Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Значение молекулярно-генетических методов в диагностике и лечении рака поджелудочной железы

На правах рукописи

КАШИНЦЕВ Алексей Ариевич

ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.12 - онкология 14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 1';ДП 2014

Санкт-Петербург - 2014

005548333

005548333

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет», заведующий кафедрой медицинской генетики

доктор медицинских наук, профессор Коханенко Николай Юрьевич

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет», заведующий кафедрой факультетской хирургии имени A.A. Русанова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Орлова Рашида Вахидовна

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Правительства Российской Федерации, заведующая кафедрой онкологии, доктор медицинских наук, профессор Гранов Дмитрий Анатольевич

Федеральное государственное бюджетное «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения Российской Федерации, руководитель отделения интервенционной радиологии и оперативной хирургии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук, г. Москва.

Защита диссертации состоится "_"_2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно - исследовательский институт онкологии имени Н.Н.Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68; тел.: (812) 596-8655, факс: (812) 596-8947. Эл.почта: oncl 1 @rion.spb.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии имени Н.Н.Петрова» Минздрава России по адресу 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68

Автореферат разослан «_»_2014 года

Учёный секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук

Бахидзе Елена Вилльевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Лечение рака поджелудочной железы представляет собой один из трудных и актуальных вопросов современной хирургии и онкологии. Причина плохих результатов кроется в поздней диагностике заболевания, а также не эффективности современных лечебных тактик (Чиссов В.И., 2013; Siegel М.,

Для улучшения результатов авторы предлагают формировать группы риска среди пациентов с экзогенными факторами, в частности сахарным диабетом, и эндогенной (наследственной) или генетической предрасположенностью, например среди лиц с семейной формой рака молочной железы, яичников, ассоциированной с мутацией генов BRCA1, BRCA2, PALB2. Среди больных раком поджелудочной железы на момент установления диагноза, частота нарушения углеводного обмена достигает 80% и поэтому диабет может рассматриваться как первый ранний симптом заболевания (Wang F., et al., 2003; Chari S., et al., 2009).

Степень разработанности темы исследования

По данным литературы, среди больных раком поджелудочной железы, частота носительства аллеля генов BRCA1 составляет от 0 до 4.7%, BRCA2 — 4,1 -17,2%, a PALB2 - 2,1 - 4,3% (Lal G.I., et al., 2000; Hahn S.A, et al., 2003; Couch F.J., et al., 2007; Axilbund J.E., et al., 2009; Ferrone C.R, et al., 2009; Jones S., et al., 2009; Ghiorzo Р., et al., 2012). Данные гены используются в качестве предикторов для химиотерапии при раках других локализаций, относительно опыта применения их при раке поджелудочной железы в мировой литературе сообщения основываются на маленьких выборках (Birsky Т., et al., 2009; Moiseyenko V.M., et al., 2010; Lowery M.A., et al., 2011; Tran В., et al., 2012).

При наличии вышеперечисленных факторов риска у пациента, актуальной остается проблема инструментального обследования с целью ранней диагностики рака, так как авторы предлагают комбинирование различных методов. При этом только эндоскопическое ультразвуковое исследование с тонкоигольной аспирацией рекомендовано всеми (Ludwig Е., et al., 2011; Schneider R., et al., 2011; Vasen H.F., et al., 2011; Canto M.I., et al., 2012). При применении последнего метода возникает проблема с цитологическим исследованием, так частота ложноотрицательных заключений достигает 60% (Correa-Gallego С., et al., 2010). Поэтому применение молекулярно - генетических маркеров может с одной стороны помочь при раннем выявлении заболевания, а с другой необходимо для подтверждения диагноза в случае карцином с неизвестной первичной локализацией, когда инструментальные методы не эффективны. В качестве таковых рассматриваются СА 19-9, чувствительность которого оценивают

2013).

81%, однако колебания его значений при прогнозе результатов лечения широко варьируют (Sail F., et al., 1987; Katz M.H.G., et al., 2010; Ballehanina U.K., 2012). В качестве генетического маркера наиболее часто применяется KRAS, частота мутации которого колеблется от 80 до 95% (Hruban R.H., et al., 2000; Aguire A.J et al., 2003). Рядом авторов для диагностики предлагаются PSCA, F5, при этом чувствительность при аденокарциноме поджелудочной железы может достигать 79,5% и 83% соответственно (Talantov D., et al., 2006; Yang W.B., et al., 2009; Saeki N., et al., 2011; Baine M.J., et al., 2012).

Таким образом, необходимо изучение значения молекулярно - генетических методов в диагностике и лечении рака поджелудочной железы.

Цель исследования

Улучшить диагностику и результаты лечения рака поджелудочной железы путем применения молекулярно-генетических методов и соответствующих схем химиотерапии.

Задачи исследования

1. Оценить клиническую картину, частоту нарушения углеводного обмена и чувствительность инструментальных методов в диагностике раннего рака поджелудочной железы.

2. Определить чувствительность молекулярно- генетических методов при раке поджелудочной железы, уточнить их [роль в установлении первичной локализации опухоли и стадии заболевания, доказать генетическую неоднородность опухолей поджелудочной железы.

3. Оценить влияние уровня онкомаркера СА 19-9 на возможность выполнения радикальной операции и на прогноз заболевания.

4. Выявить частоту мутаций генов BRCA1, BRCA2, PALB2 у больных РПЖ и оценить влияние семейного анамнеза на встречаемость мутантных аллелей этих генов.

5. Показать необходимость специфической химиотерапии у носителей мутации в BRCA генах.

Научная новизна исследования

Впервые установлена частота носительства мутации BRCA1 5382insC в группе больных раком поджелудочной железы. Разработан алгоритм отбора пациентов с данным заболеванием для генетического тестирования.

Определена распространенность семейной формы рака поджелудочной железы.

Оценена частота мутации KRAS, экспрессия РНК генов в метастазах рака поджелудочной железы и сформирована диагностическая панель, состоящая из

КЯАБ, РБСА, СБХ2, СЭН17, позволяющая с чувствительностью 61,3% подтвердить наличие рака поджелудочной железы среди карцином с неизвестной первичной локализацией.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выполненные генетические исследования позволили оценить частоту встречаемости мутаций генов ВКСА1, В11СА2, РАЬВ2 среди больных раком поджелудочной железы. Разработан принцип выбора первой линии химиотерапии для носителей аллелей генов ВЯСА.

Предложен алгоритм для формирования группы риска развития рака поджелудочной среди больных сахарным диабетом, план обследования и наблюдения за этими пациентами.

Разработана методика оценки экспрессии генов с целью установления первичной локализации опухоли при помощи ПЦР в реальном времени.

Методология и методы исследования

Данная научная работа была выполнена в соответствии с отечественным и мировым опытом. В основу диссертации легли этические принципы и правила доказательной медицины. Методология включала в себя разработку дизайна исследования, определение принципов отбора и объема выборки пациентов, а также подбора математического аппарата для статистической обработки полученных данных. Для проведения исследования использовали клинико-морфологические, инструментальные, гистологические, молекулярно-генетические методы.

Положения, выносимые на защиту

1. Наблюдение за больными, включенными в группу риска с впервые выявленным сахарным диабетом, позволяет диагностировать новообразование поджелудочной железы на более ранних стадиях.

Наибольшей чувствительность при выявлении рака поджелудочной железы обладают эндоскопическое ультразвуковое исследование, магнитно-резонансная томография с холангиопанкреатографией и спиральная компьютерная томография с внутривенным контрастированием.

2. Прогноз заболевания и результаты хирургического лечения ухудшаются при увеличении уровня онкомаркера СА 19-9 выше 100 Ед/мл.

3. Оценка молекулярно- генетических маркеров (уровень СА 19-9, экспрессия КЛАБ, СБН 17, РБСА и СБХ2) позволяет установить первичную локализацию опухоли, оценить стадию заболевания и дальнейший прогноз.

4. Носительство мутации генов BRCA1 5382insC и BRCA2 является редким среди больных раком поджелудочной железы. Для российской популяции не характерно наличие аллеля BRCA2 6174delT.

5. Наличие наследственной мутации обусловливает чувствительность опухоли к ДНК - повреждающим агентам.

Степень достоверности и апробация результатов

Для обеспечения достоверности полученных результатов было включено в исследование 257 наблюдений. Полученные данные обрабатывались -,с помощью программного пакета для статистического анализа SPSS 17.0, что позволило доказательно аргументировать полученные выводы.

Результаты работы были представлены на: 43 международном панкреатологическом симпозиуме и удостоены награды молодого исследователя (Майями, США, 2012); 2-ом международном научном и обучающем форуме «Хирургия и Онкология - 2012», где была получена почетная грамота; 49-ом ежегодном международном симпозиуме Американского общества клинических онкологов (ASCO, Чикаго, США, 2013); в ходе работы международной программы, обучающей клиническим исследованиям - ICTW, организованное Американским обществом клинических онкологов и Российским обществом химиотерапевтов (ASCO и RUSSCO, Санкт-Петербург, Россия, 2013); седьмом российском онкологическом форуме (Санкт- Петербург, Россия, 201 Зг), а также «Gastrointestinal cancer symposium» (Сан - Франциско, США, 2014).

По результатам исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора в получение результатов

При выполнении исследования автор лично участвовал в его разработке и исполнении. Проанализирован мировой опыт в изучении поставленной задаче. Осуществлен набор клинического материала, многоплановый анализ, документация и систематизация полученных результатов.

В ходе работы получена приоритетная справка на изобретение метода диагностики панкреатической гипертензии: МПК А61В 8/13, А61К 49/10»,- № 2013127373 от 14.06.13.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 297 источника, в том числе 33 отечественных и 264 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

С 2009 по 2012 годы исследованы 257 больных раком поджелудочной железы Ю - IV стадиях, проходившие лечение в ГБУЗ «Городская Мариинская больница», ГБУЗ «Покровская больница», НИИ скорой помощи им. проф. И.И. Джанелидзе, ГБУЗ «Ленинградский областной онкологический диспансер», ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер».

Для формирования группы риска среди больных с сахарным диабетом, была проанализирована клиническая картина у 183 больных раком поджелудочной железы. При этом помимо основных характеристик, учитывался семейный анамнез, временной интервал от установления диабета до выявления злокачественного образования поджелудочной железы.

Проведен анализ чувствительности инструментальных методов с целью выделения наиболее эффективных для ранней диагностики образования поджелудочной железы. Были включены следующие методы: ультразвуковое исследование (УЗИ), мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) с и без болюсного внутривенного контрастирования, магнитно - резонансная томография с холангиопанкреатографией (МРХПГ), эндосокопическое ультразвуковое исследование (ЭУЗИ).

Выполнена оценка диагностической чувствительности С А 19-9 путем сопоставления данных инструментальных методов, гистологического заключения с изменением уровня маркера. Изучены результаты 78 радикальных хирургических вмешательств выполненных в 3 стационарах с 2009 по 2012 годы. На основании полученных данных, сравнивалось изменение уровня карбогидратного антигена с количеством радикально выполненных вмешательств и выживаемостью больных.

Проанализированы результаты паллиативной химиотерапии (ХТ) у 19 больных. При этом 3 пациента получали тегафур - 800 мг/м2 2 раза в день, но не более 1,6 г/сутки в течение 14 дней, 16 - гемцитабин, 1000мг/м2 в 1, 8 и 15 дни цикла. Перед началом лечения оценивали соматический статус пациентов по шкале ЕСОв, ХТ проводилась больным при его значении 0 или 1 балл. Для результатов химиотерапии применяли критерии ЯЕСЛБТ.

Генетическое исследование состояло из двух частей: 1) Определения распространенности носительства аллелей генов ВЯСА1, В11СА2, РАЬВ2, и применения индивидуальной схемы химиотерапии. 2) Выполнения оценки частоты мутации гена КЛАБ, а также уровня экспрессии РНК генов СБН 17,

PSCA, CDX2, F5, LIPF, UPK2, TG, LPB, SPB среди карцином с неизвестной первичной локализацией.

Всех генетически обследованных больных (п = 150) в зависимости от количества родственников с онкопатологией в семейном анамнезе разделили на 3 группы: А - отсутствие таковых (п = 94), В - наличие одного родственника с онкологической патологией (п = 35), С - 2 и более родственника со злокачественными заболеваниями (ri = 21).

Для контроля популяционной встречаемости аллеля BRCA1 5382 insC лабораторией молекулярной генетики НИИ им. Н.Н.Петрова были предоставлены образцы ДНК от 1007 здоровых лиц.

Для определения наличия мутации BRCA1 5382insC, BRCA2 6174delT, в гене KRAS, а также наличие экспрессии РНК CDH 17, PSCA, CDX2, F5, LIPF, UPK2, TG, LPB, SPB использовали аллель - специфическую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени. Данное исследование выполняли на амплификаторах iCycler iQ Real - Time PCR Detection System и CFX - 96 (Bio-Rad Laboratories, США). Аллель - специфические праймеры представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Последовательности олигонуклеотидов (праймеров), использованных в

ПЦР.

Мутация npaiiMep Последовательность

BRCA1 5382insC common 5 '-AGAACCTGTGTGAAAGTATCTAGCACTG-3'

wt 5 '-AAGCGAGCAAGAGAATTCCAG-3'

mut 5'-AGCGAGCAAGAGAATTCCCA-3'

BRCA2 6174delT common 5 '-C ATAACC AAAATATGTCTGGATTGGAG-3'

wt 5 '-CTGATACCTGGACAGATTTTCCAC-3'

mut 5 '-CCTGGACAGATTTTCCCTTGC-3'

KRAS forward 5'-AATGACTGAATATAAACTTGTGG-3'

reverse 5 '-CAAGATTTACCTCTATTGTTGG-3'

PSCA forward 5' - TGTGCTGCTTGCCCTGTTGA - 3'

reverse 5' - GTTGCTC ACCTGGGCTTTG - 3'

CDX2 forward 5'- GCGGAACCTGTGCGAGTG -3'

reverse 5'- GCCGCTGGTGGTCCGTG -3'

CDH 17 forward 5'- TGAAGGCCAAGAACCGAGTC -3'

reverse 5'- TCTGTCTCCCCAGTTAGTTC -3'

F5 forward 5'- ATGCTGAAGTCGGAGACATC -3'

reverse 5'- GTGTGGTCAAGGTAAGAAGC -3'

Продолжение. Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов (праймеров), использованных в ПЦР.

Мутация npauMep Последовательность

LIPF forward 5'- CCCAGTTCAGAATAGGATGC -3'

reverse 5'- CCTTGCCACCGTTCCACAC -3'

UGRP forward 5'- GTCATGAAGCTGGTAACTATC -3'

reverse 5'- AGGTGCCAACTTGTCAACAG -3'

UPK2 forward 5 '-CCTGATTCTGCTGGCTCTG-3'

reverse 5'-ACAGGGGGGCAAGGCAAC-3'

TG forward 5 '-TGAAGAGGCCACCCACATC-3'

reverse 5' - С ATGGGTGG AAATGGGC AC-3'

LPB forward 5'-ATGGC A ACTGCCCTCCCGC-3'

reverse 5 '-GCAATGGTCATTTCTTTAT-3'

SPB forward 5'-ATGGGACGGACGTCAAAGG-3'

reverse 5 '-GC AAAGTAAGTACTGGGAA-3'

Статистическая обработка материала производилась с помощью пакета программ SPSS 17.0 (SPSS inc.), Microsoft Excel 2007, а также Epi Info, version 6. Математико—статистический анализ выживаемости больных осуществляли методом Каплан - Мейер. Выяснение силы и характера связи дискретных значений проводили непараметрическим методом Спирмена, а также путем парного сравнения, Мантель-Кокса. Подтверждение гипотезы относительного риска выполняли параметрическим методом Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Возраст пациентов колебался от 22 до 87 лет, средний составил 62,4 ± 18,2 года. На долю пациентов пожилого возраста приходилось 73,6% (п = 189). Заболевание чаще наблюдалось у женщин - 61,5% (п = 158). При первичной диагностике IV стадия выявлена у 39,7% (п = 102) больных. При гистологическом исследовании превалировала умеренно дифференцированная аденокарцинома -52,6%.

При оценке клинического течения рака поджелудочной железы, установлено, что наиболее частым симптомом являлась механическая желтуха -84,7%, а у 72,7% больных имелся нарушенный метаболизм глюкозы, среди которых на долю пациентов с сахарным диабетом (СД) приходилось 36,8% (49 больных). Средний возраст больных в группе с компрометированным углеводным обменом составил 52,1 ± 16,9 лет. При сборе семейного анамнеза отмечалось, что

в 55,7% (п = 102) случаев были близкие родственники с онкологической патологией, а с диабетом только у 8,2% (15 больных). Анализ временной зависимости показал, что в большинстве случаев (28 из 49 больных) от установления сахарного диабета до выявления рака поджелудочной железы проходило менее 2 лет, то есть СД был впервые выявленным (рис.1). При этом среднее время между двумя заболеваниями составило 15,75 ± 13,1мес (р<0,05) и при увеличении интервала отмечалось уменьшение количества больных. Принимая во внимание столь малый временной интервал между заболеваниями, можно с определенной уверенностью сказать, что диабет у этих пациентов был первым клиническим проявлением рака поджелудочной железы.

Рис. 1. Распределение пациентов в зависимости от срока выявления сахарного диабета и рака поджелудочной железы.

Таким образом, обобщая полученные результаты можно сделать вывод что, больные старше 52 лет, с впервые выявленным сахарным диабетом, имеющие в семейном анамнезе прямых родственников с онкологическими заболеваниями, являются группой риска, в которой высока вероятность выявления рака поджелудочной железы, поэтому их необходимо активно наблюдать, особенно в первые 2 года.

При анализе чувствительности различных инструментальных методов установили, что наибольшей обладают ЭндоУЗИ, МРХПГ и МСКТ с контрастированием. Совместное применение позволяет достичь чувствительности

при выявлении первичной опухоли - 95.7%, лимфоаденопатии - 91,8%, отдаленного метастазирования - 93,4% (таблица 2).

Таблица 2.

Инструментальные методы исследования и их чувствительность

Вид исследования Число обследованных больных Чувствительность метода (%)

абс. (%) Первичная опухоль Лимфоаденопатия Отдаленное метастазировани е

УЗИ 257 (100%) 80,2 64,3 68,1

МСКТ 74 (28,8%) 88,9 79,9 84,2

МСКТ с болюсным контрастированием 50 (19,5%) 91,8 87,5 92,4

МРХПГ 164 (63,8%) 92,7 86,4 89,6

ЭУЗИ 53 (24,4%) 92,4 91 88,4

Результаты радикального хирургического лечения выполненного 78 больным соответствовали литературным данным. Медиана продолжительности жизни составила 11,1 ± 1,78 месяца, а время до рецидива заболевания 8,9 ± 2,3 месяца, а в группе где выполнялись паллиативные вмешательства - 4,4 ± 0,24 месяца.

При этом наилучшие результаты наблюдались при ГО стадии, медиана составила 36,2 + 13,15 (р = 0,008) месяца, а худшие при III стадии - 6,9 0,82 (5,30 - 8,50, р-0,025) месяца.

Полученные практические результаты лечения были проанализированы в зависимости от изменения уровня онкомаркера СА 19-9. При этом чувствительность маркера составила 71,7%. Среднее значение в группе радикально оперированных больных составило 114,96 Ед/мл, а у пациентов с распространенным процессом - 549,3 Ед/мл. При оценке корреляции между уровнем СА 19-9 и количеством оперативных вмешательств коэффициент Спирмена г = 0,24 (р<0,05), т.е. имеется статистически достоверная обратная зависимость.

Было проанализировано изменение опухолевого маркера и стадии заболевания (таблица 3). При этом отмечается четкая прямая зависимость, так как

происходило увеличение, как среднего значения, так и медианы СА 19-9, что доказано статистически - г = 0,543 (р<0,01).

Таблица 3

Уровень СА 19-9 при различной стадии заболевания

Стадия заболевания Уровень СА 19-9 Ед/мл

среднее значение (min - шах) медиана

га 28,4 ±44,66 (2,3 - 80,1) 3,0

ПА 113,4 ±254,85 (5,0- 837,1) 37,85

пв 229,5 ± 186,32 (3,38 - 569,2) 185,7

III 333,3 ±359,81 (5,7 - 997,0) 247,35

IV 3161,6 ±4695,69 (31,7- 12000) 322,9

При оценке изменения СА 19-9 в зависимости от гистологической структуры опухоли поджелудочной железы, определенной зависимости между средними значениями маркера и степенью дифференцировки аденокарциномы получено не было (таблица 4). Обратная зависимость между этими двумя показателями доказана с помощью медианы антигена и коэффициента Спирмена -г = 0,317 (р<0,05).

Таблица 4.

Зависимость СА 19-9 от гистологической структуры опухоли

Гистологический тип Среднее Медиана Стандарт отклонение Минимум Максимум

Высоко дифференцированная 130,4 48,3 62,3 3,0 524,8

Умеренно дифференцированная 1345,0 145,1 658,4 5,0 12000,0

Низко дифференцированная 712,7 294,2 280,6 2,3 2660,2

не дифференцированная 435,6 350,4 163,1 25,9 1120,0

Проведен анализ зависимости уровня СА 19-9 от размера первичной опухоли поджелудочной железы, при этом отмечена прямая зависимость, г = 0,418 (р<0,01). Результат представлен в таблице 5.

Таблица 5.

Уровень СА 19-9 при разных размерах опухоли

Размер Среднее Медиана Минимум Максимум Стандартное отклонение

<2 см 158,6 14,6 2,3 837,1 333,7

2-4 см 169,1 98,3 3,4 569,2 174,5

>4 см 2338,9 331,1 5,7 12000,0 4113,8

Итого 969,6 120,0 2,3 12000,0 2677,3

Таким образом, было доказано, что карбогидратный антиген имеет не только диагностическое значение, но и прогностическое, что подтверждено при анализе выживаемости методом Каплан-Мейер. Тест Спирмена имеет следующие значения: г = 0,37 (р = 0,01). При этом наибольшая медиана наблюдалась при уровне антигена менее 100 Ед/мл: при значении ниже 37 Ед/мл - 17,1 ±2,51 мес (р = 0,031), от 37 до 100 Ед/мл - 11,1 ± 0,89 мес (р = 0,018). Примечательно, что в группе радикально оперированных больных и среди пациентов с IB и IIA стадиях, когда отсутствует регионарное метастазирование, среднее значение маркера также соответствовало 100 Ед/мл.

При проведении генетического исследования было выявлено 2 носителя аллеля BRCA1 5382insC. Относительно группы А (всех генетически обследованных пациентов, п = 150) частота составила - 1,3%, и в целом соответствовала данным зарубежной литературы (Lai G., et al., 2000; Ferrone C.R., et al., 2009; Lowery M.A., et al., 2011). Примечательно, что обнаруженная нами частота носительства мутации превышает таковую в здоровой популяции (1/1007, 0.09%), что подтверждает роль дефектов BRCA1 в формировании предрасположенности к РПЖ. Ни один из 22 пациентов, обследованных на BRCA2 6174delT, не являлся его носителем. Анализ полной нуклеотидной последовательности экзонов гена PALB2 не дал результатов, а гена BRCA2 у 8 больных выявил 1 случай патогенной мутации, при этом был обнаружен новый аллель, характеризующийся делецией тимина и цитозина в локусах 5197 и 5198 -5197_5198delTC. Учитывая тот факт, что все эти больные имели двух и более родственников с онкопатологией и вошли в группу С (подозрение на семейный

раковый синдром), то частота гетерозиготного носительства составляет для В11СА1 - 2/21(9,5%), ВЯСА2 - 1/21(4,8%). В последней группе частота мутации генов ВЯСА - 14,3%. Полученные результаты продемонстрировали, что частота среди больных раком поджелудочной железы низка. При сравнении групп А, В, С между собой, по возрасту, половому соотношению, соматическому статусу, стадии заболевания, степени дифференцировки опухоли, не было получено статистически значимых отличий. Таким образом, единственным достоверным параметром, влияющим на вероятность выявления носительства полиморфизма генов является онкологический семейный анамнез (таблица 6). При увеличении количества родственников с онкопатологией относительный риск составил 0,34 (0,23<0р<0,49; р=0,047; доверительный интервал=95.0%).

Таблица 6.

Зависимость частоты мутации в генах ВЯСА1, В11СЛ2 от семейного онкологического анамнеза

Наличие мутации 0 прямых родственников 1 прямой родственник >2 родственников

Нет мутации 94 35 18

Есть мутация 0 0 3

Всего 94 35 21

Согласно руководству международного консорциума по скринингу рака поджелудочной железы 2012 года, в группу риска должны быть включены лица с наличием прямых родственников носителей мутации гена BR.CA (Canto M.I., et al., 2012). Стоит отметить, что в нашем случае у одного из носителей аллеля BRCA1 5382insC, была дочь, получавшая лечение по поводу рака молочной железы с наличием идентичного генетического дефекта (рис. 2).

Специфическую химиотерапию удалось применить только у одного пациента, носителя аллеля BRCA2 5197_5198delTC, так как его соматический статус соответствовал 1 баллу по шкале ECOG(European Cooperative Oncology Group).

Пациент H., 59 лет. Диагноз: Первино - множественный метахронный рак: 1) Рак предстательной железы T3bNiMi; 2) Рак поджелудочной железы T4N1M1. При гистологическом сопоставлении двух злокачественных опухолей, морфологического сходства выявлено не было. К тому же за год до выявления бластомы поджелудочной железы, у пациента установили сахарный диабет.

ВЯСА1 5382июС

РМЖ

исследованный пациент,

носители мутации

- пациенты с заболеванием

Рис. 2. Схематическое изображение родословной пациента Ф. Примечание: РПЖ - рак поджелудочной железы; РМЖ - рак молочной железы

Эффективность химиотерапии оценивалась динамикой СА 19-9, а также по данным МСКТ, что отражено на рисунках 3 и 4.

Рис. 3. Изменения уровня СА 19-9 в зависимости от схемы химиотерапии Примечание: стрелками отмечено назначения химиотерапевтического агента. *- дата выявления мутации генаВЯСА2, 31.08.2012.

Как видно из полученных данных, наилучший результат отмечался при назначении ДНК-повреждающих препаратов хлорамбуцила и митомицина, что сопровождалось снижением уровня СА 19-9 до 584,6 Ед/мл. При этом опухоль оказалась резистентна к стандартной схеме РОГЛЯПЧОХ. Наибольшее время до прогрессирования составило 4,1 месяца и наблюдалось при назначении последней линии химиотерапии. Данные результаты подтверждены томограммами, выполненными при различных режимах.

inst cf Qng ofsxsv

8г$»аж* 54 В к: useo

ABDOMEN OCONTftAST

$* У?

А*: S7277

1Э52 0С11« М 5842

А.сс: 20125ес 18

AcqTrr» <30.32.4$

120.0 teV

224 OrmA 2.0 moWQ&i Ti». 0.0«

UftCCM I lin-DCM/j.Ö:lD. w as 0 tSO

DFOV «i Э О у <49 Öcm

Рис. 4. Компьютерные томограммы пациента Н. в динамике

Примечание: стрелками отмечены вторичные очаговые образования: А-сентябрь 2012, Б- февраль 2013.

В исследование были включены 19 больных с дессеминированной формой рака поджелудочной железы, получавших только химиотерапию. У всех пациентов (п = 3) получавших тегафур, наблюдалось прогрессирование заболевания. Среди больных группы гемцитабина, только в 18,7% (п = 3) установлен по критериям RECIST частичный ответ, в 25,0% (п = 4) -стабилизация, а в 56,3% (п = 9) — прогрессирование. При этом средняя продолжительность жизни составила 3.2 ± 0,7 месяца.

В отдельном разделе диссертации приведены результаты оценки частоты мутации гена KRAS и экспрессий РНК генов CDH 17, PSCA, CDX2, F5, LIPF, UPK2, TG, LPB, SPB. Для исследования были взяты парафиновые блоки с

гистологическим материалом метастазов рака поджелудочной железы от 19 пациентов. Чаще всего наблюдались положительные результаты для KRAS (68,4%), PSCA (55,6%), CDH 17 (60,0%) и CDX2 (40,0%). Используя комбинацию этих 4 генов, в случае, когда имеются отдаленные метастазы РПЖ, а первичный очаг с помощью различных методов не определяется, с чувствительностью 61,3%, можно подтвердить диагноз. Отмечалась низкая частота экспрессии гена F5 (11,1%), который позиционировался как высокоспецифичный для рака поджелудочной железы, а также маркеров типичных для карцином другой локализации: LIPF - 3 (30,0%), UPK2 - 2 (10,2 %), TG - 3 (21,4 %), LPB - 1 (6,7%), SPB - 4 (25,0%), - что доказывает высокую генетическую гетерогенность метастазов рака поджелудочной железы (таб. 7).

Таблица 7

Оценка различных онкомаркеров у больных раком поджелудочной железы

Всего Есть Нет

Онкомаркеры выполнено мутация/экспрессия, мутации/экспрессии,

анализов п(%) п (%)

KRAS 19 13 (68,4) 6(31,6)

PSCA 9 5 (55,6) 4 (44,4)

CDX2 15 6 (40,0) 9 (60,0)

CDH17 15 9 (60,0) 6 (40,0)

F5 9 1(11,1) 8 (88,9)

LIPF 10 3 (30,0) 7 (70,0)

UGRP 14 0 14(100,0)

UPK2 14 2 (10,2) 12(85,7)

TG2 14 3(21,4) 11 (78,6)

LPB 15 1 (6,7) 14 (93,3)

SPB 16 4 (25,0) 12 (75,0)

маммаглобин 15 0 15 (100.0)

Таким образом, в исследовании было показано, что молекулярно -генетические маркеры позволяют диагностировать заболевание, и имеют особенное значение в случаях, когда инструментальные методы не эффективны. Применение этих методов среди пациентов группы риска с сахарным диабетом позволит выявить больных с ранней стадией рака поджелудочной железы. Оценка молекулярного маркера в предоперационном периоде необходима для прогнозирования результатов и коррекции дальнейшей тактики лечения. При

назначении химиотерапии имеет смысл определять наличие предиктивных маркеров ВЯСА1, В11СА2 только у пациентов с наличием 2 и более прямых родственников с онкологическим анамнезом. На основании полученных данных был создан алгоритм отбора пациентов для генетического исследования, представленный на рисунке 5.

Рис. 5. Алгоритм выбора терапии первой линии больных раком поджелудочной железы на основании генетических маркеров

ВЫВОДЫ

1. При раке поджелудочной железы почти у 3Л больных наблюдается нарушение метаболизма углеводов, а сахарный диабет (СД) выявлен более чем у трети пациентов, при этом СД диагностируют в среднем за 15,75 ± 13,1мес (р<0,05). Отмечается высокая частота наличия прямых родственников с онкологической патологией (55,7%) и низкая - с сахарным диабетом (8,2%). Наибольшей чувствительностью при выявлении рака поджелудочной железы обладают: эндоскопическое ультразвуковое исследование - 92,4%, магнитно-резонансная томография с холангиопанкреатографией - 92,7% и спиральная компьютерная томография с внутривенным контрастированием - 91,8%.

2. Рак поджелудочной железы представляет собой неоднородную группу опухолей, характеризующуюся гетерогенностью экспрессии различных молекулярно - генетических маркеров (CDH 17 (60,0%), PSCA (55,6%) и CDX2 (40,0%), F5 (11,1%), LIPF (30,0%), UPK2 (10,2 %), TG (21,4 %), LPB (6,7%), SPB (25,0%)). Применение молекулярно - генетических маркеров KRAS (68,4%), CDH 17 (60,0%), PSCA (55,6%) позволяет установить диагноз рак поджелудочной железы с чувствительностью от 40,0% до 68,4%. При наличии отдаленных метастазов и невозможности установить первичную локализацию опухоли, применение диагностической панели, состоящей из KRAS, CDH 17, PSCA и CDX 2 с чувствительностью 61,3% позволяет подтвердить её наличие в поджелудочной железе.

3. При уровне онкомаркера CA 19-9 выше 100 Ед/мл отдаленные результаты радикальных операций значительно ухудшаются в обратной зависимости (г=0,37; р=0,01). При раке поджелудочной железы имеется статистически значимая зависимость между уровнем CA 19-9 и размером опухоли, гистологическим её типом, стадией заболевания (г=0,418, 0,543 и 0,317).

4. У больных раком поджелудочной железы редко встречаются мутации в генах BRCA1 (1,3%), BRCA2 (0,67%), при этом не обнаружено ни одного дефекта в гене PALB2, а также аллеля BRCA2 6174delT. Вероятность выявления дефектных генов BRCA1, BRCA2 увеличивается при наличии 2 и более родственников с онкологическими заболеваниями (относительный риск = 0,34).

5. Применение ДНК - повреждающих препаратов (митомицина) в качестве первой линии химиотерапии при наличии мутации в гене BRCA дает лучшие результаты, чем стандартные схемы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентов старше 50 лет имеющих прямых родственников с онкологической патологией и впервые выявленным сахарным диабетом, необходимо относить к группе риска развития рака поджелудочной железы и активно наблюдать в течение первых 24 месяцев от установления диагноза. При этом для исключения/подтверждения наличия образования целесообразно применять ЭндоУЗИ, MPT, МСКТ.

2. У больных раком поджелудочной железы, имеющих двух и более прямых родственников с онкологическими заболеваниями и/или носителей аутосомно-доминантной мутации, при назначении химиотерапии необходимо включать в комплекс диагностических мероприятий определение дефектов в генах BRCA1, BRCA2.

3. При наличии мутантных аллелей генов BRCA1 и BRCA2 следует начинать химиотерапию ДНК - связывающими цитостатиками (например митомицином).

4. На дооперационном этапе с целью прогноза результатов лечения следует выполнять оценку уровня онкомаркера CA 19-9.

5. Для раннего выявления рака поджелудочной железы необходимо применять эндоскопическое ультразвуковое исследование, магнитно-резонансную томографию с холангиопанкреатографией и мультиспиральную компьютерную томографию с контрастированием.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы дальнейшей разработки темы лежат в объединении данных мирового опыта применения подобного подхода в лечении рака поджелудочной железы и создания стандарта в терапии BRCA - дефицитных опухолей. Необходимо определение специфичности для диагностической панели KRAS, CDH 17, PSCA и CDX 2 среди больных хроническим панкреатитом для внедрения последней в диагностическую практику.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кашинцев, A.A. Взаимосвязь между сахарным диабетом и раком поджелудочной железы / A.A. Кашинцев, Н.Ю. Коханенко // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - Т.58, №4. - С. 36 - 39.

2. Кашинцев, А.А. Встречаемость мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком поджелудочной железы / А.А. Кашинцев, Г.А. Янус, Н.Ю. Коханенко, и соавт. // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - Т.59, №5. -С. 39-44.

3. Коханенко, Н.Ю. Выбор метода дренирования желчевыводящих путей при опухолевой механической желтухе 7 Н.Ю.Коханенко, Л.А.Кашинцев, К.В.Павелец и соавт // Профилактическая и клиническая медицина. - 2013. - Т. 48, №3. - С. 48 - 51.

4. Ширяев, Ю.Н. Тактические и технические аспекты резекции пищевода и панкреатодуоденальной резекции, производимых у одного и того же больного последовательно или симультанно (обзор литературы)/ Ю.Н. Ширяев, Ю.В. Радионов, А.А. Кашинцев и соавт. // Труды Мариинской больницы. — 2013. -№10. -С. 157- 164.

5. Павелец, К.В. Внутривенная интраоперационная фото динамическая терапия в хирургическом лечении рака билиопанкреатодуоденальной зоны (оценка результатов первого года применения) / К.В. Павелец, Н.Ю. Коханенко, А.А. Кашинцев и соавт. // Труды Мариинской больницы. - 2013. - №10. - С. 178 -180.

6. Павелец, К.В. Оценка эффективности методов диссекции при панкреатодуоденальной резекции / К.В. Павелец, А.А. Кашинцев, Н.Ю. Коханенко и соавт. // Педиатр. - 2013. - №1. - С. 71 - 73.

7. Кашинцев, А.А. Роль предоперационного уровня СА 19-9 в оценке резектабельности рака головки поджелудочной железы / А.А. Кашинцев, Н.Ю. Коханенко, К.В. Павелец и соавт // Вопросы онкологии. - 2013. - Т.З, №3. - 1010.

8. Kashintsev, A. Diagnostics of pancreatic duct hypertension by the serotonin-stimulating magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP): A preliminary study / A. Kashintsev, N. Yu. Kokhanenko, К. V. Pavelets et al. // Journal of clinical oncology. - 2014. -Vol. 32. - suppl.. 3.

9. Kashintsev, A. Frequency of BRCA1 5382insC mutations in Russian non-selected pancreatic cancer patients / A. Kashintsev, N.Yu. Kokhanenko, E.N. Imyanitov // Journal of clinical oncology. - 2013. - Vol. 31.- suppl. E 15165.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

BRCA1 - ген рака молочной железы 1 (breast cancer 1) BRCA2 - ген рака молочной железы 2 (breast cancer 2)

PALB2 - партнер и локализатор гена BRCA2 (partner and localizer of BRCA2) KRAS - онкоген саркомы мышей, вызванный вирусом Kirsten (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)

С A 19-9 - карбогидратный антиген 19-9 (carbohydrate antigen 19-9)

SPB - белок сурфактанта В (surfactant protein В)

PSCA - антиген стволовых клеток простаты (prostate stem cell antigen)

CDX2 - ген краниокаудальной дивергенции 2 (caudal related homebox gene)

CDH17 - кадерин 17 (cadherin- 17)

F5 — ген кодирующий простациклин (coagulation factor 5)

LIPF — ген кодирующий желудочную липазы (lipase gene)

UGRP - утероглобин- связывающий протеин (uteroglobin - related protein)

UPK2 - уроплакин 2(uroplakin 2)

TG2 - тиреоглобулин 2

LPB - липофилин Б

FOLFIRINOX - 5 - фторурацил, иринотекан, лейковорин, оксалиплатина

Выражаю признательность главному врачу ГБУЗ «Ленинградский областной онкологический диспансер» доценту Л.Д. Роману и главному хирургу ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» профессору М.Д. Ханевичу за предоставленный материал и помощь в проведении исследования.

Подписано в печать 22.04.14 Формат 60х84'/16 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 Заказ 21/04 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)