли тотальные пленочные препараты (которые из-за анатомических особенностей легких у земноводных более удобны для изучения, чем срезы), фиксировали спирт-формолом по Шафферу и окрашивали эритрозин-метиленовым синим. Для цитологических препаратов внутренних органов, препаратов-мазков для микроядерного анализа применяли окрашивание по Романовскому-Гимзе или эритрозин-метиленовым синим по оригинальной методике (Манских В.Н., 1999). На цитологических препаратах производили оценку количества лимфоидных клеток и макрофагов в печени и костном мозге, а также оценивали долю макрофагов и гибнущих клеток в селезенке с исключением из подсчета тромбоцитов, зрелых эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов. Клетки, гибнущие по механизму апоптоза, выявляли по морфологическим критериям (кариопикноз, кариорексис, маргинация хроматина и распад клетки на апоптозные тельца) на тех же препаратах. Учитывая, что лимфоциты в препаратах печени могут принадлежать как ткани органа, так и попадать из крови, подсчет производили в стандартизованных полях зрения, содержащих не менее 3 и не более 10 гепатоцитов и не менее 5 и не более 15 эритроцитов (окуляр хЮ; объектив х90). Полученный результат выражали в

процентах от общего числа макрофагов, лимфоцитов и гепатоцитов. В костном мозге подсчитывали процентное содержание лимфоидных клеток и макрофагов от числа всех миелокариоцитов. Во всех случаях просматривали не менее 2000 клеток.

Индукция мутагенеза канцерогенными агентами

В качестве бластомогенного агента использовали метилнитрозомочевину (МНМ), канцерогенная активность которого в отношении бесхвостых амфибий показана рядом авторов (Худолей В.В., 1999). Для исследования были использованы только половозрелые самцы. Все животные в каждом исследовании были разделены на опытные (N=9) и контрольные (N=7) группы (всего 74 лягушки и 60 жаб). Канцероген вводили в полость тела в дозе 25 мг/100 г массы в 0,64%-ом растворе хлорида натрия по схеме, предложенной для изучения мутагенеза у млекопитающих М. Carriott и соавт.: 2 инъекции с интервалом в 1 сутки и забой животных ингаляцией эфира через 24 ч. после последнего введения. Условия содержания и время суток, в которое производили введение мутагена и забой животных, во всех случаях были идентичны (5-7 ч. вечера).

Динамику элиминации аберрантных клеток оценивали после введения по аналогичной методике производного метилнитрозомочевины -алкилирующего агента ломустина в дозе общей дозе 4мг/100 г массы (в 10% растворе этилового спирта на 0,64% NaCl). Материал для исследования (спленоциты) забирали через 1, 4, и 14 суток после последней инъекции мутагена.

Цитогенетические методы

Мутагенез оценивали микроядерным тестом, для которого показана возможность применения на бесхвостых амфибиях (Войтович А.М, Елисеева К.Г., 1989; Ильинских Н.Н. И соавт., 1992; Yin Х.Н. et al., 2009). Микроядерный тест является стандартной процедурой регистрации клеток с повреждениями генома, основанный на выявлении микроядер в интерфазных клетках, которые, как считается, образуются из отставших в митозе целых хромосом или их ацентрических фрагментов (Sato S. et al., 1995; Dass S.B. et al., 1997; Hayes J. et al., 2009). Микроядра и фигуры митозов подсчитывали с иммерсией на 2000 клеток с исключением из подсчета дефектных полей зрения и зрелых форменных элементов крови, полученные результаты выражали в промилле. Регистрировали патологические формы кариокинеза. Исследовались также повреждения в метафазных хромосомах делящихся спленоцитов. Поскольку приведенные в литературе указания относительно приготовления препаратов хромосом амфибий (сроки гипотонии, состав гипотонической среды, время колхицинизации, доза колхицина и т.д.), как показал наш опыт, не дают удовлетворительных результатов, нами были разработана собственная модификация этой методики. В брюшную полость животного на 5 часов вводится 0,5 мл 0,1% раствора колхицина в

дистиллированной воде для накопления клеток в стадии метафазы митоза. Длительная, 7 часов и более, колхицинизация нецелесообразна, так как приводит к резкой конденсации хромосом и делает невозможным цитогенетический анализ. Выделенные по описанной выше методике спленоциты заливаются дистиллированной водой (5 мл) на 2 часа при комнатной температуре. Менее жесткая гипотония не дает достаточного разброса хромосом на метафазных пластинках. По прошествии этого времени клетки центрифугировали (5 мин. при 2000 об./мин.), супернатант удаляли а осадок для фиксации ресуспензировапи в 6 мл охлажденной до -4°С смеси 96% этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) (приготовленной ех tempore) и инкубировали при этой температуре в течении 2 часов. Общепринятая двукратная смена фиксатора, по нашему опыту, не улучшает качество препаратов. После повторного центрифугирования и удаления супернатанта осадок ресуспензировали в 1 мл свежей фиксирующей смеси. Полученную взвесь по каплям наносили на мокрые, тщательно очищенные и охлажденные предметные стекла, высушивали методом поджигания и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Из-за низкого митотического индекса приходилось суммарно учитывать все подсчитанные метафазы в группе (не менее 200 пластинок в каждой группе на каждый срок).

Статистические методы

Результаты (представленные в виде M±SD) обрабатывали с использованием стандартного пакета программ «Statistica for Windows» с использованием t-критерия Стьюдента, критерия ~/2 и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфология и частота новообразований у бесхвостых амфибий и их морфологическая характеристика

У исследованных животных довольно часто встречались разнообразные образования на коже в виде язв, утолщений и аномальной пигментации. Аномальная пигментация была обусловлена гиперплазией меланоцитов в виде очагов в дерме и эпидермисе. Язвы имели, как правило, инфекционно-воспалительную природу. Утолщения были вызваны главным образом кровоизлияниями в толщу кожи. В двух случаях сильно утолщенных конечностей у серых жаб гистологически обнаружено образование костной мозоли. Лишь три раза нам встретились истинные опухоли кожи: аденома кожных желез у остромордой лягушки, ранее неоднократно описанная многими авторами и две другие опухоли, диагностированные как пигментированные фибропапилломы, найденные нами впервые. Таким образом, все три найденные нами опухоли кожи имели доброкачественный характер.

Кроме опухолей кожи, нам удалось найти также 2 случая опухолей системы крови и один случай опухолевого поражения легких. Неоплазмы крови были представлены хроническим миелолейкозом у лягушки и эритромиелозом у серой жабы. В литературе отсутствуют описания случаев спонтанных и экспериментальных лейкозов мнелоидного происхождения у амфибий. В обоих представленных случаях найдены в значительном числе недифференцированные клетки эритроидного (у серой жабы) и гранулоцитарного нейтрофильного (у остромордой лягушки) ростков кроветворения с соответствующими цитологическими и гистологическими изменениями в кроветворных органах, вполне соответствующих признакам лейкозов у других позвоночных (Dawe C.J, 1969, Гольдберг Е.Д., 1989). Отличием от других позвоночных животных служит интенсивная пролиферация гемопоэтических клеток в периферической крови, что, очевидно, может быть связано с особенностями кроветворения у амфибий, в частности, с возможностью выхода в кровоток единичных пролиферирующих клеток в физиологических условиях в весеннее время года.

Еще в одном случае были обнаружены разрастания опухолевой ткани на поверхности обоих легких. Гистологически опухоль может быть определена как низкодифференцированная полиморфноклеточная саркома. Учитывая характер роста опухоли (в виде солидных очагов или муфт вокруг сосудов), гистологическое строение (крупные полигональные клетки), прорастание опухолью лишь периферических отделов легкого мы полагаем, что данная опухоль является саркоматозной мезотелиомой с гематогенными метастазами в печень и почки. Распространение опухоли на оба легких в виде множественных очагов, по-видимому, произошло имплантационным путем.

Необходимо сказать несколько слов о других исследованных нами животных. При анатомическом исследовании в нескольких случаях найдены опухолевидные образования в печени и на стенке пищеварительного тракта, микроскопически оказавшиеся инкапсулированными паразитами. Истинные опухоли других органов не отмечены.

Общая частота опухолей в исследованной нами выборке у лягушек составила 0,72%, тогда как у жаб Bufo bufo опухоли были найдены у 0,98% животных. Однако, такое сравнение некорректно, и адекватным является сравнение частот неоплазм злокачественного характера. У лягушек они были обнаружены у 0,48% животных, у жаб - 0,32% (доброкачественные - 0,24 и 0,64% соответственно). Несмотря на небольшой объем выборки, все выявленные различия оказались достоверными (р=0,0000), т.е. у жаб доброкачественные опухоли встречались чаще, а злокачественные - реже, чем у лягушек (рис. 1).

Существует несколько работ, посвященных изучению частот спонтанных опухолей у бесхвостых амфибий, проведенных в 80-х годах в Эстонии (Г.Т.Кобзарь и С.А.Карлова (1984), на Rana temporaria и Bufo bufo) и Ленинградской области (В.В.Елисеев и В.В.Худолей (1981), на Rana temporaria и Rana ridibunda), данные которых можно сопоставить с нашими.

Это сопоставление показывает значительно большую поражаемость опухолями жаб в популяции, обитающей в Кемеровской области по сравнению с эстонской популяцией, при исследовании несколько большей выборки вообще не удалось обнаружить опухолей у этих животных (Кобзарь Г.Т., Карлова С.А., 1984). Очевидно, это связано со значительно более неблагоприятными экологическими условиями на территории Кемеровской области. Более низкая частота новообразований у исследованных нами лягушек но сравнению с ленинградской популяцией (0,72 и 2,5% соответственно),быть может, отчасти обусловлена небольшими размерами сравниваемых выборок или может быть обусловлена генетическими особенностями исследованных популяций. Кроме того, в работе В.В. Елисеева и В.В. Худолея (1980) речь шла исключительно о доброкачественных новообразованиях, тогда как нами обнаружены и злокачественные опухоли. Таким образом, в ленинградской популяции R.ridibunda и R.temporaria наблюдалась только более высокая частота доброкачественных аденом, но не злокачественных опухолей. В работе Г.Т. Кобзаря и С.А. Карловой (1984) у эстонских лягушек были найдены не только аденомы, но и злокачественные аденокарциномы, однако, частоту их авторы не сообщают. По-видимому, частое образование доброкачественных аденом кожи (но не истинных злокачественных неоплазм) можно считать видовой особенностью Rana temporaria и Rana ridibunda.

Число опухолей, %

li

0,9 0,8 0,7

Рэ-(=0,000

0,6 0,5 0,4 0,3 0Л 0,1 0

р«.2=0,000

^ • злокачественные

доброкачественные

Rarvalis и Bufo bufo R-ridibunda

Рис. 1. Частоты опухолей в исследованных выборках жаб (Bufo bufo) и лягушек (Rana arvalis и Rana ridibunda).

Морфологические изменения клеток печени и костном мозге при действии МНМ

Морфологические изменения клеток печени жаб и лягушек при действии МНМ были в общем сходными и соответствовали состоянию гиперфункции этого органа. У значительного числа клеток отмечено значительное увеличение размеров клеток и базофилии цитоплазмы (при окраске по Гимзе) с образованием светлого «дворика» возле ядра. Ядра таких клеток крупные, гиперхромные, с мелкозернистым хроматином и неправильными контурами. Среди таких клеток нередко отмечались фигуры митотического деления, некоторые клетки содержали микроядра. Указанные изменения были выражены в разных клетках в неодинаковой степени, что свидетельствует о функциональной гетерогенности популяции гепатоцитов амфибий. Встречались и гибнущие клетки с пикнотическими ядрами. Интересной особенностью печени подопытных жаб является присутствие большого количества лимфоидных клеток, среди которых часто (до 0,5%) встречаются фигуры митозов. Необходимо также отметить большой полиморфизм ядер этих клеток. Характерно, что количество лимфоцитов в печени у жаб достоверно выросло по сравнению с контролем (от 9,0+3,6% до 14,4 ±1,6%; р=0,0019); у лягушек таких изменений не выявлено. Не наблюдалось и достоверных изменений в числе макрофагов в печени у лягушек. У жаб, напротив, этот показатель достоверно возрос (от 0,65 ±0,65% до 6,8 ±3,6%; р=0,0032). Интересно, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий от контроля, в опытных группах у лягушек выявлена статистически значимая высокая корреляция между содержанием макрофагов в печени и митотическим индексом в гепатоцитах (г = +0,81; р=0,03). Не исключено, что макрофаги в этом случае могут выступать как регуляторы пролиферации печеночных клеток. Морфологические изменения в костном мозге амфибий при введении МНМ заключались лишь в более выраженной гибели полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов, особенно у лягушек.

Митотическиая активность и частота цитогенетических аберраций (микроядерный тест) в соматических клетках бесхвостых амфибий при введении МНМ

Результаты изучения частот микроядер, митозов, количества лимфоцитов и макрофагов в печени и костном мозге животных опытных групп в сравнении с контролем представлены в табл. 1-3. Исследование частот микроядер в гепатоцитах контрольных животных не обнаружило достоверных видовых различий (р>0,1). У жаб этот показатель составил 8,3±1,1о/оо, у остромордой лягушки - 8,0±0,8 о/оо, а у озерной - 7,5 + 0,3. При введении МНМ частоты микроядер во всех группах достоверно возросли (р=0,000). В опытных группах удалось выявить небольшие различия между исследованными видами. Наибольшее число микроядер найдено в печени

жаб (16,0 ±0,9 о/оо, р=0,0007 при сравнении с R.arvalis и р=0,07 при сравнении с R.ridibunda), несколько менее - у прудовой (15,5 + 0,36 о/оо, при сравнении с R.arvalis р=0,04) и еще менее - у остромордой лягушки (14,81 ±0,57 о/оо). Частота микроядер в костном мозге у жаб и озерных лягушек достоверно увеличилась по сравнению с контролем (от 8,5 ±0,47 и 13,8+6,6 о/оо в контроле до 15,9±0,9 и 24,0±1,0 о/оо в опыте соответственно; р=0,0000 и р=0,009), тогда как у остромордой лягушки эти изменения были недостоверными (16,5 ±9,1 о/оо в контроле и 27,5 ± 12,5 о/оо в опыте; р=0,1). Частота микроядер в костном мозге у подопытных Bufo bufo оказалась достоверно меньше, чем у R. arvalis и R. ridibunda (р=0,014 и р=0,01 соответственно). Однако корректное сравнение данных о частотах микроядер в костном мозге затруднено в связи с различиями в его цитологическом составе, который сказался на частоте микроядер (см. ниже). Поэтому, приходится принимать во внимание только результаты, полученные на клетках печени. Этот факт позволяет говорить о том, что различия антимутагенных систем этих животных находятся не на уровне инактивации канцерогена (иначе число индуцированных МНМ цитогенетически измененных клеток у жаб было бы выше), а на уровне элиминации мутантных клеток.

Для исследования динамики элиминации аберрантных клеток нами были выполнены эксперименты с воздействием другого алкилирующего агента (аналога МНМ) - ломустина (см. ниже).

Механизмы образования микроядер у бесхвостых амфибий в клетках печени и костного мозга в норме и при действии МНМ

Исследование частот митозов в препаратах печени обнаружило достоверное повышение этого показателя у жаб (от 0 до 0,16±0,13%; р=0,002). У остальных животных изменения частот митозов в печени были недостоверными (р>0,1). Частоты митозов и микроядер у подопытных животных не обнаружили корреляции между собой ни в одной группе. Как было указано в предыдущем разделе, частота микроядер у жаб и озерных лягушек после введения МНМ достоверно увеличилась по сравнению с контролем. При этом показатели микроядерного теста имели статистически значимые различия между опытными группами R.arvalis и B.bufo (р=0,0007); аналогичные различия в контроле имели характер тенденции (р=0,08). Что касается интерпретации данных о частотах микроядер в клетках костного мозга, то нужно, прежде всего, отметить большие отличия его цитологического состава у исследованных животных. У лягушек всех групп содержание лимфоидных клеток бьшо в 3-4 раза выше, чем у жаб, причем во всех случаях р<0,05. По-видимому, это обстоятельство сказалось на результатах микроядерного анализа, поскольку известно, что лимфоидные клетки обладают повышенной цитогенетической нестабильностью и у них часто выявляются разнообразные хромосомные нарушения (Ильинских H.H.

и соавт., 1992). Действительно, у лягушек в опытных группах выявлена корреляция между частотами микроядер и количеством лимфоцитов в костном мозге, носящая характер сильной тенденции (г = +0,61; р=0,062). Еще более сильная зависимость этих параметров отмечена у контрольных жаб (г = +0,96; р=0,01). При этом показатель митотической активности в костном мозге у остромордых лягушек достоверно снизился после воздействия МНМ с 0,51 ±0,17% до 0,09 ±0,23% (р=0,029), а у жаб практически не изменился (0,42 + 0,38% в контроле и 0,46+0,37% в опыте; р~0,84). Количественный учет патологических фигур кариокинеза был затруднен невысокими показателями митотической активности, особенно у лягушек в опытных группах. Этот показатель у подопытных жаб колебался от 12 до 20%; в контроле он не превышал 3%. Среди форм патологии деления клеток отмечены отставания в ана- и метафазе целых хромосом и ацентрических фрагментов, а также К-митозы и неравнополюсные митозы, т.е. те процессы, которые классически связывают с образованием микроядер (Алов И.А., 1972, Ильинских H.H. и соавт., 1992). Между тем, изучение зависимости изменений митотического режима и частот микроядер показало высокую положительную корреляцию между этими показателями лишь в костном мозге контрольных жаб (г = +0,96; р<0,01). Во всех остальных случаях достоверной корреляции между частотами микроядер и митотической активностью не отмечено (р>0,1). Стоит обратить внимание на факт значительно более высоких частот микроядер в костном мозге опытных (р<0,05) и контрольных лягушек по сравнению с жабами, хотя в контроле это различие имеет характер тенденции (р=0,08). Изучение содержания лимфоидных клеток в костном мозге показало что, как в опытной, так и в контрольной группах оно в 3,5 раз больше у лягушек по сравнению с жабами (р<0,01). При этом у контрольных жаб обнаружена достоверная положительная (г = +0,90; р<0,037), а у лягушек - положительная корреляция, имеющая характер тенденции (р=0,06) между содержанием лимфоцитов и числом микроядер в костномозговой ткани. Объяснение такой связи заключается, по-видимому, в том, что лимфоциты характеризуются большей нестабильностью генома и у них чаще выявляются различные цитогенетические аномалии, в т.ч. и микроядра. Между тем, нам ни разу не приходилось отмечать фигуры митотического деления в лимфоцитах костного мозга подопытных лягушек (хотя в некоторых случаях относительное содержание этих клеток превышало 90%). При этом, исследование морфологии клеток печени и костного мозга выявило значительное число клеточных элементов с т.н. «хвостатыми ядрами», количество которых особенно велико среди лимфоцитов, где оно в некоторых случаях превышает 4%. Эти образования не всегда легко отличить от микроядер, что ранее было отмечено некоторыми авторами (Никифоров A.M. и соавт., 2000). Несмотря на цитогенетическую неоднородность этого термина (происхождение «хвостатых ядер» приписывают не только интерфазной деминуции хроматина, но и с анафазным и телофазным мостам,

образуемыми дицеитрическими хромосомами, а также аномально удлиненным плечам хромосом), отдельные авторы признают их роль в генезе микроядер (Колюбаева С.Н. и соавт., 1986). По классификации A.M. Никифорова и соавт. (2000), это бькш «хвостатые ядра» преимущественно 3-го и 14-го, а также 1-го и 5-го типов, образование которых как раз и связывают с интерфазной экструзией хроматина. Нередко наряду с «хвостатым ядром» в клетке встречается одно или несколько микроядер.

Таким образом, отсутствие достоверной связи между показателями митотической активности клеток печени и костного мозга у подопытных жаб и подопытных и контрольных лягушек, преимущественное наличие микроядер в лимфоцитах (содержание которых в некоторых случаях прямо пропорционально коррелирует с показателями микроядерного анализа) при полном отсутствии митозов в лимфоидных клетках лягушек опытной группы и картины «хвостатых ядер» свидетельствуют о том, что наряду с классическим кариокинетическим механизмом образование микроядер у бесхвостых амфибий может происходить и путем т.н. деминуции (выброса) интерфазного хроматина. Такой путь генеза микроядер имеет место и у нормальных животных, особенно в лимфоцитах, однако его вклад значительно возрастает при мутагенном воздействии МНМ. Этот факт нужно учитывать при цитогенетической интерпретации данных микроядерного теста, полученных на бесхвостых амфибиях.

Сравнительная динамика элиминации генетически аберрантных клеток у

видов с разной восприимчивостью к опухолевому росту после импульсного воздействия атилирующим канцерогеном ломустином

По результатам микроядерного анализа (рис.2) видно, что в контроле отмечались небольшие различия, имеющие характер тенденции (2,5±0,31 о/оо у жаб и 3,0±0,28 о/оо у лягушек, р=0,07). Митотическая активность у этих животных достоверно различалась - 5,1±2,0 о/оо у лягушек и 2,4±1,38 о/оо у жаб (р=0,03). На 3-й день число микроядер в лимфоцитах жаб снизилось по сравнению как с контролем (до 1,9±0,48 о/оо, недостоверно -р=0,056) так и с лягушками (частота микроядер 3,7±0,3 о/оо, р-0,011). Последнее различие, очевидно, произошло за счет достоверного подъема частот микроядер у лягушек по сравнению с контролем (р=0,017). Эти изменения были ассоциированы со снижением митотической активности у лягушек (до 1,2±0,94 о/оо) по сравнению с жабами (до 2,7±0,58 о/оо, отличие от лягушек р=0,048) и, следовательно, уменьшением скорости обновления популяции спленоцитов. На 7-й день число клеток с микроядрами у лягушек составило 3,5±1,14 о/оо, а у жаб 3,2±0,88 о/оо, достоверно эти показатели не различались (р=0,8). Не отличался и уровень митотической активности (2,9±2,14 о/оо у лягушек и 4,4±3,46 о/оо у жаб, р=0,5). То же самое было отмечено на 15-й день (частоты клеток с микроядрами у жаб 4,1 ±0,36 о/оо, у лягушек 6,3±2,7 о/оо, р=0,2; митотическая активность 2,3±0,48 о/оо и 4,8±2,75 о/оо соответственно, р=0,1). От контрольного уровня частоты

микроядер отличались у жаб и лягушек только на 15-й день (р=0,0003 и р=0,0007 соответственно), на 7-й день отличия были недостоверными (р=0,2 и р=0,45 соответственно).

- Остромордая лягушка (Rana arvalis)

- Серая жаба (Bufo bufo)

Рис. 2. Динамика содержания клеток с микроядрами в популяции спленоцитов у серых жаб и остромордых лягушек после внутрибрюшинного введения ломустина.

Совсем другую картину представляли собой данные анализа повреждений в метафазных хромосомах (рис.3). Основную часть из них представляли аберрации по числу хромосом - анеуплоиды. В опытной группе отмечались главным образом структурные аберрации хромосом. Разнообразие генетических повреждений было довольно велико: отмечались хроматидные разрывы, обмены, ацентрические фрагменты, пробелы. Реже встречались аберрации, имитировавшие действие радиации - парные фрагменты, дицентрики, центрические кольца, транслокации и очень редкие аберрации типа «надетости» кольцевой хромосомы на палочковидную. Что касается анеуплоидов, а именно - гипердиплоидов, то их частоты в опытных группах по сравнению с контрольной группой не изменялись. Частоты гиподиплоидов колебались у отдельных особей как в опытной, так и в контрольной группах в очень широких границах и достоверно также не различались. По-видимому, они представляли собой артефакт, связанный с повреждением клеток при приготовлении препаратов, в связи с чем в итоговой сумме их не учитывали. Различия в контрольном уровне цитогенетических аберраций были недостоверными. В то же время на 3-й день число повреждений в метафазных хромосомах у жаб и лягушек составило 27% и 25% соответственно. Различия эти были недостоверными (х2=0,15; р=0,7). На 7-й день у жаб число клеток с аберрациями было на

уровне 21%, а у лягушек поднялось до 28%, различия эти продолжали оставаться недостоверными (х2=1,72; р=0,19). Только на 15-й день опыта были зарегистрированы достоверные различия в уровне метафазных пластинок с нарушениями кариотипа; у жаб число клеток с хромосомными нарушениями составило 12,5%, а у лягушек - 29% (х2=15,06; р=0,001). Нужно сказать, что все различия были обусловлены структурными аберрациями хромосом, в меньшей степени (на 15-е сутки), полиплоидами. Частоты анеуплоидов (как гиперплоидов, так и гипоплоидов) между всеми группами животных достоверно не различались.

о

ж

сутки

Рис. 3. Динамика метафазных пластинок с хромосомными аберрациями из популяции спленоцитов у серых жаб и остромордых лягушек после внутрибрюшинного введения ломустина.

Как можно интерпретировать полученные данные? Прежде всего, следует обратить внимание на динамику уровня лимфоцитов с микроядрами.

У лягушек их число непрерывно нарастало, достигая достоверных отличий от жаб уже на 3-й день опыта. У жаб на 3-й день число микроядер было несколько снижено за счет сохранения уровня пролиферации (напомним, что у лягушек, судя по митотическому коэффициенту, она резко снизилась), что, по-видимому, и было причиной более быстрого обновления популяции спленоцитов. Что же касается общей динамики накопления лимфоцитов с микроядрами, то она была сходной с таковой у лягушек, хотя достоверные отличия от контроля здесь были достигнуты только на 15-е сутки, т.е. позднее, чем у лягушек. Исходя из этого очевидно, что клетки с микроядрами у этих животных элиминируются с разной интенсивностью (интенсивнее у жаб), но не исключено, что указанные различия могут быть обусловлены как динамикой клеточной популяции, так и тем, что микроядра

у амфибий могут иметь разное происхождение. Как нами было показано выше, у земноводных микроядра частью происходят без непосредственной связи с митозом, путем интерфазной деминуции хроматина. В связи с этим данные образования могут иметь разную связь с мутагенезом, по крайней мере, их происхождение может не соответствовать тем процессам, которые приводят к повреждениям, видимым в метафазных хромосомах. В данном случае отмечалась достоверная корреляция результатов микроядерного теста с митотической активностью только на 15-й день, причем характерно, что у жаб она была отрицательная (1= -0,9; р=0,037), тогда как у лягушек -положительная (г=0,88; р=0,02), что вполне соответствует утверждению о различиях в происхождении микроядер. Данные, полученные методом анализа повреждений в метафазных хромосомах, показывают, что у серой жабы после достижения определенного уровня аберраций, на 3-й день превышающего (хотя и не достоверно) таковой у лягушек, далее отмечается неуклонная динамика снижения частоты метафаз с повреждениями хромосом, тогда как у лягушек, напротив, происходит медленное нарастание частот цитогенетических аберраций.

Интересно, что в наших экспериментах с введением бесхвостым амфибиям ломустина наблюдалось повышение числа полиплоидных метафаз в селезенке с 0 до 8% в опыте с лягушками на 15 день после инъекции мутагена. В другие сроки опыта полиплоиды в популяции делящихся спленоцитов отмечены не были.

Все эти данные говорят о том, что, действительно, существует прямая связь между способностью поддерживать цитогенетический гомеостаз путем элиминации аберрантных клеток с резистентностью вида к канцерогенным воздействиям и низкой частотой спонтанных опухолей. Это, прежде всего, касается способности устранять клетки со структурными повреждениями хромосом, тогда как геномные нарушения, часть из которых представлена клетками с микроядрами, произошедшими путем интерфазной диминуции хроматина, подвергаются контролю и элиминации весьма слабо.

Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными И.В.Урываевой (1979), согласно которым частоты клеток со спонтанными цитогенстическими аберрациями достоверно меньше у морских свинок по сравнению с мышами и крысами, что соответствует значительно большей устойчивости морских свинок к развитию опухолей. Все это указывает на то, что причины различной поражаемости опухолевым ростом некоторых видов в разных классах позвоночных животных сходны.

Роль гибели клеток с морфологическими признаками апоптоза (ГКМПА) в генетическом гомеостазе у животных с разной межвидовой конститутивной невосприимчивостью к опухолевому росту

Достоверных различий между лягушками и жабами по частотам погибающих спленоцитов не отмечено ни в контроле (0,9±0,52 % у лягушек и 0,39±0,28 % у жаб, р=0,17), ни на 3-й (0,5±0,32 %у лягушек и 0,8±0,49 % у

жаб р=0,52), ни на 7-й (0,63±0,3 % у лягушек и 0,73±0,39 % у жаб, р=0,7) ни на 15-й день после введения ломустина (0,52±0,22 % и 0,41±0,27 %, р=0,6). Не найдено достоверных отличий у животных опытных групп по сравнению с контролем на разных сроках наблюдения. Однако, интересно отметить наличие достоверных положительных корреляций между митотической активностью и гибелью клеток у контрольных лягушек (г = +0,99; р=0,000015) и лягушек в опытной группе на 15-й день эксперимента (г = +0,99; р=0,0003), а также у жаб на 7-й день (г = +0,90; р=0,037) после введения ломустина. В то же время нами была отмечена высокая достоверная отрицательная корреляция между уровнем клеток с микроядрами и числом гибнущих клеток у контрольных лягушек (г = -0,77; р=0,044); у жаб этой зависимости не отмечено. На 15-й день после введения мутагена у лягушек также отмечена достоверная высокая корреляция между уровнем клеток с признаками апоптоза и клеток с микроядрами (г = +0,89; р=0,01). Парадоксальный на первый взгляд положительный характер корреляции объясняется указанной выше положительной корреляцией между митотической активностью и апоптозом с одной стороны, и положительной зависимостью между показателями микроядерного теста и частот митозов -с другой (г = +0,89; р=0,02).

Таким образом, в этом случае положительная корреляция между частотой микроядер и гибнущих с признаками апоптоза клеток была обусловлена как зависимостью уровня апоптоза от скорости пролиферации, так и связью с митозом процесса образования микроядер. Эти связи экранировали роль апоптоза как механизма элиминации клеток с микроядрами.

Из приведенных данных следует, что разная интенсивность элиминации аберрантных клеток путем ГКМПА не лежит в основе межвидовых различий в восприимчивости к опухолевому росту. Об этом свидетельствует то, что у лягушек, несмотря на их высокую поражаемость злокачественными новообразованиями и низкую устойчивость к мутагенным воздействиям по сравнению с жабами, наблюдалась в норме корреляция между числом клеток с микроядрами и ГКМПА, тогда как у жаб такой связи не отмечено, а частоты гибнущих клеток у этих животных не различались. Этот факт демонстрирует участие ГКМПА в цитогенегическом гомеостазе, но показывает, что он, по-видимому, не играет роли в обеспечении видовой противоопухолевой резистентности. Не удалось обнаружить также четкой связи мутагенного эффекта с уровнем ГКМПА у обоих видов, кроме опосредованной через корреляцию с пролиферацией прямой зависимости между упомянутыми показателями на 15 день опыта. Следовательно, в данном эксперименте выявился весьма слабый эффект апоптоза как фактора регуляции цитогенетического гомеостаза в условиях воздействия мутагенным агентом. Значительно ярче оказалось его значение как механизма, компенсирующего избыточную пролиферацию. Об этом же косвенно говорят данные Н.Н.Ильинских и соавт. (1992), полученные на культурах фибробластов человека, в которых при инфицировании вирусом

кори не отмечалось зависимости между гибелью и динамикой клеток с микроядрами: количество погибающих клеток монотонно возрастало с увеличением времени культивирования, тогда как число клеток с микроядрами претерпевало сложные фазные изменения.

Таким образом, все эти данные, полученные при экспериментальном и эволюционном исследовании роли ГКМПА в цитогенетическом гомеостазе и опухолевом росте, показывают, что эта роль заключается, прежде всего, в балансе тканевого роста, в регуляции пролиферации. Несомненно, что ГКМПА имеет также определенное значения и с точки зрения цитогенетического гомеостаза, но оно выявляется менее убедительно, особенно при воздействии алкилирующим мутагенным агентом.

Реакция макрофагальной системы амфибий на аберрантные клетки, возникающие при действии канцерогена

В опыте с введением МНМ, а также у контрольных животных содержание макрофагов в костном мозге достоверно не различалось в сравниваемых группах (во всех случаях р>0,1). Наряду с этим, была выявлена достоверная положительная корреляция между частотой клеток с микроядрами и содержанием макрофагов в костном мозге у жаб опытной группы (г = +0,68; р<0,05). Чем была обусловлена такая связь, сказать трудно. С одной стороны, возможно, что под влиянием алкилирующего мутагена произошло рекрутирование макрофагов в костный мозг. С другой стороны, не исключено, что введение МНМ приводило к активации в этих клетках продукции свободных радикалов, которые давали дополнительный мутагенный эффект. Несмотря на эти неопределенности, был отмечен интересный факт, что у животных этой группы макрофаги обладали явным цитотоксическим эффектом по отношению к аберрантным клеткам - в препаратах встречались картины фагоцитоза макрофагами клеток, содержащих микроядра. Биологический смысл этого процесса и его связь с видовой невосприимчивостью к опухолевому росту у амфибий нуждаются в дальнейшем исследовании. Не исключено, что он может иметь характер неспецифического механизма элиминации цитогснетически дефектных клеток и в этом заключается его роль в противоопухолевом иммунитете у жаб.

Для изучения этой связи мы исследовали содержание макрофагов в селезенке подопытных животных и их соотношение с частотами гибнущих клеток, митотической активности и частотой цитогенетических аномалий (клеток с микроядрами). Ни у контрольных животных, ни у подопытных относительное содержание макрофагов в селезенке достоверно не различалось (везде р>0,05). Не обнаружено и межвидовых различий в частоте этих клеток среди спленоцитов (р>0,1). Если у контрольных животных число макрофагов было равно 1,2±0,6% (у И-атИэ) и 0,9+0,1% (у В.Ьи1о), то на 3-й день оно составило 0,8±0,5% и 0,66±0,54%, на 7-й - 1,5+1,0% и 1,5±1,0% и, наконец, на 15-й - 2,85+1,4% и 1,7±0,84% соответственно. Можно отметить

лишь, что среднее содержание макрофагов среди спленоцитов имело тенденцию к увеличению с увеличением срока опыта (различия между контролем и 15-м днем опыта в обоих случаях были при р=0,08). Однако, исследование у контрольных жаб была выявлена очень отчетливая отрицательная корреляция между числом клеток с микроядрами и относительным содержанием макрофагов в селезенке (г=-0,85; р=0,015), чего не было у лягушек. В других группах таких корреляций найдено не было.

Эти данные интересно сопоставить с результатами изучения зависимости между интенсивностью ГКМПА и частотой микроядер. А именно — у контрольных лягушек была выявлена жесткая обратная зависимость между числом микроядер и уровнем ГКМПА а в клетках селезенки (г=-0,77; р=0,044) и отсутствовала связь между численностью макрофагов и микроядрами. У жаб, как мы видим, отмечены обратные соотношения. Это позволяет сделать предположение, что у жаб и лягушек в физиологических условиях цитогенетический гомеостаз поддерживается разными механизмами. Очевидно, что у лягушек такую роль в большей степени выполняет элиминация аберрантных клеток путем ГКМПА, а у жаб -за счет распознавания и фагоцитоза макрофагами.

К сожалению, при индукции мутагенеза ломустином не удалось увидеть четкой роли этих двух факторов в поддержании цитогенетического гомеостаза. Нам кажется, что существенную роль здесь сыграло неоднозначная связь микроядер с повреждениями хромосом и происхождении части из них путем интерфазной экструзии хроматина. На это указывает наличие отрицательной корреляции между митотической активностью и числом микроядер у жаб на 15-й день и зависимости между этими параметрами у жаб и лягушек на остальных сроках опыта (кроме положительной корреляции, имевшей место у лягушек на 15-й день). Таким образом, нами получены определенные данные, показывающие участие разных механизмов регуляции цитогенетического гомеостаза у амфибий, различающихся по восприимчивости к опухолевому росту. У лягушек за это отвечает элиминация клеток путем апоптоза, тогда как у жаб, главная роль принадлежит распознаванию и удалению таких клеток макрофагами. Последний механизм, очевидно, более эффективен, вследствие чего он обеспечивает большую резистентность к онкогенным воздействиям жаб по сравнению с лягушками. Эти соотношения выявляются в условиях физиологического мутагенеза.

ВЫВОДЫ

1. Спонтанные доброкачественные опухоли чаще возникают у жаб Bufo bufo в сравнении с лягушками R.arvalis и R.ridibunda (0,64%, и 0,24%, р=0,000). Напротив, злокачественные опухоли у жаб Bufo bufo встречаются реже, чем у лягушек (0,32%, и 0,48%, р=0,000). Ряд опухолей (фибропапиллюма кожи и эритромиелоз у жаб, мезотелиома плевры и хронический миелолейкоз у лягушек) зарегистрированы у низших

позвоночных впервые. Возникновение опухолевых поражений не было связано с гельминтозной инвазией.

2. Введение метилнитрозомочевины вызывает индукцию большего числа гепатоцитов с микроядрами у Bufo bufo (16,0±0,59 о/оо) по сравнению с лягушками (для R.arvalis 14,81±0,57 о/оо, р=0,0007, для R.ridibunda -15,5±0,36 о/оо; р=0,07). Следовательно, соматические клетки жаб не обладают большей устойчивостью к мутагенному действию метилнитрозомочевины.

3. После воздействия алкилирующим канцерогеном ломустином у жаб в селезенке наблюдается снижение клеток с повреждениями метафазных хромосом на 15-й день наблюдения по сравнению с лягушками (12,5% у R.arvalis и 29% у Bufo bufo, х2= 15,06; р=0,001), что является свидетельством активной элиминации клеток с аберрациями. Не было выявлено снижения частоты клеток с аберрациями хромосом у лягушек на протяжении всего срока опыта.

4. У интактных лягушек выявлена связь между частотой клеток с микроядрами и интенсивностью гибели клеток с морфологическими признаками апоптоза в селезенке (г = -0,77; р=0,044), тогда как у жаб частота спленоцитов с микроядрами отрицательно коррелировала с относительным содержанием в селезенке макрофагов (г=-0,85; р=0,015). Отмечен фагоцитоз макрофагами жаб клеток с микроядрами.

5. Полиплоидия является одной из форм ответа соматических клеток (спленоцитов) на воздействие алкилирующими мутагенами, причем у лягушек это явление встречается чаще, чем у жаб.

6. Микроядра у бесхвостых амфибий образуются двумя путями: как следствие аномальных митозов и как результат интерфазной деминуции («выброса») хроматина. Подобные механизмы имеют место как в норме, так и при воздействии алкилирующими мутагенами.

Практические рекомендации

1. При использовании микроядерного теста параллельно с регистрацией числа микроядер при действии того или иного предполагаемого мутагена (канцерогена) следует учитывать также наличие или отсутствие корреляции между митотической (пролиферативной) активностью клеток и результатами микроядерного анализа.

2. В связи с тем, что у бесхвостых амфибий выявлены лейкозы даже при исследовании сравнительно небольших выборок, скрининговое исследование крови может быть полезным при использовании этих животных в качестве тест-объектов для мониторинга канцерогенов во внешней среде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Манских В.Н. К вопросу о видовой устойчивости к канцерогенезу (к эволюционной патологии онкогенеза) [Текст] / В.Н. Манских // Сборник трудов, посвященный 70-летию 2-й муниципальной больницы г. Новокузнецка. - Новокузнецк. - 1999. - С. 403-406.

2. Манских В.Н. Метод окрашивания препаратов эритрозин-мстиленовым синим и его использование для изучения цитологии кроветворных органов больных лейкозами [Текст] / В.Н. Манских // Сборник научных работ учащихся. - Новокузнецк. - Издательство ИПК. - 1999. -С. 142-244.

3. Манских В.Н. Об одном вопросе эволюционной онкологии [Текст] /

B.Н. Манских // Актуальные вопросы медицинской биологии. - Томск. -Издательство СибГМУ. - 2002. - С. 29-30.

4. Манских В.Н. Морфологические изменения и мутагенез в клетках печени и костного мозга бесхвостых амфибий при действии N-mctilíi-N-нитрозомочевины [Текст] / В.Н. Манских // Сборник работ 62-й научно-практической студенческой конференции им.Н.И.Пирогова. - Томск. -Издательство СибГМУ. - 2003. - С. 284-285.

5. Манских В.Н. Опухоль кожи у обыкновенной жабы (Bufo bufo) [Текст] / В.Н. Манских // Вопросы онкологии. - 2003. - № 49 (3). -

C. 374-375.

6. Манских В.Н. К вопросу о спонтанных опухолях у амфибий [Текст] / В.Н. Манских И Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. -Томск. - Издательство СибГМУ. - 2004. - № 3 (1). - С. 175-176.

7. Манских В.Н. Очерки эволюционной онкологии [Текст] / В.Н. Манских // Томск. - Издательство СибГМУ. - 2004. - 174 с.

8. Манских В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза [Текст] / В.Н. Манских // Бюллетень сибирской медицины. - 2004. - № 3 (1). - С. 63-69.

9. Манских В.Н. Морфологические и цитогенетические изменения в паренхиматозных и иммунокомпетентных клетках печени и костного мозга бесхвостых амфибий при действии К-нитрозо№метилкарбамида (в связи с вопросом о видовой резистентности к опухолевому росту) [Текст] ! В.Н. Манских // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. - Томск. -Издательство СибГМУ. - 2004. -№4(1).- С.38-40.

10. Манских В.Н. К вопросу о правомочности выделения натуральных киллеров в самостоятельный класс иммунокомпетентных клеток [Текст] / В.Н. Манских // Естествознание и гуманизм. - Томск. - Издательство СибГМУ. -2005. - № 2 (1). - С. 34-36.

П.Манских В.Н. Смерть клетки: системный анализ некоторых ключевых проблем [Текст] / В.Н. Манских // Естествознание и гуманизм. -Томск. - Издательство СибГМУ. - 2005. - № 2 (1). - С. 22-26.

12. Манских В.Н. Влияние химических канцерогенов на амфибий [Текст] / В.Н. Манских // Вопросы онкологии. - 2006. - № 52 (1). - С. 25-31.

13. Манских В.Н. Натуральные киллеры - самостоятельный класс иммунокомпетентных клеток или совокупность функциональных субпопуляций? [Текст] / В.Н. Манских // Иммунология. - 2006. - 27 (1). -С. 56-57.

14. Манских В.Н. К вопросу о механизмах образования микроядер у бесхвостых амфибий в норме и при действии Т^-нитрозо-М-метил карбамида [Текст] / В.Н. Манских // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 141 (2). - С. 217-220.

15. Манских В.Н. Опухолевый рост как один из механизмов регуляции мутационного груза популяции [Текст] / В.Н. Манских // Биохимия. - 2006. -№71 (8).-С. 1148-1152.

16. Манских В.Н. Спонтанные неоплазмы крови у бесхвостых амфибий [Текст] / В.Н. Манских // Вопросы онкологии. - 2007. - № 53 (4). - С. 491-492.

17. Манских В.Н. Пути гибели клеток и их биологическое значение [Текст] / В.Н. Манских // Цитология. - 2007. - № 49 (11). - С. 909-915.

18. Манских В.Н. Гипотеза: фагоцитоз аберрантных клеток защищает долгоживущие виды позвоночных от опухолей [Текст] / В.Н. Манских // Успехи геронтологии. - 2008. - № 21 (1). - С. 27-33.

19. Манских В.Н. Возможная роль р53 в регуляции генетического гомеостаза и в противоопухолевом надзоре на уровне межклеточных взаимодействий [Текст] / В.Н. Манских // Вопросы онкологии. - 2008. -№ 54 (2). - Приложение. - С. 18.

Заказ 1060. Тираж 100. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы Несмотря на многоликость проблемы опухолевого роста, вряд ли вызывает сомнение существенная роль соматического мутагенеза в бластомогенезе. Не менее актуальным представляется вопрос о способности организма поддерживать генетический гомеостаз в популяциях соматических клеток. Эта проблема, на наш взгляд, имеет особый теоретический и практический интерес по двум причинам. Во-первых, бывшая длительное время очень популярной эволюционно-иммунологическая концепция M.F.Burnet (1971), приписывавшая ведущую роль в генетическом гомеостазе и канцерогенезе системе специфического иммунитета, вызывает большие сомнения, которые достигли особой остроты в настоящее время (В.М.Перельмутер, 1983; Р.М.Хаитов и соавт., 2001; В.М.Головизнин, 2001). Очень немногочисленны исследования, посвященные изучению сравнительных аспектов других механизмов генетического гомеостаза -репарации ДНК, программируемой гибели клеток и др. Изучение этих вопросов тем более необходимо, поскольку такой подход позволит не только дать адекватную оценку современным онкоиммунологическим и онко-генетическим концепциям, но и выявить новые способы управления канцерогенезом, что важно для рациональной профилактики и лечения злокачественных опухолей (Н.В. Васильев, 1988). Наиболее перспективным подходом для достижения указанной цели является исследование механизмов, обеспечивающих неодинаковую чувствительность разных видов животных к канцерогенным факторам. Такой подход может помочь в поиске путей управления канцерогенезом исходя из того, каким образом это было достигнуто в ходе эволюции некоторых видов животных, которые отличаются низкой частотой спонтанных опухолей и резистентностью к канцерогенным воздействиям в эксперименте.

Эти данные могут значительно дополнить сведения, полученные при исследовании оппозитных линий мышей. Известно, что колебания частот спонтанных и экспериментальных опухолей у животных разных линий в настоящее время связывают с особенностями обмена, а также с присутствием в геноме определенных линий онкогенных вирусов и мобильных генетических элементов (Худолей В.В., 1979; Percy D.H., Barthold S.W., 2007).

Исследование канцерогенеза и механизмов регуляции цитогенетического гомеостаза у амфибий является весьма удобной моделью для решения указанных проблем, тем более, что земноводные представляют собой одно из ключевых звеньев филогенеза позвоночных (В .В.Худо лей, 1992; 1993; 1995), а своеобразный характер таксономического распределения и эволюции противоопухолевой резистентности позволяет переносить полученные выводы на всех позвоночных. Известно, что разные семейства класса земноводных в различной степени поражаются опухолевым ростом -частоты опухолей у жаб (сем. Bufoniae) 2-3 раза меньше, чем у настоящих лягушек (сем. Raniae) (Pliss G.B. et al., 1982; Sakr S.A. et al.,1989; Худолей B.B., 1976, 1993, 1999). Причины, лежащие в основе этих различий, до настоящего времени не ясны (Худолей В.В., 1995, 1999). Исследование механизмов элиминации клеток с поврежденным геномом на модели двух видов, отличающихся по восприимчивости к опухолевому росту после действия генотоксического канцерогена способствует более глубокому пониманию стадии инициации канцерогенеза и механизма малигнизации предраковых состояний, что имеет большое фундаментальное и клиническое значение.

Помимо всего прочего, нужно заметить, что амфибии представляют собой идеальный объект для скрининговых исследований на мутагенность с помощью цитогенетических методов, например, микроядерного анализа (Ильинских Н.Н. и соавт., 1992; Hayes J. et al., 2009; Yin X.H. et al., 2009). Однако проблема образования микроядер в соматических клетках амфибий, как и вообще вопрос о механизмах микронуклеогенеза, остается дискуссионным.

Вполне естественным, с точки зрения вопроса о межвидовых различиях в восприимчивости к опухолевому росту у амфибий, является интерес к изучению частот и гистологического спектра спонтанных опухолей. Спонтанные новообразования у амфибий широко изучаются и в настоящее время имеется ряд обобщающих работ, посвященных этой теме (Balls М., Ruben R.H., 1974; В.В.Худолей, 1976; Tsonis Р.А. и Tsonis К., 1988 и др.). Внимание исследователей к этой группе животных связано, прежде всего, с перспективами использования низших позвоночных как объектов для изучения условий повышенного риска канцерогенеза, особенно в связи с проблемой индикации бластомогенных агентов во внешней среде, что очень важно в плане решения проблемы первичной профилактики рака (Г.Б.Плисс, В.В.Худолей, 1979; В.В.Худолей, 1975; 1993). Среди работ, посвященных этой проблеме, большинство выполнено на представителях класса костистых рыб, хотя имеется и немало исследований, проведенных на амфибиях (Neucomme S., 1973; Rose, 1976; Г.Б.Плисс, В.В.Худолей, 1979; В.В.Елисеев,

B.В.Худолей, 1980; В.В.Худолей, С.П.Боговский, 1982; Г.Т.Кобзарь,

C.А.Карлова, 1984; В.В.Худолей, 1993). Согласно полученным данным, имеется зависимость между содержанием нитрозоаминов, их предшественников и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) во внешней среде и частотой опухолей у обитающих в ней организмов. Кроме того, И.А.Велдре и соавт. (1982), а также В.В.Худолей (1981) было установлено, что низшие животные способны накапливать в тканях бластомогенные вещества, обнаружение которых во внешней среде классическими химическими методами представляет определенные трудности из-за низких концентраций. В связи с этим изучение спонтанных опухолей у бесхвостых амфибий имеет значение не только для эволюционной, но и для экологической онкологии.

Цель работы

Исследовать роль механизмов поддержания генетического гомеостаза в обеспечении межвидовых различий в восприимчивости к опухолевому росту на модели бесхвостых амфибий, а также получить морфологические данные о спонтанных опухолях у этих животных.

Задачи работы

1. Получить данные о спонтанных опухолях у двух видов бесхвостых амфибий с разной восприимчивостью к опухолевому росту (остромордая лягушка, Rana arvalis и серая жаба, Bufo bufo).

2. Выяснить, существуют ли различия в морфологических изменениях и интенсивности мутагенеза в печени и костном мозге при действии метилнитрозомочевины у трех видов бесхвостых амфибий, принадлежащих к семействам (настоящие жабы, Bufoniae и настоящие лягушки, Raniae), различающимся по частотам возникновения спонтанных и индуцированных опухолей.

3. Путем изучения динамики элиминации аберрантных клеток, а также ее связи с митотической активностью, интенсивностью фагоцитоза и содержанием макрофагов в селезенке после введения ломустина выявить роль и возможные механизмы генетического гомеостаза, обеспечивающие видовые различия в устойчивости к опухолевому росту.

4. Выяснить отношения между образованием микроядер, особенностями цитологического состава, морфологии клеточных элементов и митотической активностью в тканях печени и костного мозга жаб и лягушек в норме и при действии метилнитрозомочевины.

Научная новизна

1. Показано, что элиминация клеток с повреждениями метафазных хромосом у животных с меньшей видовой предрасположенностью к развитию опухолей (Bufo bufo) происходит гораздо быстрее, чем у более предрасположенного к опухолевому росту вида того же класса (R.arvalis).

2. Установлено, что макрофаги серой жабы активно поглощают клетки с цитогенетическими аберрациями и их число в селезенке, в отличие от макрофагов остромордых лягушек, находится в обратной зависимости с частотой клеток с микроядрами.

3. Показано, что гибель клеток с морфологическими признаками апоптоза не является механизмом, способным обеспечивать конститутивную противоопухолевую резистентность у амфибий, хотя играет определенную роль в регуляции генетического гомеостаза у некоторых видов;

4. Обнаружено, что микроядра у амфибий при действии алкилирующих агентов типа метилнитрозомочевины (широко используемых в клинике в качестве противоопухолевых препаратов и в эксперименте - в роли канцерогенов) образуются преимущественно путем интерфазной деминуции хроматина;

5. Показано, что у амфибий с разной конститутивной восприимчивостью к опухолевому росту введение канцерогенов индуцирует разное число полиплоидов среди спленоцитов;

6. В работе впервые исследованы причины, лежащие в основе межвидовых различий в противоопухолевой резистентности у бесхвостых амфибий, дано объяснение особенностям таксономического распределения поражаемости опухолевым ростом в эволюционном ряду. Оно исходит из закономерностей параллельной эволюции и позволяет говорить о сходстве механизмов противоопухолевого надзора у всех позвоночных, в том числе млекопитающих и человека, обладающих одинаковым уровнем конститутивной резистентности к опухолям, независимо от дивергентного положения;

7. Впервые описан ряд спонтанных опухолей у земноводных, одни из которых (пигментированная фибропапиллома у серой жабы) не имеют аналогов среди опухолей человека, другие (случаи хронического миелолейкоза у остромордой лягушки и эритромиелоза у серой жабы), напротив, заполняют пробел в сравнительной онкологии человека и низших позвоночных;

8. Показано, что у амфибий гельминтозная инвазия не играет роли в возникновении спонтанных опухолей легких у амфибий. Этот факт должен быть учтен концепциями, трактующими роль гельминтозной инвазии как важного фактора в развитии некоторых опухолей, в том числе у человека.

Практическая значимость В работе впервые описано несколько новых гистологических типов опухолей, на диагностику которых необходимо обращать внимание при использовании земноводных для индикации канцерогенов во внешней среде, а также при проведении экспериментальных работ онкологической направленности на этих животных. Полученные данные об особенностях механизма образования микроядер у амфибий необходимы для правильной интерпретации данных микроядерного теста на мутагенность, который широко используется в качестве одного из экспресс-методов выявления потенциальных канцерогенов. Что касается данных о способности макрофагов серых жаб устранять клетки с цитогенетическими нарушениями, то будущие исследования должны определить сферу возможного приложения этих данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Большей устойчивости к канцерогенным воздействиям у животным одного филогенетического уровня (бесхвостые амфибии) соответствует более высокая эффективность элиминации аберрантных клеток.

2. Существуют отличия в реакции макрофагальной системы на клетки с цитогенетическими нарушениями у земноводных, различающихся по естественной (конститутивной) восприимчивости к возникновению опухолевого роста;

3. Гибель клеток с морфологическими признаками апоптоза не является механизмом, способным обеспечивать конститутивную противоопухолевую резистентность у амфибий, хотя играет определенную роль в регуляции генетического гомеостаза у некоторых видов;

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 8 статей журналах, рекомендуемых ВАК и 1 монография.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 130 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов (заключения), выводов, списка использованной литературы, включающего 207 источников, в том числе 129 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками, в том числе 5 графиками, 6 схемами и 26 макро- и микрофотографиями.

107 ВЫВОДЫ

1. Спонтанные доброкачественные опухоли чаще возникают у жаб Bufo bufo в сравнении с лягушками R.arvalis и R.ridibunda (0,64%, и 0,24%, р=0,000). Напротив, злокачественные опухоли у жаб Bufo bufo встречаются реже, чем у лягушек (0,32%, и 0,48%, р=0,000). Ряд опухолей (фибропапиллома кожи и эритромиелоз у жаб, мезотелиома плевры и хронический миелолейкоз у лягушек) зарегистрированы у низших позвоночных впервые. Возникновение опухолевых поражений не было связано с гельминтозной инвазией.

2. Введение метилнитрозомочевины вызывает индукцию большего числа гепатоцитов с микроядрами у Bufo bufo (16,0±0,59 о/оо) по сравнению с лягушками (для R.arvalis 14,81±0,57 о/оо, р=0,0007, для R.ridibunda -15,5±0,36 о/оо; р=0,07). Следовательно, соматические клетки жаб не обладают большей устойчивостью к мутагенному действию метилнитрозомочевины.

3. После воздействия алкилирующим канцерогеном ломустином у жаб в селезенке наблюдается снижение клеток с повреждениями метафазных хромосом на 15-й день наблюдения по сравнению с лягушками (12,5% у R.arvalis и 29% у Bufo bufo, %2=15,06; р=0,001), что является свидетельством активной элиминации клеток с аберрациями. Не было выявлено снижения частоты клеток с аберрациями хромосом у лягушек на протяжении всего срока опыта.

4. У интактных лягушек выявлена связь между частотой клеток с микроядрами и интенсивностью гибели клеток с морфологическими признаками апоптоза в селезенке (г = -0,77; р=0,044), тогда как у жаб частота спленоцитов с микроядрами отрицательно коррелировала с относительным содержанием в селезенке макрофагов (г=-0,85; р=0,015). Отмечен фагоцитоз макрофагами жаб клеток с микроядрами.

5. Полиплоидия является одной из форм ответа соматических клеток (спленоцитов) на воздействие алкилирующими мутагенами, причем у ля1ушек это явление встречается чаще, чем у жаб.

6. Микроядра у бесхвостых амфибий образуются двумя путями: как следствие аномальных митозов и как результат интерфазной деминуции («выброса») хроматина. Подобные механизмы имеют место как в норме, так и при воздействии алкилирующими мутагенами.

Практические рекомендации

1. При использовании микроядерного теста параллельно с регистрацией числа микроядер при действии того или иного предполагаемого мутагена (канцерогена) следует учитывать также наличие или отсутствие корреляции между митотической (пролиферативной) активностью клеток и результатами микроядерного анализа.

2. В связи с тем, что у бесхвостых амфибий выявлены лейкозы даже при исследовании сравнительно небольших выборок, скрининговое исследование крови может быть полезным при использовании этих животных в качестве тест-объектов для мониторинга канцерогенов во внешней среде.

109