Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологические и молекулярно-биологические особенности рака легкого, развившегося в условиях повышенной радиации

На правах рукописи

САГИНДИКОВА Гульмира Елеусиновна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАКА ЛЕГКОГО, РАЗВИВШЕГОСЯ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОЙ РАДИАЦИИ

/14.00.15. - «Патологическая анатомия»/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2002

]

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Коган.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

А.Л. Черняев.

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Кагаурский.

Ведущая организация: Российский Научный Центр ренттенорадиологии МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «__>>_ 2002 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.01 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (119992, Москва, Малая Трубецкая ул., д. 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (Москва, Зубовская пл., д. 1).

Автореферат разослан «_»_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор В.А. Варшавский

р вмь р^ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак легкого (РЛ) - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований человека. По данный Международного агентства по изучению рака (МАИР), в мире ежегодно диагностируют около 1 млн новых случаев РЛ, что составляет более 12% от числа всех выявляемых злокачественных новообразований.

Проблема РЛ может рассматриваться как экологическая проблема, поскольку возникновение и развитие этой опухоли связано с курением и такими экологическими факторами, как химические вещества и ионизирующая радиация.

В последние годы при обследовании большого числа лиц, было отмечено значительное увеличение заболеваемости и смертности от рака легкого среди населения, контактировавшего с радиацией на полигонах в области Семипалатинска и Маршалловых островов, во время аварии 1986 года на Чернобыльской АЭС, пострадавших от последствий атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки. Поэтому можно заключить, что радиационный рак легкого - продукт современной цивилизации.

Уровень радиации, которой подвергаются жители Семипалатинска, где в свое время проводились ядерные испытания, до сих пор в 600 раз превышает обычные нормы и соответствует радиационному фону в Хиросиме после атомной бомбардировки.

Первый ядерный взрыв на Семипалатинском ядерном полигоне был произведен 29 августа 1949 года, последний -19 октября 1989 года. За 40 лет на полигоне произведено 470 ядерных взрывов: 88 воздушных, 30 наземных (из них 5 не сработали), 352 подземных. (Дубасов Ю.В., «Семипалатинский полигон - Алтай», 1994 г.). Информация о наземных ядерных испытаниях, содержащая наиболее полные сведения о порядковом номере, дате, месте проведения, цели, энерговыделении и высоте подрыва ядерного устройства, представлена на первом международном семинаре по проекту РАДТЕСТ (январь 1994 г., Вена, Австрия) и отработана под эгидой Межведомственной экспертной комиссии по оценке радиационной и сейсмической безопасности подземных ядерных испытаний с уточнением данных и с оценкой количества биологически значимых радионуклидов: строгшия-90 и цезия-137.

За пределы полигона вышли радиоактивные облака 35 воздушных и наземных взрывов и газовая фракция 69 подземных взрывов. Это обусловило радиационное загрязнение восточной часта территории Казахстана. Согласно данным архивных материалов за период с 1949 по 1990 годы радиоактивные осадки распространились на территории 304 тыс. кв. км. с населением около 1,7 млн. человек. В 711 населенных

пунктах доза облучения населения превысила годовую норму (0,1 бэр). Максимальньк значения дозы достигали 448 бэр за весь период испытания. Результаты экспедиционные исследований Академии наук Республики Казахстан, проведенные еще в конце 50 годов показали экологическую опасность проведения испытаний, наличие повышенной радиоактивного загрязнения территорий, прилегающих к Семипалатинскому полигону, i возникновение патологии у людей.

Исследование Y.E. Dubrova (Science, Vol. 295, 2002) показывает, что воздействи< радиоактивных осадков вследствие испытаний ядерного оружия на Ссмипалатинскок ядерном полигоне в конце 40-х, начале 50-х гг., вызвало многочисленные мутации i геноме эмбрионов матерей, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

В Семипалатинске в 2 раза упала рождаемость, увеличилось число раковьс заболеваний, психических расстройств, дети рождаются с патологией (Ходаева О.В. «Столичное обозрение», Алматы,1998 г.).

В последнее время накоплена масса информации о молекулярных основа: патогенеза рака легкого, однако результаты этих исследований зачастую противоречивы морфологической гетерогенности опухолей уделяется недостаточно внимания Малоизученными остаются морфологические и молекудярно-генетические особенносп РЛ, развившегося у лиц, длительно контактировавших с радиоактивными веществами.

Остаются нерешенными и спорными вопросы о существовании особенности гистогенеза и дифференцировки опухолевых клеток РЛ у лиц, проживавших н радиоактивно загрязненных территориях.

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей морфологи! цитогенеза и экспрессии биомолекулярных маркеров РЛ, развившегося у лиц, длительно время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинске области Казахстана.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические и цитогенетические характеристики РЛ, развившегос у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территория (РЛПР).

2. Сравнить морфологические и цитогенетические особенности РЛПР с таковыми РЛ, не обусловленного воздействием радиации.

3. Изучить иммуногистохимические особенности рака легкого, развившегося у лш длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

4. Сравнить иммуногистохимические особенности РЛПР с таковыми у РЛ, г обусловленного воздействием радиации.

5. Изучить роль IGF системы в раке легкого, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

6. Сравнить особенности действия IGF системы в РЛПР и в PJI, не обусловленного воздействием радиации.

Научная новизна

Полученные в результате исследования данные позволяют говорить о том, что РЛ, возникший у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, имеет морфологические, гистогенетические и молекулярно-биологические особенности, отличающие его от PJI жителей Москвы и Казахстана.

РЛ, связанный с воздействием радиации, характеризовался постоянным обнаружением пылевых частиц и интерстициального и очагового фиброза в опухолях различной локализации и гистологического типа; преобладанием рака с нейроэндокринной дифференцировкой опухолевых клеток мелкоклеточного РЛ (МРЛ) и немелкоклеточного РЛ (НМРЛ).

Злокачественный потенциал опухолевых клеток РЛ, обусловленного воздействием радиации, судя по экспрессией онкомаркеров опухоли, был более высоким и сопровождался усилением аккумуляции в ядрах опухолевых клеток белковых продуктов экспрессии р53 и с-шус и снижением bcl-2, по сравнению с РЛ группы сравнения.

Обнаруженные закономерности подтверждаются и изменениями IGF системы в РЛ, развившемся у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях. В опухолевых клетках отмечалась повышенная экспрессия IGFII, IGF связывающих протеинов (IGFBP)1,2 и более низкая экспрессия IGFBP5.6 по сравнению с РЛ, развившимся у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

Практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в проведении профилактики и дифференциальной диагностики РЛ, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях, прогнозировании течения опухолевого процесса и разработке новых методов генной терапии, а также при чтении лекций и преподавании патологической анатомии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Рак легкого, развившийся у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана (РЛПР), обладает особенностями морфологии и цитогенеза. Морфологически РЛПР характеризуется наличием фиброза с

большим количеством пылевых частиц как вне, так и на территории самой опухоли. Патогенетически РЛПР, как правило, имеет нейроэндокринный генез и представляет не только мелкоклеточный рак, но и немелкоклеточный рак легкого с нейроэндокршшой дифференцировкой.

2. РЛПР отличается более высоким злокачественным потенциалом в сочетании с высоким уровнем апоптоза, судя по высокому уровню экспрессии р53, с-мус, Ьах и более низкому уровню экспрессии bcl-2 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации. Интенсификация апоптоза в РЛПР, вероятно, индуцирована постоянным воздействием радиации на растущую опухоль.

3. РЛПР характеризуется особенностями экспрессии членов IGF системы и отличается более высоким уровнем экспрессии IGFTI, IGFBP1, IGFBP2 и низким уровнем экспрессии IGFI, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого не обусловленным воздействием радиации, что свидетельствует о различиях в механизмах пролиферации, дифференцировки и апоптоза в этих опухолях.

4. РЛПР, возникший и развивавшийся в условиях повышенной радиации, может быть связан с радиационным воздействием, что косвенно подтверждается данными анамнеза (годовая доза облучения превысила 0,1 бэр), наличием пневмофиброза; нейроэндокринной дифференцировкой опухолевых клеток; усилением апоптоза в опухоли, судя по особенностям экспрессии bcl-2, bax, p53,c-myc, IGFBP1,2,4.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по теме «Онкоморфология легких» на кафедре патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, на кафедре патологической анатомии Аклобинского медицинского университета в Казахстане, а также в работе биопсийной лаборатории.

Апробация работы

Апробация работы проведена 25 декабря 2001 г. на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова

Результаты исследования докладывались и обсуждались на научных конференциях кафедры патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, II Съезде Международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1999 г.), на IX, X и XI Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 1999 г., Санкт-Петербург, 2000 г. Москва, 2001 г.), на XVII и XVIII Европейских Конгрессах по патологии (Барселона, Испания, 1999 г., Берлин, Германия, 2001 г.), на IX, X и XI Конгрессах Европейского респираторного общества (Мадрид, Испания, 1999 г.,

Флоренция, Италия, 2000 г., Берлин, Германия, 2001 г.), на I и II Международной конференции-встречи морфологов стран Черноморского бассейна (Трабзон, Турция, 1999 г., 2000 г.), на IV республиканской конференции патологоанатомов Беларуси (Минск, Беларусь, 2000 г.), на II Российской конференции молодых ученых (Москва, 2001 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 19 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Текст диссертации изложен на 151 странице машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 179 источников, в том числе 24 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материал и методы исследования.

В работе использовался архивный операционный (удаленные легкие и их части) и биопсийный материал от 57 больных с PJI, из которых 17 пациентов (I группа) с детских лет до 1993 г. проживали вблизи полигона и в течение длительного времени подвергались воздействию радиации (годовая доза облучения превысила 0,1 бэр). Для исследования были использованы парафиновые блоки из архива онкологического центра г. Семипалатинска. В качестве группы сравнения использовался операционный и биопсийный материал от 40 больных (П группа), из которых 10 (ПА) проживали в Казахстане на территории с неизмененным радиационным фоном, а 30 больных PJI были оперированы в клиниках Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова в 1993 - 2000 гг (II Б).

В представленном материале мужчины (46 случаев) преобладали над женщинами (11 случаев) в соотношении 4:1. В Семипалатинской группе была только 1 женщина и 16 мужчин, в Казахстанской - 3 женщины и 7 мужчин, в Московской - 7 женщин и 23 мужчины. Средний возраст больных составил 50 лет во всех исследуемых группах.

Стадия процесса устанавливалась согласно принятой в клинической практике TNM-классификации (Mountain C.F., 1997). Гистологический тип рака легкого был диагностирован в соответствии с критериями, изложенными в классификации злокачественных опухолей легкого ВОЗ (Travis W.D., 1999).

Использовались гистологические, гистохимические, иммуногистохимические методы, метод полутонких срезов и электронномикроскопическое исследование. Проводилась статистическая обработка результатов исследования.

Гистологические и гистохимические методы исследования. Использованы залитые в парафин, предварительно фиксированные в 10% забуференном формалине кусочки опухолевой ткани. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 3 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, ставилась PAS-реакция. Гистологический тип определялся 3 независимыми экспертами - патологоанатомами (Казахстана и ММА им. И. М. Сеченова).

Метод полутонких срезов и электронная микроскопия. Для уточнения гистогенеза опухолей использовали полутонкие срезы с окраской метиленовым синим, азуром П, фуксином из парафиновых блоков и электронно-микроскопическое исследование ультрасрезов.

Иммуногистохимические методы. Проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм расположенных на стеклах, покрытых APES - слоем (Janice А., 1983).

Демаскировка антигена осуществлялась путем инкубации срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 шМ цитратного буфера с pH 6.0. Эндогенная пероксидаза блокировалась при обработке срезов в течение 30 мин в 0,03% перекиси водорода на метаноле.

В качестве первичных антител использовались моноклональные антитела к хромогранину (DAKO, Германия, в концентрации 1:100), продукту экспрессии гена р53 (DAKO, Германия, в концентрации 1:50), c-myc (Novocastro, Великобритания, в концентрации 1:100), bcl-2 (DAKO, Германия, в концентрации 1:50), bax (Calbiochem, Великобритания, в концентрации 1:40), а также специфические сыворотки к IGFI (Сей Systems, Германия, в концентрации 1:100), IGFII (Pepto tech inc., Германия, в концентрации 1:100), IGFBP1,2,3,4,6 (Immun Diagnostic, Германия, в концентрации 1:100), IGFBP5 (Austral Biologicals, Германия, в концентрации 1:100). Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток использовались моноклональные антитела к Ki-67 (DIANOVA, Германия, в концентрации 1:100). Ставились контрольные реакции: позитивный контроль - культура клеток А 549 рака легкого и лимфоузлы с известной положительной экспрессией биомолекулярных маркеров, негативный контроль - без первичных антител. В качестве вторичных антител использовались биотинилированные иммуноглобулины мыши и кролика (DAKO, Германия) в концентрации 1:200. Результаты иммуногистохимических реакций для IGFI, IGFII, IGFBP1-6, c-myc, bax, bcl-2 оценивались в баллах: (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток. В случае ядерной локализации продукта реакции (Ki-67, р53, IGFBP3) подсчитывался процент окрашенных ядер на 300 опухолевых клеток из разных участков препарата

Статистический анализ. Проводился корреляционный анализ с расчетом коэффициента Пирсона, определялась стандартная ошибка среднего с использованием программы Statistica for Microsoft Windows, version 5.0, StatSoft Inc., США - уровней экспрессии отдельных биомолекулярных маркеров, пролиферативной активности (Гланц С., 1999, Боровиков В.П., 1998), вычислялся доверительный коэффициент - критерий достоверности Стьюдента для малых выборок.

Результаты исследования и их обсуждение.

В результате проведенного исследования мы пришли к заключению, что РЛ, развившийся у лиц, проживавших в условиях повышенной радиации имеет морфологические, цитогенетические и молекулярно-биологические особенности.

1. Морфологическая характеристика рака легкого, обусловленного воздействием радиации и не связанного с ним.

РЛ больных, длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана (I группа), был представлен центральным РЛ (10 больных) и периферическим (7). РЛ группы сравнения также был представлен центральным РЛ (23 больных) и периферическим (17).

При микроскопическом исследовании РЛ I группы диагностированы различные гистологические типы опухоли: МРЛ - 9 наблюдений, из которых преобладал классический МРЛ (8) и имелся 1 случай комбинированного МРЛ; крупноклеточным РЛ (ККРЛ - 2); низкодифференцированным ПРЛ (4), шикодифференцированной аденокарциномой (АК - 2). Вероятно, такое распределение материала не случайно, что совпадает с данными литературы о преобладании МРЛ среди радиационных карцином легкого.

К морфологическим особенностям РЛПР следует отнести наличие в строме и паренхиме опухоли больших скоплений пылевых частиц в сочетании с интерстициальиым фиброзом как в самой опухоли, так и в прилежащей легочной ткани. При микроскопическом исследовании пылевые частицы концентрировались в интерстиции по ходу лимфатических коллекторов, по ходу сосудов, бронхов, субплеврально, а также в фокусах фиброза. Эта же частицы обнаруживались и в цитоплазме опухолевых клеток. Обнаружение пылевых частиц в опухолях может свидетельствовать об инициальном значении радионуклидов в развитии РЛ, что подтверждается данными литературы.

Инициальные повреждения легочных тканей радионуклидами лежат в основе развивающихся в легких патологических процессов, как в их центральных отделах (в крупных бронхах), так и в периферических (в мелких бронхах, бронхиолах, альвеолах, интерстиции респираторных отделов).

В случае мелких размеров частиц и повреждения слизистой мелких бронхов, бронхиол и альвеол возникают бронхиты, бронхиолиты и фиброзирующий альвеолит. Накопление радионуклидов в интсретиции, а также хроническое воспаление приводят к возникновению очагового и диффузного интерстициального пневмосклероза, создающего благоприятный фон пля развития периферического РЛ. Депонированию радионуклидов в легочной ткани способствуют альвеолярные макрофаги, при гибели которых радионуклидные частицы фагоцитируются другими макрофагами. Развивающийся при этом фиброз также благоприятствует накоплению в легочной ткани радиоактивного материала, поскольку ведет к нарушениям лифмо- и кровообращения в легочной ткани.

Радионуклиды могут захватываться не только альвеолярными макрофагами, но и эпителиальными клетками, оказывая на них прямое повреждающее действие и индуцируя злокачественную трансформацию. Об этом свидетельствуют данные обнаружения в клетках периферической аденокарциномы легкого у больного-ликвидатора аварии на Чернобыльской АЭС радиоактивного цезия.

В развитии радиационного периферического РЛ пневмосклероз имеет важное значение как фоновый патологический процесс. С одной стороны, процесс образования фиброзной ткани в легком следует рассматривать как адаптивный процесс, обеспечивающий некоторую защиту тканей от воздействия ионизирующей радиации. Но, с другой стороны, склеротические изменения могут создавать дополнительные условия для злокачественной трансформации эпителиальных клеток. Развитию склеротических изменений в легких могут способствовать также те пылевые примеси, которые аспирируются в легкие вместе с радионуклидами. Как показали исследования, морфогенез периферического РЛ примерно в 73% случаев связан с очаговым и/или диффузным пневмосклерозом. Следует отметить особенности радиационного пневмофиброза, выявленного в случаях развития РЛ у больных уранового производства и описанного в литературе. ''

При попадании крупных радиоактивных частиц основные изменения локализуются в крупных бронхах, где на фоне хронического воспаления могут развиваться дисрегенераторные изменения эпителия — метаплазия, дисплазия, относящиеся к предраковым изменениям.

Цитогенетической особенностью РЛПР, развившегося у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, явилось обнаружение нейроэндокринной дифференцировки раковых клеток во всех опухолях вне зависимости от гистологического типа карциномы, что было подтверждено нами при

иммуногистохимическом и элекгронномнкроскопическом исследованиях. Хромогранин обнаруживался в виде коричневого гфодукта в цитоплазме опухолевых клеток.

Во всех 17 случаях РЛ -I группы, нейроэндокринная дифференцировка опухолевых клеток была выявлена как в группе МРЛ, так и в группе пемелкоклеточного PJI - HMPJI (ПРЛ, АК, ККРЛ), что подтверждалось при реакции на хромогранин и электронной микроскопии.

При электронной микроскопии нейроэндокринные гранулы имели электрошгоплотную сердцевину и просветление по периферии, сравнительно крупные размеры и локализовались в цитоплазме опухолевых клеток. В группе сравнения НЭД не была выявлена. Полученные данные согласуются с результатами исследования Kreyberg L., который еще в 1954 г. показал преобладание опухолей с НЭД МРЛ, связанного с радиационным воздействием. Однако дополнением послужило то, что в нашем исследовании во всех случаях НМРЛ была также обнаружена НЭД.

В группе сравнения были выявлены следующие гистологические типы: МРЛ (6); ККРЛ (6); ПРЛ (13); АК.

При реакции на хромогранин опухоли этой группы были негативны, и нейроэндокринная дифференцировка не была выявлена, за исключением случаев с мелкоклеточным раком легкого.

РЛ Семипалатинской области может быть классифицирован как нейроэндокршшый рак, представленный не только МРЛ с НЭД (классический, комбинированный), но и НМРЛ с НЭД (ПРЛ с НЭД, АК с НЭД, ККР с НЭД). Очень важно подчеркнуть, что НЭД, обнаруженная у наших больных, относится не только к МРЛ, но и к НМРЛ с НЭД. При этом в группе сравнения мы не встретили ни одного случая НМРЛ с НЭД.

2. Ki-67, с-тус, bcl-2, box, pS3 в раке легкого, обусловленного воздействием радиации и не связанного с ним.

Помимо морфологических, были обнаружены иммуногистохгштеские особенности РЛ I группы, развившегося у лиц, в течение длительного времени проживавших в Семипалатинской области и подвергавшихся воздействию радиации.

Нами изучены экспрессия Ki-67, c-myc, bcl-2, мутантного р53, bax в опухолевых клетках РЛ.

Было обнаружено, что в РЛ у лиц, длительно проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области уровень экспрессии Ki-67 был наибольшим в низкодифференцированном ПРЛ и составлял 78 % (рис.1) и при

статистическом анализе был достоверно выше по сравнению с АК (р< 0,002), с МРЛ (р< 0,001), с ККРЛ(р< 0,009).

ПРЛ

АК

111Э§1Ш11Щ§ШЗ§!в

ай#

гЬГй ■ гр.1

Мф.11А

Р Пгр.НБ

В

ПРЛ

ШфЛ

1ф11А

□ф.1В

опус

ыг

Ьах

АК

ШШШ

Ф.ПА * ,оф.Е

с-пус

ККРЛ

6 ^¿Г •»"•г.

с-пус

МРЛ

с-ггус

Ьс(-2

Рис. 1. Экспрессия онкомаркеров рака легкого в исследуемых группах.

В группе сравнения было обнаружено, что при иммуногистохимическом исследовании уровня экспрессии Кл-67 процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток был наибольшим в высокоднфференцированном и умереннодифференцированном ПРЛ и составил 23 % и 25 % соответственно (см. рис.1). Низкодифференцированный ПРЛ характеризовался меньшим уровнем экспрессии К1-67, который составил 11,7 %

позитивно окрашенных ядер, что совпадает с данными других авторов (Угрюмов Д.А., 2001 г.).

При изучении пролиферативной активности опухолевых клеток АК различной степени дифференцировки обнаружено снижение уровня экспрессии К>67 в ряду от высоко- к низкодифференцированным АК легкого группы сравнения. Наибольшая пролиферативная активность была в высокодиффсренцированных АК (24 % позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток), уровень пролиферации в умеренно- и низкодифференцировапных АК составил 10 % и 5,6 % соответственно (см. рис.1). По всей видимости, для этой подгруппы НМРЛ с железистой дифференцировкой характерна та же особенность, что была обнаружена при изучении ПРЛ, а именно: пролиферативная активность высокодифференцированной опухоли выше, чем в менее дифференцированной.

В настоящее время при прогнозировании течения опухолевого процесса на первое место ставится пролиферативная активность опухоли, что, казалось бы, не лишено оснований. Однако, как показало наше исследование, нельзя ставить знак равенства между высокой пролиферативной активностью и плохим прогнозом.

В группе сравнения уровень экспрессии И-67 в МРЛ составил 40%, а в ККРЛ 33% позитивно окрашенных ядер клеток опухоли (см. рис.1). При статистическом анализе обнаружено, что уровень экспрессии Кь67 в МРЛ достоверно выше чем в ПРЛ (р< 0,002), АК (р< 0,02) и ККРЛ (р< 0,05).

При иммунопистохимическом исследовании уровня экспрессии Кь67 процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток был выше в ПРЛ у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области по сравнению со II группой, что можно гипотетически связать с его гистогенетическими особенностями, связанными с НЭД в ПРЛ. Это в свою очередь может свидетельствовать о его высокой злокачественности. А в АК уровень экспрессии Кл-67 был меньше чем в группе сравнения, что, вероятно, также отражает особенности этого типа опухоли, заключающиеся в наличии НЭД и изменении пролиферативной активности. В МРЛ имеются тенденции к повышению уровня экспрессии Кь67 в группе РЛПР по сравнению со П группой.

Участие онкогена с-тус в регуляции пролиферации также подтверждается и данными литературы.

. При изучении РЛПР обнаружено, что в низкодифференцированном ПРЛ уровень экспрессии с-тус был равен 4,5 баллам (см. рис.1). В низкодифференцированной АК 4 баллам, в классическом МРЛ 5,3 балла, в комбинированном - 4 балла. В ККРЛ уровень

экспрессии с-мус был наибольшим и составил б баллов. Продукт реакции локализовался 1 цитоплазме и ядрах опухолевых клеток. При статистическом анализе обнаружено, чп уровень экспрессии с-тус в ПРИ имеет тенденцию к повышению по сравнению с АК ККРЛ и МРЛ (р> 0,05). Уровень экспрессии с-мус был большим в группе I во все: гистологических типах РЛ, что также может быть связано с НЭД.

В высоко и умереннодифференцированном ПРЛ П группы уровни экспрессии с юус не отличались один от другого и были равны 4 баллам (см. рис.1). I низкодифференцированном ПРЛ уровень экспрессии с-тус был равен 2, 6 баллам ] отличие от показателя I группы, который был равен 4,5 балла. В АК различной степей дифференцировки уровень экспрессии с-тус был равен: в высокодифференцированны АК 1 баллу, в умереннодифференцированных 4,6, в низкодифференцированных 4 баллам В МРЛ уровень экспрессии с-мус 3,8 балла, а в ККРЛ 4,6 балла. При статисгическш анализе обнаружено, что уровень экспрессии с-тус в НМРЯ имеет тенденцию ] снижению по сравнению с МРЛ (р> 0,05).

В нашем исследовании важная роль отводилась изучению гена-еуппрессор опухолевого роста - р53. В норме «дикий» р53 отвечает за запуск в повреждении клетках процессов репарации ДНК, а при невозможности такой репарации - апоптоза Однако, в результате мутации, встречающейся, по данным литературы, в 40 - 60 % НМР.] и 40 - 70 % МРЛ (ВгатЫНа Е, 1996, Еего1а А.-К., 1997, МвЫо М., 1996, КошвЫ Т., 199" 1$Ыс1а Н., 1997), «мугшггаый» р53 утрачивает функцию «стража генома». В результат этого дефект ДНК передается дочерним клеткам, что может привести в дальнейшем ; опухолевой трансформации. Мутация вызывает конформационные изменения в протеин р53, и он накапливается в ядрах клеток, что позволяет определять ел иммунногистохимическими методами.

Продукт реакции р53 в РЛ, обусловленного воздействием радиации был найда нами в ядрах опухолевых клеток и наиболее высокое содержание р53-положитедыш: клеток обнаруживалось в классическом и комбинированном МРЛ (34% и 55 "/ соответственно), крупноклеточном (30%) и низкодифференцированном ПРЛ (37,5%). 1 низкодифференцированных АК лишь 14% (см. рис.1). При статистическом анализ обнаружено, что уровень экспрессии р53 в МРЛ имеет тенденцию к повышению в сравнению с ПРЛ, АК и ККРЛ (р> 0,05).

При изучении экспрессии р53 были выявлены тенденции к повышению уровн экспрессии в I группе только в ПРЛ, в остальных гистологических типах РЛ уровен экспрессии его был ниже чем в группе сравнения, что еще раз подтверждает возможну» высокую злокачественность ПРЛ с ГОД.

В своем исследовании мы не могли обойти стороной представителей семейства генов bel, участвующих в регуляции апоптоза. Анализируя полученные результаты, можно сказать что уровень экспрессии bcl-2 был низким в PJII группы, за исключением ПРЛ, что подтверждается данными литературы. Fontanini G. говорил о плохом прогнозе опухолей с низким уровнем bcl-2 и отмечал менее агрессивное поведение bcl-2 позитивных опухолей. При иммуногистохимическом исследовании уровня экспрессии bcl-2, обладающим автиапоптозной активностью, нами было обнаружено, что продукт реакции локализовался, как правило, в цитоплазме опухолевых клеток, однако, нередко, особенно в случаях МРЛ, можно было видеть и ядерную локализацию онкопротеина. В низкодифференцированном ПРЛ и АК I группы экспрессия bcl-2 составляет в среднем 3 балла. В обоих вариантах МРЛ он также экспрессируется и равен 5 и 2 баллам соответственно. В ККРЛ уровень экспрессии невысок и равен 2 баллам (см. рис, 1).

При исследовании П группы степень выраженности экспреосии bcl-2 последовательно увеличивается в ряду от высокодифференцированного ПРЛ к низкодифференцированному ПРЛ (см. рис.1). Вообще же, по данным литературы, экспрессия bcl-2 достаточно частое явление в РЛ, но более характерное для МРЛ по сравнению с ПРЛ. При изучении экспрессии этого гена в ПРЛ ряд авторов указывает на большую частоту экспрессии в ПРЛ, нежели в АК легкого и отмечает менее агрессивное поведение bcl-2-позитивных опухолей. Однако нами обнаружено, что в низкодифференцированном ПРЛ количество позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток преобладало над таковым в ПРЛ I и ПРЛ П. Степень выраженности экспрессии гена bcl-2 в высокодифференцированном ПРЛ была наименьшей и равнялась 2 баллам. В умереннодифференцированном ПРЛ степень экспрессии была выше, чем в высокодифференцированном и равнялось 2,5 баллам. Наиболее высоким уровень экспрессии bcl-2 был в низкодифференцированном ПРЛ (2,7 балла). В аденокарциномах bcl-2 экспрессируется примерно в 10 % случаев и реже, чем в ПРЛ. Также в литературе указывается на лучший прогноз у bcl-2-позитивных опухолей. В нашем исследовании уровень экспрессии гена bcl-2 возрастал по мере увеличения степени дифференцировш АК от высокодифферетшрованных АК к низкодифференцированным и составил 1,3 балла, 2,3 балла и 3 балла соответственно. В МРЛ степень выраженности экспресс™ гена bcl-2 составила 4,6 балла, а в ККРЛ 2,3 балла (см. рис. I).

При статистическом анализе И группы обнаружено, что уровень экспрессии bcl-2 в ПРЛ имеет тенденцию к повышению по сравнению с АК, ККРЛ и МРЛ (р> 0,05), а уровень экспрессии bcl-2 в МРЛ достоверно выше чем в ККРЛ (р< 0,02).

Таким образом, уровень экспрессии bcl-2 в РЛПРI группы был, как правило, выше по сравнению с РЛ П группы, особенно Казахстана.

Протеины Ьах, транскрипция и синтез которых регулируется р53, блокируют пролиферацию и стимулируют апоптоз опухолевых клеток. В исследуемой I группе экспрессия Ьах была обнаружена во всех гистологических типах. В низкодифференцированном ПРЛ 4,5 балла, в низкодифференцированной АК 3 балла, в классическом МРЛ 4,5 балла, в комбинированном МРЛ 2 балла, в ККРЛ его экспрессия составила 2 балла (см. рис. 1).

Уровень экспрессии Ьах имел тенденцию к повышению в РЛ I группы во всех гистологических типах, что дает вероятность предположить, что в РЛПР апоптоз высокий, за исключением ПРЛ, где Ьах работает на пролиферацию опухолевых клеток.

При изучении экспрессии Ьах в РЛ П группы обнаружено, что в опухолевых клетках отмечались отсутствие или его относительно невысокая экспрессия, что было характерно как для НМРЛ, так и для МРЛ.

Таким образом, изучение экспрессии био молекулярн ьгх маркеров показало, что РЛПР обладает молекулярно-биологическими особенностями, свидетельствующими о его более высоком злокачественном потенциале, судя по экспрессии р53, с-мус, bcl-2. Однако, разные гистотипы отличались по экспрессии Ki-67, и наибольшей пролиферативная активность в группе РЛПР соответствовала ПРЛ с НЭД. В то же время, вероятно, несмотря на высокий злокачественный потенциал, РЛПР характеризуется и более высоким уровнем апоптоза, что подтверждается повышенным уровнем экспрессии Ьах. Последнее не удивительно, поскольку, судя по данным литературы, чем выше пролиферация в опухоли, тем выше апоптоз. Кроме того, опухоли растут в условиях постоянной радиации, что также подтверждает высокий апоптоз.

В отличие от РЛ Семипалатинской области в исследованном чернобыльском и красноярском РЛ, судя по данным литературы (Чучалин А.Г., 1998 г.), отмечен более низкий уровень пролиферативной активности, что может быть следствием того, что у РЛ, развившегося в Семипалатинской области имеются отличные источники радиации, состав радиоизотопов и условия возникновения опухоли.

3. Роль IGF системы в морфогенезе РЛ, обусловленного воздействием радиации и не связанного с ним.

Известно, что радиационная опухоль часто возникает на фоне склеротических процессов в легких, т.е. на фоне нарушенных сгромально-паренхиматозных взаимоотношений, важнейшим регулятором которых является IGF система.

Установлено, что IGF система регулирует и усиливает пролиферативную активность в культурах клеток PJI, легочных фибробластов, ткали эмбрионального легкого крыс. Митогенетический эффект, оказываемый системой IGF на раковые клетки, является результирующей взаимодействия IGF I и П с соответствующими рецепторами I и П типов, связывания факторов роста с частично растворенными, частично фиксированными на клеточной мембране 6 типами связывающих протеинов, а также процессов деградации IGFBP специальными протеазами, работа которых контролируется как активирующими, так и ингибирующими субстанциями.

При изучении семейства IGF мы обнаружили особенности экспрессии членов этого семейства в PJI, обусловленного воздействием радиации и не связанного с ним.

IGF! был выявлен в 15 случаях из 17 опухолей Ггруппы и лишь в 14 случаях из 40 в РЛ П группы.

Корреляционный анализ выявил прямую корреляционную зависимость между уровнем экспрессии IGFI и Ki-67 в ПРЛ I группы. Это говорит о том, что при РЛ связанного с воздействием радиации, чем больше накапливается IGFI в опухолевых клетках, тем больше выражена прояиферативная активность опухолевых клеток ПРЛ.

IGF П был выявлен во всех случаях опухолей I группы и в 37 случаях из 40 И группы. Отсутствие фактора роста констатировано лишь в отдельных случаях НМРЛ, а в группе МРЛ IGF П выявлялся постоянно и, как правило, в больших количествах. Продукт реакции локализовался в основном в цитоплазме, но нередко обнаруживался и в ядрах опухолевых клеток, что может свидетельствовать о возможности его транспорта в ядра. Продукт реакции накапливался в делящихся опухолевых клетках и в очагах ороговения в ПРЛ. В небольших количествах IGF П обнаруживался и в фибробластах, эндотелии сосудов, особенно в зоне десмопластической реакции, на границе опухоли и сохранной ткани легкого. Высокая экспрессия IGFII в РЛПР может свидетельствовать об усилении пролиферативяой активности.

РЛ I группы отличался более высоким уровнем экспрессии IGFII, по сравнению с РЛ П группы (рис.2). В то же время РЛ П группы имел более высокий уровень IGFI, что свидетельствует о различии в регуляции пролиферации клеток на уровне факторов роста в этих 2-х группах опухолей.

Клетки опухолей легких продуцируют IGFBPs, которые могут в зависимости от условий, усиливать или подавлять биологический эффект инсулиноподобных факторов роста.

В нашем исследовании IGFBP1 и 2 обнаруживались во всех случаях РЛ обоих исследуемых групп (см. рис.2). В опухолевой ткани наиболее сильно окрашивались зоны

гибнущих клеток с пикнотичными ядрами, которые располагались вокруг очагов некроза. Накопление протеинов в небольших количествах отмечалось и в клетках стромы опухоли (гистиоциты, плазмоцига, лимфоциты, фибробласты, эндотелий сосудов), а также в экстрацеллюлярном матриксе, особенно зон склеротических изменений.

ККРЛ

*##А?Ж#*

■гр.1

• rp.UA

ОфЛЕ

МРЛ

иай

^ ^

1ф|

■ гр.ИА

агр.нб

Рис. 2.1СР система в раке легкого в исследуемых группах.

При статистическом анализе иммуногистохимических реакций обнаружено, что уровни экспрессии ЮРВР1 и 2 в РЛПР достоверно выше в МРЛ по сравнению с АК (р< 0,01): В группе сравнения уровень экспрессии ГСРВР ] достоверно выше в МРЛ по сравнению с ПРЛ (р< 0,005), а уровень экспрессии ЮГВР2 достоверно выше в АК но сравнению с ПРЛ (р< 0,014), а МРЛ имеет тенденции к повышению по сравнению с ПРЛ (р> 0,05).

Отдельно следует остановиться на ЮРВРЗ. По данным имеющейся литературы известно, что ЮРВРЗ по-разному функционирует в МРЛ и НМРЛ. В МРЛ присутствие его не обязательно, а количество протеина не коррелирует со стадией заболевания. В НМРЛ ЮИЗРЗ выявляется постоянно, а ядерная локализация протеина коррелирует с более запушенной стадией заболевания и высокой злокачественностью опухоли. В нашем

исследовании при изучении клеток стромы наибольшее количество протеинов обнаруживалось в шгазмоцитах. Показано также, что в МРЛ п отличие от НМРЛ ГСКВРЗ более чем в 50% случаев не экспрессировался. По нашим данным ЮРВРЗ обнаружен только в 7 случаях из 17 РЛ I группы, что по данным литературы является характерным для МРЛ с НЭД. а в наших результатах также и для НМРЛ с НЭД. Из 10 случаев с отсутствием экспрессии ЮБВРЗ, 3 случая были представлены Т1МРЛ с НЭД, а 7 случаев -МРЛ с НЭД.

В группе сравнения ЮРВРЗ обпаружен в 32 случаях из 40, во всех случаях НМРЛ, и только в 1 случае МРЛ.

В целом, в 1 группе больных РЛ ЮРВРЗ был ниже по сравнению со П группой (см. рис.2). Уровень ядерной экспрессии был наивысшим в НМРЛ группы П, и наименьшим в МРЛ.

При статистическом анализе уровень экспрессии ЮБВРЗ 1 группы достоверно ниже в МРЛ по сравнению с АК (р< 0,02), а в группе сравнения достоверно ниже в МРЛ по сравнению с ПРЛ (р< 0,007)..

ШРВР4 и 6 выявлялись практически во всех опухолях в группе РЛПР и во всех случаях РЛ, не обусловленного воздействием радиации. Продукты реакции ЮРВР4 и 6 располагались в цитоплазме опухолевых клеток. Более выраженное накопление продукта отмечалось в погибающих клетках с пикнотичными ядрами. Небольшие количества белка выявлялись практически во всех клетках стромы, в несколько большем количестве в периферических зонах РЛ.

При статистическом анализе уровень экспрессии ГОРВР4 в РЛПР имеет тенденцию к повышению в МРЛ по сравнению с ПРЛ, ККРЛ и АК (см. рис.2) (р> 0,05). А уровень экспрессии ЮЕВР6 достоверно выше в ПРЛ по сравпсшно с АК (р< 0,004).

При статистическом анализе уровень экспрессии ЮПЗР4 в опухолях П группы достоверно выше в АК по сравнению с МРЛ (р< 0,02). Уровень же экспрессии ГОГВРб достоверно выше в ПРЛ по сравнению с АК (р< 0,01) и достоверно ниже в АК по сравнению с МРЛ (р< 0,02).

Показано, что при периферическом РЛ уровень экспрессии ЮПЗР5 находится в отрицательной корреляционной связи со стадией заболевания и злокачественностью ,. опухоли. Также установлен факт накопления ЮРВР5 в экстрацеллюлярном матриксе очагов пневмосклероза, что может противодействовать врастанию опухоли в фиброзную ткань и распространению РЛ.

ЮРВР5 обнаружен во всех опухолях I группы и В 38 случаях из 40 опухолей П группы, продукт реакции отсутствовал в АК. Локализовался ЮУВР5 в цитоплазме

опухолевых клеток. Накопления протеина выявлялись в очагах кератинизации, там же, г® и ЮИГ, в клетках стромы фибропластического ряда и в зонах фиброза.

При статистическом анализе уровень экспрессии IGFBP5 в I группе имее: тенденции к повышению в MPJI по сравнению с ПРЛ, АК, KKPJI (р> 0,05), а во II групп« достоверно выше в МРЛ по сравнению с ПРЛ (р< 0,02), с АК (р< 0,02), с ККРЛ (р< 0,01; (см. рис.2).

При проведении статистического исследования в РЛ, связанного с воздействие», радиации обнаружена обратная корреляционная зависимость между уровнями экспрессга IGFBP5 и Ki-67 в ПРЛ. Это дает нам основание предположить, что чем больше уровеш экспрессии IGEBP5, тем меньше пролиферация опухолевых клеток, то есть, i радиационном ПРЛ IGFBP5 работает на апоптоз. Подтверждаются данные, полученные i исследовании Угрюмова Д.А. (2000 г.) о том, что в ПРЛ не апоптоз, а кератинизацщ является основным видом гибели опухолевых клеток.

РЛ I группы характеризуется более высокой экспрессией IGFBP1, IGFBP2, а РЛ I группы высокой экспрессией IGFBP4, IGFBP5 (см. рис.2).

Общим свойством для всех гистологических типов РЛ явилось присутствие в ш клетках членов IGF системы, однако локализация их была различной. IGFBP1,2,5. блокируя IGFII, выявлялся в наибольших количествах в зонах гибели клеток, тогда кал IGFII накапливался в делящихся клетках и в очагах кератинизации, представляющих очаги гибнущих клеток. Одновременно с 1GFII в этих же участках накапливались е большом количестве IGFBP2 и 5, блокирующие митогенетическое действие IGFII.

Обнаружение IGFII и IGFBP не только в паренхиме РЛ, но и в строме, закономерно ставит вопрос о месте клеточного синтеза этих факторов. Анализируя полученные нам» результаты иммунногистохимического исследования, а также данные литературы, можнс предположить, что синтез большинства факторов IGF системы происходит преимущественно в самих опухолевых клетках РЛ. Эндотелий сосудов, клетки фибропластического ряда и плазматические клетки также продуцируют и транспортирую! в опухоль некоторое количество IGFII и IGFBP. Это создает предпосылки для паракринной стимуляции роста стромальных элементов под влиянием опухолевых клеток и одновременно обеспечивает стромальную регуляцию роста опухоли через воздействия на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Наибольшее воздействие стромы на рост опухоли, судя по экспрессии IGFBP, происходит в пограничных районах, в зонах десмопластической реакции, что также подтверждается данными литературы.

Накопление IGEBP1,2,5 в экстрацеллюлярном матриксе очагов пневмосклероза может противодействовать врастанию опухоли в фиброзную ткань и распространению РЛ,

>днако, с яругой стороны, накопление в старых очагах пневмосклероза как митогенных факторов, так и протеинов, индуцирующих апоптоз, очень опасно, так как может фиводить к активации клеточных онкогенов эпителиальных клеток, замурованных в аких очагах, и далее при определенных условиях и к злокачественной трансформации.

Проведенное исследование IGF системы в разных гистологических типах РЛ видетельствует о многообразной и сложной роли этой системы в онкогенезе. 1акагагаваясь в клетках стромы и паренхимы, члены семейства являются проводниками ложных стромально-паренхимагохных взаимодействий и регулируют процессы [ролиферации и апоптоза в опухоли.

Результаты исследования позволили подтвердить участие IGF системы в юрфогенезе РЛ, дали возможность охарактеризовать особенности локализации членов емейства при РЛ на тканевом и клеточном уровнях, а также оценить их участие в тромально-паренхиматозных взаимоотношениях в опухоли.

Таким образом, описанные случаи РЛ, развившегося у лиц, проживавших на адиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области, различаются по юрфологическим и молекулярно-генетическим особешюстям, характеризуются равнительно высокой пролиферапшной активностью, что, вероятно, и обусловило ыстрый рост опухоли и предположительно плохой прогноз.

ВЫВОДЫ.

1. Рак легкого, развившийся у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных ерриториях Семипалатинской области Казахстана (РЛПР), обладает морфологическими, итогенетическими и иммуногистохимическими особенностями по сравнению с раком егкого, не обусловленным воздействием радиации.

2. Морфологически РЛПР характеризуется наличием фиброза с большим оличеством пылевых частиц как вне, так и на территории самой опухоли.

3. Циггогенетически РЛПР, как правило, относится к нейроэндокригшым опухолям ггких, включающим в себя не только мелкоклеточный рак, но и немелкоклеточный рак егкого с нейроэндокринной дифференцировкой, что было подтверждено данными нектронной микроскопии и обнаружением хромогранина А.

4. РЛПР отличается более высоким злокачественным потенциалом, судя по исокому уровню экспрессии р53, с-мус и более низкому уровню экспрессии bcl-2 в пухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием здиации.

5. РЛПР характеризуется низкой экспрессией bcl-2 и более высокой экспрессией Ьах в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленных: воздействием радиации, что может свидетельствовать об интенсификации апоптоза индуцированного постоянным воздействием радиации на растущую опухоль.

6. РЛПР отличается более высоким уровнем экспрессии IGFII и низким уровнем экспрессии IGFI в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации, что свидетельствует о различиях в механизмах пролиферации опухолевых клеток в этих 2-х группах опухолей,

7. РЛПР свойственна более высокая экспрессия IGFBP1, IGFBP2 и более низка* экспрессия IGFBP4, IGFBP5 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не связанного с воздействием радиации, что может обуславливать особенности процессот пролиферации, апоптоза и дифференцировки опухолевых клеток.

8. РЛПР характеризуется относительно невысокой экспрессией или отсутствие»! экспрессии IGFBP3 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации, что косвенно может подтверждать егс цитогенетическую связь с нейроэндокринными опухолями легких.

9. РЛПР, возникший и развивавшийся в условиях повышенной радиации, можел быть связан с радиационным воздействием, что косвенно подтверждается данными анамнеза (годовая доза облучения превысила 0,1 бэр); наличием пневмофиброза; нейроэндокринной дифференцировкой опухолевых клеток; усилением апоптоза t опухоли, судя по особенностям экспрессии bcl-2, bax, p53,c-myc, IGFBP1,2,4.

Практические рекомендации.

Полученные данные могут быть использованы в проведении дифференциально? диагностики гистогенетических вариантов МРЛ и НМРЛ, прогнозировании теченш опухолевого процесса и разработке новых методов генной терапии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сагиндикова Г.Б.. Секамова С.М., Коган Е.А. Морфология рака легкого ) лиц, проживающих на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинске} области Казахстана // Материалы I Международной конференции-встреч! морфологов стран Черноморского бассейна. 27-29 мая 1999г, Трабзон, Турция 1999.-С. 80-81.

2. Сагиндикова Г.Е.. Секамова С.М., Жак Г., Коган Е.А Морфологически характеристика рака легкого, развившегося у лиц, проживавших на радиоактивш загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Тезисы 2-п

съезда Международного Союза ассоциаций Патологоанатомов. Москва, 1999. - С. 266-267.

3. Сагиндикова Г.Е.. Коган Е.А. Особенности гистогенетической дифференцировки онкомаркеров рака легкого у лиц, подвергавшихся воздействию радиации на территории Семипалатинской области Казахстана // Материалы 9-го национального конгресса по болезням органов дыхания. 31 октября - 3 ноября 1999г, Москва, 1999. - С. 77.

4. Самсонова М.В., Сагиндикова Г.Е.. Коган Е.А. Морфологические и молекулярно-генетические особенности рака легкого, развившегося у лиц, подвергавшихся воздействию радиации // Материалы 9-го национального конгресса по болезням органов дыхания. 31 октября - 3 ноября 1999т, Москва, 1999.-С. 312.

5. Демура С.А., Сагиндикова Г.Е.. Коган Е.А. Морфологические и молекулярно-генетические особенности мелкоклеточного рака легкого, развивающегося у лиц в условиях повышенной радиации и в общей популяции // Актуальные проблемы пато- и морфогенеза. Системные аспекты патологии и вопросы преподавания патологической анатомии. Санкт-Петербург, 1999. - С. 3132.

6. Сагиндикова Г.Е.. Коган Е.А. Морфологические и биомолекулярные особенности рака легкого у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Актуальные вопросы клинической и теоретической медицины и биологии. Материалы II Международной конференции ученых-медиков стран Черноморского бассейна. 1114 мая 200Ог, Трабзон, Турция, 2000. - С. 145-146.

7. Сагиндикова Г.Е., Жак Г., Коган Е.А. Морфологические и биомолекулярные особенности рака легкого у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Методические рекомендации. Актюбинск, Казахстан, 2000.

8. Сагиндикова Г.Е.. Коган Е.А., Жак Г. Рак легкого у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Избранные вопросы онкоморфологии. Сборник научных работ. Минск, Белоруссия, 2000. - С. 53-58.

9. Сагиндикова Т.Е.. Коган Е.А., Жак Г. Рак легкого, возникший в условиях повышенной радиации Семипалатинской области Казахстана // Материалы 10-го

национального конгресса по болезням органов дыхания. 1-4 ноября 2000г, Санкт-Петербург, 2000. - С. 363.

10. Сагиндикова Г.Е. Морфологические и молекулярно-биологические особенности рака легкого, возникшего в условиях повышенной радиации Семипалатинской области Казахстана // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Материалы П Российской конференции молодых ученых. Москва, 2001. - С.54.

11. Сагиндикова Г.Е- Коган Е.А., Жак Г. IGFI.II и IGFBP1-6 в раке легкого у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Материалы 11-го национального конгресса по болезням органов дыхапия. 9-13 ноября 2001г, Москва, 2001.-С. 14.

12. Коган Е.А., Сагиндикова Г.Е., Секамова С.М., Жак Г., Реджабаева Л.Ш. Рак легкого, развившийся у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана Н Журнал пульмонологии. Москва, 2001, № 4. - С. - 23-28.

13. Коган Е.А., Сагиндикова Г.Е.. Секамова С.М., Жак Г. Морфологические, цитогенешческие и молекулярно-биологические особенности рака легкого, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана // Архга патологии. Москва, 2002.

14. Sagindikova G.. Kogan Е. Morphology of the lung cancer in persons lived in the radioactively polluted Semipalatinsk territories of Kazakhstan // Virchows Arch. 17" European Congress of Pathology and XK Spanish Congress of Pathology. Barcelona Spain, September 18-23, 1999. - Vol.435, ХаЗ - P.366.

15. Sagindikova G.. Sekamova S., Kogan E. Morphology of the lung cancer ir persons lived in the radioactively polluted Semipalatinsk territories of Kazakhstan h European Respiratory Journal. ERS Annual Congress. Madrid, Spain, October 9-13. 1999. - Vol. 14, Supplement 30. - P.268.

16. Sagindikova G„ Sekamova S., Kogan E. Morphological and molecular-genetic features of the small cell lung cancer developed in persons exposed to radiation and ir general population // European Respiratory Journal. World Congress on Lung Health anc 10th ERS Annual Congress. Florence, Italy, August 30-September 3, 2000. - Vol.16 Supplement 31.-P.398.

17. Sagindikova G.. Kogan E. Jagues G. Immunohistochemistry of IGF familj members in lung cancer in persons lived in the radioactive-polluted Semipalatinsl

Актуальность проблемы.

Рак легкого - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований человека. Результаты в диагностике и лечении рака легкого по-прежнему остаются неудовлетворительными. Несмотря на применяемые современные методы диагностики и лечения, после постановки диагноза лишь у 10 - 15 % больных раком легкого продолжительность жизни превышает 5 лет. Широкомасштабные скрининговые исследования, проводившиеся последние 15 - 20 лет с применением рентгенологических и цитологических методов диагностики и направленные на выявление рака легкого на ранней стадии, никак не отразились на показателях выживаемости больных (Sekido Y., 1998). Рак легкого диагностируется, как правило, на поздних стадиях, когда применение радикальных методов лечения становится неэффективным. До недавних пор опухолевые заболевания рассматривались лишь как следствие нарушения регуляции клеточной пролиферации. Только в середине 80-х, через 10 лет после того как была опубликована статья J.F. Kerr с соавторами (1972) об апоптозе как варианте запрограммированной клеточной смерти, имеющем характерную морфологическую картину и механизм реализации, отличные от некроза, опухолевый процесс стали рассматривать как нарушение равновесия между процессами пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели. После изучения трех классов генов, регулирующих опухолевый рост -протоонкогенов, генов-супрессоров опухолевого роста и генов апоптоза - стало очевидным, что в каждой опухоли имеется определенный набор стойких генетических изменений. В последнее время накоплена масса информации о молекулярных основах патогенеза, а также особенностях апоптоза и пролиферации в раке легкого, однако результаты этих исследований зачастую противоречивы, морфологической гетерогенности опухолей уделяется недостаточно внимания, а процессы апоптоза в раке легкого в целом, а также в его отдельных гистогенетических вариантах, требуют дальнейшего изучения.

Исследования биомолекулярных опухолевых маркеров при PJ1 имеют большое значение для его ранней диагностики, точной морфологической верификации и установления стадии прогрессии.

В то же время остаются нерешенными и спорными следующие вопросы:

1. существуют ли морфологические особенности PJI у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях;

2. существуют ли особенности гистогенеза и дифференцировки опухолевых клеток PJI у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях;

3. имеются ли особенности экспрессии онкомаркеров в опухолевых клетках PJ1 у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях, что объясняло бы особенности течения этого заболевания;

4. имеются ли особенности экспрессии IGF системы в опухолевых клетках PJI у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей морфологии, цитогенеза и экспрессии биомолекулярных маркеров РЛ, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические и цитогенетические характеристики РЛ, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

2. Сравнить морфологические и цитогенетические особенности РЛПР с таковыми у РЛ, не обусловленного воздействием радиации.

3. Изучить иммуногистохимические особенности рака легкого, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

4. Сравнить иммуногистохимические особенности РЛПР с таковыми у РЛ, не обусловленного воздействием радиации.

5. Изучить роль IGF-системы в раке легкого, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

6. Сравнить особенности действия IGF системы в РЛПР и в РЛ, не обусловленного воздействием радиации.

Научная новизна

Полученные в результате исследования данные позволяют говорить о том, что РЛ, возникший у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, имеет морфологические, цитогенетические и молекулярно-биологические особенности, отличающие его от PJI жителей Москвы и Казахстана.

PJI, связанный с воздействием радиации, характеризовался постоянным обнаружением пылевых частиц и интерстициального и очагового фиброза в опухолях различной локализации и гистологического типа.

MPJI преобладал по сравнению с другими гистологическими типами, была выявлена высокая частота HMPJ1 с НЭД.

Злокачественный потенциал опухолевых клеток PJI, обусловленного воздействием радиации, судя по экспрессии онкомаркеров опухоли, был более высоким и сопровождался усилением аккумуляции в ядрах опухолевых клеток белковых продуктов экспрессии р53 и с-шус и снижением bcl-2, по сравнению с PJI группы сравнения, что является неблагоприятным прогностическим признаком.

Наибольшей пролиферативной активностью обладал ПРЛ в группе РЛПР, судя по высокой экспрессии Ki-67.

Вследствие высоких показателей уровня экспрессии Ьах можно предположить, что апоптоз в РЛПР был высоким.

Обнаруженные закономерности подтверждаются и изменениями IGF системы. В опухолевых клетках РЛПР отмечалась повышенная экспрессия IGFII, IGFBP1,2 и более низкая экспрессия IGFBP5,6. Экспрессия IGFBP3 отсутствовала или была относительно невысокой.

Практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в проведении профилактики и дифференциальной диагностики PJI, развившегося у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях, прогнозировании течения опухолевого процесса и разработке новых методов генной терапии, а также при чтении лекций и преподавании патологической анатомии.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по теме «Онкоморфология легких» на кафедре патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, на кафедре патологической анатомии Актюбинского медицинского университета в Казахстане, а также в работе биопсийной лаборатории.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались и обсуждались на научных конференциях кафедры патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, II Съезде Международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1999 г.), на IX, X и XI Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 1999 г., Санкт-Петербург, 2000 г. Москва, 2001 г.), на XVII и XVIII Европейских Конгрессах по патологии (Барселона, Испания, 1999 г., Берлин, Германия, 2001 г.), на IX, X и XI Конгрессах Европейского респираторного общества (Мадрид, Испания, 1999 г., Флоренция, Италия, 2000 г., Берлин,

Германия, 2001 г.), на I и II Международной конференции-встречи морфологов стран Черноморского бассейна (Трабзон, Турция 1999 г., 2000 г.), на IV республиканской конференции патологоанатомов Беларуси (Минск, Беларусь, 2000 г.), на II Российской конференции молодых ученых (Москва, 2001 г.).

Публикации По результатам исследования опубликовано 19 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы о результатах собственного исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка использованной литературы. Текст диссертации изложен на 151 странице машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 179 источников, в том числе 24 отечественных.

ВЫВОДЫ.

1. Рак легкого, развившийся у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана (РЛПР), обладает морфологическими, цитогенетическими и иммуногистохимическими особенностями по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации.

2. Морфологически РЛПР характеризуется наличием фиброза с большим количеством пылевых частиц как вне, так и на территории самой опухоли.

3. Цитогенетически РЛПР, как правило, относится к нейроэндокринным опухолям легких, включающим в себя не только мелкоклеточный рак, но и немелкоклеточный рак легкого с нейроэндокринной дифференцировкой, что было подтверждено данными электронной микроскопии и обнаружением хромогранина А.

4. РЛПР отличается более высоким злокачественным потенциалом, судя по высокому уровню экспрессии р53, с-мус и более низкому уровню экспрессии bcl-2 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации.

5. РЛПР характеризуется низкой экспрессией bcl-2 и более высокой экспрессии Ьах в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации, что может свидетельствовать об интенсификации апоптоза, индуцированного постоянным воздействием радиации на растущую опухоль.

6. РЛПР отличается более высоким уровнем экспрессии IGFII и низким уровнем экспрессии IGFI в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации, что свидетельствует о различиях в механизмах пролиферации опухолевых клеток в этих 2-х группах опухолей.

7. РЛПР свойственна более высокая экспрессия IGFBP 1, IGFBP2 и более низкая экспрессия IGFBP4, IGFBP5 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не связанным с воздействием радиации, что может обуславливать особенности процессов пролиферации, апоптоза и дифференцировки опухолевых клеток.

8. РЛПР характеризуется относительно невысокой экспрессией или отсутствием экспрессии IGFBP3 в опухолевых клетках по сравнению с раком легкого, не обусловленным воздействием радиации, что косвенно может подтверждать его цитогенетическую связь с нейроэндокринными опухолями легких.

9. РЛПР, возникший и развивавшийся в условиях повышенной радиации, может быть связан с радиационным воздействием, что косвенно подтверждается данными анамнеза (годовая доза облучения превысила 0,1 бэр); наличием пневмофиброза; нейроэндокринной дифференцировкой опухолевых клеток; усилением апоптоза в опухоли, судя по особенностям экспрессии bcl-2, Ьах, p53,c-myc, IGFBP 1,2,4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенного исследования мы пришли к заключению, что РЛ, развившийся у лиц, проживавших в условиях повышенной радиации имеет морфологические и цитогенетические особенности, которые заключаются в следующем.

Во-первых, в строме и паренхиме опухоли присутствовали большие скопления пылевых частиц в сочетании с интерстициальным фиброзом как в самой опухоли, так и в прилежащей легочной ткани. При микроскопическом исследовании пылевые частицы концентрировались в интерстиции по ходу лимфатических коллекторов, по ходу сосудов, бронхов, субплеврально, а также в фокусах фиброза. Эти же частицы обнаруживались и в цитоплазме опухолевых клеток. Обнаружение пылевых частиц в опухолях может свидетельствовать об инициальном значении радионуклидов в развитии РЛ, что подтверждается данными литературы [21,2].

Инициальные повреждения легочных тканей радионуклидами лежат в основе развивающихся в легких патологических процессов, как в их центральных отделах (в крупных бронхах), так и в периферических (в мелких бронхах, бронхиолах, альвеолах, интерстиции респираторных отделов).

В случае мелких размеров частиц и повреждения слизистой мелких бронхов, бронхиол и альвеол возникают бронхиты, бронхиолиты и фиброзирующий альвеолит. Накопление радионуклидов в интерстиции, а также хроническое воспаление приводят к возникновению очагового и диффузного интерстициального пневмосклероза, создающего благоприятный фон для развития периферического PJI. Депонированию радионуклидов в легочной ткани способствуют альвеолярные макрофаги, при гибели которых радионуклидные частицы фагоцитируются другими макрофагами. Развивающийся при этом фиброз также благоприятствует накоплению в легочной ткани радиоактивного материала, поскольку ведет к нарушениям лифмо- и кровообращения в легочной ткани.

Радионуклиды могут захватываться не только альвеолярными макрофагами, но и эпителиальными клетками, оказывая на них прямое повреждающее действие и индуцируя злокачественную трансформацию. Об этом свидетельствуют данные обнаружения в клетках периферической аденокарциномы легкого у больного-ликвидатора аварии на Чернобыльской АЭС радиоактивного цезия [21].

В развитии радиационного периферического РЛ пневмосклероз имеет важное значение как фоновый патологический процесс. С одной стороны, процесс образования фиброзной ткани в легком следует рассматривать как адаптивный процесс, обеспечивающий некоторую защиту тканей от воздействия ионизирующей радиации. Но, с другой стороны, склеротические изменения могут создавать дополнительные условия для злокачественной трансформации эпителиальных клеток. Развитию склеротических изменений в легких могут способствовать также те пылевые примеси, которые аспирируются в легкие вместе с радионуклидами. Как показали исследования

6], морфогенез периферического РЛ примерно в 73% случаев связан с очаговым и/или диффузным пневмосклерозом. Следует отметить особенности радиационного пневмофиброза, выявленного в случаях развития РЛ у больных уранового производства и описанного в литературе [20].

При попадании крупных радиоактивных частиц основные изменения локализуются в крупных бронхах, где на фоне хронического воспаления могут развиваться дисрегенераторные изменения эпителия — метаплазия, дисплазия, относящиеся к предраковым изменениям.

Во-вторых, цитогенетическая особенность РЛ, развившегося в условиях повышенной радиации, связана с преобладанием опухолей с нейроэндокринной дифференцировкой, что совпадает с мнением Крейберга, который еще в 1954 г. первым отметил, что наиболее часто такой рак имеет НЭД.

Очень важно подчеркнуть, что НЭД, обнаруженная у наших больных, относится не только к МРЛ, но и к НМРЛ с НЭД. При этом в контрольной группе мы не встретили ни одного случая НМРЛ с НЭД.

РЛ Семипалатинской области может быть классифицирован как нейроэндокринный рак, представленный не только МРЛ с НЭД (классический, комбинированный), но и НМРЛ с НЭД (ПРЛ с НЭД, АК с НЭД, ККР с НЭД).

РЛ, развившийся у лиц, проживавших в условиях повышенной радиации имеет и свои иммуногистохимические особенности.

При иммуногистохимическом исследовании уровня экспрессии Ki-67 процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток был выше в ПРЛ у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области по сравнению со II группой, что можно гипотетически связать с его гистогенетическими особенностями, связанными с НЭД в ПРЛ. Это в свою очередь может свидетельствовать о его высокой злокачественности. А в АК уровень экспрессии Ki-67 был меньше чем в группе сравнения, что, вероятно, также отражает особенности этого типа опухоли, заключающиеся в наличии НЭД и изменении пролиферативной активности. В МРЛ имеются тенденции к повышению уровня экспрессии Ki-67 в группе РЛПР по сравнению со II группой.

Что касается уровня экспрессии с-мус, то он был большим в группе I во всех гистологических типах РЛ, что также может быть связано с НЭД.

При изучении экспрессии р53 были выявлены тенденции к повышению уровня экспрессии в I группе только в ПРЛ, в остальных гистологических типах РЛ уровень экспрессии его был ниже чем в группе сравнения, что еще раз подтверждает возможную высокую злокачественность ПРЛ с НЭД.

Анализируя полученные результаты, то же самое можно сказать об уровне экспрессии bcl-2, который также был низким в РЛ I группы, за исключением ПРЛ, что подтверждается данными литературы [96]. Fontanini G. говорил о плохом прогнозе опухолей с низким уровнем bcl-2 и отмечал менее агрессивное поведение bcl-2 позитивных опухолей.

Уровень экспрессии Ьах имел тенденцию к повышению в РЛ I группы во всех гистологических типах, что дает вероятность предположить, что в РЛПР апоптоз высокий, за исключением ПРЛ, где Ьах работает на пролиферацию опухолевых клеток.

Таким образом, изучение экспрессии биомолекулярных маркеров показало, что РЛПР обладает молекулярно-биологическими особенностями, свидетельствующими о его более высоком злокачественном потенциале, судя по экспрессии р53, с-мус, bcl-2. Однако, разные гистотипы отличались по экспрессии Ki-67, и наибольшей пролиферативная активность в группе РЛПР соответствовала ПРЛ с НЭД. В то же время, вероятно, несмотря на высокий злокачественный потенциал, РЛПР характеризуется и более высоким уровнем апоптоза, что подтверждается повышенным уровнем экспрессии Ьах. Последнее не удивительно, поскольку, судя по данным литературы, чем выше пролиферация в опухоли, тем выше апоптоз [9]. Кроме того, опухоли растут в условиях постоянной радиации, что также подтверждает высокий апоптоз [8].

В отличие от РЛ Семипалатинской области в исследованном чернобыльском и красноярском РЛ отмечен более низкий уровень пролиферативной активности [8], что может быть следствием того, что у РЛ, развившегося в Семипалатинской области имеются отличные источники радиации, состав радиоизотопов и условия возникновения опухоли.

Обнаружение IGFII и IGFBP не только в паренхиме РЛ, но и в строме, закономерно ставит вопрос о месте клеточного синтеза этих факторов. Анализируя полученные нами результаты иммунногистохимического исследования, а также данные литературы [85, 86], можно предположить, что синтез большинства факторов IGF системы происходит преимущественно в самих опухолевых клетках PJI. Эндотелий сосудов, клетки фибропластического ряда и плазматические клетки также продуцируют и транспортируют в опухоль некоторое количество IGFII и IGFBP. Это создает предпосылки для паракринной стимуляции роста стромальных элементов под влиянием опухолевых клеток и одновременно обеспечивает стромальную регуляцию роста опухоли через воздействия на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Наибольшее воздействие стромы на рост опухоли, судя по экспрессии IGFBP, происходит в пограничных районах, в зонах десмопластической реакции, что также подтверждается данными литературы [7].

Накопление IGFBP 1,2,5 в экстрацеллюлярном матриксе очагов пневмосклероза может противодействовать врастанию опухоли в фиброзную ткань и распространению РЛ, однако, с другой стороны, накопление в старых очагах пневмосклероза как митогенных факторов, так и протеинов, индуцирующих апоптоз, очень опасно, так как может приводить к активации клеточных онкогенов эпителиальных клеток, замурованных в таких очагах, и далее при определенных условиях и к злокачественной трансформации.

Проведенное исследование IGF системы в разных гистологических типах РЛ свидетельствует о многообразной и сложной роли этой системы в онкогенезе. Накапливаясь в клетках стромы и паренхимы, члены семейства являются проводниками сложных стромально-паренхиматохных взаимодействий и регулируют процессы пролиферации и апоптоза в опухоли.

После изучения трех классов генов, регулирующих опухолевый рост -протоонкогенов, генов-супрессоров опухолевого роста и генов апоптоза - стало очевидным, что в каждой опухоли имеется определенный набор стойких генетических изменений. В последнее время накоплена масса информации о молекулярных основах патогенеза, а также особенностях апоптоза и пролиферации в раке легкого, однако результаты этих исследований зачастую противоречивы, морфологической гетерогенности опухолей уделяется недостаточно внимания, а процессы апоптоза в раке легкого в целом, а также в его отдельных гистогенетических вариантах, требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, описанные случаи PJ1, развившегося у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях Семипалатинской области, различаются по морфологическим и молекулярно-генетическим особенностям, характеризуются сравнительно высокой пролиферативной активностью, что, вероятно, и обусловило быстрый рост опухоли и предположительно плохой прогноз.